KR101344012B1 - Separation method of tacrolimus and ascomycin using simulated moving bed chromatography - Google Patents
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Abstract
본 발명은 모사이동층 크로마토그래피를 이용하여 타크로리무스와 아스코마이신의 혼합액으로부터 타크로리무스를 분리하는 방법에 관한 것으로, 상세하게는 흡착칼럼 내의 흡착수지(resin)에 대한 타크로리무스와 아스코마이신의 흡착률 각각을 계산하는 단계(단계 1); 상기 단계 1에서 계산된 흡착률을 삼각형 이론에 적용하여 모사이동층(Simulated Movie bed, SMB) 크로마토그래피 공정의 공정조건을 계산하는 단계(단계 2); 및 모사이동층 크로마토그래피에 타크로리무스와 아스코마이신이 혼합된 원료용액과, 용리액을 공급하고 상기 단계 2에서 계산된 공정조건을 적용하여 타크로리무스를 분리하는 단계(단계 3);를 포함하는 모사이동층 크로마토그래피를 이용하여 타크로리무스와 아스코마이신의 혼합액으로부터 타크로리무스를 분리하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 모사이동층 크로마토그래피를 이용하여 타크로리무스와 아스코마이신의 혼합액으로부터 타크로리무스를 분리하는 방법은 실제 상업화하여 사용할 수 있는 분리 방법으로써, 용리액으로 사용되는 용매의 사용량을 대폭 감소시킬 수 있고, 고순도의 타크로리무스를 고수율로 손쉽게 대량생산할 수 있는 효과가 있다.The present invention relates to a method for separating tacrolimus from a mixed solution of tacrolimus and ascomycin by using a mosi- cation bed chromatography. Specifically, the adsorption rate of tacrolimus and ascomycin for the adsorption resin in the adsorption column is calculated. (Step 1); Calculating a process condition of a simulated movie bed (SMB) chromatography process by applying the adsorption rate calculated in step 1 to a triangular theory (step 2); And separating the tacrolimus by supplying the raw material solution in which tacrolimus and ascomycin are mixed to the mosai copper layer chromatography and the eluent and applying the process conditions calculated in step 2 (step 3). Provided is a method of separating tacrolimus from a mixed solution of tacrolimus and ascomycin using photography. Separation of tacrolimus from the mixed solution of tacrolimus and ascomycin by using the mosidong mobile layer chromatography according to the present invention is a separation method that can be used commercially, can greatly reduce the amount of the solvent used as the eluent, high purity Tacrolimus of the high yield is easy to mass production is effective.
Description
본 발명은 모사이동층 크로마토그래피를 이용하여 타크로리무스와 아스코마이신의 혼합액으로부터 타크로리무스를 분리하는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for separating tacrolimus from a mixed solution of tacrolimus and ascomycin using mosai copper layer chromatography.
면역억제제는 장기이식분야의 새로운 치료법 개발이 수행되지 않는 한 말기 장기부전증의 치료에 사용되는 최상의 치료법으로, 장기이식의 필요성과 수요의 증가로 많은 발전이 예상되는 분야이다. 그러나, 증가하는 수요와 맞물려 장기이식환자가 평생 복용해야 하는 면역억제제의 판매량이 큰 폭으로 증가하고 있지만, 장기복용에 따르는 부작용과 비싼 가격으로 인하여 새로운 면역억제제의 개발에 대한 요구가 커지고 있다.
Immunosuppressants are the best treatments for the treatment of end-stage organ failure, unless development of new therapies in organ transplantation is carried out. However, in line with the increasing demand, the sales volume of immunosuppressive drugs that long-term transplant patients have to take for a long time is increasing greatly, but the demand for the development of new immunosuppressive agents is increasing due to the side effects and the high price due to the long-term use.
면역억제제는 바람직하지 않은 면역반응을 억제해야하는 경우에 사용하게 되는데, 이러한 예로서는 장기이식, 신생아 적아구증의 예방 및 자가면역질환을 치료하는 것을 들 수 있다. 최초 면역억제제로 사용되었던 것은 아자티오프린(azathioprine)이었으며, 이후 사이클로스포린 A(cyclosporin A)를 면역억제제로 이용하였다. 그러나, 상기 사이클로스포린 A는 신장독성, 고혈압, 당뇨병 및 이식 후 림프세포 증식성 질환 등 부작용을 유발시킬 수 있는 문제점이 많다. 이러한 이유로 사이클로스포린 A에 이어서 널리 사용되고 있는 면역억제제는 타크로리무스, 시로리무스, 마이코피로레이트 모페틸 등이 있다. 그 중에서도 사이클로스포린 A에 비해 부작용 측면에서 이식거부와 고혈압 발생률이 낮고 적은 양으로도 동일한 면역억제효과를 나타내는 타크로리무스가 최근 그 사용이 점차 증가하고 있는 추세이다.Immunosuppressants are used in cases where it is necessary to suppress an undesirable immune response, such as organ transplantation, prevention of neonatal erythrocytes, and treatment of autoimmune diseases. Azathioprine was first used as an immunosuppressive agent, and then cyclosporin A was used as an immunosuppressive agent. However, the cyclosporin A has many problems that can cause side effects such as renal toxicity, hypertension, diabetes mellitus and lymphoid proliferative disease after transplantation. For this reason, the immunosuppressive agents which are widely used following cyclosporin A include tacrolimus, sirolimus, mycopyrrorate mofetil and the like. Among them, tacrolimus, which has lower incidence of graft rejection and hypertension in terms of side effects and shows the same immunosuppressive effect even in a small amount, is gradually increasing in use compared to cyclosporin A.
