KR101342755B1 - Immature antibody, continuous detection apparatus using the same and method for real-time continuous detection - Google Patents
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Abstract
본 발명은 미성숙 항체, 이를 이용한 연속 검출장치 및 실시간 연속 검출 방법에 대한 것이다. 본 발명의 미성숙 항체를 이용한 연속 검출장치 및 연속 검출방법을 이용하면, 분자량이 작은 물질을 연속적으로 검출할 수 있다.The present invention relates to an immature antibody, a continuous detection apparatus using the same, and a real-time continuous detection method. By using the continuous detection device and the continuous detection method using the immature antibody of the present invention, it is possible to continuously detect a substance having a low molecular weight.
Description
본 발명은 미성숙 항체, 이를 이용한 연속 검출장치 및 실시간 연속 검출 방법에 대한 것이다. The present invention relates to an immature antibody, a continuous detection apparatus using the same, and a real-time continuous detection method.
질병에 관련된 지표물질에 대한 연속적인 측정에 대한 요구는 특히 원내 입원한 중환자의 경우 그 필요성이 증대되고 있으나 무한재활용이 가능한 인식소재의 확보와 장기간 센서운용 등 기술적 문제로 요구를 충족시키지 못하고 있다. The demand for continuous measurement of indicators related to diseases is increasing, especially for critically ill patients in hospitals. However, the demand for continuous measurement of indicators and long-term sensor operation have not been met.
특히, 최근 들어 당뇨병 진단에 있어 연속혈당측정에 대한 연구가 매우 활발하며, 이것은 며칠(예: 최장 5일) 동안의 체내 혈당농도에 분포를 파악하여 혈당조절에 필요한 인슐린 투여 양 및 시기를 결정하고 평가하기 위함이다. 암 재발 진단의 경우 몇 달 간격으로 진행되고, 급성심근경색이나 패혈쇼크의 경우에는 몇 시간 간격으로 특이 분석물질에 대해 검사가 실시되는 데 비해, 혈당은 불과 몇 분 간격으로 검출하여 혈액 내 그 등락을 며칠 동안 모니터한 결과로부터 당뇨병의 진단이나 인슐린 주사의 효과 등을 검정한다(도 1 참조). 이와 같이, 혈당 농도의 변화속도는 섭취하는 음식물의 종류와 체내 인슐린 분비 등 개인차에 따라 다르지만 호발성 질환 마커 중 가장 빠르며 더욱이 그 연속진단은 당뇨병 진단 및 효과적인 치료를 위해 필요하다.In particular, in recent years, the study of continuous blood glucose measurement has been very active in diagnosing diabetes, which determines the amount and timing of insulin administration required for blood sugar control by determining the distribution of blood glucose levels in the body for several days (eg, up to 5 days). To evaluate. While cancer recurrences are diagnosed every few months, in the case of acute myocardial infarction or septic shock, tests are performed on specific analytes every few hours. The results of monitoring for several days to test the diagnosis of diabetes or the effect of insulin injection, etc. (see Figure 1). As such, the rate of change in blood glucose levels varies depending on the type of food ingested and the individual differences such as insulin secretion in the body, but is the fastest among the markers of the disease, and furthermore, the continuous diagnosis is necessary for diagnosing and effectively treating diabetes.
현재 상용화된 연속혈당측정 시스템에서는 1회용 혈당측정 스트립에서와 같이 glucose oxidase와 같은 효소반응을 이용하며 몇 분 간격으로 혈장 혹은 세포 간질액에 존재하는 혈당농도에 비례하여 발생하는 반응산물을 전기화학적으로 측정한다. 그러나 장기간 운용 시 효소의 부분적인 불활성화가 진행되어 센서의 기준선 변화가 지속적으로 일어나므로 측정 정확도가 낮아지는 문제점이 있다. 이러한 문제는 하루 3-4회 잦은 보정을 통해 어느 정도 완화될 수 있지만, 그 때 마다 말초혈액을 채취하고 1회용 스트립으로 혈당을 측정해야 하는 고통과 번거로움을 피할 수 없다.Current commercially available serial glucose monitoring systems use enzyme reactions, such as glucose oxidase, as in single-use blood glucose strips, and electrochemically react reaction products that occur in proportion to the blood glucose levels present in plasma or cell interstitial fluid every few minutes. Measure However, there is a problem in that the measurement accuracy is lowered because a partial inactivation of the enzyme proceeds during the long-term operation and the baseline change of the sensor continuously occurs. This problem can be alleviated to some extent through frequent corrections three to four times a day, but the pain and hassle of taking peripheral blood every time and measuring blood glucose with a disposable strip is inevitable.
이와 같은 효소를 이용하는 혈당센서에서의 문제점을 근본적으로 해결하고자 효소 대신에 당 부착단백질인 lectin 계열의 concanavalin A(Con A)를 인식소재로 이용하려는 시도가 최근에 활발히 연구되고 있으나, Con A는 체내에서 다양한 독성효과를 유발하는 것으로 알려져 있어서 이것을 이식형 바이오센서의 인식소재로 이용하는 데는 한계점이 있는 실정이다. 또 다른 당 부착단백질로서 glucose binding protein(GBP)을 혈당 인식소재로 채택하려는 시도도 최근에 활발히 연구되고 있으나, GBP를 장기간 혈당 모니터링에 적용하기 위해서는 임상조건하에서 측정재현성과 수명에 한계가 있다.In order to fundamentally solve the problem in the blood glucose sensor using the enzyme, attempts to use concanavalin A (Con A), a lectin-based glycoprotein, as a recognition material instead of enzyme, have been actively studied in recent years. It is known to cause various toxic effects in the present situation, there is a limit to use this as a recognition material of the implantable biosensor. Attempts to adopt glucose-binding protein (GBP) as a glycemic recognition material as another glycemic protein have recently been actively studied. However, in order to apply GBP to long-term blood glucose monitoring, measurement reproducibility and lifespan are limited under clinical conditions.
한편, 대한민국 특허등록 제0958198호 에는 가역반응특성과 고친화력을 동시에 지닌 인식성분을 이용한 실시간 연속 검출장치가 기재되어 있다. 상기 검출장치를 당과 같이 분자량이 작은 물질 검출에 이용하기 위해서는, 혈당 연속검출 시 요구되는 응답시간은 최종 반응 평형상태의 95% 도달 기준으로 약 10분 이내(L. K. Gilliam 등, Diabetes. Technol. The., Vol. 11, Page S75-82, 2009)를 충족시키기 위해, 인식성분으로 혈당 검출에 적합한 항체로, 탈착반응 속도상수(kd)가 1x10-2 sec-1 정도이며, 항원-항체 결합체의 반감기는 70초 정도인(G. Schreiber, Protein-protein interactions, Biomolecular Sensors, CRC Press. 2002) 항체를 제조해야 하나, 이와 같은 반응특성을 지닌 항체는 일반적인 방법으로는 얻기 어려운 실정이다. On the other hand, Korean Patent Registration No. 0958198 describes a real-time continuous detection apparatus using a recognition component having both a reversible reaction characteristic and a high affinity. In order to use the detection device for the detection of a substance having a low molecular weight such as sugar, the response time required for continuous blood glucose detection is within about 10 minutes based on 95% of the final reaction equilibrium (LK Gilliam et al., Diabetes. Technol. ., Vol. 11, Page S75-82, 2009), which is an antibody suitable for detecting blood glucose as a recognition component, has a desorption rate constant (k d ) of about 1 × 10 −2 sec −1 , and an antigen-antibody conjugate. Although the half-life of is about 70 seconds (G. Schreiber, Protein-protein interactions, Biomolecular Sensors, CRC Press. 2002), the antibody should be prepared, but the antibody having such a reaction characteristic is difficult to obtain by the general method.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 분자량이 작은 분석물질과 신속하게 부착반응 및 탈착반응 하는 새로운 인식소재를 생산하고 이를 센서표면에 고정시키거나 혹은 반투과성 막 등으로 제한된 액체상에 가두어 수행하는 연속검출방법을 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.
Accordingly, the present inventors have made a thorough research to overcome the problems of the prior arts, and as a result, produce a new recognition material that is quickly attached and desorption reaction with a small molecular weight analyte and fixed to the sensor surface or semi-permeable membrane, etc. The present invention has been completed by developing a continuous detection method performed by confining a limited liquid phase.
본 발명의 목적은, 분석물질 검출용 미성숙 항체 제조방법을 제공하는 것이다. An object of the present invention is to provide a method for producing immature antibodies for detecting analytes.
본 발명의 다른 목적은, 상기 방법으로 제조된 분석물질 검출용 미성숙 항체를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide an immature antibody for detecting an analyte prepared by the above method.
본 발명의 다른 목적은, 상기 미성숙 항체를 이용한 연속검출장치를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a continuous detection device using the immature antibody.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 연속검출장치를 이용한 분석물질 검출 방법을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide an analyte detection method using the continuous detection device.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 분석물질 및 운반단백질을 중합시키는 단계; 상기 분석물질 및 운반단백질 중합체로 동물을 1회 또는 2회 면역화 시키는 단계; 상기 면역화된 동물의 비장으로부터 얻은 면역세포로부터 하이브리도마 세포주를 얻는 단계; 및 상기 하이브리도마 세포주로부터 미성숙 항체를 얻는 단계를 포함하는 분석물질 검출용 미성숙 항체 제조방법을 제공한다. In order to solve the above problems, the present invention comprises the steps of polymerizing the analyte and the transport protein; Immunizing the animal once or twice with the analyte and the carrier protein polymer; Obtaining a hybridoma cell line from immune cells obtained from the spleen of the immunized animal; And it provides a method for producing an immature antibody for analyte detection comprising the step of obtaining an immature antibody from the hybridoma cell line.
본 발명의 바람직한 예에 따르면, 상기 분석물질과 운반단백질의 중합비율이, 1:1 내지 1:50 몰 비율일 수 있다. According to a preferred embodiment of the present invention, the polymerization ratio of the analyte and the transport protein may be 1: 1 to 1:50 molar ratio.
본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 분석물질 검출용 미성숙 항체를 제공한다.The present invention provides an immature antibody for detecting analyte prepared by the above method.
본 발명의 바람직한 예에 따르면, 상기 분석물질은 분자량 5,000 이하인 것일 수 있다. According to a preferred embodiment of the present invention, the analyte may have a molecular weight of 5,000 or less.
본 발명의 다른 예에 따르면, 상기 분석물질은 포도당일 수 있다. According to another embodiment of the present invention, the analyte may be glucose.
본 발명의 또 다른 예에 따르면, 상기 미성숙 항체는 분석물질과 가역반응을 하는 것 일 수 있다.According to another example of the present invention, the immature antibody may be a reversible reaction with the analyte.
