KR101339727B1 - Inhibitor of apoptosis-like protein attenuating the cell death - Google Patents

Inhibitor of apoptosis-like protein attenuating the cell death Download PDF

Info

Publication number
KR101339727B1
KR101339727B1 KR1020120014925A KR20120014925A KR101339727B1 KR 101339727 B1 KR101339727 B1 KR 101339727B1 KR 1020120014925 A KR1020120014925 A KR 1020120014925A KR 20120014925 A KR20120014925 A KR 20120014925A KR 101339727 B1 KR101339727 B1 KR 101339727B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
arabidopsis
protein
atilp
iap
apoptosis
Prior art date
Application number
KR1020120014925A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR20130094377A (en
Inventor
이상열
이선용
김외연
정영준
신미림
이균오
채호병
Original Assignee
경상대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 경상대학교산학협력단 filed Critical 경상대학교산학협력단
Priority to KR1020120014925A priority Critical patent/KR101339727B1/en
Publication of KR20130094377A publication Critical patent/KR20130094377A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR101339727B1 publication Critical patent/KR101339727B1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
    • C12N15/8263—Ablation; Apoptosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 지니는 아라비돕시스 탈리아나에서 분리된 아라비돕시스 아폽토시스 저해제-유사 단백질(AtILP)에 있어서, 상기 단백질은 C-말단에 RING 핑거 도메인을 포함하고 바큐로바이러스 IAP 반복(BIR) 도메인은 결핍되어 있음을 특징으로 하는 세포 사멸을 완화시키는 아폽토시스 저해제-유사 단백질과 상기 아라비돕시스 아폽토시스 저해제-유사 단백질(AtILP)을 과발현시키는 항-아폽토시스 활성을 지닌 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.The present invention relates to an Arabidopsis apoptosis inhibitor-like protein (AtILP) isolated from Arabidopsis thaliana having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein the protein comprises a RING finger domain at the C-terminus and baculovirus IAP repeat ( BIR) domain is to provide a transgenic plant having an apoptosis inhibitor-like protein that mitigates cell death characterized by deficiency and an anti-apoptotic activity that overexpresses the Arabidopsis apoptosis inhibitor-like protein (AtILP).

Description

세포 사멸을 완화시키는 아폽토시스 저해제-유사 단백질{Inhibitor of apoptosis-like protein attenuating the cell death}Inhibitor of apoptosis-like protein attenuating the cell death

본 발명은 식물 및 동물체내에서 세포 사멸을 완화시키는 바큐로바이러스 아폽토시스 저해제(IAP) 반복 도메인이 결실된 아라비돕시스 탈리아나 내에서 분리된 아폽토시스 저해제 유사 단백질에 관한 것이다.
The present invention relates to an apoptosis inhibitor-like protein isolated in Arabidopsis thaliana lacking a baculovirus apoptosis inhibitor (IAP) repeat domain that mitigates cell death in plants and animals.

모든 생물은 환경적 스트레스에 대한 반응뿐만 아니라 정상 발달과정 동안 또는 병원체에 저항하는 동안 항상성을 달성하고 유지하기 위해 세포 예정사 과정을 사용한다. 예정세포 사멸(PCD) 또는 아폽토시스로 알려진 이 기능적으로 보존적인 과정은 유전적으로 조절되며 분명한 형태학적 및 생화학적 특징과 관련되어 있다. 지난 10년 동안의 광범위한 연구는 동물계의 아폽토시스의 생화학적 및 형태학적 메커니즘을 밝혔다.
All organisms use cell death processes to achieve and maintain homeostasis during normal development or during pathogen resistance as well as in response to environmental stress. This functionally conserved process, known as planned cell death (PCD) or apoptosis, is genetically regulated and is associated with apparent morphological and biochemical characteristics. Extensive research over the last decade has revealed the biochemical and morphological mechanisms of apoptosis in the animal kingdom.

아폽토시스는 카스파제로 알려진 시스테인 프로테아제의 순차적인 활성에 의해 유발되며, 이는 단백질 절단 및 DNA 분자의 파괴를 초래한다. 이 아폽토시스 과정은 개시제 및 저해제에 의해 조절되며, 다양한 자극에 의해 활성화될 수 있다. 카스파제는 P1 위치의 특이적 아스파르트산 잔기에서 단백질 분해효소(proteolytic cleavage)의해 활성화되는 효소원으로 합성된다.
Apoptosis is caused by the sequential activity of cysteine proteases known as caspases, which leads to protein cleavage and destruction of DNA molecules. This apoptosis process is regulated by initiators and inhibitors and can be activated by various stimuli. Caspase is synthesized from a source of enzyme that is activated by proteolytic cleavage at specific aspartic acid residues at the P1 position.

카스파제 및 이들의 보조인자의 구획화(compartmentalization)는 두 가지 주요한 아폽토시스 경로가 존재한다는 것을 시사한다. 동물계에서 관찰되는 아폽토시스의 한 경로는 미토콘드리아로부터 시토크롬 c의 분비를 유도하는 조직 배양세포의 혈청의 부족(deprivation)에 의해 유도될 수 있다. 인자-1(Apaf1) 및 시토크롬 c를 활성화하는 아폽토시스는 프로카스파제-9를 지닌 복합체를 형성하며, 그 다음에 활성화된다.
Compartmentalization of caspases and their cofactors suggests that there are two major apoptosis pathways. One pathway of apoptosis observed in the animal kingdom can be induced by the deprivation of the serum of tissue culture cells that induce cytochrome c secretion from the mitochondria. Apoptosis activating Factor-1 (Apaf1) and cytochrome c forms a complex with procaspase-9, which is then activated.

활성 카스파제-9는 프로카스파제-3을 분절시킴으로써 공통(common) 카스파제 경로를 유발한다. 카스파제-3은 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제 및 라인 A를 포함하는 많은 중요한 단백질의 분해에 있어 전체 또는 일부에 관여한다. 또 다른 아폽토시스 경로의 존재는 조직 괴사 인자(TNF-a) 또는 Fas 리간드를 투여시 카스파제-8이 활성화된다는 관찰로부터 밝혀졌다.
Active caspase-9 induces a common caspase pathway by segmenting procaspase-3. Caspase-3 is involved in all or part of the degradation of many important proteins, including poly (ADP-ribose) polymerase and line A. The presence of another apoptosis pathway was found from the observation that caspase-8 is activated upon administration of tissue necrosis factor (TNF-a) or Fas ligand.

카스파제 활성의 손실은 우두(cowpox)로부터 바이러스 단백질 CrmA 및 바큐로바이러스로부터 p356를 발현하는 세포에서 관찰된다. 더욱이 곤충, 선충 및 포유류 세포에서 이들 바이러스 카스파제 저해제의 과발현은 아폽토시스 저항성을 초래하며, 아폽토시스 경로의 구성요소가 진화 과정 동안 매우 보존되었다는 증거를 제공한다. 이것은 이들 바이러스 단백질의 기능적 균등물(equivalent)이 고등 생물에서 존재할지도 모른다는 것을 고려케 하였다.
Loss of caspase activity is observed in cells expressing p356 from the viral protein CrmA and baculovirus from cowpox. Moreover, overexpression of these viral caspase inhibitors in insects, nematodes, and mammalian cells results in apoptosis resistance, providing evidence that components of the apoptosis pathway were highly conserved during the evolutionary process. This led to the consideration that functional equivalents of these viral proteins may be present in higher organisms.

단백질의 아폽토시스 저해제(IAP) 패밀리는 아폽토시스 및 염증 과정에서 중추적 역할을 하며, 세포 사멸로부터 보호기능을 부여한다. IAP 패밀리 구성원은 카스파제-의존적 아폽토시스 경로를 억제함으로써 세포내 사멸 신호의 전달을 방해한다. IAP 단백질은 숙주 세포의 아폽토시스를 억제하는 인자로서 처음에 바큐로바이러스에서 확인되었으며, 바이러스가 복제할 시간을 허용한다.
Apoptosis inhibitors (IAPs) family of proteins play a pivotal role in apoptosis and inflammatory processes and confer protection from cell death. IAP family members interfere with the transmission of intracellular killing signals by inhibiting caspase-dependent apoptosis pathways. IAP proteins were first identified in baculoviruses as factors that inhibit apoptosis in host cells, allowing time for the virus to replicate.

그 이후에 8개의 포유류 IAPs (XIAP, HIAP1, HIAP2, ILP2, MLIAP, NAIP, BRUCE 및 survivin) 및 3개의 Drosophila IAP 상동성 (DIAP1, DIAP2 및 Deterin)이 확인되었다. IAP 단백질은 하나 또는 그 이상의 바큐로바이러스 IAP 반복(BIR) 도메인의 존재에 의해 특성화되는 분자 구조를 나타낸다. BIR 도메인은 IAP 단백질의 항-아폽토시스 특성을 위해 필수적인 약 70개의 아미노산 잔기의 아연-결합 폴딩이다. 모든 공지된 IAP 멤버들이 BIR 도메인을 지닌다는 사실은 이 도메인이 세포 보호를 매개하는데 있어서 중추적 역할을 한다는 것을 시사한다.
Subsequently eight mammalian IAPs (XIAP, HIAP1, HIAP2, ILP2, MLIAP, NAIP, BRUCE and survivin) and three Drosophila IAP homology (DIAP1, DIAP2 and Deterin) were identified. IAP proteins represent a molecular structure characterized by the presence of one or more baculovirus IAP repeat (BIR) domains. The BIR domain is a zinc-binding folding of about 70 amino acid residues essential for the anti-apoptotic properties of the IAP protein. The fact that all known IAP members have a BIR domain suggests that this domain plays a pivotal role in mediating cellular protection.

또한 NAIP을 제외하고, 모든 공지된 IAP 패밀리 멤버는 이들의 C 말단에 RING 도메인을 포함하며, 2개의 아연원자로 배위되는 7개의 시스테인 잔기 및 1개의 히스티딘 잔기에 의해 정의된다. RING 도메인은 E3 유비퀴틴 리가아제 활성을 부여하며, 프로테아좀에 의한 분해를 위해 타겟 단백질의 유비퀴틴화를 지시함으로써 아폽토시스를 조절하는 역할을 한다는 것을 시사해왔다. RING 도메인은 인간 IAP 패밀리 멤버에 의한 아폽토시스 억제를 위해 필수적이지는 않으며, 이는 BIR 도메인이 아폽토시스로부터 세포를 보호하기에 충분하다는 것을 시사한다.
Also, with the exception of NAIP, all known IAP family members include a RING domain at their C terminus and are defined by seven cysteine residues and one histidine residue coordinated with two zinc atoms. The RING domain confers E3 ubiquitin ligase activity and has been suggested to play a role in regulating apoptosis by directing ubiquitination of target proteins for degradation by proteasomes. The RING domain is not essential for apoptosis inhibition by human IAP family members, suggesting that the BIR domain is sufficient to protect cells from apoptosis.

세포 예정사를 조절하는 유전자는 광범위한 진화적 거리에 걸쳐 기능적으로 보존되었다. 예를 들면 포유류 Bax-유도성 세포 사멸 저해제 BI-1의 상동성이 아라비돕시스, 쌀, 담배 및 보리를 포함하는 몇몇 식물에서 확인되었다. 더욱이 선충 CED-9 뿐만 아니라 인간 Bcl-2 및 Bcl-xl과 같은 동물의 아폽토시스 조절자는 형질전환 식물에서 세포 사멸을 유도 또는 억제할 수 있다. 식물에서 PCD는 꽃 발생, 배형성, 종자 발아 및 혈관과 기관 형성과 같은 발달 과정동안 일어난다.
Genes that regulate cell death are functionally conserved over a wide range of evolutionary distances. For example, homology to mammalian Bax-induced cell death inhibitor BI-1 has been identified in several plants, including Arabidopsis, rice, tobacco and barley. Moreover, apoptosis modulators of animals such as nematode CED-9 as well as human Bcl-2 and Bcl-xl can induce or inhibit cell death in transgenic plants. In plants, PCD occurs during developmental processes such as flower development, embryogenesis, seed germination and blood vessel and organ formation.