일반적으로 타크로리무스는 사이클로스포린 A와 유사하지만 100배 더 강력한 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 상기 타크로리무스는 거대고리분자 락톤계열의 항생제로써, 1984년 일본에서 토양 미생물인 Streptomyces tsukubaensis로부터 처음 분리되어 졌다. 1, 2 칼시뉴린 억제제로 작용하는 타크로리무스는 미국 식품의약국으로부터 허가를 받아 간 이식(1994), 신장 이식(1997), 심장 이식(2006) 이후 거부반응 억제제로 사용이 되었다.
Tacrolimus is generally known to be similar to cyclosporin A but with a 100-fold stronger effect. The tacrolimus is an antibiotic of the macrocyclic lactone family, Streptomyces , a soil microorganism in Japan in 1984. It was first isolated from tsukubaensis . Tacrolimus, acting as a calcineurin inhibitor, has been used as an inhibitor of rejection after liver transplantation (1994), kidney transplantation (1997), and heart transplantation (2006) with permission from the US Food and Drug Administration.
한편, 의약품으로 쓰이기 위해서는 미국 식품의약국에서 정한 유도체 및 불순물의 함량이 기준치를 넘어서는 안 되며 상기 기준치를 통과해야지만 상업적으로 사용될 수 있으며, 타크로리무스 또한 미생물을 배양한 후 분리 및 정제 공정을 통해서 고순도의 타크로리무스로 분리해내야만 의약품으로서의 역할을 할 수 있게 된다. 이러한 유도체들로는 일반적으로 아스코마이신, 디하이드로타크로리무스 ,타투머 1,2 등이 있으며, 그중에서도 타크로리무스와 분자 구조와 화학적·물리적 성질이 가장 비슷한 아스코마이신은 특히 분리가 어렵다.Meanwhile, in order to be used as a medicine, the content of derivatives and impurities defined by the US Food and Drug Administration should not exceed the standard value, but it must be passed through the standard value, but it can be used commercially. It must be separated into tacrolimus to act as a medicine. Such derivatives generally include ascomycin, dihydrotacrolimus, and
아스코마이신은 타크로리무스 구조에서 21번째 탄소의 알릴기가 에틸기로 되어 있으며, 그 구조가 타크로리무스와 매우 유사함에 따라 역상 실리카겔을 이용하여도 분리가 어렵고 타투머 1,2를 제거하는데 사용하는 재결정 방법으로도 분리해내지 못한다. Ascomycin has an allyl group of 21st carbon in tacrolimus structure, and its structure is very similar to tacrolimus, so it is difficult to separate using reverse phase silica gel and is also separated by recrystallization method used to remove
이에 미국 등록특허 제6,492,513 B1에서는 은(silver) 염으로 전 처리된 이온-교환 양이온 수지에 의한 타크로리무스의 정제 방법을 개시한 바 있으나, 이와 같이 양이온교환수지를 이용하는 것은 타크로리무스 정제 공정 중 손실이 크게 발생할 수 있는 문제가 있다. 따라서, 고순도의 타크로리무스를 고수율로 정제해내는 방법이 요구되고 있는 실정이다.
Accordingly, US Patent No. 6,492,513 B1 discloses a method for purifying tacrolimus by an ion-exchange cation resin pretreated with a silver salt, but using a cation exchange resin in this way causes a great loss during the tacrolimus purification process. There is a problem that can be. Therefore, there is a demand for a method of purifying high purity tacrolimus in high yield.
이에 본 발명자들은 고순도의 타크로리무스를 분리하는 방법을 연구하던 중, 모사 이동층 크로마토그래피를 이용하여 타크로리무스와 아스코마이신의 혼합액으로부터 고순도의 타크로리무스를 고수율로 분리할 수 있는 방법을 개발하고, 본 발명을 완성하였다.
Therefore, the present inventors have been studying a method of separating high purity tacrolimus, while developing a method for separating high purity tacrolimus from the mixture of tacrolimus and ascomycin in high yield using simulated mobile bed chromatography, and the present invention Completed.
본 발명의 목적은 모사이동층 크로마토그래피를 이용하여 타크로리무스와 아스코마이신의 혼합액으로부터 타크로리무스를 분리하는 방법을 제공하는 데 있다.
It is an object of the present invention to provide a method for separating tacrolimus from a mixed solution of tacrolimus and ascomycin using mosidong mobile layer chromatography.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은In order to achieve the above object,
하기 수학식 1을 이용하여 흡착칼럼 내의 흡착수지(resin)에 대한 타크로리무스와 아스코마이신의 흡착률 각각을 계산하는 단계(단계 1);Computing the adsorption rate of tacrolimus and ascomycin to the adsorption resin (resin) in the adsorption column using Equation 1 (step 1);
상기 단계 1에서 계산된 흡착률을 삼각형 이론에 적용하여 모사이동층(Simulated Movie bed, SMB) 크로마토그래피 공정의 공정조건을 계산하는 단계(단계 2); 및Calculating a process condition of a simulated movie bed (SMB) chromatography process by applying the adsorption rate calculated in step 1 to a triangular theory (step 2); And
모사이동층 크로마토그래피에 타크로리무스와 아스코마이신이 혼합된 원료용액과, 용리액을 공급하고 상기 단계 2에서 계산된 공정조건을 적용하여 타크로리무스를 분리하는 단계(단계 3);를 포함하는 모사이동층 크로마토그래피를 이용하여 타크로리무스와 아스코마이신의 혼합액으로부터 타크로리무스를 분리하는 방법을 제공한다.