본 발명의 또 다른 예에 따르면, 분석물질과 미성숙 항체반응시 부착속도상수(k a )는 1×103 Lmol-1sec-1 내지 1×107 Lmol-1sec-1이고, 탈착속도상수(k d )는 1×10-5 sec-1 내지 1×10-1 sec- 1 이며,평형부착상수(K A = ka/kd)가 1×105 L/mol 이상인 것일 수 있다. According to another embodiment of the present invention, the adhesion rate constant ( k a ) in the reaction between the analyte and the immature antibody is 1 × 10 3 Lmol −1 sec −1 to 1 × 10 7 Lmol −1 sec −1 , and the desorption rate constant ( k d ) is 1 × 10 -5 sec -1 to 1 × 10 -1 sec - 1 , and the equilibrium adhesion constant ( K A = ka / kd) may be 1 × 10 5 L / mol or more.
본 발명은 상기 미성숙 항체를 포함하는 분석물질의 연속 검출장치를 제공한다.The present invention provides an apparatus for continuous detection of analyte comprising the immature antibody.
본 발명의 바람직한 예에 따르면, 상기 검출장치는 시료 유입 채널; 상기 미성숙 항체, 리간드 중합체 및 센서를 포함하는 시료 분석 사이트; 및 시료 배출 채널로 구성되며, 상기 미성숙 항체는 분석 사이트 내에 분산되어 있는 것일 수 있다. According to a preferred embodiment of the present invention, the detection device comprises a sample inlet channel; A sample analysis site comprising the immature antibody, ligand polymer and sensor; And a sample discharge channel, wherein the immature antibody may be dispersed within the assay site.
본 발명의 다른 예에 따르면, 상기 시료 분석 사이트 내로 유입된 분석물질과 리간드 중합체는 상기 미성숙 항체에 대해 경쟁적으로 부착반응 하며, 상기 센서는 상기 미성숙 항체와 리간드 중합체간 반응으로부터 발생된 신호를 탐지하는 것일 수 있다. According to another example of the present invention, the analyte and ligand polymer introduced into the sample analysis site competitively attach to the immature antibody, and the sensor detects a signal generated from the reaction between the immature antibody and the ligand polymer. It may be.
본 발명의 또 다른 예에 따르면, 상기 신호 세기가 시료 내 분석물질의 농도에 반비례하는 것일 수 있다.According to another example of the invention, the signal strength may be inversely proportional to the concentration of the analyte in the sample.
본 발명의 또 다른 예에 따르면, 상기 시료 분석 사이트는 시료 유입 채널과 반투과성 막으로 구분되는 것일 수 있다. According to another example of the invention, the sample analysis site may be divided into a sample inlet channel and a semi-permeable membrane.
한편, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 실시간 연속 검출장치를 이용한 분석물질의 실시간 연속 검출방법을 제공한다: a) 분석물질을 포함하는 시료를 상기 시료 유입 채널을 통해 시료 분석 사이트 내로 주입시키는 단계; b) 상기 분석물질을 반투과성 막을 통하여 시료 분석 사이트 내로 유입시키는 단계; c) 상기 시료 분석 사이트 내에서 분석물질을 리간드 중합체와 가역반응성 인식성분에 대해 경쟁 반응시키는 단계; d) 상기 리간드 중합체와 인식성분의 결합에 의해 발생되는 신호를 센서에 의해 탐지하는 단계; e) 시료의 계속적 유입이나 세척액의 유입에 의해 상기 시료 분석 사이트 내의 분석물질이 반투과성 막을 통하여 유출되고 동시에 분석물질과 인식성분 간의 결합이 탈착되는 단계; f) 상기 분석물질이 상기 시료 배출 채널을 통해 배출되는 단계; 및 g) 상기 분석 사이트 내 가역반응성 인식성분과 리간드 중합체를 연속적으로 재활용하여 상기 b) 내지 f) 단계를 반복함으로써 시료 내 분석물질의 농도 변화를 연속적으로 측정하는 단계.On the other hand, the present invention provides a method for real-time continuous detection of analyte using a real-time continuous detection device comprising the following steps: a) injecting a sample containing an analyte into a sample analysis site through the sample inlet channel; ; b) introducing the analyte into the sample analysis site through the semipermeable membrane; c) competitively reacting the analyte with the ligand polymer in the sample assay site for a reversible reactive component; d) detecting by a sensor a signal generated by the binding of the ligand polymer and the recognition component; e) by continuously introducing the sample or by the introduction of the washing liquid, the analyte in the sample analysis site is discharged through the semi-permeable membrane and at the same time the binding between the analyte and the recognition component is desorbed; f) discharging said analyte through said sample discharge channel; And g) continuously measuring the concentration change of the analyte in the sample by repeating steps b) to f) by continuously recycling the reversible recognizing component and the ligand polymer in the assay site.
본 발명에 따른 미성숙 항체는 분석물질 농도 변화에 따라 자발적으로 분석물질과 결합 혹은 해리하는 특성을 가지므로, 동일한 인식소재의 무한재활용이 가능하게 되고 따라서 시료 내 분석물질 농도의 연속적인 탐지가 가능한 장점이 있다.The immature antibody according to the present invention has the property of spontaneously binding or dissociating with an analyte according to an analyte concentration change, thereby enabling infinite recycling of the same recognition material, and thus, continuously detecting an analyte concentration in a sample. There is this.
도 1은 본 발명에 따른 인식소재 선별 시 상대 리간드와의 결합 및 해리에 있어서 요구되는 반응속도를 결정하는 각 종 진단마커의 반복 검출시간을 나타내는 도표이다.
도 2는 분자크기가 작은 물질에 대한 (가) 인식소재를 생산하기 위해 면역원으로 각각 다른 반응조건에서 제조한 분자량 10,000 덱스트란-KLH 중합체들; (나) 인식소재에 대한 리간드를 제조하기 위해 각각 다른 조건에서 제조한 분자량 1,000 덱스트란-BSA 리간드 중합체들; 및 (다) 말토트리오조-BSA 중합체들을 제조 후 조건에 따라 분자크기 변화를 확인하는 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 3은 도 2의 분자량 10,000 덱스트란-KLH 중합체들을 면역원으로 생쥐에 일정 간격으로 주입한 면역횟수에 따라 동물로부터 채취한 항혈청의 반응성을 도 2의 분자량 1,000 덱스트란-BSA 중합체를 리간드로 고정시킨 마이크로타이터 플레이트를 이용하여 수행한 면역분석 결과를 나타내는 도표이다.
도 4는 생쥐의 미성숙 면역계로부터 유래된 단일클론 항체들(Glu #4, #26, 그리고 #45)의 반응특이성을 분석하기 위해 (가) 운반단백질; (나) 도 2의 말토트리오즈-BSA 중합체; (다) 도 2의 NaIO4 산화반응에 의해 제조한 분자량 1,000 덱스트란-BSA 중합체; (라) 도 2의 DVS 교차결합에 의해 제조한 분자량 1,000 덱스트란-BSA 중합체; 및 (마) 분자량 10,000 덱스트란을 각각 리간드로 고정시킨 마이크로타이터 플레이트를 이용하여 수행한 면역분석 결과를 나타내는 표이다.
도 5는 항체클론 Glu #26의 분자량 1,000 덱스트란 리간드에 대한 부착 및 탈착 반응속도 특성을 비표지센서 시스템인 Octet Red를 이용하여 제조사에서 제공한 과정에 따라 분석한 도표 및 이로부터 결정한 항체의 반응속도상수이다.
도 6은 분자량 1,000 덱스트란 리간드가 고정된 센서를 Glu #26 항체(인식소재) 용액에 담가 구성한 면역센서의 포도당 분석원리 및 비표지센서 시스템 Octet Red를 이용하여 구축한 혈당 면역센서의 농도응답을 나타낸 도표이다.
도 7은 도 6에서 구축한 혈당 면역센서의 농도응답 재현성을 포도당 부재 시 그리고 농도변화 시에 측정하여 나타낸 도표이다.1 is a chart showing the repetitive detection time of various diagnostic markers for determining the reaction rate required for binding and dissociation with a partner ligand when selecting recognition materials according to the present invention.
Figure 2 is a molecular weight 10,000 dextran-KLH polymers prepared under different reaction conditions as an immunogen to produce (A) recognition material for a small molecular size material; (B) molecular weight 1,000 dextran-BSA ligand polymers prepared under different conditions to prepare ligands for the recognition material; And (c) SDS-PAGE analysis to confirm the change in molecular size according to the conditions after preparation of maltotriozo-BSA polymers.
FIG. 3 shows the reactivity of the antiserum obtained from the animal according to the number of immunizations injected into the mice at regular intervals with the molecular weight 10,000 dextran-KLH polymers of FIG. 2 immobilized with a ligand of 1,000 dextran-BSA polymers of FIG. A diagram showing the results of immunoassays performed using microtiter plates.
Figure 4 is a (a) transport protein to analyze the reaction specificity of monoclonal antibodies (
FIG. 5 is a graph of the attachment and desorption kinetics of the antibody
6 is a glucose response principle of the immunosensor composed of a sensor having a molecular weight of 1,000 dextran ligands immobilized in a solution of
FIG. 7 is a chart showing the concentration response reproducibility of the blood glucose immune sensor constructed in FIG. 6 by measuring glucose absence and concentration change.
본 발명은 분자량이 작은 분석물질과 신속하게 부착반응 및 탈착반응 하는 새로운 인식소재 및 이를 이용한 분석물질의 연속검출에 대한 것이다. 본 발명에 따르면, 분석물질 농도 변화에 따라 자발적으로 분석물질과 결합 혹은 해리하는 인식소재를 진단에 이용하므로, 동일한 인식소재의 무한재활용이 가능하게 되고 따라서 시료 내 분석물질 농도의 연속적인 탐지가 가능하게 된다.
The present invention relates to a novel recognition material for the rapid attachment and desorption reaction with analyte having a low molecular weight and continuous detection of the analyte using the same. According to the present invention, since a recognition material that spontaneously binds or dissociates with an analyte according to a change in analyte concentration is used for diagnosis, infinite recycling of the same recognition material is possible, and thus continuous detection of analyte concentration in a sample is possible. Done.
본 발명에서, 상기 분석물질이란 시료 분석 사이트에 포함되어 있는 센서를 사용하여 검출하고자 하는 목적으로 센서 표면으로 주입시키는 물질을 의미하며, 분자량 5,000 이하인 것일 수 있고, 구체적으로 시료 내 분석물질인 생명체 대사물질, 호르몬, 치료약, 마약, 핵산, 식품검사대상 물질, 환경 유해물질 또는 국방 화생방 측정물질일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 분석물질은 포도당과 같이 크기가 작은 분석물질인 것이 바람직하다.