세포 예정사는 과민성 반응(HR)이라고 불리는 식물 방어 반응에 있어서 중대하며, 세포 예정사 과정을 통해 박테리아 병원체의 확산을 방해한다. 식물계에 있어서 본 발명은 세포질 수축, 핵 축합 및 DNA 래더링과 같은 아폽토시스의 생화학적 및 형태학적 홀마크(hallmarks)가 동물 및 식물 세포에서 유사하다는 것을 밝혔다. 시토졸 카스파제-매개된 아폽토시스 경로는 동물 세포에서는 잘 정의되어 있으나, 아직 식물 세포에 대해서는 규명된 것이 없었다. 하지만 최근 연구의 증거는 IAP-유사 단백질의 존재를 제외하고는 식물 아폽토시스와 동물 세포의 카스파제-매개된 아폽토시스 사이의 약간의 유사성이 있다는 것을 시사하고 있다. 예를 들면 담배 세포에서 카스파제-1-유사 프로테아제가 HR에 참여한다는 것과 보리 내의 카스파제-3-유사 프로테아제의 존재 및 세포내 편재가 보고되었다.
Cell death is critical in a plant defense response called hypersensitivity (HR) and interferes with the spread of bacterial pathogens through cell death. In plant systems, the present invention has shown that the biochemical and morphological hallmarks of apoptosis such as cytoplasmic contraction, nuclear condensation and DNA laddering are similar in animal and plant cells. Cytosol caspase-mediated apoptosis pathways are well defined in animal cells but have not yet been identified for plant cells. However, evidence from recent studies suggests that there is some similarity between plant apoptosis and caspase-mediated apoptosis of animal cells except for the presence of IAP-like proteins. For example, caspase-1-like proteases participate in HR in tobacco cells, the presence of caspase-3-like proteases in barley and intracellular ubiquity have been reported.

이에 대해 본 발명자들은 아라비돕시스 식물체에서 신규한 아라비돕시스 유전자인 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 아미노산 서열을 확인 및 동정하였으며, 이를 포유류의 IAPs와 상동성을 지니는 RING 핑거 단백질을 코드화한 것과 비교하였다. 또한 본 발명자들이 분리한 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 발현은 Hela 세포에서 카스파제의 활성화를 억제함으로써 TNF-α/ActD 및 곰팡이 독소 푸모니신 B1 (FB1)에 의해 유도되는 아폽토시스를 효과적으로 억제함을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 된 것이다.
In this regard, the present inventors have identified and identified the amino acid sequence of the Arabidopsissis IAP-like protein (AtILP), a novel Arabidopsis gene in Arabidopsis plants, and compared it to the coding of the RING finger protein with homology to mammalian IAPs. In addition, the expression of the Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) isolated by the present inventors inhibits the activation of caspase in Hela cells, thereby effectively inhibiting apoptosis induced by TNF-α / ActD and fungal toxin fumonicin B1 (FB1). The present invention has been completed by the discovery.

흥미롭게도 본 발명자들이 분리한 단백질의 경우 바큐로바이러스 IAP 반복(BIR) 도메인의 결핍에도 불구하고 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 N-말단 단편은 아라비돕시스에서 항-아폽토시스 활성을 나타내었다. 따라서 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 N-말단 도메인의 과발현은 FB1-유도된 세포 사멸의 억제를 초래하였으며 박테리아 효과기 AvrRpt2에 의해 초래된 세포 사멸을 완화시켰다. 이 결과는 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)이 아라비돕시스에서 세포 예정사의 음성적 조절자로서 작용한다는 것을 시사한다.
Interestingly, for the protein we isolated, despite the lack of the baculovirus IAP repeat (BIR) domain, the N-terminal fragment of the Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) showed anti-apoptotic activity in Arabidopsis. Thus overexpression of the N-terminal domain of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) resulted in inhibition of FB1-induced cell death and alleviated cell death caused by the bacterial effector AvrRpt2. This result suggests that Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) acts as a negative regulator of cell death in Arabidopsis.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 아라비돕시스 식물체에서 신규한 아라비돕시스 유전자인 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 아미노산 서열을 확인 및 동정코자 한 것이다. 또한 상기 단백질의 서열을 포유류 내의 IAPs와 상동성을 지니는 RING 핑거 단백질을 코드화한 것과 비교하여 또한 본 발명자들이 분리한 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 발현은 Hela 세포에서 카스파제의 활성화를 억제함으로써 TNF-α/ActD 및 곰팡이 독소 푸모니신 B1 (FB1)에 의해 유도되는 아폽토시스를 효과적으로 억제함을 확인코자 한 것이다.
The problem to be solved by the present invention is to identify and identify the amino acid sequence of the Arabidopsis IAP-like protein (AtILP), a novel Arabidopsis gene in Arabidopsis plants. In addition, the sequence of the protein was compared with that of the RING finger protein homologous to the IAPs in mammals, and the expression of the Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) isolated by the present inventors was inhibited by inhibiting caspase activation in Hela cells. To confirm that it effectively inhibits apoptosis induced by TNF-α / ActD and fungal toxin fumonisin B1 (FB1).

본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 지니는 아라비돕시스 탈리아나에서 분리된 아라비돕시스 아폽토시스 저해제-유사 단백질(AtILP)을 제공하는 것으로 상기 단백질은 C-말단에 RING 핑거 도메인을 포함하고 있고, 바큐로바이러스 IAP 반복(BIR) 도메인은 결핍되어 있음을 특징으로 한다.
It is an object of the present invention to provide an arabidopsis apoptosis inhibitor-like protein (AtILP) isolated from arabidopsis thaliana having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein the protein comprises a RING finger domain at the C-terminus, The rovirus IAP repeat (BIR) domain is characterized by a deficiency.

또한 HeLa 세포 내에서 본 발명의 아라비돕시스 아폽토시스 저해제-유사 단백질(AtILP)의 발현은 카스파제 활성의 불활성화를 통해 종양괴사인자(TNF)-α/ActD-유도된 아폽토시스에 대한 저항성을 부여함을 특징으로 한다.
In addition, expression of the Arabidopsis apoptosis inhibitor-like protein (AtILP) of the present invention in HeLa cells is characterized by conferring resistance to tumor necrosis factor (TNF) -α / ActD-induced apoptosis through inactivation of caspase activity. It is done.

또한 본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열을 지니는 아라비돕시스 아폽토시스 저해제-유사 단백질(AtILP)을 과발현시키는 항-아폽토시스 활성을 지닌 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.
Still another object of the present invention is to provide a transgenic plant having anti-apoptotic activity that overexpresses arabidopsis apoptosis inhibitor-like protein (AtILP) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.

또한 아라비돕시스 아폽토시스 저해제-유사 단백질(AtILP) 과발현 형질전환 식물체는 카스파제 활성화 및 DNA 분절화의 억제에 의해 아폽토시스를 완화하고 비병원성 박테리아 병원체의 성장을 증가시킴을 특징으로 한다.
Arabidopsis apoptosis inhibitor-like protein (AtILP) overexpressing transgenic plants are also characterized by mitigating apoptosis and increasing growth of non-pathogenic bacterial pathogens by caspase activation and inhibition of DNA fragmentation.

본 발명의 효과는 바큐로바이러스 IAP 반복(BIR) 도메인의 결핍에도 불구하고 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 N-말단 단편은 아라비돕시스에서 항-아폽토시스 활성을 나타내는 신규한 아라비돕시스 아폽토시스 저해제-유사 단백질(AtILP)을 제공하는 것이다. 또한 FB1-유도된 세포 사멸의 억제를 초래하고 박테리아 효과기 AvrRpt2에 의해 초래된 세포 사멸을 완화시킴을 특징으로 하는 아라비돕시스 아폽토시스 저해제-유사 단백질(AtILP) 과발현 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.
The effect of the present invention is that despite the lack of the baculovirus IAP repeat (BIR) domain, the N-terminal fragment of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) exhibits a novel arabidopsis apoptosis inhibitor-like protein that exhibits anti-apoptotic activity in Arabidopsis. AtILP). It is also to provide a Arabidopsis apoptosis inhibitor-like protein (AtILP) overexpressing transgenic plant characterized by suppressing FB1-induced cell death and alleviating cell death caused by the bacterial effector AvrRpt2.

