KR101349751B1

KR101349751B1 - 뇌파 분석을 이용한 신경정신질환 치료 물질의 탐색 방법

Info

Publication number: KR101349751B1
Application number: KR1020120136133A
Authority: KR
Inventors: 이만기; 최평; 장일성; 석경호
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2012-11-28
Filing date: 2012-11-28
Publication date: 2014-02-13

Abstract

본 발명은 신경정신질환 치료 물질의 탐색 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 수면-각성 상태의 뇌파(EEG)로부터 뇌파변수를 추출하고 참조 공간(reference space)을 구축한 후 시험 물질의 뇌파변수를 참조 공간에 투사하여 이를 정량적으로 비교분석함으로써 신경정신질환 치료 물질을 탐색하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 공간상의 위치로 특정 기능적 뇌 상태를 정량적으로 비교할 수 있고, 약물에 의해 유도된 상태의 차이와 시간적 경과를 파악할 수 있다. 따라서 신경정신질환 치료 약물의 효과적인 검색을 위해 전임상 시험에 응용될 수 있고, 약물 효과에 대한 평가 규칙의 일관성이 있으므로 평가 자동화도 가능하다.

Description

뇌파 분석을 이용한 신경정신질환 치료 물질의 탐색 방법 {Screening method of materials for treating neuropsychiatric disease using electroencephalographic analysis}

본 발명은 신경정신질환 치료 물질의 탐색 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 수면-각성 상태의 뇌파(EEG)로부터 뇌파변수를 추출하고 참조 공간(reference space)을 구축한 후 시험 물질의 뇌파변수를 참조 공간에 투사하여 이를 정량적으로 비교분석함으로써 신경정신질환 치료 물질을 탐색하는 방법에 관한 것이다.

뇌파(electroencephalographic, EEG) 기록의 분석은 약물의 효과를 평가하는데 필요하다. EEG로 측정된 것처럼, 뇌 활동은 내, 외부적 자극으로부터 항상 변화한다. 기본적인 개념은 뇌가 특이적인 전기적, 행동적 상태를 유도하는 동안 명백한 기능적 상태에 있음을 나타낸다는 것이다. 따라서 많은 연구자들이 EEG 분석을 이용함으로써 기능적 뇌 상태를 평가하려고 노력해왔다 (Gervasoni D et al., J Neurosci, 2004; 24: 11137-47). 약물은 각성 상태(vigilance states)와 관련된 특이적 기능 상태를 유도한다 (Kwon DH, et al., J Korean Soc Biol Ther Psychiatry, 2006; 12: 252-67). 일반적으로, 약물의 작용은 실험자에 의해 경험적으로 선택된 임의의 기간(5에서 60분)의 안정한 구간에서 평가하여 왔다. 그러나 약물-유도된 상태는 각성 상태의 자연적인 변동 없이 유지될 수 없기 때문에 직접적으로 약물의 효과를 비교하는 것이 어렵다. 일부 연구자들은 각성 상태를 유지시켜 “순수한” 약물 효과를 분리해내려고 노력하였으나, 결과를 얻는데 실패했다 (Dimpfel W, et al., Clin Investig, 1993; 71: 197-207). 사실, 이는 대부분의 실험에서 불가능하다. 다른 연구자들은 “순수한” 약물 효과를 나타내는 특이적 EEG 파라미터들을 식별해 내려고 하였으나 (Dimpfel W. Eur Neuropsychopharmacol, 2005; 15: 673-82), 확인된 파라미터들은 다른 것에 좌우된다. 따라서 본 발명자들은 약물-유도된 상태가 특이적 약물 효과와 다른 내/외부적 자극 사이의 역동적인 상호작용에 의해 유도된 상태의 집합으로 특정될 수 있을 것으로 제안한다. 본 발명에서, 최소한의 에폭 길이로서 10-초 에폭(epochs)을 선택하였는데, 이러한 시간이 동물에서 대부분의 수면 연구와 뇌파약학(pharmacoencephalographic) 연구에 사용되어 왔기 때문이며, 이에 다른 데이터들과 비교하기로 하였다. 약물 처치 후 기록된 구간에 대한 모든 에폭의 EEG 주파수대 파워(frequency band power)를 계산하여, 구간들의 에폭 집합을 약물에 의해 유도된 상태로 간주하였다.

정량적인 뇌파검사를 이용하여, 중추 작용 약물(centrally acting drugs)의 객관적이고 정량적인 효과를 서로 다른 타입의 통계분석을 이용하여 수행하였으며, 이는 스펙트럼 프로파일(spectral profiles)의 단순 비교에서 다변수(multivariate) 통계분석 및 뉴럴 네트워크(neural network)에까지 걸쳐있다. 단순 비교는 약물들 사이의 각 주파수 구간(frequency bin)에서 차이점들을 식별하지만, “어떻게 다른지” 서로 다른 약물이라고 말하기는 어렵다 (Saletu B, et al., International journal of clinical pharmacology research, 1989; 9: 183-95). 반면, 다변수 통계분석은 다중 EEG 파라미터들을 직관적 또는 시각적 결정을 가능케 하여 차이점들을 정량하는 몇 개의 파라미터로 감소시킨다 (Dimpfel W. Eur J Med Res, 2003; 8: 199-207). 뉴럴 네트워크는 다중 EEG 파라미터들을 이용하여 몇 개의 그룹에서 약물을 분류하는 것을 습득하지만, 많은 최적해(optimal solution)를 가질 수 있고, 일부는, 학습 데이터(training data)의 표시 순서에 따르기도 한다. 반면, 다변수 통계분석은 학습 데이터의 풀이 동일한 만큼의 최적해를 제공할 수 있다.

판별식(discriminant)과 클러스터(cluster) 분석과 같은 대부분의 다변수 분석들에서, 분류해법(classification solution)은 감독(supervised)되는데, 즉 모든 학습 데이터의 카테고리는 사전에 제공되어야 한다 (Dimpfel W. Eur J Med Res, 2003; 8: 199-207). 따라서 분류해법은 학습 데이터로서 제공되는 표준 약물에 달려있다. 본 발명자들은 자연적인 수면-각성 상태의 모든 에폭의 EEG 파라미터들이 학습 데이터로서 가능한 모든 자연적인 뇌의 기능적 상태를 구성한다면 분류 규칙은 일정한 것으로 가정하였다.

본 발명에서, 모든 에폭들에서 EEG 주파수 밴드 파워(EEG frequency band powers)는 참조 공간(reference spaces) 상에 구성되는데, 자연적인 수면-각성 상태, 즉 약물 투여 전 기간(pre-drug period)을 포함하는, 학습 데이터로부터 얻은 EEG 주파수 밴드 파워를 이용하여 2차원 캐논 공간(canonical space)을 구성하였다. 이러한 구성(plot)을 확률분포(probability distribution)로 간주하였다. 다음으로, 2가지 새로운 통계방법, 중심간 거리(Mahalonobis distance, MD)와 분포 형상의 상이성(Hellinger distance, HD)은 서로 다른 클러스터들 사이의 거리를 측정하고 서로 다른 클러스터의 분포들 사이의 차이점을 측정하는 사용되었다.