In the present invention, the analyte means a substance injected into the surface of the sensor for the purpose of detection using a sensor included in the sample analysis site, and may have a molecular weight of 5,000 or less, and specifically, an analyte in the sample It may be a substance, a hormone, a therapeutic drug, a drug, a nucleic acid, a food test substance, an environmentally harmful substance, or a defense chemical and biological measurement substance, but is not limited thereto. The analyte is preferably a small analyte, such as glucose.
상기 인식소재란 상기 센서의 용액 내 분산 혹은 표면에 고정되어 있으면서 분석물질과 특이적으로 결합 가능한 물질로, 미성숙 항체, 항체, 수용체, 핵산, 효소, 앱타머, 펩타이드 또는 분자인쇄 인공막일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. The recognition material is a substance that can be specifically bound to the analyte while being dispersed in the solution or the surface of the sensor, and may be immature antibodies, antibodies, receptors, nucleic acids, enzymes, aptamers, peptides, or molecular printed artificial membranes. It is not limited.
특히, 상기 인식소재는 미성숙 항체일 수 있는데, 동물의 미성숙 면역계를 이용하여 항원에 대한 특이성이 높을 뿐 아니라, 분석물질과의 탈착속도가 높아 신속한 분석물질 검출이 가능하다. 동물의 미성숙 면역계를 이용한 미성숙 항체의 제조 과정을 대략적으로 설명하면 다음과 같다. In particular, the recognition material may be an immature antibody, using the animal's immature immune system not only high specificity for the antigen, but also a high rate of desorption with the analyte enables rapid analyte detection. The production process of an immature antibody using an immature immune system of an animal is described as follows.
단백질이나 병원체와 같이 크기가 큰 외래물질(즉, 면역원)을 동물 체내에 주입 시 동물의 면역계는 그 물질을 제거하기 위해 외래물질을 독특하게 인지하는 항체를 생산한다. 면역반응 초기 항체들은 일반적으로 친화력이 낮지만 면역글로블린 M 타입의 분자들이 많아 다중결합에 의해 효과적으로 외래 침입에 대응한다. 동일한 외래물질이 반복하여 침입할 경우, 면역계는 성숙되는데 특히 과도 돌연변이(hypermutation) 기작을 통해 친화력이 높은 면역글로블린 G 타입의 항체를 생산한다. When a large foreign substance (i.e., an immunogen), such as a protein or pathogen, is injected into an animal body, the animal's immune system produces antibodies that uniquely recognize the foreign substance in order to remove it. Early immune response antibodies generally have low affinity, but many immunoglobulin M-type molecules effectively cope with foreign invasion by multiple binding. When the same foreign substance invades repeatedly, the immune system matures, producing a high-affinity immunoglobulin G-type antibody, especially through a hypermutation mechanism.
이와 같이 면역계가 성숙됨에 따라 생산되는 항체의 친화력 변화는 물론 항원과 반응하는 항체의 부착 및 탈착속도의 변화도 관찰된다. 면역반응의 초기에는 즉, 외래물질이 대략 2-3주일 간격으로 3회 미만 침입 시 항원에 대한 반응속도 특히 탈착속도가 매우 빠른 항체들이 일반적으로 생산된다. 생산된 항체의 부착속도상수(k a )는 1×104 Lmol-1sec-1 내지 1×107 Lmol-1sec-1, 그리고 탈착속도상수(k d )는 ×10-3 sec-1 내지 1×10-2 sec-1 범위의 신속 반응특성을 가지는 것을 특징으로 한다. 그러나 3회 이상 반복적으로 면역반응이 유도되면 과도 돌연변이가 유발되고 이 과정에 의해 특히 항원과의 반응에서 탈착속도가 매우 느린 항체가 일반적으로 생산되기 시작한다. 이와 같은 면역계의 성숙과정에 따라 생산된 항체는 결국 친화력(KA = 부착속도상수(ka)/탈착속도상수(kd))이 현저히 증가되고 동시에 항원에 대한 특이성도 증가된다. As the immune system matures, a change in the affinity of the antibody produced as well as a change in the attachment and desorption rate of the antibody reacting with the antigen are observed. In the early stages of the immune response, that is, when foreign substances invade less than three times at intervals of approximately 2-3 weeks, antibodies to the antigens, particularly those with very high desorption rates, are generally produced. The adhesion rate constant ( k a ) of the produced antibody is 1 × 10 4 Lmol -1 sec -1 to 1 × 10 7 Lmol -1 sec -1 , and the desorption rate constant ( k d ) is × 10 -3 sec -1 To 1 × 10 −2 sec −1 . However, if the immune response is repeatedly induced three or more times, a transient mutation is induced and this process generally starts to produce antibodies with a very low desorption rate, particularly in response to antigen. Antibodies produced according to the maturation of the immune system eventually increase affinity (K A = adhesion rate constant (k a ) / desorption rate constant (k d )) and at the same time the specificity for the antigen is also increased.
반응속도가 느린 기존 항체의 경우 특히, 탈착속도가 느린 경우가 대부분인데 이 항체는 분석물질과 결합 후 분석물질 농도가 낮아지더라도 결합체의 해리가 매우 느리거나 어렵다. 이러한 반응특성은 연속측정 시 매우 긴 응답시간을 초래하거나 혹은 해리를 가속시키기 위해 가혹조건(예: 산성 pH)의 사용이 불가피하여 실시간 검출이 원천적으로 불가능하게 된다. In the case of conventional antibodies that have a slow reaction rate, in particular, the desorption rate is slow, but the antibody is very slow or difficult to dissociate even if the analyte concentration is low after binding to the analyte. These response characteristics can lead to very long response times in continuous measurements or the use of harsh conditions (eg acidic pH) to accelerate dissociation, making real-time detection inherently impossible.
그러나 미성숙 항체와 같이 부착 및 탈착 반응속도가 모두 높은 경우 분석물질의 농도에 따라 항체는 자발적으로 분석물질과 결합 혹은 결합체로부터 해리되므로 항체 및 항체를 이용한 센서의 연속재활용이 가능하게 된다. 더욱이 시료 내 농도변화가 급격한 분석물질 측정에 적용하는 경우 센서의 응답시간이 빨라지고 따라서 분석물질의 실시간 검출이 가능하게 된다. However, if both the attachment and desorption reaction rate is high, such as immature antibodies, the antibody spontaneously dissociates from the analyte or binds to the analyte depending on the concentration of the analyte, thereby enabling continuous recycling of the antibody and the sensor using the antibody. In addition, the response time of the sensor is faster when the concentration change in the sample is applied to the measurement of the analyte, thereby real-time detection of the analyte is possible.
본 발명의 상기 미성숙 항체는 분석물질과 가역반응을 하는 것 일 수 있다.The immature antibody of the present invention may be a reversible reaction with the analyte.
분석물질과 본 발명의 미성숙 항체반응시 부착속도상수(k a )는 1×103 Lmol-1sec-1 내지 1×107 Lmol-1sec-1이고, 탈착속도상수(k d )는 1×10-5 sec-1 내지 1×10-1 sec-1 이며,평형부착상수(K A = ka/kd)가 1×105 L/mol 이상인 것일 수 있다.
The adhesion rate constant ( k a ) is 1 × 10 3 Lmol -1 sec -1 to 1 × 10 7 Lmol -1 sec -1 when the analyte reacts with the immature antibody of the present invention, and the desorption rate constant ( k d ) is 1 × 10 -5 sec -1 to 1 × 10 -1 sec -1 , equilibrium adhesion constant ( K A = ka / kd) may be 1 × 10 5 L / mol or more.
구체적으로, 본 발명은 (1) 분석물질 및 운반단백질을 중합시키는 단계; (2) 상기 분석물질 및 운반단백질 중합체로 동물을 1회 또는 2회 면역화 시키는 단계; (3) 상기 면역화된 동물의 비장으로부터 얻은 면역세포로부터 하이브리도마 세포주를 얻는 단계; 및 (4) 상기 하이브리도마 세포주로부터 미성숙 항체를 얻는 단계를 포함하는 분석물질 검출용 미성숙 항체 제조방법에 대한 것이다.
Specifically, the present invention comprises the steps of (1) polymerizing the analyte and the transport protein; (2) immunizing the animal once or twice with the analyte and the carrier protein polymer; (3) obtaining a hybridoma cell line from immune cells obtained from the spleen of the immunized animal; And (4) relates to a method for producing an immature antibody for analyte detection comprising the step of obtaining an immature antibody from the hybridoma cell line.
본 발명의 미성숙 항체 제조방법을 단계별로 설명하면, 다음과 같다. When explaining the immature antibody production method of the present invention step by step.
(1) 분석물질 및 (1) analytes and 운반단백질을Transport proteins 중합시키는 단계 Polymerization step
상기 분석물질은 위에서 정의한 바와 같으며, 상기 운반단백질은 KLH(keyhole lymphet hemocyanin), BSA(bovine serum albumin), 오브알부민(ovalbumin), 그리고 면역글로불린(immunoglobulin)일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. The analyte is as defined above, and the transport protein may be keyhole lymphet hemocyanin (KLH), bovine serum albumin (BSA), ovalbumin, and immunoglobulin, but is not limited thereto.
상기 분석물질과 운반단백질은 화학반응을 통해 중합될 수 있으며, 당분자를 산화시켜 단백질에 중합시키거나, 당과 단백질을 화학적으로 교차결합 시킬 수 있다. 구체적으로, 당 분자를 NaIO4로 산화시켜 단백질에 중합시키거나(M. Barbara Wilson 등, J. Immuno. Methods, Vol. 12, Page 171-181, 1976) divinyl sulfone(DVS) cross-linker로 당과 단백질을 화학적으로 교차결합 시키는 것일 수 있다(S. Liu 등, Langmuir, Vol. 18, Page 8350-8357, 2002). The analyte and the transport protein may be polymerized through a chemical reaction, oxidize sugar molecules to polymerize to proteins, or chemically cross-link sugars and proteins. Specifically, sugar molecules are oxidized with NaIO 4 to polymerize to proteins (M. Barbara Wilson et al., J. Immuno. Methods, Vol. 12, Page 171-181, 1976) or sugars with divinyl sulfone (DVS) cross-linkers. And may be chemically crosslinked with (S. Liu et al., Langmuir, Vol. 18, Page 8350-8357, 2002).
상기 분석물질과 운반단백질의 중합비율은 1:4 내지 1:25 중량비인 것이 바람직하다. The polymerization ratio of the analyte and the transport protein is preferably 1: 4 to 1:25 weight ratio.
