KR101342080B1 - Nucleic Acid Aptamer Capable of Specifically Binding to Tetracyclines Compound and Use thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 테트라사이클린계 화합물에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 앱터머 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 종래 앱타머에 비하여 고민감도로 특이적으로 테트라사이클린계 화합물에 결합할 수 있는 핵산 앱타머 및 이를 이용한 테트라사이클린계 화합물의 검출 및 분리방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 테트라사이클린계 화합물에 특이적으로 결합하는 앱타머는 기존의 앱타머에 비하여 1000배 이상으로 감도가 증가되어 식품 등 시료 중 극히 미량으로 존재하는 테트라사이클린계 화합물의 검출 및 분리를 가능하게 하는 장점이 있다. 아울러, 기존 앱타머들이 60-96 base 정도의 길이였던 것과 달리 8mer 및 18mer의 극히 짧은 길이의 앱타머로서 테트라사이클린계 화합물을 특이적으로 검출할 수 있는바, 앱타머 합성 시 효율적인 비용 절감이 가능하다. 아울러, 하나의 앱타머로서 같은 계열의 항생물질 여러 종을 한번에 탐지가능한 바 실생활 응용 시 더욱 유용하다. The present invention relates to a nucleic acid aptamer capable of specifically binding to a tetracycline-based compound and its use, and more particularly, to a nucleic acid capable of specifically binding to a tetracycline-based compound with high sensitivity compared to a conventional aptamer. It relates to an aptamer and a method for detecting and separating tetracycline compounds using the same. The aptamer specifically binding to the tetracycline-based compound according to the present invention has an increased sensitivity of at least 1000 times compared to the conventional aptamer to enable detection and separation of tetracycline-based compounds present in extremely small amounts in samples such as food. There is an advantage. In addition, unlike existing aptamers having a length of about 60-96 bases, the short aptamers of 8mer and 18mer can specifically detect tetracycline-based compounds, which can effectively reduce the cost of aptamer synthesis. Do. In addition, as one aptamer can detect several species of antibiotics of the same series at once, it is more useful in real life applications.
Description
본 발명은 테트라사이클린계 화합물에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 앱터머 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 종래 앱타머에 비하여 고민감도로 특이적으로 테트라사이클린계 화합물에 결합할 수 있는 핵산 앱타머 및 이를 이용한 테트라사이클린계 화합물의 검출 및 분리방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a nucleic acid aptamer capable of specifically binding to a tetracycline-based compound and its use, and more particularly, a nucleic acid capable of specifically binding to a tetracycline-based compound with high sensitivity compared to a conventional aptamer. It relates to an aptamer and a method for detecting and separating a tetracycline-based compound using the same.
테트라사이클린(tetracycline) 그룹은 매우 광범위하게 사용되는 항생제 중 하나이다. 이것은 동물용 약품으로 일반적으로 사료 첨가물 또는 성장 촉진인자로 사용되어 사육동물의 성장률을 높이는데 이용되거나 우럭, 광어 등의 양식 수산물, 축산물의 감염 예방 차원에서 직접 투여되기도 한다. 그러나 문제되는 점은 동물의 사료 찌꺼기나 배설물에 들어있던 잔류 TCs가 토양이나 물에 흡수되어 있다가 환경에서의 여러 경로를 통하여 사람에게까지 영향을 줄 수 있다는 것이다. 특히 임산부나 소아에게 미치는 영향으로는 치아와 뼈가 황갈색으로 변할 수 있고, 태아의 골격발육을 지연시켜 기형아 출산 위험성이 높은 것으로 알려지고 있다.The tetracycline group is one of the most widely used antibiotics. This is an veterinary drug, which is generally used as a feed additive or growth stimulating factor, and is used to increase the growth rate of breeding animals, or is administered directly to prevent infection of farmed aquatic products and livestock products such as cattle and flounder. However, the problem is that residual TCs in animal feed wastes and excreta may be absorbed into soil or water and affect humans through various pathways in the environment. In particular, as an effect on pregnant women and children, teeth and bones can turn yellowish brown, and it is known that there is a high risk of birth defects by delaying skeletal development of the fetus.
또한 Tetracycline등의 항생제가 잔류되어 있는 축수산물을 장기간 섭취할 경우에 생체 내에 내성이 생겨 면역력을 떨어뜨리는 등 부작용이 생길 수 있다. 다시 말해 동물들에 대한 항생제 오남용으로 인해 일반적인 식중독균이 ‘다제내성균’(슈퍼박테리아)이 되어버린다면, 일반적으로 사용하는 항생제로는 식중독을 치료할 수 없게 된다는 것이고 이를 낫게 하기 위해서 더 독한 항생제를 투여하는 악순환이 반복되는 것이다. 따라서 항생제의 오남용을 방지하는 것은 물론이고 식품의 안전성을 확보하기 위해 잔류되어 있는 항생제를 검출해 내는 방법을 개발하는 것 또한 필요한 실정이다.In addition, ingestion of livestock products containing antibiotics such as tetracycline for a long period of time may cause side effects such as resistance to living body and lowering immunity. In other words, if the general food poisoning bacteria become'multi-drug resistant bacteria' (super bacteria) due to the misuse of antibiotics in animals, it means that food poisoning cannot be cured with commonly used antibiotics. This will be repeated. Therefore, it is necessary not only to prevent abuse of antibiotics, but also to develop a method to detect residual antibiotics to ensure food safety.