본 발명은, EEG 주파수 밴드 파워를 계산하는 것에서 기록된 데이터의 부분집합(subsets)으로부터 참조 공간을 구성하는 것까지의 단계들을 설명함으로써 시험 데이터로서 수면-각성 상태를 갖는 참조 공간들의 판별 능력을 평가한다. 카페인-유도된 각성 효과는 수면-스코어링(sleep-scoring)으로 평가하였고 최선의 참조 공간에서 새로운 방법을 이용하여 얻은 것들과 비교하였다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 약물의 작용을 시간적 경과와 더불어 변화하는 기능적 뇌 상태의 집합으로 가정함으로써 임의의 기간 동안 이들 집합의 분포의 통계적 분석을 통하여 정량적인 상태를 평가할 수 있는, 뇌파 분석을 이용한 신경정신질환 치료 물질의 탐색 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 뇌파 분석을 이용한 신경정신질환 치료 물질의 탐색 방법을 제공한다:

a) 자연 수면-각성 상태의 뇌파(EEG)를 측정하는 단계;

b) 상기 측정된 뇌파의 스펙트럼 분석으로부터 참조 정량뇌파변수들을 생성하는 단계;

c) 상기 참조 정량뇌파변수들로부터 무감독 분류 분석(unsupervised classification analysis)으로 2~3개의 뇌파 변수를 추출하는 단계;

d) 상기 추출된 변수들로 2~3차원의 참조 공간(reference space)을 구축하는 단계;

e) 시험 물질을 투여한 후 측정된 뇌파를 스펙트럼 분석하여 얻은 시험 정량뇌파변수들을 상기 참조 공간에 투사하는 단계; 및

f) 상기 참조 공간상에서 참조 정량뇌파변수들의 분포와 시험 정량뇌파변수들의 분포를 정량적으로 비교분석하는 단계.

본 발명의 기술적 특징은, 뇌파(electroencephalography, EEG)를 측정한 후 뇌파를 스펙트럼 분석으로 다수의 정량뇌파변수(주파수 대역별 파워값)를 생성하고, 개체의 하루 동안 자연 수면-각성 주기에 따라 변동하는 뇌파를 10초씩 나누고, 각 10초 에폭이 그 시점의 특정 기능적 상태를 표현한다고 간주하여 주파수 대역별 파워의 무감독 분류 분석(unsupervised classification analysis)으로 2~3개 변수로 축소하여 2~3차원 상태 ‘참조공간’을 구축하고, 중추성 작용 물질에 의해 유발되는 뇌파 양상을 이 공간상에 투사하여 물질의 중추 효과를 평가할 수 있도록 하는 것이다.

본 발명의 방법에서, 상기 a)단계의 뇌파 측정은 두뇌의 다수 영역으로부터 측정될 수 있으나, 뇌파의 측정이 용이한 전두엽피질 또는 두정엽피질로부터 뇌파를 측정하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에서, 상기 b) 및 e)단계의 스펙트럼 분석은 측정된 뇌파(EEG) 신호를 10초 에폭(epochs)씩 잘라서 잡신호가 오염된 것을 제외하고 10초 에폭을 1초씩 중첩되도록 2초씩 잘라 Hanning-Window 처리하고 고속푸리에변환(Fast Fourier transform)으로 스펙트럼을 계산하는 것을 특징으로 한다.

상기 고속푸리에변환에 의한 스펙트럼 분석은 당업계에 잘 알려져 있는 분석방법으로서(Brigham E.O. The Fast Fourier Transform: Prentice Hall, 1973, pp1-304), 이를 통해 각 뇌파 신호에 대한 주파수별 파워 값을 구할 수 있다.

[식 1]

여기서, g(kT)는 시간 변역에서 변화 함수(에폭 뇌파신호), G(n/NT)는 주파수 변역에서 변화 함수(스펙트럼), T는 샘플링 간격, n은 주파수 지수, k는 데이터 지수, N은 샘플 수, f=n/NT는 주파수, t=kT는 시간이다. 상기 G(n/NT)값이 주파수별 파워값이 된다.

본 발명의 방법에서, 상기 b) 및 e)단계의 정량뇌파변수는 상기 스펙트럼의 에폭들로부터 계산된 주파수 대역별 상대적인 파워 값(frequency relative band power)인 것을 특징으로 한다.

이 때, 상기 스펙트럼으로부터 주파수를 대역별로 나누고 상기 대역 내 주파수의 파워를 더하여 대역별 파워값을 구하였다. 대역별 상대 파워 값은 대역별 파워를 총 파워값으로 나눈 값이다 (도 1의 Relative band power). 하기 식 2와 식 3을 통해 구할 수 있다.

[식 2]

여기서, G(f)는 주파수 변역에서 변화 함수(스펙트럼), f는 주파수, L은 대역의 낮은 주파수, H는 대역의 높은 주파수, S는 에폭의 크기(초), A는 대역(주파수 L부터 H까지)의 절대파워이다.

[식 3]

여기서, T는 총파워, N은 전체 대역의 최소 주파수, M은 전체 대역의 최고 주파수이다. 상대파워(R)는 A/T이다.

본 발명의 방법에서, 상기 c)단계의 무감독 분류 분석은 요인 분석(factor analysis)인 것을 특징으로 한다.

상기 요인 분석(factor analysis)는 드러나는 다수의 측정된 변수(다변수 데이터, 여기서 정량 뇌파변수 값들)는 서로 의존적으로 변화하고 이것들은 숨겨진 소수의 독립적인 요인(factors)의 선형 조합으로 기술될 수 있다고 보고 소수의 독립 요인으로 각 변수를 가장 잘 설명할 수 있는 선형 조합의 계수(loadings)를 찾는 모델링 방법이다 (Kleinbaum D.G et al. Factor Analysis. Duxbury Press, 1978. pp376-413). 구체적으로, 요인 분석은 다변수 데이터의 공분산 행렬이 다음과 같다고 가정하여 계산한다.

먼저 n개의 관찰(측정)을 갖는 p개 변수가 x₁, .., x_p가 있고, 각각의 평균이 μ₁, .., μ_p라고 할 때 x는 loadings L과 소수의 독립 요인 F으로 기술하는데 각 변수의 에러의 공분산을 추가하여 다음 식 4로 표현할 수 있다.

[식 4]

x_i - μ_i = l_i1F₁ + .. + l_ikF_k + ε_i

또는, 행렬로 표시하면

x - μ = LF + ε

여기서, x는 측정값으로 pn 행렬, μ는 각 변수의 분산의 대각선 행렬로 p개 값, L은 loadings(선형식의 계수)로 pk 행렬, F는 독립 요인으로 kn 행열이다. 요인 분석으로 L과 F를 계산할 수 있다.

상기 요인분석을 통해 계산된 L과 F로 부터 후술하는 방법으로 캐논 변수(canonical components or scores, 도 1에 나타난 C1 및 C2)를 구하고 이를 X,Y값으로 하여 2차원의 참조공간을 구축하였다.

종래 행동실험을 이용한 중추성 작용 물질의 검색 기술은, 특정 질환별 서로 다른 행동실험을 실시해야 하므로 수십 가지의 행동실험 배터리(battery)가 요구되었으며 그에 따라 동물, 시간, 인력이 과도하게 요구되는 문제가 있었다. 그러나 본 발명은, 모든 범주의 질환에 대해서 한 번의 뇌파 기록으로 중추성 작용 물질이 가지는 특정 질환에 대한 치료 효과를 찾아낼 수 있는 효율적인 검색 기술이다.