또한, 분석물질과 운반단백질을 중합한 후, 정제하는 것이 바람직하다.
It is also preferable to polymerize the analyte and the transport protein and then purify it.
(2) 상기 분석물질 및 (2) the analyte and 운반단백질Transport protein 중합체로 동물을 1회 또는 2회 One or two animals with polymer 면역화 시키는Immunizing 단계 step
상기 (1)에서 수득한 중합체로 동물(생쥐 등)을 일정 간격으로 면역화 시키고 그 면역횟수에 따라 동물로부터 채취한 항혈청 내 항체의 분석물질과의 반응성을 분석한다. 항혈청의 반응성이 감소하는 회차 이전에서의 면역화 된 동물의 미성숙 면역계로부터의 비장세포를 이용하여 하기 (3), (4) 단계를 수행한다. Animals (mouse, etc.) are immunized at regular intervals with the polymer obtained in (1) above, and the reactivity with the analyte of the antibody in the antiserum taken from the animal is analyzed according to the number of immunizations. The following steps (3) and (4) are carried out using splenocytes from the immature immune system of the immunized animal before the round in which the antiserum reactivity is reduced.
구체적인 예로, 분석물질이 포도당이나 덱스타란일 경우, 2차 면역화까지 면역횟수에 비례하여 증가하지만 3차 면역화부터는 대부분 감소하는 추세를 나타낸다. 이러한 동물 체내 포도당에 대한 항체의 생성은 자기인식과 같은 현상이므로 과도 돌연변이가 일어나는 3차 면역화 시기부터는 거부되는 것으로 해석된다. 따라서 2회 면역화 된 동물의 미성숙 면역계로부터 얻어진 비장세포를 이용하여 하기 단계를 수행한다.
As a specific example, when the analyte is glucose or dexteran, it increases in proportion to the number of immunizations until the second immunization, but most decreases from the third immunization. Since the production of the antibody against glucose in the animal body is the same phenomenon as self-recognition, it is interpreted that it is rejected from the third immunization stage when a transient mutation occurs. Therefore, the following steps are performed using splenocytes obtained from the immature immune system of two immunized animals.
(3) 상기 면역화된 동물의 비장으로부터 얻은 면역세포로부터 (3) from immune cells obtained from the spleen of the immunized animal 하이브리도마Hybridoma 세포주를 얻는 단계 Steps to Obtain a Cell Line
상기 (2)에서 수득한 B-세포 등의 면역세포를 단일클론 생산 표준공정에 기반하여 암세포와 융합하고, HAT 스크리닝 과정에 의해 융합된 하이브리도마 세포를 획득할 수 있다. Immune cells, such as B-cells obtained in (2) above, may be fused with cancer cells based on a monoclonal production standard process, and fused hybridoma cells may be obtained by a HAT screening process.
단일클론 세포는 제한희석(limiting dilution) 과정을 통하여 획득할 수 있으며, 각 세포로부터 생산되는 단일클론 항체의 반응특성을 분석하기 면역분석을 실시하여, 분석물질과 특이적으로 반응하는 항체를 선별한다.
Monoclonal cells can be obtained through a limiting dilution process, and an immunoassay is performed to analyze the reaction characteristics of monoclonal antibodies produced from each cell, and to select antibodies that specifically react with the analyte. .
(4) 상기 하이브리도마 세포주로부터 미성숙 항체를 얻는 단계(4) obtaining immature antibodies from the hybridoma cell line
본 단계는 항원과 특이하게 반응하는 항체 중에서 항원의 농도변화에 따라 항원과의 부착 및 탈착이 신속한 가역반응성 항체를 선별하기 위한 과정이다. This step is a process for screening reversible antibodies for rapid attachment and desorption with antigens according to antigen concentration changes among antibodies that specifically react with antigens.
본 단계에서는 실시간 반응결합을 추적할 수 있는 선별시스템을 이용할 수 있으며, 구체적으로 Bio-Layer Interferometry(BLI) 센서와 같은 비표지 센서가 장착된 선별시스템을 이용하여 부착 및 탈착 반응속도를 실시간으로 측정할 수 있다.In this step, a screening system that can track real-time reaction binding can be used. Specifically, a screening system equipped with a non-labeled sensor such as a Bio-Layer Interferometry (BLI) sensor is used to measure the rate of attachment and desorption in real time. can do.
선별된 항체는 그 농도 변화(증가 혹은 감소)를 단지 원동력으로 비표지 센서에 고정된 항원과 반응하며 반응이 유도된 후 불과 수 분 내에 새로운 평형상태에 도달한다. 새로운 평형에 도달하는 요구 시간(최종 평형상태의 95% 기준)은 시료 내 분석물질의 농도 증감 속도와 의료진단의 경우 임상조건에 따라 변화된다(도 1 참조). 본 발명의 예시로서, 연속 혈당측정에 적합하도록 선별한 단일클론 항체(Glu #26)의 반응특성(부착반응속도상수(k a ), 탈착반응속도상수(k d ), 그리고 부착평형상수(KA = k a /k d ))을 도 5의 나에 제시하였다. 항체의 부착반응속도상수는 평균 4.15x104 M-1s-1, 탈착속도상수는 평균 1.10x10-2 s-1인데, 부착반응속도는 속도상수(k a )뿐만 아니라 반응물의 농도에 의해 조절되는 반면에 탈착반응속도는 단지 속도상수(k d )에 의해서만 결정된다. 따라서 혈당측정 시 요구되는 항체의 반응특성 중 매우 빠른 탈착속도상수가 가장 중요한 요소 중 하나이다.Selected antibodies react only with the concentration change (increase or decrease) to the antigen immobilized on an unlabeled sensor with the sole motive force and reach a new equilibrium within minutes after the reaction is induced. The time required to reach a new equilibrium (based on 95% of the final equilibrium) will vary depending on the rate of increase or decrease of the concentration of the analyte in the sample and, in the case of medical diagnosis, clinical conditions (see FIG. 1). As an example of the present invention, the reaction characteristics (adhesion rate constant ( k a ), desorption rate constant ( k d ), and equilibrium equilibrium constant (K k ) of monoclonal antibodies (Glu # 26) selected for continuous blood glucose measurement A = k a / k d )) is presented in Figure 5b. Adhesion rate constant of antibody is 4.15x10 4 M -1 s -1 and desorption rate constant is 1.10x10 -2 s -1 on average, and the rate of adhesion reaction is controlled by reaction rate as well as rate constant ( k a ) On the other hand, the rate of desorption reaction is only determined by the rate constant ( k d ). Therefore, the very fast desorption rate constant is one of the most important factors among the reaction characteristics of antibodies required for blood glucose measurement.
본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 분석물질 검출용 미성숙 항체를 제공한다.
The present invention provides an immature antibody for detecting analyte prepared by the above method.
또한, 본 발명은 상기 미성숙 항체를 포함하는 분석물질의 연속 검출장치에 대한 것이다. In addition, the present invention relates to a continuous detection device of the analyte containing the immature antibody.
상기 검출장치는 시료 유입 채널; 상기 미성숙 항체, 리간드 중합체 및 센서를 포함하는 시료 분석 사이트; 및 시료 배출 채널로 구성되며, 상기 미성숙 항체는 분석 사이트 내에 분산되어 있는 것일 수 있다. The detection device comprises a sample inlet channel; A sample analysis site comprising the immature antibody, ligand polymer and sensor; And a sample discharge channel, wherein the immature antibody may be dispersed within the assay site.
상기 시료 분석 사이트 내로 유입된 분석물질과 리간드 중합체는 상기 미성숙 항체에 대해 경쟁적으로 부착반응 하며, 상기 센서는 상기 미성숙 항체와 리간드 중합체간 반응으로부터 발생된 신호를 탐지하는 것일 수 있다. The analyte and ligand polymer introduced into the sample analysis site competitively attach to the immature antibody, and the sensor may detect a signal generated from the reaction between the immature antibody and the ligand polymer.
상기 경쟁적 부착반응의 한 예로서, 분석계는 BLI 비표지 센서 표면에 고정된 포획 리간드(덱스트란(11))-운반단백질(12) 중합체, 일정 농도의 당 특이항체(Glu #26(10)), 그리고 시료에 포함된 포도당(13)으로 구성된다(도 6, 가). 포획 리간드는 액체상의 당 특이항체에 부착반응하기 위해 표준시료 내에 포함된 포도당 분자(임상시료 농도범위: 10-1,000 mg/dL)와 경쟁한다. 따라서 시료 내 포도당 농도가 증가하면 포획 리간드에 대한 항체의 부착이 억제되므로 비표지 센서로부터의 신호는 감소하게 된다(도 6, 나). 결국, 센서 신호가 포도당 농도에 반비례하는 표준곡선을 얻을 수 있고, 이 표준곡선은 미지의 임상시료에 포함된 포도당 농도를 측정하기 위해 사용된다. As an example of this competitive attachment reaction, the assay system captures a ligand (dextran (11))-carrier protein (12) polymer, a concentration of sugar specific antibody (Glu # 26 (10)) immobilized on a BLI unlabeled sensor surface. And it consists of glucose 13 contained in the sample (FIG. 6, a). The capture ligand competes with the glucose molecule (clinical sample concentration range: 10-1,000 mg / dL) contained in the standard sample for attachment reaction to liquid sugar specific antibody. Therefore, when the concentration of glucose in the sample is increased, the adhesion of the antibody to the capture ligand is inhibited, so that the signal from the unlabeled sensor is reduced (Fig. 6, B). As a result, a sensor signal can obtain a standard curve inversely proportional to the glucose concentration, which is used to measure the glucose concentration contained in the unknown clinical sample.
이와 같은 혈당검출 면역센서는 임상 농도범위의 포도당 측정에 이용될 수 있을 뿐만 아니라 체내 혈당농도 변화를 추적하는데 필요한 센서의 응답속도도 충족시킬 수 있다. 특히, 당뇨 환자의 경우 식사 직후 포도당 농도는 전형적으로 2 mg dL-1min-1 속도로 증가한다. 연속 혈당측정 시 센서는 혈당 농도변화 속도와 같거나 더 빠른 응답속도를 나타내어야 실시간 모니터링이 가능하게 된다. 본 발명을 통해 생산된 당 특이항체(Glu #26)의 반응특성은(도 5, 나 참조) 포도당 측정을 위해 사용될 수 있는 후보 인식물질로 알려진 Con A의 특성과 매우 유사하다. Glu #26의 탈착반응 속도상수(koff)로부터 계산된 항원-항체 반응결합체의 반감기는 약 70초인데 이것은 연속 혈당측정의 필요조건을 충족시킬 수 있는 것으로 판단된다.