Supplying the raw material solution mixed with tacrolimus and ascomycin to the mosidong mobile layer chromatography, and separating the tacrolimus by applying the process conditions calculated in step 2 (step 3); It provides a method for separating tacrolimus from the mixed solution of tacrolimus and ascomycin using.
<수학식 1>&Quot; (1) "
(qi는 흡착수지부피당 흡착률을 나타내고,(q i represents the adsorption rate per adsorption resin volume,
α는 보정된 체류인자를 나타내며,α represents a calibrated retention factor,
VE ,i는 흡착칼럼 내에서 i물질의 체류부피를 나타내며,V E , i represents the retention volume of i substance in the adsorption column,
ε는 공극률을 나타내고,ε represents the porosity,
Vcol은 컬럼의 부피를 나타내며,V col represents the volume of the column,
ci는 주입한 물질의 농도를 나타낸다.)
c i represents the concentration of the injected material.)
본 발명에 따른 모사이동층 크로마토그래피를 이용하여 타크로리무스와 아스코마이신의 혼합액으로부터 타크로리무스를 분리하는 방법은 실제 상업화하여 사용할 수 있는 분리 방법으로써, 용리액으로 사용되는 용매의 사용량을 대폭 감소시킬 수 있고, 고순도의 타크로리무스를 고수율로 손쉽게 대량생산할 수 있는 효과가 있다.
Separation of tacrolimus from the mixed solution of tacrolimus and ascomycin by using the mosidong mobile layer chromatography according to the present invention is a separation method that can be used commercially, can greatly reduce the amount of the solvent used as the eluent, high purity Tacrolimus of the high yield is easy to mass production is effective.
도 1은 타크로리무스와 아스코마이신의 분자적 구조를 나타낸 그림이고;
도 2는 모사이동층 크로마토그래피의 기본적인 모식도를 나타낸 것이고;
도 3은 고성능액체크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)를 이용하여 타크로리무스와 아스코마이신을 분석한 그래프이고;
도 4는 타크로리무스와 아스코마이신의 농도에 따른 흡착수지로의 흡착률을 분석한 그래프이고;
도 5는 삼각형 이론을 이용하여 모사이동층 크로마토그래피의 공정조건을 최적화하는 그래프이고;
도 6의 (ㄱ)은 모사이동층 크로마토그래피와 동일한 컬럼 및 장치비용을 갖는 회분식 크로마토그래피를 나타낸 그림이고, (ㄴ)은 모사이동층 크로마토그래피와 동일한 흡착제량을 이용한 회분식 크로마토그래피를 나타낸 것이며;
도 7은 모사이동층 크로마토그래피를 통해 분리된 타크로리무스의 농도와 아스코마이신의 농도를 나타낸 그래프이다.1 is a diagram showing the molecular structure of tacrolimus and ascomycin;
Figure 2 shows a basic schematic diagram of the mother layer chromatography;
3 is a graph analyzing tacrolimus and ascomycin using High Performance Liquid Chromatography (HPLC);
Figure 4 is a graph analyzing the adsorption rate to the adsorption resin according to the concentration of tacrolimus and ascomycin;
FIG. 5 is a graph of optimizing the process conditions of mother layer chromatography using triangular theory; FIG.
(A) of FIG. 6 shows a batch chromatography having the same column and equipment cost as that of the mosidongdong bed chromatography, and (b) shows the batch chromatography using the same amount of adsorbent as the mosidongdong bed chromatography;
FIG. 7 is a graph showing the concentration of tacrolimus and the concentration of ascomycin isolated through mosi- cation chromatography.
본 발명은The present invention
하기 수학식 1을 이용하여 흡착칼럼 내의 흡착수지(resin)에 대한 타크로리무스와 아스코마이신의 흡착률 각각을 계산하는 단계(단계 1);Computing the adsorption rate of tacrolimus and ascomycin to the adsorption resin (resin) in the adsorption column using Equation 1 (step 1);
상기 단계 1에서 계산된 흡착률을 삼각형 이론에 적용하여 모사이동층(Simulated Movie bed, SMB) 크로마토그래피 공정의 공정조건을 계산하는 단계(단계 2); 및Calculating a process condition of a simulated movie bed (SMB) chromatography process by applying the adsorption rate calculated in step 1 to a triangular theory (step 2); And
모사이동층 크로마토그래피에 타크로리무스와 아스코마이신이 혼합된 원료용액과, 용리액을 공급하고 상기 단계 2에서 계산된 공정조건을 적용하여 타크로리무스를 분리하는 단계(단계 3);를 포함하는 모사이동층 크로마토그래피를 이용하여 타크로리무스와 아스코마이신의 혼합액으로부터 타크로리무스를 분리하는 방법을 제공한다.
Supplying the raw material solution mixed with tacrolimus and ascomycin to the mosidong mobile layer chromatography, and separating the tacrolimus by applying the process conditions calculated in step 2 (step 3); It provides a method for separating tacrolimus from the mixed solution of tacrolimus and ascomycin using.