도 1은 본 발명의 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 추정 아미노산 서열, 뉴클레오티드 서열 및 다른 IAPs를 지닌 RING 도메인간의 비교를 나타낸 것이다.
(A) 아미노산 잔기는 우측에 번호를 매겼으며, 추정 RING 도메인은 파란색으로 나타냈다. (B) 비교를 위해 배열된 RING 도메인은 아라비돕시스 탈리아나의 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)과 인간(HIAP1, HIAP2, XIAP 및 KIAP)이다. 서열은 SwissProt 자료로부터 얻었다; 보존된 시스테인 및 히스티딘 잔기는 각각 분홍색 및 파란색으로 나타내었다.
도 2는 TNF-α/ActD-유도된 아폽토시스에 대한 본 발명의 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 억제 효과를 나타낸 것이다.
HeLa 세포는 엠티 벡터 또는 양성 대조군으로서 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 또는 GPx에 대한 발현 벡터로 일시적으로 공동-트랜스펙트되었다. 세포 생존율은 처리되지 않은 아폽토시스 유도 샘플의 생존율과의 상대적인 염색 강도를 기초로 하여 계산되었다. 컬럼 A는 음성 대조군으로서 벡터 단독인 것이다; 컬럼 B는 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP); 컬럼 C는 양성 대조군으로서 GPx인 것이다. 자료는 세 번의 별도의 실험 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 N-말단 지역은 TNF-α/ActD-유도 아폽토시스를 억제함을 나타낸 것이다.
(a) 도 3a는 TNF-α/ActD로 처리된 아폽토시스 세포의 형태학적 변화를 나타낸 것이다. 스케일 바는 10 ㎛를 나타낸다. (b) HeLa 세포가 전체 길이 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 또는 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 공지된 단편에 대한 발현 벡터로 일시적으로 공동-트랜스펙트된 것을 제외하고는 세포는 도 2와 같이 처리되었다. (c) 도 3c는 전체 길이 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 및 절단 변이의 도식을 나타낸 것이다. (d) HeLa 세포로부터의 전체 단백질 추출물은 13% SDS-PAGE에 의해 분리되었으며, 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)은 항-아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 항체를 사용하여 면역 블롯 분석에 의해 검출되었다.
도 4는 본 발명의 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)이 카스파제 활성화를 저해함으로써 TNF-α/ActD-유도 아폽토시스를 억제한다는 것을 나타낸 것이다.
TNF-α/ActD로 처리된 트랜스펙트된 HeLa 세포로부터의 단백질 추출물은 카스파제 에세이 완충용액에서 펩타이드 기질(Ac-DEVD-pNA)과 함께 배양되었다. 형광은 405 nm에서 측정되었다. 자료는 세 번의 별도의 반복실험 중 하나의 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 과발현이 FB1 처리에 의해 유도되는 HR에 대한 저항성을 부여한다는 것을 나타낸 것이다.
(a) 2주된 야생형 및 형질전환 아라비돕시스 묘목은 MS 플레이트 (-FB1) 또는 3 μM FB1가 보충된 MS 플레이트로 이동되었다. 이동 5일 후에 묘목의 사진을 찍었다. FB1 없이 MS 플레이트 상에서 성장된 야생형 및 형질전환 식물은 서로 구분되지 않았다. (b) 3 μM FB1이 있거나 없는 MS 플레이트 상에서 성장된 형질전환 식물 라인으로부터의 단백질 추출물은 카스파제 에세이 완충용액에서 펩타이드 기질(Ac-DEVD-pNA)과 함께 배양되었다. 형광은 405 nm에서 측정되었다. 자료는 세 번의 별도의 반복실험 중 하나의 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 전체 길이 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 또는 N-말단 도메인의 과발현이 전해질 누출을 억제한다는 것을 나타낸 것이다.
야생형 또는 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 또는 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 도메인을 과발현시킨 형질전환 아라비돕시스는 AvrRpt2을 과발현시킨 107 cfu/ml 양의 P. syringae pv. phaseolicola NPS3121로 침윤되었다. 잎 디스크는 전도도 측정을 위해 시간이 흐르면서 제거되었다. 결과는 세 번의 별도의 반복실험 중 하나의 평균 마이크로시멘스 ±표준편차를 의미한다.
도 7은 본 발명의 야생형 및 형질전환 아라비돕시스에 있어서 엠티 벡터 또는 발현 AvrRpt2를 운반하는 Pma M6CΔE의 성장을 나타낸 것이다.
식물은 104 cfu/ml 양에서 엠티 벡터(a) 또는 발현 AvrRpt2(b)를 운반하는 Pma M6CΔE로 침윤되었다. 잎의 박테리아 역가는 공시한 시점에서 측정되었다. 결과는 네 번의 별도의 반복실험 중 하나의 평균 cfu/cm2 ±표준편차(오차막대)를 의미한다.
도 8은 아라비돕시스 원형질체 내에서 본 발명의 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)에 의한 DNA 분절화의 억제 및 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 세포내 편재를 나타낸 것이다.
(a) 야생형 및 형질전환 식물은 3 μM FB1이 있거나 없는 MS 플레이트 상에서 성장되었다. 게놈 DNA는 전기영동에 의해 떼어내지고, 분리되었으며 그 다음에 브롬화 에티듐을 사용한 염색에 의해 시각화되었다. (b) 10일 된 아라비돕시스 원형질체는 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)::smGFP 및 RFP::NLS 발현 컨스트럭트 10 μg 으로 공동-변형되었다. RFP::NLS는 핵 편재를 위한 대조군으로서 사용되었다. Bright, GFP 및 RFP로 표지된 이미지는 형광 현미경에 의해 얻어졌다. GFP 및 RFP의 공동-편재(Merge)는 노란색으로 나타난다. 스케일 바는 10㎛이다.
도 9는 야생형 및 형질전환 식물로부터의 단백질 추출물에 있어서 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 부재를 보여주는 면역 블롯 분석이다. 면역 블롯은 항-아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 항체를 사용하여 실시되었다.
도 10은 본 발명의 단백질의 2차 구조 분석을 나타낸 것이다. 2차 구조 요소는 나선(실린더) 및 스트랜드 (화살표)로 묘사된다. 이 자료는 GOR 2차 구조 예상 방법 버전 Ⅳ를 사용하여 얻었다. 1 shows a comparison between putative amino acid sequences, nucleotide sequences and RING domains of other IAPs of the Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) of the present invention.
(A) Amino acid residues are numbered on the right and putative RING domains are shown in blue. (B) The RING domains arranged for comparison are Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) of Arabidopsis thaliana and human (HIAP1, HIAP2, XIAP and KIAP). The sequence was obtained from SwissProt data; Conserved cysteine and histidine residues are shown in pink and blue, respectively.
Figure 2 shows the inhibitory effect of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) of the invention on TNF-α / ActD-induced apoptosis.
HeLa cells were temporarily co-transfected with an empty vector or an expression vector for Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) or GPx as a positive control. Cell viability was calculated based on staining intensity relative to the viability of untreated apoptosis inducing samples. Column A is the vector alone as negative control; Column B comprises Arabidopsis IAP-like protein (AtILP); Column C is GPx as a positive control. The data show the results of three separate experiments.
Figure 3 shows that the N-terminal region of the Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) of the present invention inhibits TNF-α / ActD-induced apoptosis.
(a) Figure 3a shows the morphological changes of apoptosis cells treated with TNF-α / ActD. Scale bars represent 10 μm. (b) Cells were transfected with FIG. 2 except that HeLa cells were temporarily co-transfected with expression vectors for known fragments of full length Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) or Arabidopsis IAP-like protein (AtILP). It was processed together. (c) FIG. 3C shows a schematic of full length Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) and cleavage mutations. (d) Total protein extracts from HeLa cells were isolated by 13% SDS-PAGE, and Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) was detected by immunoblot analysis using anti-arabidopsis IAP-like protein (AtILP) antibody. It became.
FIG. 4 shows that the Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) of the present invention inhibits TNF-α / ActD-induced apoptosis by inhibiting caspase activation.
Protein extracts from transfected HeLa cells treated with TNF-α / ActD were incubated with peptide substrate (Ac-DEVD-pNA) in caspase assay buffer. Fluorescence was measured at 405 nm. The data represent the results of one of three separate replicates.
FIG. 5 shows that overexpression of the Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) of the present invention confers resistance to HR induced by FB1 treatment.
(a) Two week wild-type and transgenic Arabidopsis seedlings were transferred to MS plates (-FB1) or MS plates supplemented with 3 μM FB1. Five days after the transfer, the seedlings were photographed. Wild-type and transgenic plants grown on MS plates without FB1 were indistinguishable from each other. (b) Protein extracts from transgenic plant lines grown on MS plates with or without 3 μΜ FB1 were incubated with peptide substrate (Ac-DEVD-pNA) in caspase assay buffer. Fluorescence was measured at 405 nm. The data represent the results of one of three separate replicates.
FIG. 6 shows that overexpression of the full length Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) or N-terminal domain of the present invention inhibits electrolyte leakage.
Or wild-type Arabidopsis IAP- like proteins (AtILP) or Arabidopsis IAP- like proteins (AtILP) transgenic Arabidopsis was overexpressed the domain 10 in which the over-expression AvrRpt2 7 cfu / ml Amount of P. syringae pv. Infiltrated with phaseolicola NPS3121. Leaf disks were removed over time for conductivity measurements. The results represent the mean microsiemens ± standard deviation of one of three separate replicates.
Figure 7 shows the growth of Pma M6CΔE carrying empty vector or expression AvrRpt2 in wild-type and transgenic arabidopsis of the present invention.
Plants were infiltrated with Pma M6CΔE carrying empty vector (a) or expression AvrRpt2 (b) at an amount of 10 4 cfu / ml. Bacterial titers of the leaves were measured at the time of publication. Results represent mean cfu / cm 2 ± standard deviation (error bar) of one of four separate replicates.
FIG. 8 shows the inhibition of DNA fragmentation by the Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) and the intracellular localization of the Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) in the Arabidopsis protoplasts.
(a) Wild-type and transgenic plants were grown on MS plates with or without 3 μM FB1. Genomic DNA was removed by electrophoresis, separated and then visualized by staining with ethidium bromide. (b) The 10 day old Arabidopsis protoplasts were co-modified with 10 μg of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) :: smGFP and RFP :: NLS expression constructs. RFP :: NLS was used as a control for nuclear localization. Images labeled with Bright, GFP and RFP were obtained by fluorescence microscopy. Merge of GFP and RFP appears in yellow. The scale bar is 10 μm.
9 is an immunoblot analysis showing the absence of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) in protein extracts from wild type and transgenic plants. Immune blots were performed using anti-arabidopsis IAP-like protein (AtILP) antibodies.
10 shows a secondary structure analysis of the protein of the present invention. Secondary structural elements are depicted as spirals (cylinders) and strands (arrows). This data was obtained using version IV of the GOR secondary structure estimation method.

본 발명의 아라비돕시스 탈리아나 내의 신규한 아폽토시스의 저해제가 공지된 아포톱시스 저해제(IAP) 단백질과의 서열 상동성 비교를 통해 확인되었다. 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)은 C-말단 RING 핑거 도메인을 포함하고 있으나, 다른 IAP 패밀리 멤버에서 항-아폽토시스 활성을 위해 필수적인 바큐로바이러스 IAP 반복(BIR) 도메인이 결핍되어 있다.
Novel apoptosis inhibitors in the Arabidopsis thaliana of the present invention have been identified through sequence homology comparisons with known apoptotic inhibitor (IAP) proteins. Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) contains a C-terminal RING finger domain, but lacks the baculovirus IAP repeat (BIR) domain, which is essential for anti-apoptotic activity in other IAP family members.

HeLa 세포에서 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 발현은 카스파제 활성의 불활성화를 통해 종양괴사인자(TNF)-α/ActD-유도된 아폽토시스에 대한 저항성을 부여한다. 카스파제-3의 활성을 저해하지 않는 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 C-말단 RING 도메인과는 대조적으로, 공지된 BIR 도메인과 상동성을 나타내지 않음에도 불구하고 N-말단 영역은 시험관 내에서 카스파제-3의 활성을 강하게 억제하며, TNF-α/ActD-유도된 아폽토시스를 저해한다.
Expression of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) in HeLa cells confers resistance to tumor necrosis factor (TNF) -α / ActD-induced apoptosis through inactivation of caspase activity. In contrast to the C-terminal RING domain of Arabidopsiss IAP-like protein (AtILP), which does not inhibit the activity of caspase-3, the N-terminal region does not show homology with known BIR domains in vitro. Strongly inhibits the activity of caspase-3 and inhibits TNF-α / ActD-induced apoptosis.

식물체 내에서 관찰된 본 발명의 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) N-말단 도메인의 항-아폽토시스 활성은 동물계에서도 재현된다. 곰팡이 독소 푸모니신 B1, 식물에서 아폽토시스-유사 세포 사멸을 유도하는 약물을 투여하였을 때, 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)을 과발현시킨 형질전환 아라비돕시스 라인은 항-아폽토시스 활성을 보였다.
The anti-apoptotic activity of the Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) N-terminal domain of the present invention observed in plants is also reproduced in the animal kingdom. When administered the fungal toxin fumonisin B1, a drug that induces apoptosis-like cell death in plants, the transgenic arabidopsis line overexpressing Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) showed anti-apoptotic activity.

본 발명의 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 형질전환 식물에서 세포 사멸의 억제는 카스파제 활성화 및 DNA 분절화의 억제에 의해 수반된다. 또한 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 과발현은 효과인자 단백질-유도된 세포 사멸을 약화시켰으며 비병원성 박테리아 병원체의 성장을 증가시켰다. 본 발명의 결과는 아라비돕시스에서 카스파제 활성을 막는 신규한 식물 IAP-유사 단백질의 존재를 증명하였으며, 식물 항-아폽토시스 유전자는 식물계 및 동물계에서 유사한 기능을 한다는 것을 나타낸다.
Inhibition of cell death in Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) transgenic plants of the invention is accompanied by inhibition of caspase activation and DNA fragmentation. Overexpression of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) also attenuated effector protein-induced cell death and increased the growth of non-pathogenic bacterial pathogens. The results of the present invention demonstrated the presence of novel plant IAP-like proteins that block caspase activity in Arabidopsis, indicating that plant anti-apoptotic genes have similar functions in plant and animal systems.

이하 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

(1) 아리비돕시스의 아폽토시스 저해제의 확인 및 동물 세포에서 항-아폽토시스 활성의 입증
(1) Identification of apoptosis inhibitors of arididopsis and demonstration of anti-apoptotic activity in animal cells

IAP 패밀리 멤버를 포함하는 아폽토시스를 조절하는 신호 메커니즘의 일부 측면은 광범위한 진화적 거리에 걸쳐 기능적으로 보존되어 왔다. HIAP1 및 HIAP2은 호모 사피엔스에 있어서 기능적인 항-아폽토시스 단백질이다. 고등 식물이 HIAP-유사 단백질을 이동시키는지 여부를 측정하기 위해서, 상동성은 아라비돕시스 유전체 서열 자료에 대해 조사되었으며, 이는 쿼리(query)로서 HIAP1 및 2의 서열을 이용하여 수행되었다. 상기 조사는 다른 IAPs와 유의미한 유사성을 지니는 추정 단백질을 인코딩하는 유전자인 At4g19700에 대해서 실시되었다. 특히 상기 단백질은 C-말단에 RING 도메인을 포함하고 있었다. 이 단백질은 아라비돕시스 탈리아나 IAP-유사 단백질(아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP))라고 불리었다. 전체-길이 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) cDNA는 아라비돕시스 cDNA 라이브러리로부터 분리되었다. 이는 305 아미노산 추정 오픈 리딩 프레임을 인코딩하는 915 뉴클레오티드로 구성되었다(도 1A). 인간 HIAP1, HIAP2, XIAP 및 KIAP을 지니는 RING 도메인의 아미노산 서열 배치(alignment)는 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)이 완벽한 C-말단 C3HC4 시그너쳐를 암호화한다는 것을 나타냈다(도 1B). 고도로 보존된 RING 도메인을 제외하고는 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)은 다른 공지된 보조된 도메인을 암호화하지는 않는 것으로 보인다.
Some aspects of the signaling mechanisms that regulate apoptosis, including IAP family members, have been functionally conserved over a wide range of evolutionary distances. HIAP1 and HIAP2 are functional anti-apoptotic proteins for homo sapiens. To determine whether higher plants migrate HIAP-like proteins, homology was examined for Arabidopsis genomic sequence data, which was performed using the sequences of HIAP1 and 2 as queries. The investigation was conducted on At4g19700, a gene encoding putative protein with significant similarities with other IAPs. In particular, the protein contained a RING domain at the C-terminus. This protein was called Arabidopsis thaliana IAP-like protein (Arabidopsis IAP-like protein (AtILP)). Full-length Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) cDNA was isolated from the Arabidopsis cDNA library. It consisted of 915 nucleotides encoding a 305 amino acid putative open reading frame (FIG. 1A). Amino acid sequence alignment of the RING domain with human HIAP1, HIAP2, XIAP and KIAP indicated that the Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) encodes a complete C-terminal C3HC4 signature (FIG. 1B). Except for the highly conserved RING domain, Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) does not appear to encode other known assisted domains.