그러나 기존의 잔류항생제 검출방법은 잔류 항생제가 녹아있는 성분에 따라 각기 다른 시험용액을 조제하여 잔류항생제를 추출, 정제하여 액체크로마토그래피로 정량하는 방법을 사용한다. 또한, 기존의 방법은 녹인 물질에 따른 시험법도 소수이며, 시험용액을 각기 조제하는 데에도 번거로우며, 추출, 정제 과정 중에 타겟물질의 손실이 있을 수도 있으므로 정확한 정량이 어려운 단점이 있었다. 아울러, 기존의 잔류항생제 검출은 식품이나 물에만 적합하였다. 이에 이러한 문제점들을 해결한 새로운 잔류 항생제 검출 방법의 개발이 요구되었다. However, the conventional detection method for residual antibiotics uses a method of extracting and purifying residual antibiotics by preparing different test solutions according to the components in which residual antibiotics are dissolved, and quantifying them by liquid chromatography. In addition, the existing method has a small number of test methods depending on the dissolved substance, and it is cumbersome to prepare each test solution, and there may be a loss of the target substance during the extraction and purification process, so it is difficult to accurately quantify. In addition, the existing detection of residual antibiotics was only suitable for food or water. Accordingly, there is a demand for the development of a new residual antibiotic detection method that solves these problems.
한편, 앱타머(aptamer)는 특정 타겟에 대해 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일가닥 DNA 또는 RNA의 구조체를 말한다. 앱타머는 센서 분야에서 이용되는 기존의 감지물질인 항체보다도 훨씬 타겟에 대한 친화도가 높고, 열 안정성이 우수하며 시험관내(in vitro)에서 합성이 가능하기 때문에, 동물에게 항원을 주입하여 항체를 얻어낼 필요가 없어 비용 면에서 훨씬 우위에 있으며, 타겟물질에 제약이 없어 단백질, 아미노산 같은 생분자나 환경호르몬이나 항생제 같은 작은 유기화학 물질, 박테리아 등의 다양한 타겟에 대한 앱타머를 합성할 수 있다. 이렇게 표적 물질과 특이적으로 결합하는 앱타머의 특성으로 인해 최근 들어 앱타머를 신약개발, 약물전달 시스템 그리고 바이오센서 등의 연구에 이용하기 위해 많은 연구가 이루어지고 있다. 따라서 앱타머는 극미량의 잔류 항생제의 검출방법에 도입하기에 매우 적절한 물질이며, 이를 활용한 나노바이오 기술을 이용하여 다른 특정 물질을 검출하는데도 응용할 수 있다. 그러나, 기존의 앱타머 개발은 대부분 의료 진단용 바이오센서 개발이나 신약 개발에 사용하기 위해 단백질을 질병 관련 표적물질로 하는 앱타머 연구가 주된 목표였다. Meanwhile, an aptamer refers to a single-stranded DNA or RNA structure having high specificity and affinity for a specific target. Aptamer has a much higher affinity for the target than antibodies, which are conventional detection materials used in the sensor field, has excellent thermal stability, and can be synthesized in vitro. Therefore, antibodies are obtained by injecting an antigen into an animal. Since there is no need to pay, it is far superior in cost, and because there are no restrictions on target substances, it is possible to synthesize biomolecules such as proteins and amino acids, small organic chemical substances such as environmental hormones or antibiotics, and aptamers for various targets such as bacteria. Due to the characteristics of the aptamer that specifically binds to the target substance, many studies have recently been conducted to use the aptamer for research on new drug development, drug delivery systems, and biosensors. Therefore, aptamer is a very suitable material to be introduced into a method for detecting trace amounts of residual antibiotics, and it can be applied to detect other specific substances by using nanobio technology utilizing this. However, most of the existing aptamer development was mainly aimed at researching the aptamer using protein as a disease-related target substance for use in the development of biosensors for medical diagnosis or the development of new drugs.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 노력한 결과, 항생물질의 대표적인 테트라사이클린 계열에 대해 특이적으로 높은 친화도를 보일 뿐 아니라 종래 앱타머에 비하여 1000배 이상의 고감도로 테트라사이클린계 화합물을 검출할 수 있는 앱타머를 제작하고 이를 이용하여 식품, 상하수원, 인체 등으로부터 잔류 항생물질을 효과적으로 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, as a result of the present inventors making diligent efforts to overcome the problems of the prior art, not only exhibits a specifically high affinity for the typical tetracycline family of antibiotics, but also a tetracycline system with a high sensitivity of 1000 times or more compared to the conventional aptamer. It was confirmed that an aptamer capable of detecting a compound was prepared and used to effectively detect residual antibiotics from food, water and sewage sources, the human body, and the like, and the present invention was completed.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
The information described in the background section is only for improving an understanding of the background of the present invention, and thus does not include information forming the prior art known to those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains. I can't.