<수학식 1>&Quot; (1) "
(qi는 흡착수지부피당 흡착률을 나타내고,(q i represents the adsorption rate per adsorption resin volume,
α는 보정된 체류인자를 나타내며,α represents a calibrated retention factor,
VE,i는 흡착칼럼 내에서 i물질의 체류부피를 나타내며,V E, i represents the retention volume of i substance in the adsorption column,
ε는 공극률을 나타내고,ε represents the porosity,
Vcol은 컬럼의 부피를 나타내며,V col represents the volume of the column,
ci는 주입한 물질의 농도를 나타낸다.)
c i represents the concentration of the injected material.)
이하, 본 발명에 따른 분리방법을 각 단계별로 상세히 설명한다.
Hereinafter, the separation method according to the present invention will be described in detail for each step.
본 발명에 따른 타크로리무스를 분리하는 방법에 있어서, 단계 1은 수학식 1을 이용하여 흡착칼럼 내의 흡착수지(resin)에 대한 타크로리무스와 아스코마이신의 흡착률 각각을 계산하는 단계이다. In the method for separating tacrolimus according to the present invention, step 1 is a step of calculating the adsorption rates of tacrolimus and ascomycin for each of the adsorption resins (resin) in the adsorption column using Equation 1.
도 1은 아스코마이신과 타크로리무스의 구조를 나타낸 그림으로, 도 1에 나타낸 바와 같이 아스코마이신은 타크로리무스 구조에서 21번째 탄소의 알릴기가 에틸기로 되어 있으며, 그 구조가 타크로리무스와 매우 유사함에 따라 역상 실리카겔을 이용하여도 분리가 어렵고 타투머 1,2를 제거하는데 사용하는 재결정 방법으로도 분리할 수 없다. 본 발명에서는 이와 같이 분리가 어려운 아스코마이신과 타크로리무스를 분리하여 고순도의 타크로리무스를 정제하기 위하여 모사이동층 크로마토그래피를 이용한다. 이때, 상기 단계 1에서 타크로리무스와 아스코마이신의 흡착률을 분석하는 것은 모사이동층 크로마토그래피 공정의 공정조건을 설계하기 위한 주요인자 중 하나로써, 타크로리무스와 아스코마이신의 흡착률로부터 이들의 흡착상수값을 계산해낼 수 있으며, 이를 토대로 모사이동층 크로마토그래피에 공급할 타크로리무스와 아스코마이신의 유량 등을 도출해낼 수 있다. 1 is a diagram showing the structure of ascomycin and tacrolimus. As shown in FIG. 1, ascormycin has an allyl group of 21st carbon in the tacrolimus structure, and an ethyl group, and its structure is very similar to tacrolimus. Even though it is difficult to separate, it cannot be separated by the recrystallization method used to remove the
한편, 상기 단계 1에서는 타크로리무스와 아스코마이신의 흡착수지에 대한 흡착률을 수학식 1을 이용하여 계산해낸다. 상기 단계 1의 흡착률 분석은 아세토나이트릴, 아이소프로판올, 메탄올, 테트라하이드로퓨란, 터트부틸메틸에테르, 물 등의 용매를 이용하여 고성능액체크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)를 통해 수행하며, 바람직하게는 인산, 아세토나이트릴, 터트부틸메틸에테르, 물을 혼합한 용매와 C18 흡착컬럼으로 구성된 HPLC를 통해 수행할 수 있다.
Meanwhile, in step 1, the adsorption rate of the tacrolimus and ascomycin to the adsorption resin is calculated using Equation 1. Adsorption rate analysis of step 1 is carried out through high performance liquid chromatography (HPLC) using a solvent such as acetonitrile, isopropanol, methanol, tetrahydrofuran, tertbutylmethyl ether, water, Preferably it can be carried out through HPLC consisting of a solvent and a C18 adsorption column mixed with phosphoric acid, acetonitrile, tertbutyl methyl ether, water.
상기 단계 1에서 수학식 1을 이용하여 흡착률을 계산하는 것은 일반적인 전단분석법과 비교하여 주입되는 시료량이 적기 때문에 소량의 물질을 분석하는 것에 유리하며, 빠른 분석으로 인하여 처리시간을 단축시킬 수 있다. 또한, 타크로리무스와 아스코마이신의 농도를 변화시키며 도출해내는 보정된 체류인자를 상기 수학식 1에 적용함으로써 보다 정확한 흡착률을 계산해낼 수 있다.
Calculation of the adsorption rate by using Equation 1 in step 1 is advantageous in analyzing a small amount of material because the amount of sample injected is small compared to the general shear analysis method, it is possible to shorten the processing time due to the fast analysis. In addition, by applying a corrected retention factor derived from varying concentrations of tacrolimus and ascomycin to Equation 1, more accurate adsorption rates can be calculated.
본 발명에 따른 타크로리무스를 분리하는 방법에 있어서, 단계 2는 상기 단계 1에서 계산된 흡착률을 삼각형 이론에 적용하여 모사이동층(Simulated Movie bed, SMB) 크로마토그래피 공정의 공정조건을 계산하는 단계이다. In the method for separating tacrolimus according to the present invention,
모사이동층(Simulated Moving Bed, SMB) 크로마토그래피 공정은 효율적인 분리를 위해 연속적인 향류(counter-current flow)를 이용하는 TMB(True Moving Bed)공정을 모사한 공정으로, 본 발명에서의 모사이동층 크로마토그래피 공정 장비를 도 2의 그림을 통해 나타내었다.The simulated moving bed (SMB) chromatography process simulates a true moving bed (TMB) process using a counter-current flow for efficient separation. The graphing process equipment is shown in the figure of FIG.