또한, 기존 뇌파를 이용한 중추성 작용 물질의 검색 기술은 기본 효과 약물의 기준 뇌파 패턴이 주어지는 감독 분류(supervised classification)로 기본 효과 약물의 구성에 따라 평가 규칙이 달라지므로 검색 결과가 달라질 수 있다. 이와 대조적으로 본 발명의 기술은 무감독 분류로 기본 효과 약물의 뇌파 패턴이 주어지는 대신 전반적으로 일관성을 가지는 자연 수면-각성 상태의 뇌파 패턴을 이용하는 무감독 분류(unsupervised classification)를 적용함으로써 평가 규칙의 일관성이 유지되므로 검색 결과가 일관성을 가진다.

상기 요인 분석은 알지 못하는 특성을 규명하기 위하여 변수들 간의 상호관계를 분석하여 상관이 높은 변수들을 묶어서 몇 개의 요인으로 규명하고 그 요인의 의미를 부여하는 통계방법이다. 본 발명에서는, 측정된 뇌파로부터 추출된 2~3개의 변수들을 요인으로 가정하여 무감독 분류에 적용하였다.

본 발명의 방법에서, 상기 e)단계의 참조 공간에의 투사는 캐논 상관분석(canonical correlation analysis)을 이용하는 것을 특징으로 한다.

상기 캐논 상관분석은 두 개의 독립 요인(F) 간의 상관성을 최적화 시켜주는 선형 조합을 발견하는 통계방법으로(Afifi A. et al. Canonical correlation analysis. CRC Press 2012. pp223-238), 유도된 캐논 변수(canonical components or scores, C1 및 C2) 값은 군 간 구분을 최대로 만들게 된다.

본 발명에서는 모든 동물에서 일관성을 가지는 자연 수면-각성 상태 뇌파(“참조 데이터”, 도 1의 REF data)로부터 계산된 정량뇌파변수(대역별 상대파워)를 요인 분석으로 처리하여 얻어진 요인들(이들은 평균이 0이고 분산이 1임)을 캐논 상관분석으로 처리하고 최적의 선형 조합의 계수, 즉, Eigenvector(E)를 구하였다(참조 공간). 약물 투여 후 야기된 뇌파(“시험 데이터”, 도 1의 TEST data)로부터 계산된 정량뇌파변수 값에 위 참조 데이터에서 구한 참조 공간을 구축하는 식의 계수(Loadings, L와 Eigenvector, E)를 곱하여 캐논 변수(canonical components or scores, C1 및 C2)를 구하고 이것을 이차원 평면(참조 공간)상에 투사하였다(시각적 판단이 가능한 차원인 2~3개 변수를 사용할 수 있음. 여기서는 2개 변수 사용, 즉, 2개 캐논 변수를 2차원 이차원 평면 상에 투사).

C = Xc * L * E,

여기서,

Xc는 TEST data에서 REF data의 평균을 뺀 값,

L은 요인 분석에서 얻어진 Loadings,

E는 캐논 상관분석에서 얻어진 Eigenvector.

도 1에 나타난 ‘Canonical score'는 각각의 10초 에폭에 해당하는 캐논 변수들을 이차원 평면(참조 공간) 상에 투사한 것으로, 무수히 많은 점들로 표시된다. 이렇게 표시된 점들의 군 간의 차이를 정량적으로 표시하기 위해 divergence analysis를 통해 약물에 의해 유도된 상태의 차이를 분석할 수 있다 (도 1의 하단 참조).

본 발명의 방법에서, 상기 f)단계에서 정량적 비교분석은 divergence analysis로 얻어진 중심간 거리 (McLachian G.J. Mahalanobis distance. Resonance 4 (1999), pp20-26) 또는 분포 형상의 상이성(Nikulin M.S. Hellinger distance. Encyclopaedia of mathematics, Springer-Verlag, Berlin (2002))으로 표시되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서, 상기 중심간 거리는 기준이 되는 어떤 위치에서부터 특정 기능적 상태의 투사의 중심(centroid)까지의 거리(distance 또는 Rho) 및 방향(Theta, 기준 위치를 중심으로 한 x-축에서 특정 상태의 위치의 방향을 반시계방향으로 잰 각도, radian)을 계산하고, 상기 분포 형상의 상이성은 기준이 되는 어떤 투사의 분포와 특정 기능적 상태의 투사의 분포의 상이성(dissimilarity)을 계산하는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 신경정신질환 치료 물질의 탐색 방법은, 공간상의 위치로 특정 기능적 뇌 상태를 정량적으로 비교하거나, 약물에 의해 유도된 상태의 차이와 시간적 경과를 알 수 있다. 따라서 신경정신질환 치료 약물의 효과적인 검색을 위해 전임상 시험에 응용될 수 있다. 평가 규칙의 일관성이 있으므로 평가 자동화가 가능하여 다수의 시스템으로 구성하면 중추신경계 신약 개발에서 고속대량스크리닝(high-throughput screening)이 가능할 것으로 기대된다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 신경정신질환 치료 물질의 탐색 방법은 종래 행동실험을 이용한 약물 탐색 방법과 달리 여러 가지 효과를 한 번에 측정가능하고, 감독 분류 방법과 달리 일관성 있는 분류 규칙을 유지해서 약물 효과의 탐색 결과의 일관성을 유지할 수 있다. 또한 동물, 시간, 인력 자원을 절약하고 동시에 여러 가지 효과를 비교할 수 있어서 효율적인 신약 후보 물질의 발굴이 가능하다. 뿐만 아니라, 뇌파는 동물 모델과 사람 간의 타당도(validity)가 높아서 전임상 시험 결과를 임상시험으로 연장하여 중추신경계 및 신경정신질환 치료 효과를 예측 비교할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 분석 단계들을 설명한다.
도 2의 (A)는 전두엽피질_감조 공간(REF_FC) 및 두정엽피질 참조 공간(REF_PC)에 대한 전두엽피질의 수면 각성 상태(FC Stgs) 및 두정엽피질의 수면 각성 상태(PC Stgs)에서 에폭의 산포도(Scatter plot)이고, (B)는 참조 공간에서 6개의 수면-각성 상태의 중심 사이의 거리(MD)의 평균 및 표준편차와 그들의 변동계수(CV)이고, (C)는 참조 공간의 기준위치로부터 모든 에폭의 중심의 MD이다.
도 3의 (A)는 서로 다른 참조 공간을 갖는 참조 공간에서 전두엽피질의 수면-각성 상태(FC Stgs) 및 두정엽피질의 수면 각성 상태(PC Stgs)에서 에폭, 즉 모든 에폭(REF), 각 피질(REF_FC 및 REF_PC)의 Stg1(REF_Stg1), Stg4(REF_Stg4), 또는 Stg6(REF_Stg6)의 에폭이고, (B)는 참조 공간에서 6개의 수면-각성 상태의 중심 사이의 거리(MD)의 평균 및 표준편차와 그들의 변동계수(CV)이고, (C)는 참조 공간의 기준위치로부터 모든 에폭의 중심의 MD이다.
도 4의 (A)는 전두엽 참조 공간(FEF_FC)과 두정엽피질 참조 공간(REF_PC)에서 전두엽피질의 에폭(FC Stgs)의 확률분포(probability distribution)이고 (B)는 두정엽피질의 에폭(PC Stgs)의 확률분포이다. (C)는 참조 공간에서 전두엽피질(FC Stgs)에 대한 6개의 수면-각성 상태의 투사 분포의 상이성(HD)의 평균 및 표준편차와 그들의 변동계수(CV)이다. (D)는 참조 공간에서 두정엽피질(PC Stgs)에 대한 6개의 수면-각성 상태의 투사 분포의 상이성(HD)의 평균 및 표준편차와 그들의 변동계수(CV)이다.
도 5의 (A)는 전두엽피질(REF_FC all, 1, 4, 및 6) 및 두정엽피질 참조 공간(REF_PC all, 1, 4, 및 6)의 집합(substes)의 참조 공간에서 전두엽피질의 에폭(FC Stgs)의 확률분포이고 (B)는 두정엽지필의 에폭(PC Stgs)의 확률분포이다. (C) 참조 공간에서 전두엽피질(FC Stgs)에 대한 6개의 수면-각성 상태의 HD의 평균 및 표준편차와 그들의 변동계수이다. (D) 참조 공간에서 두정엽피질(PC Stgs)에 대한 6개의 수면-각성 상태의 HD의 평균 및 표준편차와 그들의 변동계수이다.
도 6은 카페인 투여 후 시간이 흐름에 따라 종래의 수면 스코어링과 theta, rho, HD로 수면-각성 상태의 기간을 평가한 것이다. (A1)은 Stg1. (A2)는 Stg4. (B1과 B2)는 전두엽피질 참조 공간 및 두정엽피질 참조 공간에서의 theta이다. (C1과 C2)는 전두엽피질 참조 공간 및 두정엽피질 참조 공간에서의 MD이다. (D1과 D2)는 전두엽피질 참조 공간 및 두정엽피질 참조 공간에서의 HD이다.
도 7은 전두엽피질 참조 공간에서의 theta, MD 및 HD 사이의 상관관계와, Stg1 및 Stg4이다.
도 8은 두정엽피질 참조 공간에서의 theta, MD 및 HD 사이의 상관관계와, Stg1 및 Stg4이다.
도 9는 참조 공간에서 카페인 효과의 2차원 표현이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실험방법 1. 실험동물의 관리 및 수술