Such a glucose detection immunosensor can be used not only to measure glucose in the clinical concentration range, but also to satisfy the response speed of the sensor necessary for tracking changes in blood glucose levels in the body. In particular, for diabetics, glucose concentrations typically increase at a rate of 2 mg dL −1 min −1 immediately after eating. In the case of continuous blood glucose measurement, the sensor should display a response speed that is equal to or faster than the rate of change in blood glucose concentration to enable real-time monitoring. The reaction characteristics of the sugar-specific antibody (Glu # 26) produced through the present invention (see FIG. 5, B) are very similar to those of Con A, which is known as a candidate recognizer that can be used for glucose measurement. The half-life of the antigen-antibody reactant calculated from the desorption rate constant (k off ) of
상기 시료 분석 사이트는 시료 유입 채널과 반투과성 막으로 구분되는 것일 수 있다.The sample analysis site may be divided into a sample inflow channel and a semipermeable membrane.
본 발명의 미성숙 항체(10)는 시료 내 분석물질(13)인 포도당과 같은 생명체 대사물질, 단백질, 호르몬, 핵산, 세포, 식품검사대상 물질, 환경 유해물질 또는 국방 화생방 측정물질과 신속하게 반응하는 것을 특징으로 한다. 또한 미성숙 항체가 장착된 상기 센서는 포획리간드(11)-인식성분(10) 결합체로부터 발생된 신호를 직접 탐지하는 비표지 센서(14) (도 6의 (가) 참조), 또는 포획리간드(11)-인식성분(10) 결합체 밀도에 비례하여 신호를 발생시키는 표지물질을 경유하여 탐지하는 표지 센서인 것을 특징으로 한다. 상The
본 발명에서, 상기 비표지 센서는 포획리간드(11)-인식성분(10) 결합체에 비례하여 변화하는 센서 상의 질량, 진동자의 저항, 전하분포 변화에 의한 표면 왜곡, 에너지 전달 등을 신호로서 측정한다. 센서표면의 결합체 질량 변화에 따라 광 굴절각 차이를 나타내는 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance; SPR) 센서 (Robert Karlsson 등, Journal of Immunological Methods, Vol. 145, Page 229-240, 1990), 진동자의 저항이나 전하분포를 감지하는 캔틸레버(cantilever) 센서 (Hans-Jurgen Butt, Journal of Colloid and Interface Science, Vol. 180, Page 251-260, 1996), 광도파로(evanescent) 센서 (R. G. Eenink 등, Analytica Chimica Acta, Vol. 238, Page 317-321, 1990), 나아가 나노차원의 선 혹은 간격을 이용한 나노센서 (Fengli Qu 등, Biosensors and Bioelectronics, Vol. 22, Page 1749-1755, 2007) 등이 비표지 센서로 사용될 수 있다.In the present invention, the unlabeled sensor measures as a signal the mass on the sensor that changes in proportion to the capture ligand (11) -recognition component (10) combination, the resistance of the vibrator, the surface distortion caused by the charge distribution change, energy transfer, and the like as a signal. . Surface plasmon resonance (SPR) sensors (Robert Karlsson et al., Journal of Immunological Methods, Vol. 145, Page 229-240, 1990), which show differences in optical refraction angles with changes in the mass of the conjugate on the sensor surface, Cantilever sensors for detecting charge distribution (Hans-Jurgen Butt, Journal of Colloid and Interface Science, Vol. 180, Page 251-260, 1996), evanescent sensors (RG Eenink et al., Analytica Chimica Acta, Vol. 238, Page 317-321, 1990), as well as nanosensors using nano-dimensional lines or spacing (Fengli Qu et al., Biosensors and Bioelectronics, Vol. 22, Page 1749-1755, 2007), may be used as unlabeled sensors. Can be.
또한, 상기 표지 센서는 포획리간드(11)-인식성분(10) 결합체에 비례하여 신호를 발생시키기 위해 인식성분에 표지물질을 표지하여 반응시킨 후 표지물질로부터의 신호를 측정한다. 신호를 발생시키는 표지물질로는 형광체, 발광체, 효소, 금속입자, 플라스틱 입자, 자성입자 등이 사용되며 이로부터 발생되는 형광, 발광, 발색, 전기화학, 자기장 등을 탐지하는 센서가 표지 센서로 사용될 수 있다.
In addition, the label sensor measures the signal from the labeling material after reacting the labeling material with the labeling component in order to generate a signal in proportion to the capture ligand 11-
이와 같은 새로운 개념의 미성숙 항체 기반의 면역센서는 질병이나 증세에 대한 실시간 모니터링을 가능하게 하므로 현존하는 거의 모든 면역분석시스템들이 안고 있는 한번 사용한 후 폐기하는 1회용 성능의 한계를 극복할 수 있고 인체의 만성질병 혹은 고위험군 환자에 대한 연속적인 감시가 가능하게 된다. 더욱이 현재의 진단체계에서 진단결과를 얻기 위해 시간이 오래 걸리고 또한 환자상태 감지 데이터를 실험실에서 분석할 필요가 있을 경우 진찰시점과 진료결과가 나오는 시간의 차이가 많아서 정확한 질병진단이나 적시 치료에 어려움이 많은 문제점을 해결할 수 있다.This new concept of immature antibody-based immunosensors enables real-time monitoring of diseases and conditions, thus overcoming the limitations of disposable performance that can be discarded once used and discarded by almost all existing immunoassay systems. Continuous monitoring of chronic or high risk patients is possible. In addition, if the current diagnosis system takes a long time to obtain a diagnosis result and the patient condition detection data needs to be analyzed in the laboratory, there is a large difference in time between the time of examination and the result of the diagnosis, which makes it difficult to accurately diagnose or timely treat the disease. Many problems can be solved.
또한 본 발명의 미성숙 항체 기반의 면역센싱 기술은, 생명체 대사물질, 호르몬, 핵산, 식품검사대상 물질, 환경 유해물질 또는 국방 화생방 측정물질 등을 분석하는데 활용될 수 있는데, 산업분야 별 제품군을 예시로서 정리하면 다음과 같다. 의료진단 산업으로는, 고위험군(만성질환자, 노인, 중환자) 연속진단시스템 제품, 당뇨환자 감염 연속진단시스템 제품, 그리고 좌변기 건강모니터링 시스템 제품 등을 들 수 있다. 인공장기 산업으로는, 인공췌장 제어시스템 제품 등 인공장기 제어 등에 적용할 수 있다. 환경 산업으로는, 강물, 연안, 해양 오염 연속감시시스템 제품 등을 들 수 있다. 생물 및 식품 산업으로는, 생물공정 연속모니터링시스템 제품과 식품 생산공정 연속모니터링시스템 제품 등에 적용될 수 있다.
In addition, the immature antibody-based immunosensing technology of the present invention can be used to analyze biological metabolites, hormones, nucleic acids, food test substances, environmentally harmful substances or defense chemicals and defense substances, and the like by way of example In summary, it is as follows. The medical diagnosis industry includes high-risk (chronic, elderly, critically ill) continuous diagnosis system products, diabetes patient infection continuous diagnosis system products, and toilet seat health monitoring system products. The artificial organs industry can be applied to artificial organ control such as artificial pancreas control system products. Examples of the environmental industry include river water, coastal and marine pollution continuous monitoring system products. As the biological and food industry, it can be applied to the bioprocess continuous monitoring system products and the food production process continuous monitoring system products.
한편, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 실시간 연속 검출장치를 이용한 분석물질의 실시간 연속 검출방법에 대한 것이다:On the other hand, the present invention relates to a method for real-time continuous detection of analyte using a real-time continuous detection device comprising the following steps:
a) 분석물질을 포함하는 시료를 상기 시료 유입 채널을 통해 시료 분석 사이트 내로 주입시키는 단계; b) 상기 분석물질을 반투과성 막을 통하여 시료 분석 사이트 내로 유입시키는 단계; c) 상기 시료 분석 사이트 내에서 분석물질을 리간드 중합체와 가역반응성 인식성분에 대해 경쟁 반응시키는 단계; d) 상기 리간드 중합체와 인식성분의 결합에 의해 발생되는 신호를 센서에 의해 탐지하는 단계; e) 시료의 계속적 유입이나 세척액의 유입에 의해 상기 시료 분석 사이트 내의 분석물질이 반투과성 막을 통하여 유출되고 동시에 분석물질과 인식성분 간의 결합이 탈착되는 단계; f) 상기 분석물질이 상기 시료 배출 채널을 통해 배출되는 단계; 및 g) 상기 분석 사이트 내 가역반응성 인식성분과 리간드 중합체를 연속적으로 재활용하여 상기 b) 내지 f) 단계를 반복함으로써 시료 내 분석물질의 농도 변화를 연속적으로 측정하는 단계.
a) injecting a sample comprising an analyte into the sample analysis site through the sample inlet channel; b) introducing the analyte into the sample analysis site through the semipermeable membrane; c) competitively reacting the analyte with the ligand polymer in the sample assay site for a reversible reactive component; d) detecting by a sensor a signal generated by the binding of the ligand polymer and the recognition component; e) by continuously introducing the sample or by the introduction of the washing liquid, the analyte in the sample analysis site is discharged through the semi-permeable membrane and at the same time the binding between the analyte and the recognition component is desorbed; f) discharging said analyte through said sample discharge channel; And g) continuously measuring the concentration change of the analyte in the sample by repeating steps b) to f) by continuously recycling the reversible recognizing component and the ligand polymer in the assay site.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. Since these examples are only for illustrating the present invention, the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.
실험재료Experimental material
본 발명의 실시예를 위해 사용된 재료 및 구입처는 다음과 같다. 덱스트란(분자량: 1,000 및 10,000), 말토트리오조(maltotriose), 포도당(D(-)glucose), divinyl sulfone (DVS), Sephadex (G-15, G-25, G-50, 및 G-100), Con A, HAT 배지보완제(medium supplement), 염소 항 생쥐 IgG 항체(goat anti-mouse IgG antibody; whole IgG에 대해 특이)-horseradish peroxidase(HRP) 중합체, 3,3,5,5-tetramethylbenzidine (TMB), casein (sodium salt 형태, 우유로부터 추출), 우혈청 알브민(bovine serum albumin; BSA), keyhole limpet hemocyanin (KLH), 그리고 polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Tween 20)는 시그마 사(St. Louis, MO)로부터 구입되었다. 총 IgG 정량키트(mouse IgG core ELISA) 및 HRP는 KOMA Biotech 사(한국 서울)로부터 공급되었다. Octet Red aminopropylsilane (APS) 센서 팁 및 샘플 희석액은 ForteBio 사(San Francisco, CA)에서 구입되었고, NaIO4, NaCNBH3, 그리고 glycoprotein detection reagent(GDR)는 Pierce(Rockford, IL)에서 구매되었다. Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) 및 태아 우 혈청(fetal bovine serum; FBS)은 Welgene 사(한국 대구) 및 PAA Laboratory 사(캐나다 온타리오)로부터 각각 공급되었다. 본 발명에서 사용된 그 외 다른 시약들은 분석등급을 사용하였다.