도 2에 도시된 바와 같이, SMB 크로마토그래피 공정은 복수개의 흡착컬럼을 포함하며, 상기 흡착컬럼 내로 공급되는 물질들의 유량을 조절하기 위한 조절 밸브 시스템을 포함할 수 있다. 또한, 용리액과 혼합원료물질이 유입되는 2개의 유입구와 분리된 물질(아스코마이신, 타크로리무스)이 각각 유출되는 2개의 유출구로 구성될 수 있으며, 상기 두 개의 유출구 및 유입구는 공정설계를 통해 결정된 교환시간마다 밸브에 의하여 이동상인 용리액의 이동 방향을 따라 이동하여 이동상과 고정상의 향류를 모사한다.As shown in FIG. 2, the SMB chromatography process may include a plurality of adsorption columns, and may include a control valve system for controlling the flow rate of materials supplied into the adsorption column. In addition, it may be composed of two inlets through which the eluent and the mixed raw materials are introduced, and two outlets through which the separated substances (ascomycin and tacrolimus) flow out, respectively, and the two outlets and the inlets are exchange time determined through the process design. Each time, the valve moves along the moving direction of the eluent, which is the mobile phase, to simulate the countercurrent of the mobile phase and the fixed phase.
이때, SMB 크로마토그래피 공정을 구성하는 유입구, 유출구 및 흡착컬럼으로 공급되는 혼합물질의 유량과 교환시간은 일반적으로 삼각형 이론(triangle theory)을 이용하여 결정하며, 상기 삼각형 이론을 이루는 식은 하기 수학식 2와 같이 정의할 수 있다.
In this case, the flow rate and the exchange time of the mixture material supplied to the inlet, the outlet, and the adsorption column constituting the SMB chromatography process are generally determined using a triangle theory, and the equation for forming the triangle theory is represented by
<수학식 2>&Quot; (2) "
(α는 보정된 체류인자를 나타내며, (α represents the adjusted retention factor,
VE ,i는 흡착칼럼 내에서 각 물질의 체류부피를 나타내며,V E , i represents the retention volume of each substance in the adsorption column,
ε는 공극률을 나타내고,ε represents the porosity,
Vcol은 컬럼의 부피를 나타낸다.)
V col represents the volume of the column.)
상기 삼각형 이론은 분리하고자 하는 두 물질의 등온흡착식과 컬럼 특성을 이용하여 모사이동층 공정의 운전을 위한 조업조건을 계산하며, 상기 단계 2에서는 단계 1에서 계산된 흡착률을 삼각형 이론에 적용하여 모사이동층(Simulated Movie bed, SMB) 크로마토그래피 공정의 공정조건, 즉 아스코마이신과 타크로리무스 혼합물질의 유량, 교환시간 등을 결정한다. 이때, 상기 흡착률을 삼각형 이론에 적용한다는 것은 흡착률로부터 도출된 흡착상수값을 삼각형 이론의 계산식에 적용함을 의미하며, 공정조건의 계산은 크로마토그래피 모사프로그램을 이용하여 수행할 수 있으며, 상기 모사프로그램은 일반적으로 SMB 공정에 사용되는 모사프로그램을 선택하여 이용할 수 있다.
The triangular theory calculates operating conditions for the operation of the parent sieve bed using isothermal adsorption and column characteristics of two materials to be separated, and in
본 발명에 따른 타크로리무스를 분리하는 방법에 있어서, 단계 3은 모사이동층 크로마토그래피에 타크로리무스와 아스코마이신이 혼합된 원료용액과, 용리액을 공급하고 상기 단계 2에서 계산된 공정조건을 적용하여 타크로리무스를 분리하는 단계이다. In the method for separating tacrolimus according to the present invention, step 3 supplies tacrolimus and ascomycin mixed raw material solution and the eluent to the mosquito layer chromatography to separate tacrolimus by applying the process conditions calculated in
상기 단계 2에서 삼각형 이론을 통해 계산된 공정조건으로 모사이동층 크로마토그래피 장치를 설계하고, 설계된 장치로 타크로리무스와 아스코마이신이 혼합된 원료용액과, 용리액을 공급하여 공정을 수행함으로써, 고순도의 타크로리무스를 분리할 수 있다. 이때, 상기 용리액으로는 아세토나이트릴, 아이소프로판올, 메탄올, 테트라하이드로퓨란, 터트부틸메틸에테르, 물 등의 용매를 사용할 수 있으며, 경우에 따라 이들을 혼합하여 사용할 수 있다.By designing the mosidong mobile layer chromatography apparatus under the process conditions calculated by the triangular theory in
상기 단계 3에서 모사이동층 크로마토그래피를 이용함으로써, 타크로리무스와 아스코마이신의 혼합물로부터 고순도의 타크로리무스를 고수율로 분리해낼 수 있다. 즉, 모사이동층 크로마토그래피를 이용함에 따라 일반적인 회분식 크로마토그래피와 비교하여 매우 적은 양의 용리액(용매)가 사용되어 고농도 및 고순도의 타크로리무스가 분리되고, 연속공정이 가능함에 따라 그 생산량 또한 향상시킬 수 있다.