1) 동물

몸무게 250-300 g의 22개월 수컷 쥐(Sprague-Dawley rats: Samtaco, Osan, Korea)를 사용하였다. 2마리는 수술 전 플라스틱 케이지(28×42×18 cm)에서 사육하였고, 동물들은 수술 후 개별적으로 사육하였다. 동물들은 통제된 환경에서 다음의 실험을 통해 사육하였다: EEG 기록 시를 제외하고, 임의로 사용가능한 상업적 먹이와 물로, 21~24℃ 주변 온도, 12:12 시간 낮-밤 사이클(7:00에서 19:00까지 낮). 실험은 실험동물의 관리와 사용에 관한 지침의 국제위원회에 따라 수행하였다. 획득한 일부 데이터는 다른 연구에 발표된 바 있다 (Kwon DH, et al., J Korean Soc Biol Ther Psychiatry, 2006; 12: 252-67).

2) 수술

수술 과정은 예비 실험에 사용된 것과 유사하게 진행하였다 (Kwon DH, et al., J Korean Soc Biol Ther Psychiatry, 2006; 12: 252-67.). 간단히 설명하면, 쥐를 케타민(ketamine, 75 mg/kg, i.p.)과 자일라진(xylazine, 5 mg/kg, i.p.)의 혼합물로 마취시키고 추가적인 혼합물로 유지시켰다. 동물을 스테레오택식 프레임(stereotaxic frame)에 위치시켰다. 4개의 스테인리스 스틸 스크류(tip diameter ~1.0 mm)를 EEG 기록을 위해 전두골(frontal)(+/-2.5 mm lateral to midline and 2.5 mm anterior to the bregma) 및 두정골(parietal)(+/-2.5 mm lateral to midline and 5.0 mm posterior to the bregma)에 찔러 넣었고, 2개의 스크류를 참조 및 접지 전극(reference and ground electrodes)으로서 두정간골(interparietal bone)에 각각 찔러 넣었다. 2개의 테프론-코팅된 실버 와이어(silver wire)를 EMG 기록을 위해 삽입하였다. 연결핀을 가진 상기 전극들을 3×2 배열로 가지런히 놓고 두개골을 치과용 시멘트로 깊이 넣었다.

실험방법 2. 뇌파(EEG) 기록

쥐들은 수술 후 최소 2일의 회복시간이 주어졌으며 기록 하루 전 기록 챔버에서 순응시켰다. 기록 당일, 쥐들을 기록 챔버에 위치시키고 10:00 이전에 회전 고리(swivel)가 부착된 연결 케이블을 연결하였으며 EEG 신호는 10:30에서 17:30까지 계속 기록하였다. 13:20-13:30에 식염수 또는 카페인 (1.5, 3, 7.5, 15 및 30 mg/kg)을 쥐들에게 복강 내로 주사하였다. 참조 전극에 대해서는 4개의 신호를 전두엽피질 및 두정엽피질로부터 기록하였다. 상기 신호들을 프리앰프(preamplifier: Model 1700, A-M Systems Inc., USA) 및 앰프(amplifier: CyberAmp 380, Axon Instruments Inc., USA)에 입력하여, 10,000배 증폭한 후 0.5 Hz 고역필터(high-pass filter) 및 60 Hz 저역필터(low-pass filter)로 필터링하였다. 신호들은 200 Hz의 샘플링 레이트(sampling rate)에서 데이터 획득 장치(data acquisition board: DigiData 1200A, Axon Instruments Inc., USA, or DAQ Pad, National Instruments Inc., USA)를 이용하여 PC에 저장하였다.

실험방법 3. 데이터 분석

데이터 분석의 흐름도는 도 1에 도시되어 있다. EEG 스펙트럼 분석은 공지된 방법에 따라 구성하였다 (Lee M-G, et al., Experimental neurology, 2011; 20). 간단히 설명하면, 로(raw) EEG 신호들은 분석 전 육안으로 검토하여 아티팩트(artifacts)가 있는 10-초 EEG 에폭들은 분석에서 제외시켰다. 10-초 에폭을 (1-초씩 중첩되도록) 2초씩 잘라 Hanning-window 처리하고 고속푸리에변환(fast Fourier transform, FFT)을 사용하여 파워 스펙트럼을 계산하고 이것을 평균하여 10초 에폭에 대응하는 한 개의 스펙트럼으로 계산하였다. 상기 스펙트럼을 7개의 주파수 밴드에 할당하였다: low delta, 0.5~2.0 (1 or D1); high delta, 2.5~4.0 (2 or D2); low theta, 4.5~5.5 (3 or T1); high theta, 6.0~8.0 (4 or T2); alpha, 8.5~12.0 (5 or AL); beta, 12.5~24.5 (6 or BE); and gamma, 25~49.5 Hz (7 or GA). 상대적인 밴드 파워(relative band powers)는 총 파워값(total power)에 대한 7개 주파수 밴드의 파워 값의 비를 나타낸다.