IAP 단백질은 하나 또는 그 이상의 구조적으로 별개인 약 70개의 아미노산 잔기로 구성된 아연-핑거 접힘 도메인인 BIR 도메인의 존재에 의해 특징화된다. BIR 도메인은 동물계의 IAP 단백질의 항-아폽토시스 특징을 위해 필수적이라는 것이 널리 알려져 있다. BIR 도메인을 지니지 않아도 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)이 항-아폽토시스 활성을 지니고 있는지 여부를 측정하기 위해서, HeLa 세포는 리포펙트아민을 사용하여 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 또는 Gpx에 대한 발현 벡터 또는 대조군으로서 엠티 벡터(pcDNA)로 트랜스펙트되었으며, TNF-α/ActD-유도된 세포 사멸에 대한 반응이 분석되었다. Gpx는 아폽토시스 저해에 대한 양성 대조군으로서 사용되었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, TNF-α/ActD-유도된 세포 사멸은 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)을 발현시키는 세포에 있어서 현저하게 감소되었으며, 심지어 GPx-발현 세포보다 더욱 감소되었다. GPx-발현 세포의 생존도가 약 55%인 반면에 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)-발현 세포의 생존도는 85%를 넘었다. 이들 결과는 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)이 인간 IAPs와 구조적 및 기능적 상동성을 지닌 RING 핑거 단백질이라는 것을 나타냈으며 유전자는 동물계와 비슷한 방식으로 식물 기능에 있어서 아폽토시스 저해와 관련되어 있다.
IAP proteins are characterized by the presence of a BIR domain, which is a zinc-finger folding domain consisting of one or more structurally distinct about 70 amino acid residues. It is well known that the BIR domain is essential for the anti-apoptotic character of animal IAP proteins. In order to determine whether Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) has anti-apoptotic activity without having a BIR domain, HeLa cells can use lipofectamine to express expression vectors for Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) or Gpx. Or transfected with empty vector (pcDNA) as a control and the response to TNF-α / ActD-induced cell death was analyzed. Gpx was used as a positive control for apoptosis inhibition. As shown in FIG. 2, TNF-α / ActD-induced cell death was significantly reduced in cells expressing Arabidopsis IAP-like protein (AtILP), and even more reduced than GPx-expressing cells. The viability of the Arabxidopsis IAP-like protein (AtILP) -expressing cells was over 85%, while the viability of GPx-expressing cells was about 55%. These results indicated that Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) is a RING finger protein with structural and functional homology with human IAPs, and the gene is associated with apoptosis inhibition in plant function in a similar fashion to the animal kingdom.

(2) 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 N-말단 도메인은 TNF-α/ActD-유도된 카스파제 활성화를 저해한다.
(2) The N-terminal domain of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) inhibits TNF-α / ActD-induced caspase activation.

아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 항-아폽토시스 활성의 분자 결정요인을 정의하기 위해서, 4개의 상이한 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 단백질 단편이 컨스트럭트되었다(도 3B). HeLa 세포는 전체-길이 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 또는 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 단편(단편 a, b, c 또는 d) 하나에 대한 발현 벡터로 트랜스펙트되었으며, 그 다음에 항-아폽토시스 활성이 측정되었다. 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)은 BIR 도메인을 지니고 있지 않기 때문에 컴퓨터-기반 서열 상동성 조사는 다른 IAP 단백질과 아무런 유사성이 없다는 것을 밝혔으며, 본 발명자들은 기능적 도메인이 C-말단 RING 도메인을 보여줄 것이라고 기대하였다. 도 3A에 나타낸 바와 같이, 엠티 벡터 또는 단편 C 및 d로 트랜스펙트된 세포는 TNF-α/ActD에 반응하여 세포 사멸이 일어났다. 대조적으로 전체 길이 AtILP에 대한 트랜스펙션 발현 벡터, 단편 a 또는 단편 b는 TNF-α/ActD-유도된 아폽토시스를 현저하게 감소시켰다. 단편 a 및 b는 전체 길이 단백질의 저해 활성을 ~75% 지녔으며, 반면에 C-말단 RING 도메인을 포함하는 단편 c 및 d의 항-아폽토시스 활성은 대조군과 비슷하였다(도 3B). 다양한 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 단편은 도 3B에 도식적으로 나타내었다. 전체-길이 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 및 상기 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 단편은 HeLa 세포에서 모두 안정하게 발현되었다(도 3C). 이 결과는 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 N-말단 150 아미노산 잔기를 포함하는 단편 b가 항-아폽토시스 활성의 주요한 결정요인을 포함한다는 것을 나타내었다.
Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) In order to define the molecular determinants of anti-apoptotic activity, four different arabidopsis IAP-like protein (AtILP) protein fragments were constructed (FIG. 3B). HeLa cells were transfected with expression vectors for either full-length Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) or Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) fragments (fragments a, b, c or d), followed by anti-apoptosis Activity was measured. Since the Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) does not have a BIR domain, computer-based sequence homology studies revealed no similarity to other IAP proteins, and we believe that the functional domain will show a C-terminal RING domain. Expected. As shown in FIG. 3A, cells transfected with empty vectors or fragments C and d resulted in cell death in response to TNF-α / ActD. In contrast, the transfection expression vector, fragment a or fragment b for full length AtILP significantly reduced TNF-α / ActD-induced apoptosis. Fragments a and b had ˜75% inhibitory activity of the full length protein, whereas the anti-apoptotic activity of fragments c and d, including the C-terminal RING domain, was similar to the control (FIG. 3B). Various Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) fragments are shown schematically in FIG. 3B. The full-length Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) and the Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) fragment were both stably expressed in HeLa cells (FIG. 3C). This result indicated that fragment b comprising the N-terminal 150 amino acid residues of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) contains the major determinants of anti-apoptotic activity.

카스파제는 아폽토시스의 중요한 매개자이기 때문에, 본 발명자들은 카스파제 불활성화가 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 항-아폽토시스 활성에 있어서 역할을 하는지 여부를 조사하였다. DEVDase 활성은 Ac-DEVD-pNA인 색소 기질의 단백질 분해효소(proteolytic cleavage)를 측정함으로써 평가되었으며, 이는 카스파제-3-유사 프로테아제의 기질로서 작용한다. 도 4에 나타낸 바와 같이, DEVDase 불활성화시 전체 길이 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 및 각각의 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 단편의 저해 효과는 세포 생존도 분석 결과와 관련되어 있다. 이 자료는 세포 사멸의 저해에 있어서 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 활성은 카스파제 활성화의 억제를 통해 N-말단 도메인에 의해 매개된다는 것을 명확히 시사하였다(도 4).
Since caspases are important mediators of apoptosis, we investigated whether caspase inactivation plays a role in the anti-apoptotic activity of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP). DEVDase activity was evaluated by measuring the proteolytic cleavage of the pigment substrate, Ac-DEVD-pNA, which acts as a substrate of caspase-3-like protease. As shown in FIG. 4, the inhibitory effect of full length Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) and each Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) fragment upon DEVDase inactivation is correlated with cell viability assay results. This data clearly indicated that the activity of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) in the inhibition of cell death is mediated by the N-terminal domain through inhibition of caspase activation (FIG. 4).

(3) 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 N-말단 도메인은 아라비돕시스에서 FB1-유도된 아폽토시스에 대한 저항성을 부여한다.
(3) The N-terminal domain of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) confers resistance to FB1-induced apoptosis in Arabidopsis.

식물의 아폽토시스 저해에 있어서 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 역할을 평가하기 위하여, 콜리플라워의 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터의 대조군 하에서 전체-길이 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 또는 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 N-말단 (아미노산 1∼150) 또는 C-말단 (아미노산 151∼304) 도메인을 구성적으로(constitutively) 발현시키는 형질전환 아라비돕시스 라인이 생성되었다. 전체-길이, 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 N-말단 또는 C-말단의 높은 발현 수준을 나타내는 몇몇 형질전환 식물이 추가 분석(도 9)을 위해 선택되었다. N-말단 및 C-말단 도메인은 각각 150 및 154개의 아미노산으로 구성되었다. 식물 아폽토시스의 두드러진 예인 HR은 박테리아 병원체 감염 지역 또는 주변의 숙주 세포에서 유발되는 세포 사멸 프로그램이며 세포 붕괴 및 괴사성 병변(necrotic lesions)의 형성을 초래한다. 곰팡이 독소 FB1이 식물에서 HR을 유도한다는 것은 잘 알려져 있는데, 본 발명자들은 아라비돕시스에서 FB1-유도된 HR시 전체 길이 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 또는 N- 또는 C-말단 도메인의 과발현 효과를 조사하였다. 야생형 아라비돕시스 생태형 Col-0 및 형질전환 아라비돕시스 식물은 MS 한천 배지 상에서 2주 동안 성장되었으며, 3 μM FB1을 포함하는 MS 배지로 이동되었고 그 다음에 이동 4일 후에 형태학적 변화를 관찰하였다. 도 5A에 나타낸 바와 같이, 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 C-말단 단편을 지니는 야생형 및 형질전환 식물의 잎을 완전히 물에 불렸고, 죽은 병변(death lesion)이 분명하게 나타났다. 대조적으로 전체 길이 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 또는 N-말단 도메인을 발현시킨 형질전환 식물은 위쪽 잎에서 약간의 병변이 나타났으나, 전반적으로 야생형 및 C-말단 도메인 형질전환 식물과 비교시 FB1-유도된 세포 사멸에 대한 높은 저항성을 나타냈다.
To assess the role of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) in plant apoptosis inhibition, full-length Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) or Arabidopsis IAP-like under the control of Cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter. A transgenic arabidopsis line was generated that constitutively expresses the N-terminal (amino acids 1-150) or C-terminal (amino acids 151-304) domains of protein (AtILP). Several transgenic plants showing high expression levels of full-length, N-terminus or C-terminus of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) were selected for further analysis (FIG. 9). The N-terminal and C-terminal domains consisted of 150 and 154 amino acids, respectively. HR, a prominent example of plant apoptosis, is a cell death program induced in or around bacterial pathogen infection areas and results in cell disruption and formation of necrotic lesions. It is well known that the fungal toxin FB1 induces HR in plants, and we investigated the effect of overexpression of full-length Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) or N- or C-terminal domains upon FB1-induced HR in Arabidopsis. . Wild-type Arabidopsis Eco-type Col-0 and transformed Arabidopsis plants were grown for 2 weeks on MS agar medium, transferred to MS medium containing 3 μΜ FB1 and then observed morphological changes 4 days after migration. As shown in FIG. 5A, the leaves of wild-type and transgenic plants with C-terminal fragments of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) were completely soaked in water and dead lesions were evident. In contrast, transgenic plants expressing full-length Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) or N-terminal domains showed some lesions in the upper leaves, but overall FB1 compared to wild-type and C-terminal domain transgenic plants. High resistance to induced cell death.