본 발명의 목적은 저분자 물질인 테트라사이클린계 화합물을 검출할 수 있으면서도 종래 앱타머에 비하여 감도가 증가된 핵산 앱타머 및 그 용도를 제공하는 데 있다.
An object of the present invention is to provide a nucleic acid aptamer with increased sensitivity compared to a conventional aptamer while being able to detect a tetracycline-based compound, which is a low molecular weight substance, and a use thereof.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는, 테트라사이클린계 화합물에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 앱타머를 제공한다:In order to achieve the above object, the present invention provides a nucleic acid aptamer capable of specifically binding to a tetracycline-based compound, characterized in that it has the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 4:
여기서, 상기 핵산 앱타머가 RNA인 경우에는 상기 핵산서열에서 T는 U임을 특징으로 함.Here, when the nucleic acid aptamer is RNA, T is U in the nucleic acid sequence.
본 발명은 또한, 상기 핵산 앱타머를 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 테트라사이클린계 화합물의 검출방법을 제공한다. The present invention also provides a method for detecting a tetracycline-based compound comprising the step of contacting the nucleic acid aptamer with a sample.
본 발명은 또한, 상기 핵산 앱타머를 포함하는 테트라사이클린계 화합물의 검출용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for detecting a tetracycline-based compound containing the nucleic acid aptamer.
본 발명은 또한, 상기 핵산 앱타머를 포함하는 테트라사이클린계 화합물의 검출용 센서를 제공한다.The present invention also provides a sensor for detecting a tetracycline-based compound containing the nucleic acid aptamer.
본 발명은 또한, 상기 핵산 앱타머를 포함하는 테트라사이클린계 화합물의 검출용 키트를 제공한다.The present invention also provides a kit for detecting a tetracycline-based compound containing the nucleic acid aptamer.
본 발명은 또한, 상기 핵산 앱타머를 이용하는 것을 특징으로 하는 테트라사이클린계 화합물의 분리방법을 제공한다.The present invention also provides a method for separating a tetracycline-based compound, characterized in that the nucleic acid aptamer is used.
본 발명은 또한, 상기 핵산 앱타머를 포함하는 테트라사이클린계 화합물의 분리용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for separating a tetracycline-based compound containing the nucleic acid aptamer.
본 발명은 또한, 상기 핵산 앱타머를 포함하는 테트라사이클린계 화합물의 분리용 키트를 제공한다.
The present invention also provides a kit for separating a tetracycline-based compound containing the nucleic acid aptamer.
본 발명에 따른 테트라사이클린계 화합물에 특이적으로 결합하는 앱타머는 기존의 앱타머에 비하여 1000배 이상으로 감도가 증가되어 식품 등 시료 중 극히 미량으로 존재하는 테트라사이클린계 화합물의 검출 및 분리를 가능하게 하는 장점이 있다. 아울러, 기존 앱타머들이 60-96 base 정도의 길이였던 것과 달리 8mer 및 18mer의 극히 짧은 길이의 앱타머로서 테트라사이클린계 화합물을 특이적으로 검출할 수 있는바, 앱타머 합성 시 효율적인 비용 절감이 가능하다. 아울러, 하나의 앱타머로서 같은 계열의 항생물질 여러 종을 한번에 탐지가능한 바 실생활 응용 시 더욱 유용하다.
The aptamer specifically binding to the tetracycline compound according to the present invention has increased sensitivity by 1000 times or more compared to the conventional aptamer, enabling the detection and separation of the tetracycline compound present in a very small amount in samples such as food. There is an advantage to that. In addition, unlike existing aptamers that were about 60-96 base in length, 8mer and 18mer aptamers with extremely short lengths can specifically detect tetracycline compounds, enabling efficient cost reduction when synthesizing aptamers. Do. In addition, as one aptamer can detect several species of antibiotics of the same family at once, it is more useful in real life applications.
도 1은 앱타머 및 염 유도 금 나노입자 응집현상을 이용하여 타겟물질을 검출하는 원리를 설명하는 개략도이다.
도 2는 A 타입 앱타머의 2차 구조이다.
도 3은 B 타입 앱타머의 2차 구조이다.
도 4는 C 타입 앱타머의 2차 구조이다.
도 5는 생성한 금 나노입자를 TEM으로 확인한 사진이다.
도 6은 11종의 앱타머의 테트라사이클린계 화합물 검출여부를 확인하기 위하여, 금나노입자의 UV 흡광도를 측정한 결과 그래프이다.
도 7은 앱타머 C3를 이용하여 표적 물질의 농도를 달리하여 금 나노입자의 색 변화를 관찰한 사진이다.
도 8은 앱타머 C3를 이용하여 표적 물질의 농도를 달리하여 금 나노입자의 UV 흡광도를 측정한 결과 그래프이다.1 is a schematic diagram illustrating the principle of detecting a target material using an aptamer and salt-induced gold nanoparticle aggregation.
2 is a secondary structure of the A-type aptamer.