모든 쥐들로부터 얻은 10:30-13:00 사이 기록된 뇌파에서 수면-각성 상태의 모든 에폭 또는 일부 에폭에 대한 7개의 상대적인 밴드 파워는 요인분석(factor analysis) 및 캐논 상관분석(canonical correlation analysis)을 위한 입력 데이터(input data)로서 사용되어 ‘참조 공간’이라고 불리는 2차원 캐논 공간을 구성하였다. 변수(variables)와 고유벡터(eigenvectors)의 요인 적재량(factor loading)은 시험 데이터의 에폭에 대한 캐논 스코어를 계산하는데 사용되었다. 10:30-13:00 사이의 수면-각성 상태의 모든 전두엽피질(FC Stgs) 또는 두정엽피질(PC Stgs) EGG 에폭들은 상기 참조 공간에 투사되었다. 분포(distributions) 및 위치(locations)와 같은, 클러스터들의 디버전스(Divergence) 측정은, 참조 공간의 상태-판별 능력을 평가하기 위해 비교되었다. 참조 공간에서 위치는 2가지 파라미터를 이용하여 설명된다: 중심간 거리(Mahalanobis distance, MD) (McLachlan GJ. Mahalanobis distance. Resonance, 1999; June 20-6) 및 방향(Theta). MD는 참조 공간에서 2개의 위치 사이의 거리이고 Theta는 참조공간에서 기준 위치를 중심으로 한 x-축에서 특정 상태의 위치의 방향을 반시계방향으로 잰 각도이다. 분포는 투사 분포간의 상이성(Hellinger distances, HD)을 이용하여 비교하였다 (Nikulin MS. Encyclopaedia of Mathematics. Springer-Verlag: Berlin, 2002). HD는 캐논 공간에 투사된 EEG 에폭들의 확률분포 사이의 상이성(dissimilarity)을 정량하는데 사용된다. 모든 계산은 맞춤 제작한 프로그램 및 MatLab (MathWorks Inc., Natick, MA, USA)를 사용하여 수행되었다.

약물 처리 후 얻은 4시간 기록은 8개의 30분 구간(B1에서 B8)에 할당되었고, 30분 구간의 EEG 에폭은 2개의 피질 참조 공간에 투사되었다. 클러스터들의 디버전스 측정은 카페인-각성 효과를 평가하기 위해 비교하였다.

실험방법 4. 통계 분석

참조 공간에서 MD, Theta 및 HD와 같은, 디버전스 측정 사이의 차이점은 ANOVA 및 post-hoc Tukey test를 사용하여 비교하였다. 디버전스 측정의 변동계수(Coefficients of variation)로 계산하였다. 수면 파라미터와 디버전스 측정 사이의 피어슨 상관계수(Pearson’s correlation coefficient)로도 계산하였다.

실험결과.

몇 개의 참조 공간은 다양한 데이터 집합으로부터 구성하였다. 첫째, 전두엽피질과 두정엽피질의 2개의 서로 다른 피질 EEG 데이터 세트로부터 형성된 2개의 참조 공간을 비교하였다. 둘째, 활성 각성 상태(active wake state), 서파수면 상태(slow-wave sleep state), 역설수면 상태(paradoxical sleep state) 또는 모든 상태의 데이터 집합으로부터 4개의 서로 다른 참조 공간을 비교하였다. 참조 공간들의 상태-판별 능력을 평가하기 위해, 수면-각성 상태들의 디버전스 측정을 사용하였다. 마지막으로, 카페인의 용량(dose)- 및 시간(time)-의존 각성 상태를 평가하기 위해, 카페인 처리 후 30분 구간의 디버전스 측정들을 비교하였다.

실험결과 1. 2개의 서로 다른 피질 참조 공간에서 상태 클러스터들의 중심간 거리( MD )의 비교

전두엽피질 참조 공간(REF_FC) 및 두정엽피질 참조 공간(REF_PC)을 전두엽피질 EEG 및 두정엽피질 EEG 데이터로부터 전처리 기간 동안 각각 구성하였다. 각 수면-각성 상태의 전두엽피질 EEG 에폭(FC Stgs) 또는 두정엽피질 EEG 에폭(PC Stgs) 중 하나를 전두엽피질 공간(REF_FC)에 작성하였다 (도 2의 A 상부 패널). 또한 이를 두정엽피질 공간(RFE_PC)에 작성하였다 (도 2의 A 하부 패널).

전두엽피질 공간(REF FC)에 전두엽피질 EEG 에폭(FC Stgs)의 투사 및 두정엽피질 공간(REF PC)에 두정엽피질 EEG 에폭(PC Stgs)의 투사 둘 다는 각 참조 공간에 2차원으로 잘 분포되었다 (도 2의 A의 1 및 4). 모든 에폭의 중심(centroids)은 각 공간의 기준(origin)에 위치하였다 (도 2의 C). 반면, 두정엽피질 공간(REF PC)에 전두엽피질 EEG 에폭(FC Stgs)의 투사 및 전두엽피질 공간(REF FC)에 두정엽 EEG 에폭(PC Stgs)의 투사 둘 다는 각 참조 공간에 1차원으로 분포되었다 (도 2의 A의 2 및 3). 또한 모든 에폭의 중심은 각 참조 공간의 기준 위치에서 벗어나 있었다 (도 2의 C). 이러한 결과는 동일한 피질 참조 공간에 대한 EEG 에폭의 투사가 잘 분포되고 (즉, 효과적인 공간 분포(spatial distribution)) 서로 다른 피질 참조 공간에 대한 투사에 비해 벗어나지 않는 것을 나타낸다.

각 수면-각성 상태의 EEG 에폭의 투사는 참조 공간에서 클러스터(cluster)를 형성하였다 (도 2의 A). 전두엽피질 참조 공간(REF FC)에서 동일한 전두엽피질 EEG(FC Stgs)의 클러스터 사이의 평균 MD는 다른 피질 (두정엽) 참조 공간(REF PC)에서 보다 현저히 더 컸다 (p=0.042). 또한 전두엽피질 참조 공간(REF FC)에서 다른 피질 (두정엽) EEG(PC Stgs)의 클러스터 사이의 평균 MD는 동일한 두정엽피질 참조 공간(REF PC)에서의 그것 보다 큰 경향을 보였다 (p=0.237) (도 2B의 상부). 반면, 거리들의 변동성(variability)(변동계수 = 표준편차를 평균으로 나눔)은 에폭이 서로 다른 피질 참조 공간에 투사될 때 보다 동일한 피질 참조 공간에 투사될 때 작아지는 경향을 보였다 (도 2의 B 하부). 이러한 결과는 상태-판별 능력이 에폭들이 동일한 피질 참조 공간에 투사되는 경우에 더 좋아짐을 나타낸다.

실험결과 2. 4개의 서로 다른 상태 참조 공간에서 상태 클러스터의 거리( MD )의 비교

각 수면-각성 상태의 EEG 에폭(FC Stgs 또는 PC Stgs)이 모든 에폭 참조 공간(REF)에 투사될 때, 모든 투사의 중심은 각 참조 공간의 기준위치(origin)에 있다 (도 3의 A REF 및 도 3의 C). 반면, EEG 에폭(FC Stgs 또는 PC Stgs)이 상태-특이적 참조 공간(REF Stg1, Stg4 및 Stg6)에 투여될 때, 모든 투사의 중심은 기준위치에서 벗어나 있었다 (도 3의 A REF Stg1, Stg4, Stg6 및 도 3의 C). 이는 모든 에폭 참조 공간에 대한 피질 EEG의 투사가 벗어나 있지 않음을 나타낸다.