By using the mosidong mobile layer chromatography in step 3, it is possible to separate high purity tacrolimus from the mixture of tacrolimus and ascomycin in high yield. In other words, by using the mosidong mobile layer chromatography, a very small amount of eluent (solvent) is used as compared to the general batch chromatography to separate the high concentration and high purity of tacrolimus, and as a continuous process is possible, the yield can also be improved. have.
본 발명에 따른 상기 분리방법을 통해 타크로리무스를 99% 이상의 고순도로 분리할 수 있으며, 분리된 타크로리무스는 바람직하지 않은 유도체인 아스코마이신이 대부분 제거된 상태이기 때문에 면역억제제로 사용하기 적합하다. 또한, 일반적인 크로마토그래피와는 달리 생산수율이 우수하여 50% 이상의 수율을 나타낼 수 있어 고순도의 타크로리무스를 대량생산이 가능하며, 이를 통해 상기 분리방법이 상업적으로 이용하기 적합함을 알 수 있다
Tacrolimus can be separated by a high purity of 99% or more through the separation method according to the present invention, and the isolated tacrolimus is suitable for use as an immunosuppressive agent because most of the undesirable derivatives of ascomycin are removed. In addition, unlike general chromatography, the production yield is excellent, so that the yield can be 50% or more. Therefore, it is possible to mass-produce high purity tacrolimus, and through this, it can be seen that the separation method is suitable for commercial use.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples. It should be noted, however, that the following examples are illustrative of the invention and are not intended to limit the scope of the invention.
<실시예 1> 타크로리무스와 아스코마이신의 혼합액으로부터 고순도 타크로리무스의 분리Example 1 Isolation of High Purity Tacrolimus from a Mixture of Tacrolimus and Ascomycin
단계 1 : 스트렙토마이세스속인 균주를 발효시켜 타크로리무스와 아스코마이신을 포함하는 발효배양액을 제조하였으며, 상기 발효 배양액으로부터 타크로리무스를 추출하였다. Step 1: Fermentation strain of Streptomyces genus to prepare a fermentation broth containing tacrolimus and ascomycin, tacrolimus was extracted from the fermentation broth.
아스코마이신을 포함하는 상기 추출된 타크로리무스를 고성능액체크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)를 이용하여 흡착률을 분석하였다. 이를 증명하기 위한 HPLC분석은 인산, 아세토나이트릴, 터트부틸메틸에테르, 물의 혼합 용매를 이용하였다. 상기 HPLC 분석의 결과는 도 3에 나타내었다. 또한, 도 4에 나타낸 바와 같이 타크로리무스와 아스코마이신의 농도별로 보정된 체류인자를 구하였으며, 보정된 체류인자를 수학식 1에 적용하여 타크로리무스와 아스코마이신의 흡착률을 계산하였다. 이때, 계산된 타크로리무스와 아스코마이신의 흡착률은 각각 4.188과 3.671로 나타났다.
The extracted tacrolimus containing ascomycin was analyzed for adsorption rate using High Performance Liquid Chromatography (HPLC). HPLC analysis was performed using a mixed solvent of phosphoric acid, acetonitrile, tertbutyl methyl ether and water. The results of the HPLC analysis are shown in FIG. 3. Further, as shown in FIG. 4, the retention factor corrected for each concentration of tacrolimus and ascomycin was obtained, and the adsorption rate of tacrolimus and ascomycin was calculated by applying the corrected retention factor to Equation 1. At this time, the calculated adsorption rates of tacrolimus and ascomycin were 4.188 and 3.671, respectively.
단계 2 : 상기 단계 1의 분석결과 도출된 흡착률을 이용하여 타크로리무스와 아스코마이신의 흡착상수를 도출해내었으며, 이를 토대로 도 5에 나타낸 바와 같이 삼각형 이론에 따른 삼각형을 도시함으로써, 모사이동층 크로마토그래피의 교환시간, 원료물질 및 용리액의 유량 등의 공정조건을 도출해내었다. Step 2: The adsorption constants of tacrolimus and ascomycin were derived by using the adsorption rate derived from the analysis result of step 1, and based on this, by plotting triangles according to the triangle theory as shown in FIG. Process conditions such as exchange time, raw material and eluent flow rate were derived.
이때, 도 5에 도시한 삼각형에 포함되는 모든 운전 조건은 이론적으로 고순도의 물질을 추출할 수 있다. 그러나, 실질적으로 많은 주변 환경들과 다이나믹으로 인하여 상기 삼각형 내에서 최적의 점을 찾아야 하며, 본 발명자는 도 5에 도시한 삼각형 중 최적의 운전 조건을 선택하여 모사이동층 크로마토그래피의 공정조건을 도출해내었다.
At this time, all the operating conditions included in the triangle shown in Figure 5 can theoretically extract a material of high purity. However, due to the substantial environment and dynamics, it is necessary to find the optimal point within the triangle, and the present inventors select the optimal operating conditions among the triangles shown in FIG. Came out.
단계 3 : 상기 단계 2에서 도출된 공정조건을 토대로 도 1에 개략적으로 나타낸 바와 같은 모사이동층 크로마토그래피를 설계하였으며, 설계된 모사이동층 크로마토그래피로 타크로리무스와 아스코마이신이 혼합된 혼합원료와, 용리액으로써 물, 테트라하이드로퓨란 및 아이소프로판올을 혼합한 혼합용매를 공급하여 공정을 진행하였으며, 그 결과 고순도의 타크로리무스를 분리해내었다. Step 3: Based on the process conditions derived from
이때, 실시예 1에서 모사이동층 크로마토그래피 공정을 진행한 공정조건은 하기 표 1 및 표 2에 정리하여 나타내었다.