3 is a secondary structure of the B-type aptamer.
4 is a secondary structure of a C-type aptamer.
5 is a photograph of the generated gold nanoparticles confirmed by TEM.
6 is a graph showing the results of measuring UV absorbance of gold nanoparticles in order to confirm whether or not a tetracycline-based compound of 11 types of aptamers is detected.
7 is a photograph of observing the color change of gold nanoparticles by varying the concentration of a target substance using aptamer C3.
8 is a graph showing the results of measuring UV absorbance of gold nanoparticles by varying the concentration of a target material using aptamer C3.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by an expert skilled in the art to which the present invention belongs. In general, the nomenclature used in this specification is well known and commonly used in the art.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다. Definitions of main terms used in the detailed description of the present invention are as follows.
본원에서 "핵산 앱타머"란, 높은 친화성으로 타겟물질을 특이적으로 인지할 수 있는 작은 단일가닥 올리고핵산을 말한다. As used herein, "nucleic acid aptamer" refers to a small single-stranded oligonucleotide capable of specifically recognizing a target material with high affinity.
본원에서 "시료"란, 테트라사이클린계 화합물을 함유하거나 함유하고 있는 것으로 추정되어 분석이 행해질 조성물을 의미하며, 액체, 토양, 공기, 식품, 폐기물, 동식물 장내 및 동식물 조직 중 어느 하나 이상에서 채취된 시료로부터 검출되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이때, 액체는 물, 혈액, 소변, 눈물, 땀, 타액, 림프 및 뇌척수액 등임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 물은 강수(江水), 해수(海水), 호수(湖水) 및 우수(雨水) 등을 포함하고, 폐기물은 하수, 폐수 등을 포함하며, 상기 동식물은 인체를 포함한다. 또한, 상기 동식물 조직으로는 점막, 피부, 외피, 털, 비늘, 안구, 혀, 뺨, 발굽, 부리, 주둥이, 발, 손, 입, 유두, 귀, 코 등의 조직을 포함한다. As used herein, the term "sample" refers to a composition that contains or is estimated to contain a tetracycline-based compound and is to be analyzed, and is collected from any one or more of liquid, soil, air, food, waste, animal and plant intestine, and animal and plant tissues. It may be characterized as being detected from the sample, but is not limited thereto. At this time, the liquid may be characterized as water, blood, urine, tears, sweat, saliva, lymph, cerebrospinal fluid, and the like, and the water is precipitation, seawater, lake, and rainwater. Including, the waste includes sewage, wastewater, and the like, and the animals and plants include the human body. In addition, the animal and plant tissues include tissues such as mucous membranes, skin, skin, hair, scales, eyes, tongue, cheeks, hoofs, beaks, snouts, feet, hands, mouths, nipples, ears, and nose.
본원에서, 테트라사이클린계 화합물이란 테트라사이클린계 항생물질로서 예시적으로 테트라사이클린, 독시사이클린 또는 옥시테트라사이클린을 의미한다.
In the present application, the tetracycline-based compound refers to a tetracycline-based antibiotic, exemplarily, tetracycline, doxycycline, or oxytetracycline.
본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는, 테트라사이클린계 화합물에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 앱타머에 관한 것이다. In one aspect, the present invention relates to a nucleic acid aptamer capable of specifically binding to a tetracycline-based compound, characterized in that it has the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 4.
앱타머 A1: 5'-CGC TGG TG-3' (서열번호 1)Aptamer A1: 5'-CGC TGG TG-3' (SEQ ID NO: 1)
앱타머 A2: 5'-CGG TGG TG-3' (서열번호 2)Aptamer A2: 5'-CGG TGG TG-3' (SEQ ID NO: 2)
앱타머 C2: 5'-GTG TTG TGG GCG TTG TGT-3' (서열번호 3)Aptamer C2: 5'-GTG TTG TGG GCG TTG TGT-3' (SEQ ID NO: 3)
앱타머 C3: 5'-GTG TTG CGG GTG TGG TGT-3' (서열번호 4)Aptamer C3: 5'-GTG TTG CGG GTG TGG TGT-3' (SEQ ID NO: 4)
핵산 앱타머는 단일가닥 DNA 또는 RNA로서 제공되는 것으로서, 본 발명에서 상기 핵산이 RNA인 경우에는 상기 핵산서열에서 T는 U로 표시되며, 이러한 서열이 본 발명의 범위에 포함됨은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 자명한 사항이라 할 것이다. Nucleic acid aptamer is provided as single-stranded DNA or RNA, and in the present invention, when the nucleic acid is RNA, T is represented by U in the nucleic acid sequence, and this sequence is included in the scope of the present invention. It will be a matter of self-evident to those with ordinary knowledge in