각 피질 EEG의 4개의 참조 공간에서 수면-각성 상태의 클러스터의 거리(MD)의 평균 및 변동계수를 비교하였다 (도 3). 참조 공간(REF all, Stg1, Stg4 및 Stg6)에서 수면-각성 상태의 전두엽피질 EEG 에폭(FC Stgs)의 거리(MD)의 ANOVA 분석은 큰 차이는 없었다 (p=0.848)(도 3의 B 상부). 그러나 변동계수는 다른 상태-특이적 참조 공간(REF Stg1, Stg4 및 Stg6) 보다 모든 에폭 참조 공간(REF)이 더 작았다. 참조 공간에서 수면-각성 상태의 두정엽 EEG 에폭(PC Stgs)의 거리의 ANOVA 분석은 별다른 경향성을 나타내지 않았다 (p=0.083)(도 3의 B 상부). 변동계수는 다른 상태-특이적 참조 공간에서 보다 모든 에폭 참조 공간에서 더 작았다. 이는 수면-각성 상태가 다른 상태-특이적 참조 공간 보다 모든 에폭 참조 공간에 투사될 때 상태 구별(state differentiation)이 더 잘됨을 나타낸다.

실험결과 3. 2개의 서로 다른 피질 참조 공간에서 상태 클러스터의 상이성( HD ) 사이의 비교

수면-각성 상태의 전두엽피질 EEG 에폭(FC Stgs)의 클러스터 사이의 상이성(HD)은 두정엽피질 참조 공간(REF PC) 보다 전두엽피질 참조 공간(REF FC)에 투사될 때 더 컸다 (p=0.063)(도 4의 A 왼쪽 패널 및 도 4의 C). 두정엽피질 EEG 에폭(PC Stgs)에 대한, 상이성(HD)의 ANOVA 분석은 큰 차이를 나타내지 않았다 (도 4의 A 우? 패널 및 도 4의 D)(p=0.907). 변동계수는 EEG 에폭이 동일한 피질 참조 공간에 투사될 때 더 작았으며 (도 4의 C 및 D), 이는 전두엽피질 EEG 에폭(FC Stgs)이 전두엽피질 참조 공간(REF FC)에 투사될 때 더 두드러졌다. 이러한 결과는 전두엽피질 EEG의 스펙트럼 프로파일이 수면-각성 상태와 함께 변화한다는 것을 나타낸다.

실험결과 4. 4개의 서로 다른 집합 참조 공간에서 상태 클러스터의 상이성( HD ) 비교

수면-각성 상태의 EEG 에폭은 각 피질에 대한 4개의 각각의 참조 공간에 작성하였다. 수면-각성 상태 사이의 상이성(HD)의 ANOVA 분석은 큰 차이가 없는 것으로 나타났고 (p=0.127 for frontal EEG epochs and p=0.995 for parietal EEG epochs) 변동계수는 모든 에폭 참조 공간에 투사될 때 더 작았다 (도 5의 C와 D). 변동계수는 전두엽피질 EEG 에폭이 모든 에폭 참조 공간에 투사될 때 더 작았다. 이러한 결과는 전두엽피질 EEG 에폭이 모든 에폭 참조 공간에 투사될 때 수면-각성 상태가 잘 구별됨을 나타낸다.

실험결과 5. 카페인 투여 후 수면 파라미터 및 디버전스 가변성의 시간적 경과

본 발명자들은 새로운 디버전스 측정의 시간적 경과(Temporal trends), 즉 참조 공간에서 순차적인 30분 구간의 상이성(HD)과 위치(MD 및 Theta)를 시험하여, 카페인-유도된 각성의 시간적 변화를 나타낼 수 있는지를 확인하였다.

각성기간(aW duration)은 증가되었고 (F(6,48)=82.019, p=0.000) 서파수면기간(SWS duration)은 감소되었으며 (F(6,48)=70.362, p=0.000), 그 효과는 시간에 따라 감소하였다 (aW duration: F(8,48)=10.365, p=0.000; SWS duration: F(8,48)=9.143, p=0.000)(도 6의 A).

또한 전두엽피질 EEG의 Theta는 반시계 방향으로 용량-의존적으로 증가하였고 (F(6,48)=14.186, p=0.000) 카페인 투여 후 시간에 의존하여 회복하였으며, 반면 두정엽 EEG의 theta는 카페인 투여 후 반시계 방향으로 변화하였으나 비처리 대조군에서는 시계방향으로 변화하였다 (F(6,48)=9.594, p=0.000) without time dependence (F(8,48)=1.001, p=0.431)(도 6의 B). 전두엽피질 및 두정엽피질 EEG의 거리(MD)는 카페인 투여 후 용량 의존적으로 증가하였고 (전두엽피질 EEG: F(6,48)=26.345, p=0.000; 두정엽피질 EEG: F(6,48)=26.797, p=0.000) 시간에 의존하여 (전두엽피질 EEG: F(8,48)=27.298, p=0.000; 두정엽피질 EEG: F(8,48)=26.280, p=0.000) 증가하였다 (도 6의 C). 전두엽피질 및 두정엽피질 EEG 둘 다의 상이성(HD)은 용량 의존적으로 증가하였고 (전두엽피질 EEG: F(6,48)=68.334, p=0.000; 두정엽피질 EEG: F(6, 48)=69.647, p=0.000) 시간에 의존하여 증가하였다 (전두엽피질 EEG: F(8, 48)=30.155, p=0.000; 두정엽피질 EEG: F(8, 48)=26.287, p=0.000)(도 6의 D).

실험결과 6. 수면 파라미터 및 디버전스 가변성 사이의 상관관계

이에 더하여, 종래의 수면 파라미터와 신규한 디버전스 측정 사이의 상관관계를 시험하였다. 모든 디버전스 측정은 각성기간 (도 7) 및 서퍼수면기간 (도 8)과 높은 관련이 있다.

각성기간에 대한 전두엽피질 및 두정엽피질 EEG의 Theta의 변동계수는 각각 0.79 (p<0.001) 및 -0.51 (p<0.001)이고 (도 7의 A), 각성기간에 대한 전두엽피질 및 두정엽피질 EEG의 거리(MD)의 상관계수(correlation coefficients)는 각각 0.75 (p<0.001) 및 0.83 (p=0.000)이다 (도 7의 B). 각성기간에 대한 전두엽피질 및 두정엽피질 EEG의 상이성(HD)의 상관계수는 각각 0.92 (p=0.000) 및 0.88 (p=0.000)이다 (도 7의 C).

전두엽피질 및 두정엽피질 EEG의 Theta와 서파수면기간 사이의 상관계수는 각각 - 0.82 (p<0.001) 및 0.47 (p<0.001)이다 (도 8의 A). 전두엽피질 및 두정엽피질 EEG와 서파수면기간 사이의 상관계수는 각각 -0.77 (p=0.001) 및 -0.84 (p<0.001)이고 (도 8의 B), 전두엽피질 및 두정엽피질 EEG의 상이성(HD)과 서파수면기간 사이의 상관계수는 각각 -0.90 (p<0.001) 및 -0.87 (p<0.001)이다 (도 8의 C). 상이성(HD)은 3가지 측정 중 가장 높은 상관계수를 가지는데, 이는 약물 효과를 평가할 때 수면 파라미터를 대체하는 새로운 측정으로서의 이용 가능성을 의미한다.