카스파제-유사 활성 및 HR의 카스파제-유사 프로테아제의 역할이 식물에서 보고되었으며, HR은 카스파제-유사 프로테아제의 저해를 통해 예방될 수 있다. HeLa 세포에서 보여진바와 같이(도 4) FB1에 노출된 식물의 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 항-아폽토시스 활성이 카스파제-유사 프로테아제 불활성화에 의해 매개되는지 여부를 측정하기 위하여, 야생형 및 형질전환 식물로부터의 단백질 추출물이 제조되었다. 도 5B에 나타낸 바와 같이, 카스파제 불활성화는 전체 길이 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 및 FB1-유도된 아폽토시스를 저해하는 N- 및 C-말단 도메인의 능력과 관련되어 있다. FB1의 처리는 야생형 및 C-말단 도메인 형질전환 식물에 있어서 카스파제-유사 프로테아제의 활성화를 유도하였다. 대조적으로 전체 길이 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 또는 N-말단 도메인의 과발현은 카스파제-유사 프로테아제 활성화를 효과적으로 저해하였다(도 5B). 이 결과는 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 분리된 N-말단 도메인이 카스파제-유사 프로테아제 활성화를 저해함으로써 식물 세포 사멸을 예방할 수 있다는 것을 시사하였다.
Caspase-like activity and the role of caspase-like proteases in HR have been reported in plants, and HR can be prevented through inhibition of caspase-like proteases. In order to determine whether the anti-apoptotic activity of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) in plants exposed to FB1 as shown in HeLa cells is mediated by caspase-like protease inactivation, wild-type and trait Protein extracts from converting plants were prepared. As shown in FIG. 5B, caspase inactivation is associated with the ability of the N- and C-terminal domains to inhibit full length Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) and FB1-induced apoptosis. Treatment of FB1 induced the activation of caspase-like proteases in wild type and C-terminal domain transgenic plants. In contrast, overexpression of full-length Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) or N-terminal domain effectively inhibited caspase-like protease activation (FIG. 5B). This result suggested that the isolated N-terminal domain of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) could prevent plant cell death by inhibiting caspase-like protease activation.

(4) 아라비돕시스와 박테리아 병원체 P. syringae 사이의 상호작용시 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 효과
(4) Effect of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) on the interaction between Arabidopsis and bacterial pathogen P. syringae

아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 발현이 이펙터 단백질-유도된 HR 및 관련된 세포 사멸을 변화시키는지 여부가 조사되었다. 그람-음성 식물 병원성 박테리아는 복잡한 일련의 효과기를 분비하며, 하나의 효과기 단백질에 의해 유도된 HR의 변화를 감지하는 것을 어렵게 한다. 이런 한계를 극복하기 위해서, 그람-음성 식물 박테리아 병원체 주인 Pph 주 NPS3121이 사용되었으며 그 다음에 비병원성 유전자 AvrRpt2을 발현시켰다. 이 주를 이용하면 비병원성 박테리아 병원체에 반응하는 HR 및 전해질 누출을 측정하는 것이 가능하다. 6일 된 아라비돕시스 식물의 잎(야생형 및 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 형질전환 라인)이 107 cfu/ml의 양에서 AvrRpt2을 발현시키는 Pph 주 NPS3121(Pph (AvrRpt2))과 침윤되었다 (Materials and Methods 참조). 16시간 이내에, 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 C-말단 도메인이 과발현된 대부분의 야생형 및 형질전환 식물은 병원체 침윤 지역에서 융합성 조직 붕괴가 나타났으며, 이는 HR-관련된 세포 사멸의 특징적 세부 특징이다. 그러나 16시 경과시 작은 비율의 약한 HR이 생겼으나, 전체 길이 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 또는 N-말단 도메인이 과발현한 형질전환 식물의 잎 대부분에는 HR의 심각한 징후는 보이지 않았다. 전체 길이 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 및 N-말단 도메인 형질전환 식물의 약한 HR은 침윤 지점 주위의 좁은 지역으로 제한되며 융합성이 아니다. 융합성 조직 붕괴는 접종 후 20 시간이 지나서 트랜스 식물의 접종된 잎 대부분에서 발견되었다(표 1).
It was investigated whether the expression of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) altered effector protein-induced HR and related cell death. Gram-negative plant pathogenic bacteria secrete a complex series of effectors, making it difficult to detect changes in HR induced by one effector protein. To overcome this limitation, the Gram-negative plant bacterial pathogen Pph strain NPS3121 was used, followed by the expression of the non-pathogenic gene AvrRpt2. Using this note, it is possible to measure HR and electrolyte leakage in response to nonpathogenic bacterial pathogens. Leaves of 6-day-old Arabidopsis plants (wild-type and Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) transformation lines) were infiltrated with Pph strain NPS3121 (Pph (AvrRpt2)) expressing AvrRpt2 at an amount of 10 7 cfu / ml (Materials and Methods). Within 16 hours, most wild-type and transgenic plants overexpressing the C-terminal domain of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) showed confluent tissue disruption in the pathogen-infiltrating area, which is a characteristic detail of HR-related cell death. It is characteristic. However, after 16 o'clock, a small percentage of weak HR developed, but most of the leaves of transgenic plants overexpressing the full-length Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) or N-terminal domain showed no significant signs of HR. Weak HR of full length Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) and N-terminal domain transgenic plants is limited to a small area around the infiltration point and is not confluent. Confluent tissue disruption was found in most of the inoculated leaves of trans plants 20 hours after inoculation (Table 1).

전체 길이 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 또는 N-말단 지역의 과발현은 AvrRpt2을 발현시키는 P.syringae pv. phaseolicola NPS3121에 의해 유도되는 과민 반응을 약화시킨다. 총 20개의 침윤된 잎 중에서 붕괴된 잎은 적어도 반 정도였다Overexpression of full-length Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) or the N-terminal region resulted in P. syringae pv. phaseolicola attenuates the hypersensitivity reaction induced by NPS3121. Of the 20 infiltrated leaves, at least half of them collapsed 식물plant 8 시간8 hours 16 시간16 hours 24 시간24 hours Col-0Col-0 2/202/20 18/2018/20 20/2020/20 전체-길이 AtILP-발현 아라비돕시스 라인 1Full-length AtILP -Expression Arabidopsis Line 1 0/200/20 8/208/20 17/2017/20 전체-길이 AtILP-발현 아라비돕시스 라인 2Full-length AtILP -Expression Arabidopsis Line 2 0/200/20 9/209/20 18/2018/20 N 말단 AtILP-발현 아라비돕시스 라인 1N-Terminal AtILP -Expressing Arabidopsis Line 1 0/200/20 7/207/20 17/2017/20 N 말단 AtILP-발현 아라비돕시스 라인 2N-terminal AtILP -expressing Arabidopsis line 2 0/200/20 8/208/20 18/2018/20 C 말단 AtILP-발현 아라비돕시스 라인 1C-terminal AtILP -expression Arabidopsis line 1 1/201/20 17/2017/20 20/2020/20 C 말단 AtILP-발현 아라비돕시스 라인 2C-terminal AtILP -expressing Arabidopsis line 2 2/202/20 19/2019/20 20/2020/20

식물-병원체 상호작용의 결과로서 막 손상에 의한 전해질 누출은 HR-관련된 세포 사멸의 특징적이고 정량적인 세부 특징이다. HR의 약화가 막 손상과 관련이 있는지 여부를 측정하기 위하여, 야생형 및 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 형질전환 식물의 전해질 누출이 Pph (AvrRpt2) 침윤(107 cfu/ml) 후에 측정되었다. 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 C-말단 도메인을 과발현시키는 야생형 및 형질전환 식물로부터의 잎은 접종 12∼16 시간 후 최대의 전도도에 근접하였다. 전체 길이 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 또는 N-말단 도메인을 과발현시키는 형질전환 식물은 유사한 패턴을 나타냈으나, 반응의 중요성이 상당히 낮아졌으며, 최대 전도도는 야생형 또는 C-말단 도메인 형질전환 식물과 비교시 더 늦게 도달하였다(도 6). 그러나 식물을 병원성 박테리아 병원체 Pph로 처리시 전도도의 차이점은 관찰되지 않았다(자료에는 나타내지 않음). 이 결과는 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 N-말단 도메인의 과발현은 비병원성 박테리아 병원체에 의한 유도된 HR-관련된 세포 사멸을 상당히 악화시켰다는 것을 나타낸다.
Electrolyte leakage by membrane damage as a result of plant-pathogen interactions is a characteristic and quantitative detail of HR-related cell death. To determine whether HR weakness was associated with membrane damage, electrolyte leakage of wild-type and Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) transgenic plants was measured after Pph (AvrRpt2) infiltration (10 7 cfu / ml). Leaves from wild-type and transgenic plants overexpressing the C-terminal domain of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) were close to maximum conductivity after 12-16 hours of inoculation. Transgenic plants overexpressing full-length Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) or N-terminal domains showed a similar pattern, but the importance of the response was significantly lower, and the maximum conductivity was higher than that of wild-type or C-terminal domain transgenic plants. It arrived later in comparison (FIG. 6). However, no differences in conductivity were observed when plants were treated with the pathogenic bacterial pathogen Pph (data not shown). These results indicate that overexpression of the N-terminal domain of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) significantly exacerbated HR-related cell death induced by non-pathogenic bacterial pathogens.

식물 방어 반응에서 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 역할을 추가로 분석하기 위해서, 박테리아 성장시 약화된 세포 사멸의 효과가 박테리아 병원체 Pma 주 M6CΔE를 이용하여 평가되었다. 병원성 병원체는 야생형과 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 형질전환 라인으로 P. syringae의 병원성 주 (Pma 주 M6CΔE)의 접종 후에 평가되었다. 모든 식물(형질전환 및 야생형)은 접종 3∼4일 후 뚜렷한 황백화 현상이 나타났으며, 이는 감염된 잎 상에서 시간이 경과함에 따라 진행되었다. 식물 라인은 황백화 현상의 심각성의 면에서는 동일하였다(자료에는 나타나지 않음). 더욱이 야생형과 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 형질전환 라인 사이에서 박테리아 역가(bacterial titer)에 있어서 차이점은 없었다(도 7A). 이 결과는 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 과발현이 독성 Pma 주 M6CΔE 감염에 대한 방어 반응을 변화시키는 않는 다는 것을 나타내고 있다.
To further analyze the role of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) in plant defense responses, the effect of attenuated cell death on bacterial growth was evaluated using bacterial pathogen Pma strain M6CΔE. Pathogenic pathogens were assessed after inoculation of P. syringae pathogenic strain (Pma strain M6CΔE) with wild-type and Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) transformation lines. All plants (transformation and wild type) showed a clear yellowing phenomenon 3-4 days after inoculation, which progressed over time on infected leaves. Plant lines were identical in terms of severity of efflorescence (not shown in data). Moreover, there was no difference in bacterial titer between wild type and Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) transformation lines (FIG. 7A). This result indicates that overexpression of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) does not alter the protective response to toxic Pma strain M6CΔE infection.

아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)-매개된 HR 약화는 Pma의 비병원성 주의 성장에 영향을 끼치는지 여부를 측정하기 위해, 비병원성 유전자 AvrRpt2를 운반하는 주 M6CΔE는 접종물질로서 사용되었다. 이 경우 전체 길이 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 또는 N-말단 도메인의 과발현은 박테리아 성장에 있어서 30∼40배 증가를 초래하였으며, 이는 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 과발현이 무독성 Pma 주 M6CΔE에 대한 저항성을 감소시킨다는 것을 나타낸다(도 7B).
To determine whether Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) -mediated HR weakening affects the growth of non-pathogenic strains of Pma, the primary M6CΔE carrying the non-pathogenic gene AvrRpt2 was used as the inoculum. In this case, overexpression of the full-length Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) or N-terminal domain resulted in a 30-40 fold increase in bacterial growth, whereby overexpression of the Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) was associated with non-toxic Pma strain M6CΔE. It decreases the resistance to (Fig. 7B).

(5) 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)은 핵에 편재화되고 DNA 분절화 현상을 막는다.
(5) Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) is localized in the nucleus and prevents DNA fragmentation.