본 발명의 일 실시예에서는 테트라사이클린계 화합물에 특이적으로 결합하는 앱타머를 제작하기 위하여, 종래의 앱타머보다 더 짧은 앱타머 서열들을 예측 합성한 다음, 이에 대하여 염 유도 금 나노입자 응집 현상을 이용하여 테트라사이클린계 화합물 특이적 앱타머를 선별하였다. 즉, 도 1에 나타난 바와 같이, 금 나노입자는 표면에 앱타머가 흡착되어 있는 경우 염이 존재하여도 응집 반응이 일어나지 않으나 금 나노입자에 흡착된 앱타머가 특이적으로 결합하는 타겟이 함께 존재하는 경우 앱타머가 금 나노입자의 표면으로부터 떨어져 나와 타겟과 결합하며서 금 나노입자가 응집하는 것을 이용하였다. 염 첨가 시 응집 현상에 의하여 금 나노입자 사이의 거리가 가까워지면 색 변화가 이루어지게 된다. 본 발명의 실시예에서는 앱타머 A1 및 A2는 대조군으로 사용된 다이클로페낙이나 글라이포세이트에 비하여 테트라사이클린계 화합물인 테트라사이클린, 독시사이클린 및 옥시테트라사이클린 모두 특이적으로 검출할 수 있고, 앱타머 C2 및 C3의 경우 테트라사이클린계 화합물 중 테트라사이클린 및 옥시테트라사이클린에 대하여 매우 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하고, 테트라사이클린계 화합물에 특이적으로 결합하는 앱타머로서 앱타머 A1,A2,C2,C3를 선정하였다.In an embodiment of the present invention, in order to prepare an aptamer that specifically binds to a tetracycline-based compound, aptamer sequences shorter than that of a conventional aptamer were predicted and synthesized, and then salt-induced gold nanoparticle aggregation was performed. Using the tetracycline-based compound-specific aptamer was selected. That is, as shown in FIG. 1, when an aptamer is adsorbed on the surface of the gold nanoparticles, an aggregation reaction does not occur even if a salt is present, but when a target to which the aptamer adsorbed to the gold nanoparticles specifically binds is present together. It was used that the aptamer was separated from the surface of the gold nanoparticles and bonded to the target, and the gold nanoparticles aggregated. Color change occurs when the distance between the gold nanoparticles becomes close due to the aggregation phenomenon when salt is added. In an embodiment of the present invention, aptamers A1 and A2 can specifically detect all of the tetracycline compounds tetracycline, doxycycline and oxytetracycline compared to diclofenac or glyphosate used as a control, and aptamer C2 And C3 confirms that it can be detected very specifically for tetracycline and oxytetracycline among the tetracycline compounds, and aptamers A1, A2, C2, as aptamers that specifically bind to tetracycline compounds, C3 was selected.
아울러, 본 발명의 다른 실시예에서는 상기 선정된 앱타머의 검출 한계를 실험한 결과, 육안으로는 10nM 까지 관찰가능하고, 분광기로는 5nM까지 검출가능하여 종래의 앱타머 대비 민감도가 약 1000배 증가되었음을 확인하였다. 즉, 본 발명에 따른 앱타머는 민감도가 매우 향상되어 식품이나 물 등에 극히 미량 존재하는 테트라사이클린계 항생물질의 검출에 적합하다. In addition, in another embodiment of the present invention, as a result of testing the detection limit of the selected aptamer, it is possible to observe up to 10 nM with the naked eye, and up to 5 nM with a spectroscope, so that the sensitivity is increased by about 1000 times compared to the conventional aptamer. Was confirmed. That is, the aptamer according to the present invention has very improved sensitivity and is suitable for detection of tetracycline-based antibiotics present in very small amounts in food or water.
본 발명은 또 다른 관점에서 앱터머를 이용한 테트라사이클린계 화합물의 검출방법에 관한 것이다. 상기 테트라사이클린계 화합물은 물, 토양, 공기, 식품, 폐기물, 동식물 장내 및 동식물 조직 중 어느 하나 이상에서 채취된 시료로부터 검출되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이때, 상기 물은 강수(江水), 해수(海水), 호수(湖水) 및 우수(雨水) 등을 포함하고, 폐기물은 하수, 폐수 등을 포함하며, 상기 동식물은 인체를 포함한다. In another aspect, the present invention relates to a method for detecting a tetracycline-based compound using an aptamer. The tetracycline-based compound may be characterized in that it is detected from a sample collected from at least one of water, soil, air, food, waste, animal and plant intestine, and animal and plant tissues, but is not limited thereto. In this case, the water includes precipitation, seawater, lake, and rainwater, and waste includes sewage, wastewater, and the like, and the animals and plants include the human body.
본 발명의 다른 실시예에서는 염 유도 금 나노입자 응집현상을 이용하여 본 발명에 따른 앱타머가 특이적으로 테트라사이클린계 화합물에 결합함을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 테트라사이클린계 화합물에 특이적으로 결합하는 앱타머를 함유하는 테트라사이클린계 화합물 검출용 조성물에 관한 것이다. 아울러, 상기 테트라사이클린계 화합물에 특이적으로 결합하는 앱타머는 칩 등 기판에 고정되어 테트라사이클린계 화합물 검출용 센서의 형태로 제공될 수 있다. In another embodiment of the present invention, it was confirmed that the aptamer according to the present invention specifically binds to a tetracycline-based compound using a salt-induced gold nanoparticle aggregation phenomenon. Accordingly, from another viewpoint, the present invention relates to a composition for detecting a tetracycline-based compound containing an aptamer that specifically binds to the tetracycline-based compound. In addition, the aptamer specifically binding to the tetracycline-based compound may be fixed to a substrate such as a chip and provided in the form of a sensor for detecting the tetracycline-based compound.