At this time, the process conditions of the step of carrying out the mosidong mobile layer chromatography in Example 1 are summarized in Table 1 and Table 2.
(g/l)Concentration of raw materials
(g / l)
(ml/min)Flow
(ml / min)
<비교예 1 및 2>≪ Comparative Examples 1 and 2 >
도 6에 개략적으로 나타낸 회분식 크로마토그래피를 이용하여 아스코마이신과 타크로리무스 혼합액의 분리를 수행하였다. Separation of the ascomycin and tacrolimus mixture was performed using batch chromatography schematically shown in FIG. 6.
이때, 상기 도 3의 (ㄱ)은 실시예 1에서 사용한 모사이동층 크로마토그래피와 동일한 컬럼 및 장치비용을 갖도록 구성한 회분식 크로마토그래피(비교예 1)이며, At this time, (a) of FIG. 3 is a batch chromatography (comparative example 1) configured to have the same column and apparatus cost as the parent interlayer chromatography used in Example 1,
도 3의 (ㄴ)은 실시예 1에서 사용한 모사이동층 크로마토그래피와 동일한 흡착제량을 적용한 회분식 크로마토그래피(비교예 2)이다. FIG. 3B is a batch chromatography (comparative example 2) to which the same amount of adsorbent as that used for the mosidong mobile layer chromatography used in Example 1 is applied.
비교예 1 및 2의 회분식 크로마토그래피의 공정조건은 하기 표 3에 정리한 바와 같으며, 상기 공정조건은 하나의 흡착컬럼을 이용한 시뮬레이션 후, 도출된 값을 스케일업하여 설정하였다.
The process conditions of the batch chromatography of Comparative Examples 1 and 2 are summarized in Table 3 below, and the process conditions were set by scaling up the derived values after simulation using one adsorption column.
(g/l)Concentration of raw materials
(g / l)
(ml/min)Flow
(ml / min)
분석analysis
(1) 고성능액체크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC) 분석(1) High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Analysis
아스코마이신과 타크로리무스의 흡착률 분석을 위해 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 아스코마이신과 타크로리무스의 혼합물을 분석하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.In order to analyze the adsorption rate of ascomycin and tacrolimus, a mixture of ascomycin and tacrolimus was analyzed using high performance liquid chromatography (HPLC), and the results are shown in FIG. 3.
도 3에 나타낸 바와 같이, HPLC의 분석결과 가장 큰 면적을 가지는 피크는 타크로리무스를 나타냄을 알 수 있으며, 상기 피크의 앞에서 검출된 피크는 아스코마이신을 나타낸다. 즉, 본 발명에서 인산, 아세토나이트릴, 터트부틸메틸에테르, 물을 혼합하여 HPLC 분석에 사용함으로써, 아스코마이신과 타크로리무스를 완전히 분리하여 확인할 수 있음을 알 수 있다. 이에 따라, 상기 혼합용매를 이용하여 HPLC 분석을 수행하는 것은 아스코마이신과 타크로리무스의 분석에 적합함을 확인하였다.
As shown in FIG. 3, it can be seen that the peak having the largest area shows tacrolimus as a result of HPLC analysis, and the peak detected in front of the peak indicates ascomycin. That is, in the present invention, it can be seen that by mixing phosphoric acid, acetonitrile, tertbutyl methyl ether and water and using it for HPLC analysis, ascormycin and tacrolimus can be completely separated and confirmed. Accordingly, it was confirmed that performing the HPLC analysis using the mixed solvent is suitable for the analysis of ascomycin and tacrolimus.
(2) C18 흡착수지 부피에 대한 흡착률 분석(2) Analysis of Adsorption Rate for C18 Adsorption Resin Volume
실제 모사이동층 크로마토그래피에 흡착수지로 사용된 C18 흡착수지의 부피에 대한 아스코마이신과 타크로리무스의 흡착률을 분석하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. The adsorption rates of ascomycin and tacrolimus were analyzed for the volume of the C18 adsorption resin used as the adsorption resin for the real mosquito bed chromatography, and the results are shown in FIG. 4.
도 4에 나타낸 바와 같이, 아스코마이신의 C18 흡착수지에 대한 흡착률은 타크로리무스 보다 낮은 것을 알 수 있다. 즉, 구조가 유사함에 따라 분리가 어려웠던 상기 두 물질은 C18 흡착수지에 대한 흡착률의 차이가 있음을 알 수 있으며, 이들의 흡착률 차이를 이용하여 타크로리무스를 분리할 수 있음을 예측할 수 있다.
As shown in Figure 4, it can be seen that the adsorption rate of ascomycin to the C18 adsorption resin is lower than that of tacrolimus. That is, the two materials, which were difficult to separate due to the similar structure, can be seen that there is a difference in adsorption rate for the C18 adsorption resin, and it can be predicted that tacrolimus can be separated using these adsorption rate differences.
(3) 모사이동층 크로마토그래피를 이용하여 분리된 타크로리무스의 분석(3) Analysis of Isolated Tacrolimus Using Mosai Copper Layer Chromatography
상기 실시예 1, 비교예 1 및 2에서 분리된 타크로리무스의 특성을 고성능액체크로마토그래피를 이용하여 분석하였고, 그 결과를 표 4 및 도 7에 나타내었다.