PCD 과정 동안 게놈 DNA 분절화 현상은 올리뉴클레오좀 단위로(oligonucleosomal units) 핵 DNA를 분해하는 세포 사멸-특이적 엔도뉴클레아제의 활성화의 결과로서 일어난다. 게놈 DNA는 3 μM FB1로 처리 또는 처리하지 않은 야생형 및 형질전환 식물로부터 추출되었다. 도 8A에 나타낸 바와 같이 전체 길이 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 또는 N-말단 도메인을 지니는 형질전환 식물에서, FB1-유도 DNA 분절화는 억제되었다. DNA 분절화가 아폽토시스의 특징이라는 것을 고려하면, 이 결과는 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)이 식물에서 아폽토시스를 방해한다는 것과 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 N-말단 도메인이 이 항-아폽토시스 활성에 있어 중요하다는 것을 확인해 주었다.
Genomic DNA segmentation during the PCD process occurs as a result of activation of cell death-specific endonucleases that degrade nuclear DNA in oligonucleosomal units. Genomic DNA was extracted from wild-type and transgenic plants treated with or without 3 μM FB1. In transgenic plants with full length Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) or N-terminal domains as shown in FIG. 8A, FB1-induced DNA fragmentation was inhibited. Given that DNA fragmentation is a hallmark of apoptosis, the results indicate that Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) interferes with apoptosis in plants and that the N-terminal domain of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) is responsible for this anti-apoptotic activity. I confirmed that it is important.

아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)이 게놈 DNA 분절화를 매개하기 위해 핵에 존재한다는 것을 확인하기 위해서, 체내에서 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 세포내 편재가 아라비돕시스에서 분석되었다. 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 C-말단 smGFP 융합 단백질이 아라비돕시스 원형질체에서 생성되었으며 발현되었다. 형광 현미경은 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)은 핵에 편재된다는 것(도 8B)과 대조군 단백질인 RFP::NLS와 일부 겹쳐진다는 것을 밝혔다. 이 결과는 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)이 식물 세포에서 오직 핵으로 타켓된 다는 것을 나타낸다.
In order to confirm that Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) is present in the nucleus to mediate genomic DNA segmentation, the intracellular localization of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) in the body was analyzed in Arabidopsis. The C-terminal smGFP fusion protein of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) was generated and expressed in the Arabidopsis protoplast. Fluorescence microscopy revealed that Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) is localized in the nucleus (FIG. 8B) and partially overlaps with the control protein RFP :: NLS. This result indicates that Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) is targeted only to the nucleus in plant cells.

상기와 같은 실험 결과를 통해 다음과 같은 사실이 확인된다.
Through the above experimental results, the following facts are confirmed.

양성적 및 음성적으로 PCD를 조절하는 다수의 유전자가 확인되었다; 하지만 식물에서 PCD를 조절하는 메커니즘은 거의 알려지지 않은 채로 남아있다. 본 발명에서 신규한 아라비돕시스 RING 핑거 단백질인 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)이 확인되었으며, 아라비돕시스에서 PCD의 음성 조절자라는 것이 밝혀졌다. 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 과발현은 효과기 단백질- 및 FB1-유도 세포 사멸을 억제하였다. 더욱이 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)은 HeLa 세포에서 카스파제 활성화의 억제를 통해 TNF-/ActD-유도 세포 사멸을 차단하였으며, 세포 사멸의 억제에 있어서 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 기능이 종에 거쳐서 보존된다는 것 시사하였다.
A number of genes have been identified that positively and negatively regulate PCD; However, the mechanisms that regulate PCD in plants remain little known. In the present invention, a novel Arabidopsis RING finger protein, Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) has been identified and found to be a negative regulator of PCD in Arabidopsis. Overexpression of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) inhibited effector protein- and FB1-induced cell death. Moreover, Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) blocked TNF- / ActD-induced cell death through inhibition of caspase activation in HeLa cells, and the function of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) in suppressing cell death was a species. It is suggested that it is preserved through.

아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)에 의한 아폽토시스의 억제를 위한 구조적 기반을 밝히기 위하여, 시험관에서 카스파제 활성 및 HeLa 세포에서 아폽토시스의 억제시 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 여러 단편의 효과가 분석되었다. 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 RING 도메인은 카스파제-3의 활성을 억제하지 못하는 반면에 알려진 BIR 도메인과 상동성을 지니지 않는 N-말단 단편은 시험관 내에서 카스파제-3의 활성을 억제하였으며 TNF-α/ActD-유도 아폽토시스를 차단하였다(도 3 및 4). 다른 IAP 단백질의 아미노산 서열 배열은 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)이 알려진 BIR 도메인과의 상동성이 결여되어 있다는 것을 나타냈다. 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 이차 구조가 연구되었으며, 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 및 인간 IAPs이 3개의 연속적인 β 스트랜드(β strands), α 나선, β 스트랜드 및 α 나선으로 구성된 공통의 모티프를 공유한다는 것이 밝혀졌다(도 10). 한 가지 가능성은 이 공통의 구조적 모티프가 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 카스파제 억제 활성을 결정한다는 것이다.
To elucidate the structural basis for the inhibition of apoptosis by Arabidopsis IAP-like protein (AtILP), the effects of several fragments of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) on caspase activity in vitro and inhibition of apoptosis in HeLa cells were analyzed. . The RING domain of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) did not inhibit caspase-3 activity, whereas N-terminal fragments that did not have homology with known BIR domains inhibited caspase-3 activity in vitro. TNF-α / ActD-induced apoptosis was blocked (FIGS. 3 and 4). The amino acid sequence arrangement of other IAP proteins indicated that the Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) lacks homology with known BIR domains. The secondary structure of the Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) has been studied, and the Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) and human IAPs have a common structure consisting of three consecutive β strands, α strands, β strands and α helices. It was found to share the motif (FIG. 10). One possibility is that this common structural motif determines the caspase inhibitory activity of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP).

아미노산 서열 분석을 기초로 하여 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)은 RING 단백질 패밀리에 속하며, 이들 멤버는 식물에서 다양한 생물학적 기능을 지닌다. 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)은 C-말단에 잘 보존된 RING 도메인을 포함하고 있다. 식물에서 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 과발현은 비병원성 박테리아 병원체 및 FB1의 적은 사용량에 반응하여 세포 사멸의 감소를 초래하였다. 대부분의 RING 핑거 단백질은 유비퀴틴화/26S 프로테아좀 단백질 분해 시스템 내에서 반응을 촉매화하는 효소 활성을 지니고 있다. 많은 IAP 단백질은 E3 유비퀴틴 리가아제 활성을 나타내며, RING 도메인은 PCD의 생물학적 활성 및 조절을 위해 중요하다. 사실 시험관 내에서 E3 유비퀴틴 리가아제 활성을 보여주는 아라비돕시스 RING 1은 세포 사멸과 관련이 있다. 아라비돕시스 내에서 또 다른 RING 도메인 단백질인 AtHAL1의 생화학적 활성 및 추정 기능은 밝혀졌다.
Based on amino acid sequencing, Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) belongs to the RING protein family, and these members have various biological functions in plants. Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) contains a well-conserved RING domain at the C-terminus. Overexpression of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) in plants resulted in a decrease in cell death in response to small amounts of non-pathogenic bacterial pathogens and FB1. Most RING finger proteins have enzymatic activity that catalyzes the reaction in the ubiquitination / 26S proteasome proteolysis system. Many IAP proteins exhibit E3 ubiquitin ligase activity, and the RING domain is important for the biological activity and regulation of PCD. In fact, Arabidopsis RING 1, which shows E3 ubiquitin ligase activity in vitro, is associated with cell death. The biochemical activity and putative function of another RING domain protein, AtHAL1, in Arabidopsis has been revealed.

곰팡이 독소 FB1으로 접종시 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)이 과발현된 형질전환 아라비돕시스 라인은 항-아폽토시스 활성을 보였다. 세포 사멸의 억제는 카스파제 활성화 및 DNA 분절화의 억제에 의해 수반되었다. 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 항-아폽토시스 활성은 N-말단 도메인을 보여주었으며, HeLa 세포의 유사한 실험 결과와 관련이 있다. 세포 사멸 억제에 있어서 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 역할을 규명하기 위해서, T-DNA 삽입 변이 유발이 실시되었으며, 몇몇의 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 넉아웃 식물 라인이 확인 및 특성화되었다. 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 변이는 야생형 식물과 비교하여 발아, 개화 및 성장률에 있어서 어떤 표현형적 차이도 초래하지는 않았다. 더욱이 AvrRpt2를 발현시키는 P. syringae pv. tomato DC3000 및 FB1에 반응하는 식물은 야생형 아라비돕시스와 구분되지 않았으며, 이는 아라비돕시스에 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 세포 사멸 억제 활성의 손실을 보상할 수 있는 아직 확인되지 않은 다른 유전자가 있다는 것을 의미한다(자료에는 나타나지 않음).
The transgenic Arabidopsis line overexpressed Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) upon inoculation with fungal toxin FB1 showed anti-apoptotic activity. Inhibition of cell death was accompanied by inhibition of caspase activation and DNA fragmentation. The anti-apoptotic activity of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) showed an N-terminal domain and correlated with similar experimental results in HeLa cells. To elucidate the role of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) in inhibiting cell death, T-DNA insertion mutation induction was performed, and several Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) knockout plant lines were identified and characterized. Variation of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) did not result in any phenotypic differences in germination, flowering and growth rates compared to wild type plants. Furthermore, P. syringae pv. Expressing AvrRpt2. Plants responding to tomato DC3000 and FB1 were indistinguishable from wild-type Arabidopsis, meaning that Arabidopsis had other genes not yet identified that could compensate for the loss of apoptotic inhibitory activity of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP). (Not shown).

그람-음성 식물 병원성 박테리아는 타입 Ⅲ 분비계(TTSS)를 통해 숙주세포로 직접적으로 타입 Ⅲ 효과기 복합체 세트를 분비한다. 예를 들면 야생형 Pto 주는 적어도 33개의 타입Ⅲ 효과기를 운반하며, 아마 50개는 운반할 것이다. 따라서 박테리아 주 Pto에 반응하는 HR은 다수의 효과기 단백질의 축적효과이다. 결과적으로 단일 효과기 단백질에 의해 유도되는 HR을 검출하는 것은 거의 불가능하다. 본 발명에서 AvrRpt2을 발현시키는 그람-음성적 식물 병원체 박테리아 P. syringae pv. phaseolicola (Pph) 주 NPS3121가 사용되었다. Pph HR을 유발하지 않았으며. 이는 다른 방어 반응을 모호하게 할 수 있다. Pph는 콩에서 달무리 무늬병(halo blight)을 일으키나 아라비돕시스에서는 일으키지 않는 병원체 모델이다. 따라서 이 병원체의 용도는 본 발명자들로 하여금 HR 및 전해질 누출시 AvrRpt2의 효과를 판단하는 것을 가능케 하였다.
Gram-negative plant pathogenic bacteria secrete a set of type III effector complexes directly into the host cell via a type III secretion system (TTSS). For example, wild-type Pto lines carry at least 33 Type III effectors, perhaps 50. Thus, HR, which responds to bacterial strain Pto, is the accumulation effect of many effector proteins. As a result, it is almost impossible to detect HR induced by a single effector protein. In the present invention, the Gram-negative plant pathogen bacterium P. syringae pv. phaseolicola (Pph) strain NPS3121 was used. Did not cause Pph HR. This can obscure other defense responses. Pph is a pathogen model that causes halo blight in soybeans but not Arabidopsis. The use of this pathogen thus enabled the inventors to determine the effect of AvrRpt2 on HR and electrolyte leakage.