상기 테트라사이클린계 화합물에 특이적으로 결합하는 앱터머를 함유하는 검출 센서 시스템은, 키트(kit)의 형태로 제공될 수 있다. 테트라사이클린계 화합물 검출용 키트는 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다. A detection sensor system containing an aptamer that specifically binds to the tetracycline-based compound may be provided in the form of a kit. Kits for detecting tetracycline compounds may take the form of bottles, tubs, small sachets, envelopes, tubes, ampoules, etc. These are partially or entirely plastic, glass, paper, It can be formed from foil, wax, and the like. The container may be equipped with a completely or partially detachable stopper, which is initially part of the container or can be attached to the container by mechanical, adhesive, or other means. The container may also be equipped with a stopper, which allows access to the contents by a needle. The kit may include an external package, and the external package may include instructions for use of the components.
본 발명에 따른 테트라사이클린계 화합물에 특이적으로 결합하는 앱터머는 또한, 테트라사이클린계 화합물만을 특이적으로 검출하는바, 이를 포함하여 테트라사이클린계 화합물의 분리용 조성물을 제공할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에게 자명한 것이다. The aptamer specifically binding to the tetracycline-based compound according to the present invention also specifically detects only the tetracycline-based compound, and the present invention can provide a composition for separating a tetracycline-based compound including the same. It is apparent to those skilled in the art in the art to which it belongs.
본 발명은 또 다른 관점에서, 테트라사이클린계 화합물에 특이적으로 결합하는 앱터머를 이용한 테트라사이클린계 화합물의 분리방법에 관한 것이다. 본 발명의 한 양태에 따르면, 바람직하게는 상기 앱터머가 고정된 비드를 컬럼에 충진하고 테트라사이클린계 화합물가 포함된 시료를 통과시켜 테트라사이클린계 화합물를 분리할 수 있다.
In another aspect, the present invention relates to a method for separating a tetracycline-based compound using an aptamer that specifically binds to the tetracycline-based compound. According to one aspect of the present invention, the tetracycline-based compound may be separated by preferably filling the bead to which the aptamer is immobilized in a column and passing a sample containing the tetracycline-based compound.
실시예Example
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are for illustrative purposes only, and it will be apparent to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not construed as being limited by these examples.
앱타머의 합성Synthesis of Aptamer
테트라사이클린계 화합물에 결합하는 앱타머들을 분리한 다음, 이들의 서열을 분석하고 이들 서열을 변형시켜 A 타입 (8mer), B 타입 (11mer) 및 C 타입(18mer)의 새로운 앱타머 서열들을 예측, 합성하였다. 이때, 하기의 새로운 앱타머 서열의 발굴에는 선별된 앱타머 서열에서 특정 분자에 대한 높은 결합력을 지니는 특정 서열만을 알아내고 불필요한 서열을 제거하기 위하여, truncation 을 수행하였다. 합성한 각 앱타머의 2차 구조는 도 2 내지 4와 같다. After separating the aptamers that bind to the tetracycline-based compound, their sequence is analyzed and these sequences are modified to predict new aptamer sequences of A type (8mer), B type (11mer) and C type (18mer), Synthesized. At this time, in the discovery of a new aptamer sequence below, truncation was performed in order to find out only a specific sequence having high binding power to a specific molecule from the selected aptamer sequence and to remove unnecessary sequences. The secondary structure of each synthesized aptamer is shown in FIGS. 2 to 4.
앱타머 흡착 금 나노입자를 이용한 색도 분석Chromaticity analysis using aptamer adsorbed gold nanoparticles
실시예 1의 앱타머가 특이적으로 테트라사이클린계 화합물을 검출할 수 있는지 확인하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다.
In order to confirm whether the aptamer of Example 1 can specifically detect a tetracycline-based compound, the following experiment was performed.
2-1: 비 고정화 방식 앱타머 흡착 금 나노입자의 제조2-1: Preparation of non-immobilized aptamer adsorbed gold nanoparticles
비 고정화 방식 앱타머 흡착 금나노입자를 만드는데 이용하기 위해 시트로산염 (citrate)로 안정화된 금나노입자를 생성하였다. 큰 비커에 HCl과 HNO3를 3:1 비율로 섞어서 왕수를 만들어 준비한 뒤, 금나노입자를 만드는데 사용할 200 ml 플라스크와 자석을 적어도 15분 이상 담가두어 오염물질을 제거하였다. 위와 같이 준비한 플라스크에 3차 증류수를 98 ml 넣고 핫플레이트 위에서 저어주면서(stirring) 50 mM의 HAuCl4 용액을 2 ml 첨가하여 HAuCl4의 최종 농도가 1 mM이 되도록 하였다. 이 용액이 끓기 시작하면 빠르게 38.8 mM의 시트르산나트륨 (sodium citrate) 용액을 10 ml 첨가하였다. 그러면 용액의 색이 밝은 노란색에서 짙은 붉은색으로 1분 안에 변화하였다. 20분 더 끓인 뒤에는 상온에서 식을 때까지 stirring 하면서 놔두었다. 이 용액은 0.45 um nitrocellulose 필터 페이퍼를 이용하여 여과하여 만드는 과정에서 응집된 금나노입자 혹은 그 외의 불순물을 제거하였다. 도 5에서 제시한 바와 같이, 생성된 금나노입자는 TEM (Transmission Electron Microscopy)을 이용하여 크기와 모양을 확인하였다. 완성된 금나노입자는 4 ℃에 냉장 보관하였다.