Materials used and purchased for the embodiments of the present invention are as follows. Dextran (molecular weight: 1,000 and 10,000), maltotriose, glucose (D (-) glucose), divinyl sulfone (DVS), Sephadex (G-15, G-25, G-50, and G-100 ), Con A, HAT medium supplement, goat anti-mouse IgG antibody (specific for whole IgG) -horseradish peroxidase (HRP) polymer, 3,3,5,5-tetramethylbenzidine (TMB), casein (sodium salt form, extracted from milk), bovine serum albumin (BSA), keyhole limpet hemocyanin (KLH), and polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Tween 20) are available from St. Louis, MO). Total IgG core ELISA and HRP were supplied from KOMA Biotech (Seoul, Korea). Octet Red aminopropylsilane (APS) sensor tips and sample dilutions were purchased from ForteBio (San Francisco, Calif.) And NaIO 4 , NaCNBH 3 , and glycoprotein detection reagent (GDR) were purchased from Pierce (Rockford, IL). Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) and fetal bovine serum (FBS) were supplied from Welgene (Cod, Korea) and PAA Laboratory (Ont., Canada), respectively. Other reagents used in the present invention used analytical grade.
실시예Example 1. 다당류 성분과 1. Polysaccharide Ingredients 운반단백질Transport protein 간 중합체 제조 Liver polymer manufacturing
두 종류의 덱스트란(분자량 1,000 및 10,000)과 말토트리오즈를 운반단백질과 화학적으로 중합시켰다. 운반단백질은 동물면역화 목적인 경우 KLH를 그리고 포획 리간드로 이용할 목적인 경우 BSA를 사용하였다. 이러한 목적을 위해 다음과 같은 다른 두 화학적 중합방법이 이용되었다.
Two types of dextran (molecular weight 1,000 and 10,000) and maltotriose were chemically polymerized with the carrier protein. The carrier protein was KLH for animal immunization and BSA for capture ligand. Two other chemical polymerization methods have been used for this purpose.
Periodate 산화 방법. 두 종류의 덱스트란을 먼저 10 내지 100 mM 최종 농도로 탈이온수(DIW; 100 mL)에 용해시킨 NaIO4로 각각 산화시켰다. 1시간 동안 반응시킨 후, 과량의 NaIO4는 140 mM NaCl을 포함한 10 mM 인산 완충용액(pH 7.4; PBS)에 대해 30분 씩 2회 투석과정을 통하여 제거되었다. 별도의 제시가 없는 경우, 모든 반응은 실온에서 orbital shaker 위에서 수행되었다. 이와 같이 산화된 각 덱스트란에 대해 280배 과량 몰 비율로 KLH와 혼합한 후 50 mM NaCNBH3를 포함한 PBS 내에서 10시간 동안 중합 반응시켰다. 동일한 과정이 덱스트란과 BSA 간의 중합에도 이용되었다. 중합 반응 후 PBS에 대해 투석시켰고, 중합되지 않은 덱스트란 성분은 젤 칼럼(BSA 중합체의 경우 Sephadex G-50 젤 및 KLH 중합체의 경우 Sephadex G-100 젤)을 통해 분리되었다. Bradford 방법을 이용한 유출분획 분석 후, 단백질 성분을 포함한 분획들을 모아서 약 1 mg/mL 단백질 농도가 되도록 농축시켰다. 농축액들은 소량으로 나누어 신속히 얼린 후 보관하였다. 또한, 말토트리오즈도 분자량 1,000 크기의 덱스트란-BSA 중합체 합성과정과 동일한 조건 하에서 중합되었다.
Periodate oxidation method. Two types of dextran were first oxidized with NaIO 4 dissolved in deionized water (DIW; 100 mL) first at a final concentration of 10-100 mM. After reacting for 1 hour, the excess NaIO 4 was removed through two dialysis procedures for 30 minutes for 10 mM phosphate buffer (pH 7.4; PBS) containing 140 mM NaCl. Unless otherwise indicated, all reactions were performed on an orbital shaker at room temperature. The oxidized dextran was mixed with KLH in a 280-fold excess molar ratio and then polymerized in PBS containing 50 mM NaCNBH 3 for 10 hours. The same procedure was used for the polymerization between dextran and BSA. Dialysis was carried out against PBS after the polymerization reaction and unpolymerized dextran components were separated through a gel column (Sephadex G-50 gel for BSA polymer and Sephadex G-100 gel for KLH polymer). After runoff fraction analysis using the Bradford method, fractions containing protein components were collected and concentrated to a protein concentration of about 1 mg / mL. The concentrates were divided into small portions and quickly frozen and stored. Maltotriose was also polymerized under the same conditions as the synthesis of dextran-BSA polymer having a molecular weight of 1,000.
DVS 를 이용한 가교반응 . 두 종류의 덱스트란(각 1 mM)을 100 mM carbonate 완충용액(pH 10.3)에 각각 용해시킨 후 여기에 10 내지 250 과량 몰 비율의 DVS를 첨가하여 화학적으로 활성화시켰다. 이 혼합물을 37에서 2시간 동안 반응시킨 후 PBS에 대해 2회 투석시켜 과량의 DVS를 제거하였고 또한 pH를 낮추었다. KLH 혹은 BSA와 중합시키기 위해, 그 단백질을 당 성분이 280배 과량 몰 비율이 되도록 첨가하였고 37에서 10시간 동안 반응시켰다. 분자량 10,000인 덱스트란에 대해, 그 최종 반응물을 PBS에 대해 2회 투석시킨 후 반응하지 않은 당 성분은 위에서 언급한 바와 같이 젤 칼럼(10 mL) 상에서 분리시켰다. 단백질을 포함한 분획들을 모아서 농축시켰고 위에서와 같이 얼려 보관하였다. 말토트리오즈도 같은 과정에 의해 단백질과 중합시켰고 당 과량 몰 비율은 5,000배 까지 사용하였다.
Cross-linking reaction using a DVS. Two types of dextran (1 mM each) were dissolved in 100 mM carbonate buffer (pH 10.3), respectively, and then chemically activated by adding 10 to 250 excess molar ratio DVS. The mixture was reacted for 2 hours at 37 and then dialyzed twice against PBS to remove excess DVS and lower the pH. To polymerize with KLH or BSA, the protein was added so that the sugar component was in 280-fold excess molar ratio and reacted for 37 to 10 hours. For dextran having a molecular weight of 10,000, the final reaction was dialyzed twice against PBS and the unreacted sugar component was separated on a gel column (10 mL) as mentioned above. Fractions containing protein were collected and concentrated and stored frozen as above. Maltotriose was also polymerized with the protein by the same procedure and the excess molar ratio was used up to 5,000 times.
합성된 모든 중합체들에 대해 그 분자크기 변화 여부를 확인하기 위해 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE) 방법을 이용하여 분석하였다(도 2). 제조한 모든 중합체에 대해, 운반단백질 대비 당 성분의 중합비율이 증가할수록 중합체 밴드의 분자크기는 비례하여 증가하는 것으로 나타났고 이로부터 중합반응이 매우 효과적으로 진행됨을 알 수 있었다.
All the synthesized polymers were analyzed by using sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) method to determine the molecular size change (FIG. 2). For all the prepared polymers, the molecular size of the polymer band was increased proportionally as the polymerization ratio of the sugar component to the carrier protein increased, indicating that the polymerization proceeded very effectively.
중합비율 결정. 제조한 당-단백질 중합체의 중합비율을 결정하기 위해 당 및 단백질의 함유량을 분석하였다. 먼저, 표준곡선을 작성하기 위해 당 원료성분(각 50 mL)을 10 내지 2,000 mg/mL 농도가 되도록 PBS로 희석하였고 실온에서 15분 간 NaIO4(최종 50 mM)로 산화시켰다. 이와 같이 산화된 성분들에 1 M NaOH 용액에 용해된 0.5% GDR(150 mL)을 첨가한 후 1시간 동안 반응시켰고, 각 발색된 색조밀도를 흡광도 400 nm에서 측정하였다. 각 중합체의 단백질 함량은 Bradford 분석법에 의해 측정되었다(J. M. Walker 및 N. J. Kruger, The Protein Protocols Handbook, Humana Press, 1996). 이 결과를 각 성분에 대해 표준곡선을 작성하였고 미지 시료의 정량에 적용하였다. Determination of the polymerization ratio. The content of sugar and protein was analyzed to determine the polymerization ratio of the prepared sugar-protein polymer. First, sugar raw materials (50 mL each) were diluted with PBS to a concentration of 10 to 2,000 mg / mL to prepare a standard curve and oxidized with NaIO 4 (final 50 mM) for 15 minutes at room temperature. The oxidized components were added with 0.5% GDR (150 mL) dissolved in 1 M NaOH solution and reacted for 1 hour, and each color tone density was measured at 400 nm of absorbance. Protein content of each polymer was determined by Bradford assay (JM Walker and NJ Kruger, The Protein Protocols Handbook , Humana Press, 1996). These results were drawn to the standard curve for each component and applied to the quantification of unknown samples.
전형적으로 30 mM 혹은 50 mM NaIO4 조건에서 합성한 덱스트란-BSA 중합체에 적용한 결과 평균 중합비율은 각각 몰 비로 4.1 혹은 22인 것으로 결정되었고 이 중합체들을 아래 실험에서 포획 리간드로 사용하였다.
Application to dextran-BSA polymers typically synthesized at 30 mM or 50 mM NaIO 4 conditions resulted in an average polymerization ratio of 4.1 or 22 in molar ratios, respectively, which were used as capture ligands in the experiments below.
실시예Example 2. 생쥐 단일클론 항체 생산 2. Mouse Monoclonal Antibody Production
생쥐 면역화. 덱스트란에 특이한 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제작을 위해 면역화 횟수를 제외하고는 통상적인 표준방법에 따라 실시하였다. 구체적으로, 위에서 제조한 덱스트란(분자량 10,000)-KLH 중합체(각 생쥐에 대해 매번 80 mg/mL)를 생후 6주된 암컷 BALB/c 생쥐 4마리의 복강에 면역원으로 주사하여 면역시킨 후 2주 간격으로 2회 부스팅하였다. 면역 활성시험을 위해, 면역화 전에 그리고 각 부스팅 후 7일째 각 생쥐로부터 항혈청 시료를 채취하였다.