많은 경우에서 PCD 및 질병 저항성은 고등 식물에서 복잡하게 관련되어 있다. 식물과 박테리아 병원체 사이의 부적합한 상호작용 동안, HR-관련된 세포 사멸은 종종 식물 질병 저항성의 발달을 유발하며, 식물 조직에서 병원체 성장의 중단을 초래한다. 그러나 세포 사멸은 저항성 반응과 관련되지 않을 수도 있다. 예를 들면 아라비돕시스 변이체 dnd1(defense no death)은 HR-관련된 세포 사멸 없이 Pst에 저항력이 있다. 본 발명에서 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 과발현은 감소된 HR 세포 사멸을 초래하는 Pph의 비병원성 주에 대한 스트레스 반응의 감소를 일으켰다. 더욱이 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)을 과발현시키는 형질전환 아라비돕시스 라인은 AvrRpt2를 지니는 Pma M6CΔE으로 접종 후에 야생형 식물과 비교하여 더 높은 수준의 박테리아 성장을 보였다. 이 결과는 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)이 PCD와 질병 저항성을 조절하는 즉 AvrRpt2-유도 PCD에 있어서 음성 역할 및 RPS2-매개 저항성에 있어서 양성 역할을 하는 분명한 기능을 지니고 있다는 것을 나타낸다. 또한 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 과발현(도 7A) 및 변이(자료에는 나타내지 않음)는 병원성 주(Pma M6CΔE)에 대한 식물의 반응에 영향을 끼치지 않는다. 그러므로 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 식물에서 감소된 PCD는 병원성 병원체에 대한 방어 반응과 관련되지 않은 것 같다.
In many cases PCD and disease resistance are complexly involved in higher plants. During inadequate interactions between plants and bacterial pathogens, HR-related cell death often leads to the development of plant disease resistance, leading to disruption of pathogen growth in plant tissues. However, cell death may not be related to the resistance response. For example, the Arabidopsis variant dnd1 (defense no death) is resistant to Pst without HR-related cell death. Overexpression of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) in the present invention resulted in a decrease in the stress response to non-pathogenic strains of Pph resulting in reduced HR cell death. Moreover, the transgenic Arabidopsis line overexpressing Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) showed higher levels of bacterial growth compared to wild type plants after inoculation with Pma M6CΔE with AvrRpt2. These results indicate that Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) has a clear function of regulating PCD and disease resistance, ie, a negative role in AvrRpt2-induced PCD and a positive role in RPS2-mediated resistance. In addition, overexpression of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) (FIG. 7A) and mutations (not shown) do not affect plant response to pathogenic strain (Pma M6CΔE). Therefore, reduced PCD in Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) plants does not appear to be associated with a protective response to pathogenic pathogens.

이하 본 발명을 실시예를 통해 더욱 상세하게 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.

(실시예 1) 플라스미스 구축
Example 1 Plasmid Construction

아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)의 단편을 인코딩하는 플라스미드(아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 전체 길이; 단편 a (잔기 1∼250), b (잔기1∼150), c (잔기 151∼304) 및 d (잔기 251∼304); N-말단 도메인 (1∼150); 및 C-말단 도메인(151∼304)을 포함)는 템플릿과 같이 전체 길이 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)을 인코딩하는 플라스미드를 사용하여 일-단계 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 제조되었다. 프라이머의 서열은 다음과 같다: 5’-GGATCCATGGCTGTTGAAGCTCATCACATG-3’(서열번호: 2)(전체 길이 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP), 단편 a 및 b 및 N-말단 도메인), 5’-GGATCCATGTCTGCGGTTCAAAAC-3’(서열번호: 3)(단편 c 및 C-말단 도메인) 및 정방 프라이머와 같은 5’-GGATCCATGGGTGGTTGTAAACGG-3’ (서열번호: 4)(단편 d) ; 5’-CTCGAGTCAAGAAGACATGTTAACAT-3’(서열번호: 5) (전체 길이, 단편 c 및 d, 및 C-말단 도메인), 5’-CTCGAGTCAAACCGCCGTTACCGGTT-3’(서열번호: 6) (단편 a) 및 역방 프라이머와 같은 5’-CTCGAGTCACGCTAACATCCGCGTTTGCGT-3’(서열번호: 7) (단편 b 및 N-말단 도메인). 증폭된 전체 길이 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 및 단편 a, b, c 및 d는 BamH1 및 Xho1으로 분해되며, 그 다음에 pcDNA3.1으로 서브 클론 되었다. 전체 길이 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 및 N-말단 및 C-말단 도메인 단편은 BamH1 및 Xho1으로 분해되며, 그 다음에 E. coli에서의 발현을 위해 pBI121로 서브 클론 되었다.
Plasmids encoding fragments of Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) (Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) full length; fragments a (residues 1-250), b (residues 1-150), c (residues 151-304)) And d (residues 251 to 304); N-terminal domains (1 to 150); and C-terminal domains (151 to 304), such as a template, encodes a full-length Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) Was prepared by one-step polymerase chain reaction (PCR). The sequence of the primers is as follows: 5'-GGATCCATGGCTGTTGAAGCTCATCACATG-3 '(SEQ ID NO: 2) (full length Arabidopsis IAP-like protein (AtILP), fragments a and b and the N-terminal domain), 5'-GGATCCATGTCTGCGGTTCAAAAC-3 5'-GGATCCATGGGTGGTTGTAAACGG-3 '(SEQ ID NO: 4) (fragment d) such as' (SEQ ID NO: 3) (fragment c and C-terminal domain) and square primer; 5'-CTCGAGTCAAGAAGACATGTTAACAT-3 '(SEQ ID NO: 5) (full length, fragments c and d, and C-terminal domain), 5'-CTCGAGTCAAACCGCCGTTACCGGTT-3' (SEQ ID NO: 6) (fragment a) and reverse primers Same 5'-CTCGAGTCACGCTAACATCCGCGTTTGCGT-3 '(SEQ ID NO: 7) (fragment b and N-terminal domain). Amplified full length Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) and fragments a, b, c and d were digested with BamH1 and Xho1 and then subcloned into pcDNA3.1. Full length Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) and N-terminal and C-terminal domain fragments were digested with BamH1 and Xho1 and then subcloned into pBI121 for expression in E. coli.

(실시예 2) 세포 배양 및 세포 생존도 분석
Example 2 Cell Culture and Cell Viability Assay

인간 자궁경부 상피 암종 (HeLa) 세포는 American Type Culture Collection (ATCC)에서 구입하였다. HeLa 세포는 가습 CO2 배양기에서 10% 열 불활성화된 우태아혈청 (FBS; Life Technologies Inc.), 2 mM L-글루타민, 100 unit/ml 페니실린 및 100 unit/ml 스트렙토마이신으로 보충된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM; Life Technologies Inc.)에서 배양되었다. 세포는 리포펙타민(lipofectamine)을 사용하여 공시된 발현 벡터로 트랜스펙트되었다. 안정한 transfectant는 G418(800 ㎍/ml)의 존재시에 선별되었다.
Human cervical epithelial carcinoma (HeLa) cells were purchased from the American Type Culture Collection (ATCC). HeLa cells were treated with Dulbecco's modified Eagle's supplemented with 10% heat inactivated fetal bovine serum (FBS; Life Technologies Inc.), 2 mM L-glutamine, 100 unit / ml penicillin and 100 unit / ml streptomycin in a humidified CO 2 incubator. incubated in medium (DMEM; Life Technologies Inc.). Cells were transfected with the expression vectors published using lipofectamine. Stable transfectants were selected in the presence of G418 (800 μg / ml).

세포 생존도는 크리스탈 바이올렛 염색법에 의해 측정되었다. 간단히 말하면, 12-웰 접시에 놓인 HeLa세포는 TNF-a (100 ng/ml)/ActD (100 ng/ml)에 노출되었다. 세포는 10분 동안 실온에서 30% 에탄올 및 3% 포름알데하이드에서 0.5% 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색되었으며, 그 후 플레이트는 수돗물로 세 번 세척되었다. 염색 후 세포는 1% SDS에서 용해되었고 염료 흡수율은 96-웰 플레이트 판독기를 사용하여 550 nm에서 측정되었다. 세포 생존도는 처리되지 않은 샘플과 비교하여 염료 강도로서 계산되었다.
Cell viability was measured by crystal violet staining. In brief, HeLa cells placed in 12-well dishes were exposed to TNF-a (100 ng / ml) / ActD (100 ng / ml). The cells were stained with 0.5% crystal violet solution in 30% ethanol and 3% formaldehyde at room temperature for 10 minutes, after which the plates were washed three times with tap water. After staining cells were lysed in 1% SDS and dye uptake was measured at 550 nm using a 96-well plate reader. Cell viability was calculated as dye intensity compared to untreated samples.

(실시예 3) DEVDase 활성 분석
Example 3 DEVDase Activity Assay

세포 펠렛은 차가운 PBS로 세척되었으며, 그 다음에 프로테아제 저해제(5 mg/ml 아프로티닌 및 펩스타틴, 10 mg/ml 류펩틴 및 0.5 mM 페닐메틸설포닐 플로라이드)를 포함하는 100 mM HEPES 완충용액(pH 7.4)에서 재서스펜드되었다. 상기 세포 서스펜션은 3번의 동결 융해 사이클에 의해 용해되었으며, 그 다음에 시토졸 분획이 4℃에서 1시간 동안 100,000 x g로 원심분리하여 수득되었다. DEVDase 활성은 색소 기질 Ac-DEVD-pNA의 단백질 분해효소(proteolytic cleavage)를 측정함으로써 평가되었으며, 카스파제-3-유사 프로테아제에 대한 기질로서 작용한다. 간단히 말하면 세포 용해물(단백질 40 ㎍)은 96-웰 플레이트에서 Ac-DEVD-pNA (240 μM을 포함하는 반응 완충용액 150 μl과 혼합되었다. 반응 혼합물은 90분 동안 37℃에서 배양되었다. 효소로-분비되는 pNA의 증가는 405 nm 흡광도에서 15분마다 측정되었다; DEVDase 활성은 초속도로 계산되었다.
The cell pellet was washed with cold PBS and then 100 mM HEPES buffer solution containing protease inhibitors (5 mg / ml aprotinin and pepstatin, 10 mg / ml leupetin and 0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride) pH 7.4). The cell suspension was lysed by three freeze thaw cycles, and then the cytosol fraction was obtained by centrifugation at 100,000 xg for 1 hour at 4 ° C. DEVDase activity was assessed by measuring the proteolytic cleavage of the pigment substrate Ac-DEVD-pNA and acts as a substrate for caspase-3-like protease. In brief, cell lysates (40 μg protein) were mixed with 150 μl of Ac-DEVD-pNA (240 μM reaction buffer containing 240 μM in 96-well plates. The reaction mixture was incubated at 37 ° C. for 90 minutes. The increase in secreted pNA was measured every 15 minutes at 405 nm absorbance; DEVDase activity was calculated at initial rate.

식물에서 DEVDase 활성 분석 측정을 위해, 잎을 갈은 다음에 카스파제 추출 완충용액 [50 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1% BSA, 1 mM PMSF, 20% 글리세롤]에서 균일화되었다. 샘플은 카스파제 에세이 완충용액(150 μM Ac-DEVD-pNA을 포함하는 카스파제 추출 완충용액)과 혼합되었으며, 그 다음에 1시간 동안 37℃에서 배양되었다. 효소로-분비되는 pNA의 증가는 405 nm 흡광도에서 15분마다 측정되었다; DEVDase 활성은 초속도로 계산되었다.
For measuring DEVDase activity assay in plants, the leaves were ground and then in caspase extraction buffer [50 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1% BSA, 1 mM PMSF, 20% glycerol]. Homogenized. Samples were mixed with caspase assay buffer (caspase extraction buffer with 150 μM Ac-DEVD-pNA) and then incubated at 37 ° C. for 1 hour. The increase in enzyme-secreted pNA was measured every 15 minutes at 405 nm absorbance; DEVDase activity was calculated at initial speed.

(실시예 4) 식물
Example 4 Plant

아라비돕시스 탈리아나 모??은 2% 수크로스 및 0.6% Phytagel를 포함하는 MS 배지에서 발아되었으며 온도-, 광-통제된 성장 챔버에서 유지되었다. 신선한 MS 플레이트 또는 FB1가 보충된 신선한 MS 플레이트로 이동되기 전에 아라비돕시스 묘목은 14일 동안 성장되었다.
Arabidopsis thaliana mode was germinated in MS medium containing 2% sucrose and 0.6% Phytagel and maintained in a temperature-, light-controlled growth chamber. Arabidopsis seedlings were grown for 14 days before being transferred to fresh MS plates or fresh MS plates supplemented with FB1.