실험결과 7. 카페인 효과에 대한 2차원적 표현

신규한 디버전스 측정과 종래의 수면 파라미터들 사이의 단순한 상관관계 외에도, 피질 참조 공간에 카페인 투여 후 EEG 에폭의 투사의 궤적(trajectories)을 서로 다른 투여 용량에서 서로 다른 선(traces)을 나타내었다 (도 9). 비이클 처리(vehicle treatment) 후 궤적은 기준위치(origin)에서 전두엽피질 참조 공간의 상부-우측 4분면으로 약간 움직였고, 기준위치로부터 두정엽 참조 공간의 상부-좌측 방향으로 움직였다 (도 9의 A1 및 B1). 1.5 mg/kg 카페인 투여 후 첫 30분 구간의 중심은 공간에서 기준위치에서 왼쪽에 위치한 다음 전두엽피질 참조 공간에서 기준위치 근처로 이동하였고 (도 9의 A2), 하부-좌측 방향으로 위치한 후 두정엽피질 참조 공간에서 기준위치 근처로 이동하였다 (도 9의 B2). 7.5 mg/kg 카페인 투여 후 첫 30분 구간의 중심은 각성(aW) 에폭의 중심에 대해 상부-좌측에 위치한 다음 전두엽 참조 공간의 기준 위치로 돌아갔고 (도 9의 A3) 각성 에폭의 중심 근처 좌측-하부에 위치한 다음 두정엽 참조 공간의 기준위치로 돌아갔다 (도 9의 B3). 고용량(30 mg/kg)의 카페인 투여 후 30분 구간의 중심은 각성 에폭의 중심에 대해 상부-좌측에 위치한 다음 이 위치를 유지하였고 (도 9의 A4), 각성의 중심 근처 좌측-하부에 위치한 후 역시 이 위치를 유지하였다 (도 9의 B4). 참조 공간에서의 위치가 카페인에 의해 유도된 집합기능상태(collective function state)를 나타낼 것이라는 예상대로, 상기 궤적은 용량-의존적 방법의 시간과 관련이 있고, 이는 거리(MD) 및 Theta가 시간이 지남에 따른 카페인 효과 설명할 수 있음을 의미한다.

결과해석

본 발명에서, 요인분석(factor analysis) - 데이터정리 기법에 의한 7개의 상대적인 밴드 파워(relative bands)에서 얻은 2개의 캐논 구성요소(canonical components)로 2차원 공간을 구성하였다. 이러한 2차원 캐논 공간은 수면-각성 상태의 에폭들이 투사되는 참조 공간으로 사용되었다. EEG 데이터의 서로 다른 집합(sets)들은 서로 다른 참조 공간을 구성하는데 사용되었다. 첫째, 본 발명자들은 피질 참조 공간 보다 동일한 피질 참조 공간이 피질 EEG의 수면-각성 상태를 구별하는데 더 적절함을 확인하였다. 둘째, 데이터 집합(subsets)으로부터 구성된 참조 공간 보다 전체 에폭(full epochs)들로부터 구성된 참조 공간이 피질 EEG의 수면-각성 상태를 구별하는데 더 적절함을 확인하였다. 셋째, 디버전스 측정이 카페인 투여 후, 종래의 수면 파라미터, 각성기간(aW duration) 및 서파수면기간(SWS duration)과 높은 관련이 있고 카페인의 용량-의존적 효과에 대한 시간적 추이(temporal trends)를 나타낼 수 있음을 확인하였다.

중심간 거리(Mahalanobis distance)는 참조 공간에 분포된 클러스터들 사이를 설명하는데 사용되어온 (Lee M-G, et al., Experimental neurology, 2011; 20) 반면, 투사 분포간의 거리(Hellinger distance)는 분포들 사이의 상이성(dissimilarities)을 설명하는데 사용될 수 있다 (Derpanis KG. The Bhattacharyya measure. http://www.cse.yorku.ca/~kosta/, 2008). 본 발명에서, 전두엽피질 또는 두정엽피질 EEG의 수면-각성 상태의 클러스터들은 피질 EEG가 서로 다른 참조 공간에 투사될 때 보다 동일한 참조 공간에 투사될 때 더 잘 구별된다는 것을 확인하였다. 참조 공간에서 상태들 사이의 상대적인 거리는 투사된 참조 공간에 달려있는 것으로 확인되었다. 이는 하나의 피질 EEG의 상태가 다른 피질의 상태와 구별됨을 의미한다. EEG 스펙트럼은 피질들 사이의 차이를 프로파일링한다. 수동 및 자동 수면 스코어링은 기록 부위(recording site)에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있고 (Fang G, et al., Physiological measurement, 2009; 30: 589-601), 이와 일치하여, 본 발명의 결과는 전두엽피질 참조 공간에서 전두엽피질 EEG에 의한 구별이 두정엽 참조 공간에서 두정엽 EEG에 의한 구별 보다 더 좋음을 보여준다. 유사하게, 상이성의 CV는 전두엽피질 EEG가 다른 두정엽 참조 공간 보다 동일한 참조 공간에 투사될 때 더 낮았으나, 두정엽피질 EEG가 투사될 때는 뚜렷한 차이가 있지는 않았다. 이러한 결과는 참조 공간이 시험 데이터의 집합과 유사한 스펙트럼 특성의 데이터 집합으로부터 구성될 때 디버전스 측정이 상태들을 잘 구별함을 의미한다.

본 발명자들은 전체 데이터 세트 및 데이터 서브세트(subsets)로부터 구성된 참조 공간을 이용하여 6개의 수면-각성 상태를 시험하였다. 디버전스 측정의 CV에 의해 나타나는 것과 같이, 수면-각성 상태의 클러스터들은 전체 데이터 참조 공간에 투사되는 경우 잘 구분되었다. 이러한 결과는 참조 공간이 수면-각성 상태의 가능한 모든 스펙트럼 특성으로 구성될 때 디버전스 측정이 상태들을 잘 구별함을 의미한다.

이전 연구에서, 각성기간(wake duration) 및 서파수면기간(slow-wave sleep duration)과 같은, 수면 파라미터들을 평가함으로써, 카페인이 용량-의존적 및 시간-의존적으로 각성을 유도함을 확인하였다 (Kwon DH, et al., J Korean Soc Biol Ther Psychiatry, 2006; 12: 252-67). 본 발명에서는, 디버전스 측정과 수면 파라미터들 사이의 높은 상관계수로 알 수 있듯이, 중심간 거리 및 투사 분포 형상의 상이성과 같은, 디버전스 측정이 카페인의 효과를 평가하는데 사용될 수 있음을 확인하였다. 특히, 전두엽피질 EEG의 투사 분포 형상의 상이성은 높은 상관관계를 보여준다. 이는 전두엽피질 EEG가 두정엽피질 EEG 보다 수면-각성 상태에 관한 더 많은 정보를 포함한다는 것을 의미한다.

또한, 참조 공간에 카페인 투여 후 EEG 구간의 클러스터 위치는 대조군 클러스터(control cluster)에서의 거리 뿐 아니라 방향지수(directional index)인, Theta를 제공한다. 공간에서 2개의 클러스터가 기준위치로부터 동일한 거리에 위치해 있더라도, Theta로 나타나는 것처럼, 글러스터들은 2차원 참조 공간에서 서로 다른 위치일 수 있다. 따라서 시간 의존적 효과의 궤적은 크기와 방향으로 지시되는 상태의 시간적 변화를 나타낼 수 있다 (Lee M-G, et al., Experimental neurology, 2011; 20). 약물동력학(pharmacokinetics)을 고려하면, 궤적은 EEG에 의한 약물 히스테리시스 효과(hysteresis effect)를 보여줄 수 있다 (Lee M-G, et al., Experimental neurology, 2011; 20). 그러나 카페인은 본 발명에서 히스테리시스를 명확히 나타내지 않았다.