Mice Immunization. Except for the number of immunizations, the preparation of hybridoma cells producing monoclonal antibodies specific for dextran was carried out according to conventional standard methods. Specifically, the dextran (molecular weight 10,000) -KLH polymer prepared above (80 mg / mL each time for each mouse) was immunized by injection into the abdominal cavity of four 6-week-old female BALB / c mice with an immunogen, followed by a 2-week interval. Boosted twice. For immune activity testing, antisera samples were taken from each mouse before immunization and 7 days after each boost.
면역분석을 통한 항혈청 반응성 시험. 효소면역분석(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)을 실시하고자, 덱스트란(분자량 10,000)-BSA 중합체(1 mg/mL)를 PBS로 희석하였고 마이크로타이터 플레이트의 각 웰(100 mL 씩)에 분주하였다. 그 플레이트를 100% 습도가 유지되는 밀폐상자 내에 넣어 37에서 1시간 동안 반응시킨 후 탈이온수로 세척하였다. 이러한 조건은 특별히 언급이 없는 한 아래 과정에서도 동일하게 사용되었다. 잔여표면은 Casein-PBS(200 mL)으로 블로킹 되었다. 생쥐에서 채취된 항혈청을 0.1% tween 20이 포함된 Casein-PBS(Casein-PBS-TW)으로 1,000배 희석하였고 각 웰 내에 분주하였다(100 mL). 반응 후, HRP와 중합된 염소 항 생쥐 IgG 항체를 순차적으로 반응시켰다. 마지막으로, TMB를 포함한 HRP 효소기질 용액(100 mL)을 실온에서 15분 간 반응시킨 후 2 M 황산용액(50 mL)을 넣어 발색반응을 중지시켰다. 발색 색조밀도는 흡광도 450 nm에서 마이크로타이터 플레이트 리더기(VERSA max, Molecular Device 사; 미국 Sunnyvale)로 측정하였다. 음성 배경신호를 제하기 위해, 동일한 과정을 BSA가 코팅된 웰로 반복하였다. Antisera reactivity test via immunoassay. To perform an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), dextran (molecular weight 10,000) -BSA polymer (1 mg / mL) was diluted with PBS and dispensed into each well of the microtiter plate (100 mL each). It was. The plate was placed in an airtight box maintained at 100% humidity and reacted at 37 for 1 hour, followed by washing with deionized water. These conditions were used equally in the following procedures unless otherwise noted. The remaining surface was blocked with Casein-PBS (200 mL). Antisera from mice was diluted 1000-fold with Casein-PBS (Casein-PBS-TW) containing 0.1% tween 20 and dispensed into each well (100 mL). After the reaction, HRP and polymerized goat anti mouse IgG antibodies were reacted sequentially. Finally, HRP enzyme substrate solution containing TMB (100 mL) was reacted at room temperature for 15 minutes, and then 2 M sulfuric acid solution (50 mL) was added to stop the color reaction. Color tone density was measured with a microtiter plate reader (VERSA max, Molecular Device; Sunnyvale, USA) at
면역화가 진행됨에 따라 다른 동물로부터 채취된 항혈청의 덱스트란에 대한 반응성은 대부분 두 번째 면역화까지 증가하였다(도 3). 그 후, 면역화 된 동물에 따라 약간의 차이는 있지만 덱스트란에 대한 반응성은 대부분 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 덱스트란이 포도당의 폴리머 분자이기 때문에 본 발명자들에게 매우 흥미로운 것으로 인식되었다. 즉, 동물의 면역계는 체내에 존재하는 포도당 유도체에 대해서는 항체 생성을 조절 혹은 억제하는 것으로 예측되었다. 따라서 항체생산을 위한 다음 과정에서는 덱스트란에 대해 면역화 상태가 고조된 그러나 면역계가 미성숙 된 2회 면역화 된 생쥐를 이용하였다.
As the immunization progressed, the responsiveness of the antisera from other animals to dextran mostly increased until the second immunization (FIG. 3). Subsequently, although there was a slight difference depending on the immunized animal, the responsiveness to dextran was found to decrease mostly. This result was recognized to be very interesting to the inventors because dextran is a polymer molecule of glucose. In other words, the immune system of animals was expected to regulate or inhibit the production of antibodies to glucose derivatives present in the body. Therefore, the next step for antibody production was to use two immunized mice with high immunization against dextran but immature immune system.
세포 융합 및 하이브리도마 세포 선별. 2회 면역화 후 3일째에 생쥐를 희생시켜 비장을 적출하여 얻은 비장세포를 마이앨로마(myeloma) 세포주(Sp2/0 Ag14)와의 세포융합을 실시하였다. 융합된 하이브리도마 세포는 HAT 선택과정을 이용하여 스크리닝되었고 이로부터 생산된 항체들의 반응성은 고정된 항원을 이용한 ELISA 법을 통해 위에서 설명된 바와 같이 측정되었다. 여러 다른 반응성을 지닌 항체를 생산하는 하이브리도마 클론들을 미리 선별한 후 제한희석 과정을 이용하여 단일클론으로 분리하였다. 각 배양배지(10% FBS를 포함한 DMEM) 내 각 항체 농도는 IgG 정량키트를 이용하여 결정되었다.
Cell Fusion and Hybridoma Cell Screening. Three days after the two immunizations, the spleens were obtained by sacrifice of mice and splenocytes were subjected to cell fusion with a myeloma cell line (Sp2 / 0 Ag14). Fusion hybridoma cells were screened using the HAT selection procedure and the reactivity of the antibodies produced therefrom was measured as described above via ELISA using immobilized antigen. Hybridoma clones producing antibodies with different reactivity were preselected and isolated into monoclones using a restriction dilution process. Each antibody concentration in each culture medium (DMEM with 10% FBS) was determined using an IgG quantitative kit.
반응특이성 시험. DVS 교차중합을 통해 합성된 덱스트란(분자량 10,000)-KLH 중합체로 면역화 시켜 얻어진 하이브리도마 클론들로부터 3클론 즉 Glu 4, 26, and 45를 선별하였다. 마이크로 웰 내에 PBS로 희석한 다음 성분들(각 1 mg/mL)을 첨가하여 코팅하였다. 비특이 반응에 대한 대조군으로 BSA 및 KLH, 말토트리오즈-BSA 중합체, 다른 화학반응을 통해 제조한 덱스트란(분자량 1,000)-BSA 중합체, 그리고 분자량 10,000인 덱스트란을 이용하였다. 잔여표면을 Casein-PBS로 코팅한 후, 세포배양액에서 생산된 항체를 Casein-PBS-TW으로 10배 희석하여 반응시켰고 그리고 HRP로 표지된 염소 항 생쥐 IgG 항체를 순차적으로 반응시켰다. 그 다음 과정은 위에서 항혈청 반응성 시험(ELISA)에 대해 설명한 바와 같다. Response specificity test. Three clones,
반응성 시험 결과를 보면(도 4), 그 항체들은 운반단백질과는 반응하지 않는 클론들로부터 선별되었기 때문에 BSA 및 KLH와는 비특이 반응을 하지 않았다(도 4, 가). 시험된 항체들은 우선 포도당 분자가 1,4-결합 형태로 중합된 말토트리오즈와는 전혀 반응하지 않았다(도 4, 나). 반면에, 1,6-글리코시드 연결고리 형태로 중합된 덱스트란에 대해서는 운반단백질 및 그 중합반응 방법에 따라 차이는 있지만 비교적 강하게 반응하였다(도 4, 다 및 라). 이와 같이 항체반응이 포도당 분자 간 연결된 형태에 대해 특이한(glycosidic linkage-specific) 것은 덱스트란을 동물 면역원으로 사용하였기 때문이다. 1,6-글리코시드 연결고리 형태는 글라이코겐을 제외하면 생체성분으로는 드물게 존재하므로 덱스트란에 대한 동물 체내 항체생성이 가능한 것으로 예측된다.The results of the reactivity test (FIG. 4) showed that the antibodies did not react nonspecifically with BSA and KLH because they were selected from clones that did not react with the transport protein (FIG. 4, a). The antibodies tested did not react at all with maltotriose, in which glucose molecules were polymerized in 1,4-bound form (Fig. 4, b). On the other hand, the dextran polymerized in the form of 1,6-glycosidic linkages reacted relatively strongly, depending on the transport protein and its polymerization method (Fig. 4, C and D). The glycesidic linkage-specificity of the antibody response is due to the use of dextran as an animal immunogen. The 1,6-glycosidic linkage form is rarely present as a biological component except glycogen, and thus, it is predicted to be able to generate an antibody in the animal body against dextran.
항체들 간 반응성을 비교해 보면, Glu 4 및 45는 운반단백질에 중합된 덱스트란 뿐만 아니라 단독 덱스트란 분자와도 잘 반응하였다(도 4, 마). 이 항체들은 당 성분에 대해 선택성을 갖는 것으로 예측된다. 반면에, Glu 26는 다른 두 항체에 비해 당 성분에 대한 반응성이 일반적으로 낮은 것으로 나타났고, NaIO4 산화반응에 의해 제조된 중합체에 대해서보다는 DVS에 의해 교차결합된 중합체에 더 강한 반응성을 나타내었다(도 4, 다-마 참조).
Comparing the reactivity between the antibodies,
반응속도상수 결정. 항체클론 Glu 26에 대한 부착 및 탈착 반응속도 특성을 비표지센서 시스템인 Octet Red를 이용하여 제조사에서 제공한 과정에 따라 분석하였다. 우선, PBS에 용해된 덱스트란(분자량 1,000)-BSA 중합체(20 mg/mL)를 APS 센서 팁 표면에 30에서 900초 간 고정시켰고 그 잔여표면은 Casein-PBS에서 블러킹 되었다. 그 덱스트란이 고정된 센서를 Casein-PBS로 희석된 항체용액(10 mg/mL)에 담가 동일한 조건에서 부착 반응시킨 후 다시 블러킹 용액으로 되담가 탈착반응을 유도하였다. 동일한 과정을 단지 casein으로 블로킹 된 음성 대조군 센서에 대해 반복하였다. Determination of reaction rate constant. Adhesion and desorption kinetics of the
제조사에서 제공한 분석 프로그램(Data analysis 6.3)을 이용하여 본래의 항체 반응결과로부터 대조군으로부터 얻은 시험결과를 제함으로서 Glu 26에 대한 각 부착 및 탈착 반응곡선을 구하였다(도 5, 가). 그 프로그램 상의 회귀분석을 통하여 항원-항체 간 부착(ka) 및 탈착(kd) 반응속도상수를 결정하였고, 이로부터 부착평형상수(KA)를 구하였다(도 5, 나). 3번 반복하여 측정한 속도상수들은 잘 일치하였고 그 평균값으로부터 Glu 26 항체클론의 반응성을 특성화하였다. 그 항체의 분자량 1,000인 덱스트란에 대한 부착 및 탈착 반응속도는 다른 항체들에 비해 매우 빠른 것으로 나타났는데, 특히 당 성분에 대한 부착단백질로 잘 알려진 Con A의 mannotriose에 대한 반응속도와 거의 동일하였다. 그러나 Glu 26 항체는 체내 연속 혈당측정 시 Con A가 갖고 있는 잠재적인 문제점 즉, 생체독성(biotoxicity), 당 성분에 대한 비선택적인 반응, 그리고 포획 리간드에 대한 다중 부착반응 등을 극복하거나 완화시킬 수 있는 장점을 제공한다.