DNA 분절화 분석을 위해, 유전체 DNA 10 μg은 0.8% 아가로스/0.6% 메타포 아가로즈 겔 상에서 전기영동에 의해 분리되었으며 그 다음에 Hybond 막으로 이동되었다. 프로브로서 전체 유전체 아라비돕시스 DNA 50 ng은 상업적으로 사용 가능한 임의의 레벨링 키트를 이용하여 표지되었다. 하이브리디제이션 후에 상기 막은 2시간 동안 65℃에서 0.1X SSC/0.1% SDS로 세척되었다.
For DNA fragmentation analysis, 10 μg of genomic DNA was separated by electrophoresis on 0.8% agarose / 0.6% metaphor agarose gel and then transferred to Hybond membrane. 50 ng of whole genome Arabidopsis DNA as probe was labeled using any leveling kit available commercially. After hybridization the membranes were washed with 0.1 × SSC / 0.1% SDS at 65 ° C. for 2 hours.

(실시예 5) 박테리아
Example 5 Bacteria

박테리아주는 선별을 위해 28℃의 적절한 항생제를 포함하는 KB 배지에서 성장되었다. 이온 누출을 평가하고 HR 표현형을 점수화하기 위해서, 식물은 무바늘 1 ml 주사기를 사용하여 Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (Pph)주 NPS3121의 107 cfu/ml (A600=0.2)과 침윤되었다(표 1 및 도 6). AvrRpt2 지니는 Pph 주 NPS3121은 이온 누출 및 세포 사멸 분석을 위해 사용되었다. 이온 누출 측정을 위해, 잎 디스크 8장(지름 8 mm)은 침윤 후에 즉시 제거되었으며(t=0), 40 ml 물 위로 부유시켰다. 30분 후에, 세척수는 10 ml의 새로운 물로 교체되었으며, 그 다음에 시간에 대한 전도도는 Fisher brand 전도도 측정기를 사용하여 측정되었다.
Bacteria lines were grown in KB medium containing appropriate antibiotics at 28 ° C. for selection. To assess ion leakage and to score HR phenotypes, plants were treated with Pseudomonas syringae pv. Infiltrated with 10 7 cfu / ml (A 600 = 0.2) of phaseolicola (Pph) NPS3121 (Table 1 and FIG. 6). Pph strain NPS3121 with AvrRpt2 was used for ion leakage and cell death analysis. For ion leakage measurements, eight leaf disks (8 mm in diameter) were removed immediately after infiltration (t = 0) and suspended above 40 ml water. After 30 minutes, the wash water was replaced with 10 ml of fresh water, and then the conductivity over time was measured using a Fisher brand conductivity meter.

엠티 벡터 (pVSP61) 또는 AvrRpt2를 인코딩하는 유도체를 지니는 P. syringae pv. maculicola (Pma) 주 M6CΔE를 사용하는 성장 실험을 위해(도 7), 5주된 식물 잎은 무바늘 1 ml 주사기를 사용하여 10 mM MgCl2의 박테리아 서스펜션을 접종하였다. 지시한 시간 후에, 각 샘플에 대한 세 개의 잎 디스크는 10 mM MgCl2에서 가루로 되며 그 다음에 연속으로 희석되고 박테리아 수를 세기 위해서 플레이트 되었다.
P. syringae pv. With an empty vector (pVSP61) or a derivative encoding AvrRpt2. For growth experiments using maculicola (Pma) main M6CΔE (FIG. 7), 5 week plant leaves were inoculated with bacterial suspension of 10 mM MgCl 2 using a needleless 1 ml syringe. After the indicated time, three leaf disks for each sample were ground in 10 mM MgCl 2 and then diluted serially and plated to count bacteria.

(실시예 6) 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP) 융합 단백질의 세포내 편재
Example 6 Intracellular Localization of Arabidopsis IAP-Like Protein (AtILP) Fusion Proteins

PCR은 전체-길이 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)을 인코딩하는 cDNA 단편을 생성하기 위해서 사용되었다. cDNA 단편은 Xba I 및 BamH I으로 분해되었으며 그 다음에 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)::smGFP을 제조하기 위해서 용해성 변성 녹색 형광 단백질(smGFP)로 결찰된 인-프레임을 만들었다. 아라비돕시스 IAP-유사 단백질(AtILP)::smGFP 융합 컨스트럭트는 폴리펩티드 글리세롤-매개된 형질전환을 이용하여 아라비돕시스 원형질체로 도입되었다(Jin et al., 2001). 핵 위치 신호와 융합된 빨간색 형광 단백질의 발현(RFP::NLS)은 핵 위치에 있어서 양성 대조군으로서 사용되었다. 형질전환된 원형질체는 암 조건 22℃에서 배양되었다. 융합 단백질의 발현은 기준 FITC 및 로다민 필터를 이용한 형광 현미경(올림푸스 AX70, 일본)에 의해 형질전환 2일 후에 관찰되었다(Koiwa et al., 2004).PCR was used to generate cDNA fragments encoding full-length Arabidopsis IAP-like protein (AtILP). The cDNA fragment was digested with Xba I and BamH I and then in-frame ligated with soluble denatured green fluorescent protein (smGFP) to prepare Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) :: smGFP. Arabidopsis IAP-like protein (AtILP) :: smGFP fusion construct was introduced into the Arabidopsis protoplasts using polypeptide glycerol-mediated transformation (Jin et al., 2001). Expression of red fluorescent protein (RFP :: NLS) fused with nuclear position signal was used as a positive control for nuclear position. Transformed protoplasts were cultured at 22 ° C. in cancer conditions. Expression of the fusion protein was observed 2 days after transformation by fluorescence microscopy (Olympus AX70, Japan) using a reference FITC and rhodamine filter (Koiwa et al., 2004).

서열목록 전자파일 첨부Attach an electronic file to a sequence list

Claims (4)

서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 지니는 아라비돕시스 탈리아나에서 분리된 아라비돕시스 아폽토시스 저해제-유사 단백질(AtILP)을 포함하는 조성물에 있어서, 상기 단백질은 C-말단에 RING 핑거 도메인을 포함하고 바큐로바이러스 IAP 반복(BIR) 도메인은 결핍되어 있음을 특징으로 하는 아라비돕시스 아폽토시스 저해제-유사 단백질(AtILP)을 포함하는 세포 사멸을 완화시키는 조성물.
In a composition comprising an Arabidopsis apoptosis inhibitor-like protein (AtILP) isolated from Arabidopsis thaliana with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, the protein comprises a RING finger domain at the C-terminus and a baculovirus IAP repeat A composition that mitigates cell death comprising Arabidopsis apoptosis inhibitor-like protein (AtILP), characterized in that the (BIR) domain is deficient.
제 1항에 있어서, HeLa 세포 내에서 상기 아라비돕시스 아폽토시스 저해제-유사 단백질(AtILP)의 발현은 카스파제 활성의 불활성화를 통해 종양괴사인자(TNF)-α/ActD-유도된 아폽토시스에 대한 저항성을 부여함을 특징으로 하는 아라비돕시스 아폽토시스 저해제-유사 단백질(AtILP)을 포함하는 세포 사멸을 완화시키는 조성물.
The method of claim 1, wherein expression of the Arabidopsis apoptosis inhibitor-like protein (AtILP) in HeLa cells confers resistance to tumor necrosis factor (TNF) -α / ActD-induced apoptosis through inactivation of caspase activity. A composition for alleviating cell death, including Arabidopsis apoptosis inhibitor-like protein (AtILP).
제 1항의 아라비돕시스 아폽토시스 저해제-유사 단백질(AtILP)을 과발현시키는 항-아폽토시스 활성을 지닌 아라비돕시스 형질전환 식물체.
An Arabidopsis transformed plant having anti-apoptotic activity that overexpresses the Arabidopsis apoptosis inhibitor-like protein (AtILP) of claim 1.
제 3항에 있어서, 상기 아라비돕시스 아폽토시스 저해제-유사 단백질(AtILP) 과발현시키는 형질전환 식물체는 카스파제 활성화 및 DNA 분절화의 억제에 의해 아폽토시스를 완화하고 비병원성 박테리아 병원체의 성장을 증가시킴을 특징으로 하는 항-아폽토시스 활성을 지닌 아라비돕시스 형질전환 식물체.4. The transgenic plant of claim 3, wherein said transgenic plant overexpressing said Arabidopsis apoptosis inhibitor-like protein (AtILP) mitigates apoptosis by increasing caspase activation and DNA fragmentation and increases the growth of non-pathogenic bacterial pathogens. Arabidopsis transforming plant with apoptosis activity.
KR1020120014925A 2012-02-14 2012-02-14 Inhibitor of apoptosis-like protein attenuating the cell death KR101339727B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120014925A KR101339727B1 (en) 2012-02-14 2012-02-14 Inhibitor of apoptosis-like protein attenuating the cell death

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120014925A KR101339727B1 (en) 2012-02-14 2012-02-14 Inhibitor of apoptosis-like protein attenuating the cell death

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130094377A KR20130094377A (en) 2013-08-26
KR101339727B1 true KR101339727B1 (en) 2013-12-11

Family

ID=49218153

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120014925A KR101339727B1 (en) 2012-02-14 2012-02-14 Inhibitor of apoptosis-like protein attenuating the cell death

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101339727B1 (en)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101450309B1 (en) 2013-08-08 2014-10-22 주식회사 만도 Piston valve assembly of shock absorber

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NCBI의 database accession no.NP193705(2011.05.28.) *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20130094377A (en) 2013-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Huang et al. The Arabidopsis SUMO E3 ligase AtMMS21, a homologue of NSE2/MMS21, regulates cell proliferation in the root
Hu et al. A rabidopsis transcription factor WRKY 8 functions antagonistically with its interacting partner VQ 9 to modulate salinity stress tolerance
Sanchez et al. AtBI‐1, a plant homologue of Bax inhibitor‐1, suppresses Bax‐induced cell death in yeast and is rapidly upregulated during wounding and pathogen challenge
do Canto et al. Biological activity of nine recombinant AtRALF peptides: implications for their perception and function in Arabidopsis
Wang et al. Overexpression of BnWRKY33 in oilseed rape enhances resistance to S clerotinia sclerotiorum
Hanania et al. Isolation of a novel SUMO protein from tomato that suppresses EIX‐induced cell death
Oh et al. Capsicum annuum WRKY protein CaWRKY1 is a negative regulator of pathogen defense
Chichkova et al. Phytaspase, a relocalisable cell death promoting plant protease with caspase specificity
Cao et al. Overexpression of the rice EREBP-like gene OsBIERF3 enhances disease resistance and salt tolerance in transgenic tobacco
Oh et al. CaWRKY2, a chili pepper transcription factor, is rapidly induced by incompatible plant pathogens
Peng et al. Overexpression of a vesicle trafficking gene, OsRab7, enhances salt tolerance in rice
Zhang et al. Calmodulin-like gene MtCML40 is involved in salt tolerance by regulating MtHKTs transporters in Medicago truncatula
Ponti et al. An amphibian antimicrobial peptide variant expressed in Nicotiana tabacum confers resistance to phytopathogens
Du et al. The CC‐NB‐LRR OsRLR1 mediates rice disease resistance through interaction with OsWRKY19
Kwon et al. Expression analysis of the metacaspase gene family in Arabidopsis
Kim et al. Pepper pathogenesis‐related protein 4c is a plasma membrane‐localized cysteine protease inhibitor that is required for plant cell death and defense signaling
MXPA01004318A (en) Trans-species transfer of apoptotic genes and transgenic plants developed thereby.
Ke et al. ROP6 is involved in root hair deformation induced by Nod factors in Lotus japonicus
Kim et al. Inhibitor of apoptosis (IAP)-like protein lacks a baculovirus IAP repeat (BIR) domain and attenuates cell death in plant and animal systems
Hou et al. Characterization of the CsPNG1 gene from cucumber and its function in response to salinity stress
KR101112656B1 (en) Novel pathogenicity gene in blast fungus to suppress basal defenses of host and uses thereof
Al-Daoude et al. RIN13 is a positive regulator of the plant disease resistance protein RPM1
KR101339727B1 (en) Inhibitor of apoptosis-like protein attenuating the cell death
KIM et al. The chili pepper CaATL1: an AT‐hook motif‐containing transcription factor implicated in defence responses against pathogens
US10336791B2 (en) Means and methods for mediating protein interference

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160927

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171020

Year of fee payment: 5

LAPS Lapse due to unpaid annual fee