Gold nanoparticles stabilized with citrate were produced for use in making non-immobilized aptamer adsorption gold nanoparticles. After preparing aqua regia by mixing HCl and HNO 3 in a 3:1 ratio in a large beaker, a 200 ml flask and magnet to be used to make gold nanoparticles were soaked for at least 15 minutes to remove contaminants. 98 ml of distilled water was added to the flask prepared as above, and 2 ml of 50 mM HAuCl 4 solution was added while stirring on a hot plate so that the final concentration of HAuCl 4 was 1 mM. When the solution started to boil, 10 ml of a 38.8 mM sodium citrate solution was quickly added. Then, the color of the solution changed from light yellow to dark red within 1 minute. After boiling for another 20 minutes, it was left with stirring until it cools down at room temperature. This solution was filtered using 0.45 um nitrocellulose filter paper to remove aggregated gold nanoparticles or other impurities. As shown in FIG. 5, the size and shape of the generated gold nanoparticles were confirmed using TEM (Transmission Electron Microscopy). The finished gold nanoparticles were stored refrigerated at 4°C.
2-2: 테트라사이클린계 화합물 특이적 앱타머의 선별2-2: Selection of tetracycline compound-specific aptamer
금나노입자를 보관할 두 개의 vial은 12 M NaOH에 1 시간 이상 담가둔 뒤 증류수(DW)로 씻어서 준비하였다. 2nM의 금나노입자와 실시예 1의 500nM의 테트라사이클린 계열 앱타머들을 버퍼용액(20 mM Tris-Cl buffer pH 7.6 contained 100mM NaCl, 2mM MgCl2, 5mM KCL, 1mM CaCl2)에 넣고 상온에서 30분간 반응시킨 후 250uM의 테트라사이클린(tetracycline), 옥시테트라사이클린(oxytetracycline), 독시사이클린(Doxycycline) (이하 테트라사이클린계 화합물)과, 양성대조군으로서 다이클로페낙, 글라이포세이트를 각각 첨가하여 30분간 반응시켰다. 그 다음 상기 용액에 0.1M NaCl을 첨가하여 염 유발 금 뭉침 현상(salt induced gold aggregation)을 유도하여 UV/VIS 분광기 (Ultrospec 6300 pro, GE health care, USA)를 이용하여 금나노입자의 UV 흡광도를 측정하였다. Two vials to store gold nanoparticles were prepared by immersing them in 12 M NaOH for at least 1 hour and then washing them with distilled water (DW). 2nM gold nanoparticles and 500nM tetracycline-based aptamers of Example 1 were put in a buffer solution (20 mM Tris-Cl buffer pH 7.6 contained 100mM NaCl, 2mM MgCl 2 , 5mM KCL, 1mM CaCl 2 ) and at room temperature for 30 minutes. After the reaction, 250 uM of tetracycline, oxytetracycline, and doxycycline (hereinafter, tetracycline-based compound), and diclofenac and glyphosate as positive controls were added, respectively, and reacted for 30 minutes. Then, 0.1M NaCl was added to the solution to induce salt induced gold aggregation, and the UV absorbance of the gold nanoparticles was measured using a UV/VIS spectrometer (Ultrospec 6300 pro, GE health care, USA). It was measured.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 검출한도인 650/520 ratio 값 0.2를 기준으로 살펴본 결과, 앱타머 A1 및 A2는 대조군으로 사용된 다이클로페낙이나 글라이포세이트에 비하여 테트라사이클린계 화합물인 테트라사이클린, 독시사이클린 및 옥시테트라사이클린 모두 특이적으로 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다. 아울러, 앱타머 C2 및 C3의 경우 테트라사이클린계 화합물 중 테트라사이클린 및 옥시테트라사이클린에 대하여 매우 특이적으로 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다. 이에 본 발명에 따른 테트라사이클린계 화합물에 특이적으로 결합하는 앱타머로서 앱타머 A1,A2,C2,C3를 선정하였다.
As a result, as shown in FIG. 6, as a result of examining based on the detection limit of 650/520 ratio value 0.2, aptamers A1 and A2 were tetracycline compounds compared to diclofenac or glyphosate used as controls. It was confirmed that all of cyclin, doxycycline and oxytetracycline can be specifically detected. In addition, in the case of aptamers C2 and C3, it was confirmed that tetracycline and oxytetracycline among the tetracycline-based compounds can be detected very specifically. Accordingly, aptamers A1, A2, C2, C3 were selected as aptamers that specifically bind to the tetracycline-based compound according to the present invention.