Using the analysis program provided by the manufacturer (Data analysis 6.3), each adhesion and desorption reaction curve for
실시예Example 3. 혈당 검출 면역센서 시험 제작 3. Blood glucose detection immune sensor test production
비표지센서를 이용한 농도응답. 덱스트란 중합체(리간드)가 고정된 APS 센서를 Glu 26 항체(포획성분) 용액에 담가 혈당 면역센서를 구성하였다(도 6, 가, 왼쪽). 용액에 포도당을 첨가하면 그 포도당 분자와 고정 리간드 간에 항체에 대한 부착반응 경쟁이 야기된다. 따라서 포도당 농도가 증가하면 고정 리간드와 항체 간의 부착반응이 반비례하여 감소하게 된다(도 6, 가, 오른쪽). 이와 같은 항체와 리간드 간 반응 변화가 신호로 변환될 수 있도록, 그 면역센서를 비표지센서 시스템 내에 장착하여 운영하였다. 우선 APS 센서를 PBS에 60초 간 담근 다음 다시 PBS에 용해된 덱스트란(분자량 1,000)-BSA 중합체(20 mg/mL)에 담가 그 중합체를 센서 팁 상에 30에서 1,500초 간 고정시켰다. 잔여표면을 샘플 희석액으로 블로킹한 후, 센서를 샘플 희석액으로 5배 희석한 Glu 26 항체용액에 담가 1,500초 간 반응시켰다. 센서 팁을 다시 블로킹 용액으로 옮겨 같은 시간 동안 반응시켰다. 이와 동일한 과정을 10 내지 1,000 mg/dL 농도의 포도당이 포함된 용액으로 반복 실험하였다. 또한 단지 BSA(20 mg/mL)로 코팅된 센서를 음성 대조군으로 이용하였다. 실험 결과들에 대해 제조사에서 제공한 프로그램을 이용하여 위에서 설명한 바와 같이 동일하게 분석하였다. Concentration response using unlabeled sensor . APS sensor immobilized with dextran polymer (ligand) was immersed in a solution of
포도당 각 농도에서 구한 면역센서의 최대 신호변화를 센서 농도응답으로 채택하였고 그 신호변화의 크기는 포도당 농도에 반비례하는 것으로 나타났다(도 6, 나). 실험한 포도당 농도범위(10 내지 1,000 mg/dL)에서 센서의 농도응답은 약 60%가 변화하였다. 또한 최종 평형상태의 95%를 기준으로 측정한 농도응답 시간은 체내 혈당농도 변화속도 보다 빨라야 측정이 지연되지 않는데, 센서의 응답시간은 약 10분 이내인 것으로 측정되어서 혈당 연속측정의 필요조건을 충족시키는 것으로 판단되었다. 참고로, 도 5의 (나)에 제시한 탈착반응속도를 이용하여 Glu 26 항체의 탈착반응 반감기를 계산하면 약 70초이었다. 이것은 항체가 제공할 수 있는 가장 빠른 반응속도 범위에 속하는 것으로서 이러한 반응특성은 체내 혈당 측정에 적용하기에 충분한 것으로 예측되었다.
The maximum signal change of the immune sensor obtained at each concentration of glucose was adopted as the sensor concentration response, and the magnitude of the signal change was inversely proportional to the glucose concentration (FIG. 6, B). In the tested glucose concentration range (10 to 1,000 mg / dL), the concentration response of the sensor changed about 60%. In addition, the concentration response time measured based on 95% of the final equilibrium state is faster than the change rate of blood glucose concentration in the body so that the measurement is not delayed. The response time of the sensor is measured to be within about 10 minutes, meeting the requirements of continuous blood glucose measurement. It was judged to make. For reference, when the desorption reaction half-life of the
반복적인 농도응답. 혈당 면역센서의 반복적인 농도응답을 연속적으로 얻기 위해, 위에서와 같이 비표지센서 시스템 내에서 덱스트란 중합체를 APS 센서 팁에 고정시켰고 잔여표면을 블로킹하였다. 포도당 농도 0, 10, 100, 그리고 1000 mg/dL를 각각 포함한 Glu 26 항체용액(10 mg/mL)을 일련의 마이크로타이터 플레이트 웰에 분주하였고, 준비된 센서를 연속적으로 이동시켜 그 농도응답을 측정하였다. 단, 다음 웰로의 이동 전에 센서를 매번 새로 준비한 Casein-PBS에 담가 탈착반응을 유도하였다. 본 실험은 웰 내 분주된 샘플의 증발에 의해 분석에 영향을 주지 않는 범위 내에서 수행되었다. 센서 신호의 증감이 포도당 농도 변화에 의한 결과임을 확인하기 위해, 위에서와 동일한 조건하에서 단지 Glu 26 항체만을 포함한 샘플에 대해서도 분석하였다. 또한, 센서신호의 기준선을 보정하기 위해 단지 BSA(20 mg/mL)로만 코팅된 센서를 이용하여 같은 과정을 반복하였다. 위에서와 같이, 실험 결과들에 대한 보정은 제조사에서 제공한 프로그램을 이용하였다. Repeated concentration response. To continuously obtain a repeated concentration response of the blood glucose immunosensor, the dextran polymer was fixed to the APS sensor tip and the remaining surface was blocked in the unlabeled sensor system as above.
혈당 면역센서의 농도응답 재현성을 시험하기 위해, 단지 Glu 26 항체만을 포함한 용액을 이용하여 8회 반복 측정한 결과 센서로부터의 신호는 평균값을 중심으로 매번 +/- 6.2% 오차범위 내에서 매우 높은 재현성이 있음을 확인하였다(도 7, 가). 또한 면역센서의 포도당 농도응답을 연속 측정한 결과 신호세기는 포도당 농도의 증감에 반비례하여 일관성있게 변화하였다(도 7, 나). 농도응답 시간은 매우 신속해서 최종 평형상태의 95%를 기준으로 부착반응 시 평균 3분 그리고 탈착반응 시 평균 8분 정도인 것으로 측정되었다. 혈당 측정 시 실제 샘플에는 잠재적인 방해물질이 있을 수 있으나, 대표적으로 fructose 및 글라이코겐은 그 농도들이 포도당 농도에 비해 전형적으로 10배 이상 낮고 글루코사민은 항체와는 반응하지 않는 1,4-글리코시드 연결고리로 구성되므로 문제가 되지 않을 것으로 판단된다.To test the concentration response reproducibility of the blood glucose immunosensor, eight repeated measurements using a solution containing only
10: 인식성분(미성숙항체 등)
11: 포획 리간드
12: 운반단백질
13: 분석물질(포도당 등)
14: 비표지 혹은 표지 센서10: Recognition component (immature antibody, etc.)
11: capture ligand
12: carrier protein
13: Analytes (Glucose, etc.)
14: unlabeled or labeled sensor
Claims (10)
상기 분석물질 및 운반단백질 중합체로 동물을 1회 또는 2회 면역화 시키는 단계;
상기 면역화된 동물의 비장으로부터 얻은 면역세포로부터 하이브리도마 세포주를 얻는 단계; 및
상기 하이브리도마 세포주로부터 미성숙 항체를 얻는 단계를 포함하는 분석물질 연속 검출용 미성숙 항체 제조방법으로,
상기 미성숙 항체는 분석물질과 항원-항체 반응시의 탈착속도상수 (kd)가 1×10-5 sec-1 내지 1×10-1 sec-1 인 것을 특징으로 하는 제조방법. Polymerizing analyte and carrier protein having a molecular weight of 5,000 or less;
Immunizing the animal once or twice with the analyte and the carrier protein polymer;
Obtaining a hybridoma cell line from immune cells obtained from the spleen of the immunized animal; And
In a method for producing immature antibodies for continuous detection of analyte comprising the step of obtaining immature antibodies from the hybridoma cell line,
The immature antibody is characterized in that the desorption rate constant (k d ) during the reaction between the analyte and the antigen-antibody is 1 × 10 −5 sec −1 to 1 × 10 −1 sec −1 .
상기 분석물질과 운반단백질의 중합비율이, 1:1 내지 1:50 몰 비인 제조방법.The method of claim 1,
Wherein the polymerization ratio of the analyte and the transport protein is 1: 1 to 1:50 molar ratio.
상기 분석물질은 포도당인 것을 특징으로 하는 미성숙 항체.The method of claim 3,
Immature antibody, characterized in that the analyte is glucose.
상기 미성숙 항체는 분석물질과 가역반응을 하는 것을 특징으로 하는 미성숙 항체.The method of claim 3,
The immature antibody is immature antibody, characterized in that the reversible reaction with the analyte.
상기 검출장치는 시료 유입 채널;
상기 미성숙 항체, 리간드 중합체 및 센서를 포함하는 시료 분석 사이트; 및
시료 배출 채널로 구성되며, 상기 미성숙 항체는 분석 사이트 내에 분산되어 있는 것을 특징으로 하는 분석물질의 연속 검출장치.The method according to claim 6,
The detection device comprises a sample inlet channel;
A sample analysis site comprising the immature antibody, ligand polymer and sensor; And
And a sample discharge channel, wherein the immature antibody is dispersed in the assay site.
상기 시료 분석 사이트 내로 유입된 분석물질과 리간드 중합체는 상기 미성숙 항체에 대해 경쟁적으로 부착반응 하며, 상기 센서는 상기 미성숙 항체와 리간드 중합체간 반응으로부터 발생된 신호를 탐지하는 것을 특징으로 하는 연속 검출장치.The method of claim 7, wherein
And analyte and ligand polymer introduced into the sample analysis site competitively attach to the immature antibody, and the sensor detects a signal generated from the reaction between the immature antibody and the ligand polymer.
상기 신호 세기가 시료 내 분석물질의 농도에 반비례하는 것을 특징으로 하는 연속 검출장치.9. The method of claim 8,
And the signal strength is inversely proportional to the concentration of analyte in the sample.
A real time continuous detection method of analyte using a real time continuous detection device according to claim 6.
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