The characteristics of the tacrolimus separated in Example 1, Comparative Examples 1 and 2 were analyzed using high performance liquid chromatography, and the results are shown in Table 4 and FIG.
표 4 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 실시예 1, 비교예 및 비교예 2에서 분리된 타크로리무스의 순도는 99% 이상으로 분리됨을 알 수 있다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예 1에서 모사이동층 크로마토그래피를 이용하는 경우 회분식 크로마토그래피와 비교하여 원료대비 용매 사용량을 매우 절감할 수 있다. 또한 비교예 1 및 2에서 회분식 크로마토그래피를 이용한 것보다 많게는 약 17배, 적게는 약 8배 가까이 수율이 향상된 것을 알 수 있었으며, 농축도 또한 최소 약 2배에서 최대 약 24배까지 높아진 것을 알 수 있었다. 나아가, 연간 생산량으로 비교하였을 때, 모사이동층 크로마토그래피를 이용하는 것이 회분식 크로마토그래피보다 최소 약 17배, 많게는 약 80배까지 증대되는 것을 알 수 있다. 이를 통해, 본 발명에 따른 분리방법에서 모사이동층 크로마토그래피를 이용하여 고순도의 타크로리무스를 분리할 수 있으며, 특히 그 수율이 우수함에 따라 대량의 타크로리무스를 제조할 수 있어 상업적 이용성이 매우 우수함을 확인하였다. As shown in Table 4 and Figure 7, it can be seen that the purity of tacrolimus separated in Example 1, Comparative Example and Comparative Example 2 is separated by more than 99%. However, in the case of using the mosidong mobile layer chromatography in Example 1 according to the present invention it is possible to significantly reduce the amount of solvent compared to the raw material compared to the batch chromatography. In addition, in Comparative Examples 1 and 2, it was found that the yield was improved by about 17 times and about 8 times as much as that by using the batch chromatography, and the concentration was also increased by at least about 2 times and up to about 24 times. there was. Furthermore, when compared to the annual production, it can be seen that the use of mosidong mobile layer chromatography is increased by at least about 17 times and as much as about 80 times than batch chromatography. Through this, in the separation method according to the present invention, it is possible to separate high purity tacrolimus by using the mosidong mobile layer chromatography, and in particular, the yield of the tacrolimus can be produced in large quantities, and thus it was confirmed that the commercial availability is very excellent. .
이상에 설명한 바와 같이, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 본 발명의 범위는 상기의 상세한 설명보다는 후술할 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
As described above, those skilled in the art will understand that the present invention may be embodied in other specific forms without departing from the spirit or essential characteristics thereof. It will be understood by those skilled in the art that the present invention may be embodied in many other specific forms without departing from the spirit or scope of the invention as defined by the appended claims and their equivalents. .
Claims (5)
상기 단계 1에서 계산된 흡착률을 삼각형 이론에 적용하여 모사이동층(Simulated Movie bed, SMB) 크로마토그래피 공정의 공정조건을 계산하는 단계(단계 2); 및
모사이동층 크로마토그래피에 타크로리무스와 아스코마이신이 혼합된 원료용액과, 용리액을 공급하고 상기 단계 2에서 계산된 공정조건을 적용하여 타크로리무스를 분리하는 단계(단계 3);를 포함하는 모사이동층 크로마토그래피를 이용하여 타크로리무스와 아스코마이신의 혼합액으로부터 타크로리무스를 분리하는 방법:
<수학식 1>
(qi는 흡착수지부피당 흡착률을 나타내고,
α는 보정된 체류인자를 나타내며,
VE,i는 흡착칼럼 내에서 i물질의 체류부피를 나타내며,
ε는 공극률을 나타내고,
Vcol은 컬럼의 부피를 나타내며,
ci는 주입한 물질의 농도를 나타낸다.).
Computing the adsorption rate of tacrolimus and ascomycin to the adsorption resin (resin) in the adsorption column using Equation 1 (step 1);
Calculating a process condition of a simulated movie bed (SMB) chromatography process by applying the adsorption rate calculated in step 1 to a triangular theory (step 2); And
Supplying the raw material solution mixed with tacrolimus and ascomycin to the mosidong mobile layer chromatography, and separating the tacrolimus by applying the process conditions calculated in step 2 (step 3); Separation of tacrolimus from the mixture of tacrolimus and ascomycin using
&Quot; (1) "
(q i represents the adsorption rate per adsorption resin volume,
α represents a calibrated retention factor,
V E, i represents the retention volume of i substance in the adsorption column,
ε represents the porosity,
V col represents the volume of the column,
c i represents the concentration of the injected material).
The method of claim 1, wherein the adsorption resin of step 1 is a C18 adsorption resin.
The method of claim 1, wherein the eluent of step 3 is at least one solution selected from the group consisting of acetonitrile, isopropanol, methanol, tetrahydrofuran, tertbutyl methyl ether and water. Separation method of tacrolimus using.
The method of claim 1, wherein the tacrolimus separated by the method of separating the tacrolimus has a purity of 99% or more, characterized in that the separation method of tacrolimus using a mosai copper layer chromatography.
The method of claim 1, wherein the separation of tacrolimus through the method of separating the tacrolimus is characterized in that the yield is 50% or more.
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