참조공간에서 평가된 카페인 투여 후 모든 30분 구간들이 일관성이 있다고 여기지지는 않았지만, 본 발명자들은 몇 개의 서로 다른 상태를 포함하는 하나의 집합적 상태로 상기 구간을 간주하였다. 사실, 약물들이 자연적으로 상태 변화 및 각성 변동(vigilance fluctuate)을 유발하기 때문에 어느 정도 기간에 걸쳐서 일관성 있는 상태(steady state)의 유지는 불가능한 것으로 잘 알려져 있다 (Lee MG. J Appl Pharmacol, 1999; 7: 242-8). 따라서 그 당시 약물 상태로서 집합적 상태의 고려는 EEG에 의한 카페인 효과를 평가하는데 사용될 수 있다. 각성 효과가 수면 연구 시 각성 또는 수면 기간에 의해 평가될 수 있기 때문에, 본 발명은 카페인과 같은 약물의 효과가 디버전스 측정을 이용하여 평가될 수 있음을 보여준다. 본 발명자의 이전 연구에서, 피소스티그민(physostigmine)과 요힘빈(yohimbine)의 효과는 참조 공간에서 디버전스 측정을 이용하여 객관적으로 평가하여 비교되었다 (Lee M-G, et al., Experimental neurology, 2011; 20). 유사한 측정들이 약물뇌파검사 연구 분야에서 중추신경계에 대한 약물 효과를 구별하는데 적용되어 왔다 (Herrmann WM, et al., Pharmacopsychiatry, 1991; 24: 196-205). 또한, 판별분석(discriminant analysis) 및 클러스터 분석(cluster analysis)과 같은, 감독된 다변수분석방법(supervised multivariate analysis)은 이전 연구에서 사용되어 왔다 (Dimpfel W. Eur J Med Res, 2003; 8: 199-207). 약물 효과의 분류는 예정된(predetermined) 카테고리에 의존한다. 자동 수면 스코어링 동안, 상태들은 특이적 상태를 나타내는 학습 데이터로 감독된 분석에 의해 구성된 상태 공간에서도 분류된다 (Gross BA, et al., J Neurosci Methods, 2009; 184: 10-8). 그 때, 스코어링은 학습 분류에 대한 데이터에 의존한다. 반면, 본 발명자들은 전체 데이터(pooled data)를 이용하여 요인 분석과 같은, 무감독 분석(unsupervised analysis)을 사용하였다. 전체 데이터가 기록들 사이 및 동물들 사이에서 변하지 않는다고 가정한다면, 상태 공간은 모든 가능한 상태들을 포함한다. 더욱이, 처리 후 데이터가 공간에 투사된다면 처리 군들 사이에서 비교 연구가 가능하고 시간에 따른 데이터가 공간에 투사된다면 종단 연구(longitudinal study)가 가능한 것으로 생각된다.

결론적으로, 참조 공간이 모든 가능한 프로파일로 구성된 전체 데이터로부터 구성될 때, 그 참조 공간은 동일한 피질 기원으로부터 비롯되고, 수면-각성 상태 또는 약물 효과의 평가는 효과적이다. 카페인의 효과에서 나타난 것처럼, 약물 효과는 1차원 대신 2차원 또는 그 이상의 차원적으로 평가될 수 있고, 이는 서로 다른 각성 메커니즘을 가진 약물들이 객관적으로 비교될 수 있게 한다. 따라서 본 발명은 2가지 신규한 통계적 방법이 뇌 기능 상태 및 약물 유도 상태를 객관적으로 설명할 수 있음을 제안한다.

Claims

하기 단계들을 포함하는 뇌파 분석을 이용한 신경정신질환 치료 물질의 탐색 방법:
a) 자연 수면-각성 상태의 뇌파(EEG)를 측정하는 단계;
b) 상기 측정된 뇌파의 스펙트럼 분석으로부터 참조 정량뇌파변수들을 생성하는 단계;
c) 상기 참조 정량뇌파변수들로부터 무감독 분류 분석(unsupervised classification analysis)으로 2~3개의 뇌파 변수를 추출하는 단계;
d) 상기 추출된 변수들로 2~3차원의 참조 공간(reference space)을 구축하는 단계;
e) 시험 물질을 투여한 후 측정된 뇌파를 스펙트럼 분석하여 얻은 시험 정량뇌파변수들을 상기 참조 공간에 투사하는 단계; 및
f) 상기 참조 공간상에서 참조 정량뇌파변수들의 분포와 시험 정량뇌파변수들의 분포를 정량적으로 비교분석하는 단계.
제 1항에 있어서, 상기 a)단계의 뇌파 측정은 전두엽피질 또는 두정엽피질로부터 뇌파를 측정하는 것을 특징으로 하는 신경정신질환 치료 물질의 탐색 방법.
제 1항에 있어서, 상기 b) 및 e)단계의 스펙트럼 분석은 뇌파 신호를 고속 푸리에 변환(Fast Fourier transform)으로 계산되는 것을 특징으로 하는 신경정신질환 치료 물질의 탐색 방법.
제 1항에 있어서, 상기 b) 및 e)단계의 정량뇌파변수는 상기 스펙트럼의 에폭들로부터 계산된 대역별 파워 값인 것을 특징으로 하는 신경정신질환 치료 물질의 탐색 방법.
제 1항에 있어서, 상기 c)단계의 무감독 분류 분석은 요인 분석(factor analysis)인 것을 특징으로 하는 신경정신질환 치료 물질의 탐색 방법.
제 1항에 있어서, 상기 e)단계의 참조 공간에의 투사는 캐논 상관분석(canonical correlation analysis)을 이용하는 것을 특징으로 하는 신경정신질환 치료 물질의 탐색 방법.
제 1항에 있어서, 상기 f)단계에서 정량적 비교분석은 중심간 거리 (Mahalanobis distance) 또는 분포 형상의 상이성(Hellinger dissimilarity)으로 표시되는 것을 특징으로 하는 신경정신질환 치료 물질의 탐색 방법.
제 7항에 있어서, 상기 중심간 거리는 기준이 되는 어떤 위치에서부터 특정 기능적 상태의 투사의 중심(centroid)까지의 거리(distance 또는 Rho) 및 방향(Theta, 기준 위치를 중심으로 한 x-축에서 특정 상태의 위치의 방향을 반시계방향으로 잰 각도, radian)을 계산하고, 상기 분포 형상의 상이성은 기준이 되는 어떤 투사의 분포와 특정 기능적 상태의 투사의 분포의 상이성(dissimilarity)을 계산하는 것을 특징으로 하는 신경정신질환 치료 물질의 탐색 방법.
제 1항에 있어서, 공간상의 위치로 특정 기능적 뇌 상태를 정량적으로 비교할 수 있고, 약물에 의해 유도된 상태의 차이와 시간적 경과를 알 수 있는 것을 특징으로 하는 신경정신질환 치료 물질의 탐색 방법.