테트라사이클린계 화합물의 검출한계 측정Measurement of detection limits of tetracycline compounds
테트라사이클린 검출 한계 농도를 알아보기 위하여, 앱타머 C3와 테트라사이클린을 선정하여, 테트라사이클린의 농도에 변화를 주며 금나노입자의 색변화를 관찰하였다. In order to determine the detection limit concentration of tetracycline, aptamer C3 and tetracycline were selected, and the color change of gold nanoparticles was observed while changing the concentration of tetracycline.
금나노입자를 보관할 두 개의 vial은 12 M NaOH에 1 시간 이상 담가둔 뒤 증류수(DW)로 씻어서 준비하였다. 2nM의 금나노입자와 500nM의 테트라사이클린 계열 앱타머 C3를 버퍼용액(20 mM Tris-Cl buffer pH 7.6 contained 100mM NaCl, 2mM MgCl2, 5mM KCL, 1mM CaCl2)에 넣고 상온에서 30분간 반응시킨 후 0nM~100nM의 테트라사이클린을 첨가하여 30분간 반응시켰다. 상기 용액에 0.1M NaCl을 첨가하여 salt induced gold aggregation을 유도하여 금나노입자의 UV 흡광도를 측정 테트라사이클린 검출 한계 농도를 분석하였다.Two vials to store gold nanoparticles were prepared by immersing them in 12 M NaOH for at least 1 hour and then washing them with distilled water (DW). Add 2nM gold nanoparticles and 500nM tetracycline-based aptamer C3 to a buffer solution (20 mM Tris-Cl buffer pH 7.6 contained 100mM NaCl, 2mM MgCl2, 5mM KCL, 1mM CaCl2) and react at room temperature for 30 minutes, and then 0nM~ 100 nM tetracycline was added and reacted for 30 minutes. 0.1M NaCl was added to the solution to induce salt-induced gold aggregation to measure UV absorbance of gold nanoparticles, and the detection limit concentration of tetracycline was analyzed.
그 결과, 육안으로 관찰한 경우에는, 도 7에 나타난 바와 같이, 10nM까지도 테트라사이클린의 검출이 가능하였으며, UV/VIS 분광기로 관찰한 경우에는 도 8에 나타난 바와 같이, 5nM까지 검출이 가능한 것으로 나타나 극히 민감도가 높은 것으로 나타났다. 이는 실시예 1에서 본 발명에 따른 앱타머 제작을 위하여 사전 분리한 테트라사이클린 특이적 앱타머를 이용한 경우에 비하여 민감도가 약 1000배 이상 증가한 수치이다.
As a result, when observed with the naked eye, as shown in FIG. 7, it was possible to detect up to 10 nM of tetracycline, and when observed with a UV/VIS spectroscope, as shown in FIG. 8, it was found that it was possible to detect up to 5 nM. It was found to be extremely sensitive. This is a value in which the sensitivity is increased by about 1000 times or more compared to the case of using the tetracycline-specific aptamer previously isolated for production of the aptamer according to the present invention in Example 1.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
As described above, a specific part of the content of the present invention has been described in detail. For those of ordinary skill in the art, this specific description is only a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereby It will be obvious. Accordingly, it will be said that the substantial scope of the present invention is defined by the appended claims and their equivalents.
부호 없음No sign
서열목록 전자파일 첨부Attach electronic file of sequence list
Claims (10)
여기서, 상기 핵산 앱타머가 RNA인 경우에는 상기 핵산서열에서 T는 U임을 특징으로 함.
A nucleic acid aptamer capable of specifically binding to a compound selected from the group consisting of tetracycline and oxytetracycline, having the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 3 to 4:
Here, when the nucleic acid aptamer is RNA, T in the nucleic acid sequence is characterized in that U.
A method for detecting a compound selected from the group consisting of tetracycline and oxytetracycline, comprising contacting the nucleic acid aptamer of claim 1 with a sample.
The method of claim 2, wherein the compound selected from the group consisting of tetracycline and oxytetracycline is detected from a sample collected from any one or more of water, soil, air, food, waste, flora and fauna and flora and fauna tissues. How to.
A composition for detecting a compound selected from the group consisting of tetracycline and oxytetracycline comprising the nucleic acid aptamer of claim 1.
Sensor for detecting a compound selected from the group consisting of tetracycline and oxytetracycline comprising the nucleic acid aptamer of claim 1.
A kit for detecting a compound selected from the group consisting of tetracycline and oxytetracycline comprising the nucleic acid aptamer of claim 1.
A method for separating a compound selected from the group consisting of tetracycline and oxytetracycline, using the nucleic acid aptamer of claim 1.
8. The method of claim 7, wherein the nucleic acid aptamer comprises passing the sample through a column filled with immobilized beads.
A composition for separation of a compound selected from the group consisting of tetracycline and oxytetracycline comprising the nucleic acid aptamer of claim 1.
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