KR101337460B1

KR101337460B1 - Axenic culture induction for Microcystis

Info

Publication number: KR101337460B1
Application number: KR1020090054528A
Authority: KR
Inventors: 오희목; 김은경; 안치용; 최강국
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2009-06-18
Filing date: 2009-06-18
Publication date: 2013-12-06
Also published as: KR20100136257A

Abstract

본 발명은 마이크로시스티스의 무균 유도방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 남세균인 마이크로시스티스와 오염 세균의 항생제에 대한 민감성의 차이를 이용하여, 오염 세균을 선택적으로 사멸시키고 남세균의 오염 세균에 대한 상대적 개체수 비율을 높인 후, 희석을 통해 다수의 분획된 미량 배양조에 남세균 세포 한 마리 미만이 포함될 정도의 배양액을 접종함으로써 무균 유도 확률이 낮더라도 동시에 처리할 수 있는 처리 개수를 획기적으로 증가시킴에 의해 무균 유도를 확률적으로 보장받는, 하이 쓰루풋(high throughput) 개념의 무균 유도방법에 관한 것이다. The present invention relates to a method for inducing sterility of microcistis, and more particularly, by using the difference in sensitivity of antibiotics of microbacteria and microbial bacteria that are contaminated with bacteria, selective killing of contaminating bacteria and By increasing the relative population ratio, the dilution inoculated a culture solution containing less than one bacterium cell into multiple fractionated microculture tanks, thereby dramatically increasing the number of treatments that can be processed simultaneously, even if the probability of aseptic induction is low. A method for aseptic induction with a high throughput concept, which is probabilistically guaranteed for aseptic induction.

마이크로시스티스, 무균 유도방법, 항생제, 무균 균주(axenic strain), 하이 쓰루풋(high throughput) Microcistis, sterile induction methods, antibiotics, axenic strains, high throughput

Description

Axenic culture induction for Microcystis

본 발명은 남세균(cyanobacteria) 마이크로시스티스의 무균 유도방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 항생제 처리와 하이 쓰루풋(high throughput) 배양의 단계적 처리를 통해 보다 신속하게 높은 확률로 무균상태의 남세균을 얻는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for inducing sterility of cyanobacteria microsis, and more particularly, a method for obtaining sterile bacillus with a high probability with a high probability through the stepwise treatment of antibiotic treatment and high throughput culture. It is about.

남세균은 미세조류(microalgae)의 일종으로, 식물체와 동일한 방식의 산소발생 광합성을 수행하여 에너지를 얻는 유일한 원핵생물(prokaryote)이다. 남세균은 약 35억 년 전에 지구에 출현한 매우 오래된 세균으로, 원시대기에 산소를 공급하여 현재의 대기를 만든 것도 남세균인 것으로 알려져 있으며, 현재에도 전지구 일차 생산량의 4분의 1 정도를 담당하고 있다. 스피루리나(Spirulina)와 같은 남세균 일부종은 건강보조식품으로 유명하고, 시네코시스티스(Synechocystis) 종은 광합성 연구의 좋은 모델종으로 사용되고 있는 등, 다양한 남세균이 유용하게 사용되고 있다. 또한, 대양에 풍부하게 존재하는 남세균의 생장을 조절함으로써 지구온난화를 막을 수 있으리라는 전망도 제기되고 있다. 그러나, 일부 남세균은 부영양화된 담수 호소에서 녹조를 발생시켜 다양한 환경문제를 야기하기도 하고, 독소를 생산함으로써 식수원을 위협하기도 한다. 이러한 남세균의 생리, 생태에 대한 이해를 높이고 이들을 보다 효과적으로 이용하기 위하여, 최근에는 남세균에 대한 지놈 시퀀싱(genome sequencing)을 통한 유전체 해독 및 수생태 모니터링을 위한 마이크로어레이(microarray)용 디엔에이 칩(DNA chip)의 개발이 점차 많은 종에 대하여 이루어지고 있다. 이러한 최신의 기술을 사용하기 위한 전제조건으로서, 무균의 남세균 배양이 우선적이고 필수적으로 요구된다. 즉, 다른 세균을 완전히 제거하고 순수하게 한 종의 남세균만을 얻어야 하는데, 남세균과 오염세균은 동일한 원핵생물이기 때문에 항생제의 사용도 상당히 제약되며, 일부 남세균은 고체배지에서 제대로 배양이 되지 않아 무균유도를 더욱 어렵게 한다. 이에 따라 국내뿐만 아니라 외국의 미세조류은행에서도 상당수의 남세균 균주가 세균에 오염된 상태에서 배양, 유지되고 있으며, 무균상태의 균주도 배양 및 실험과정에서 재오염되는 사례가 많다.A bacterium is a microalgae, the only prokaryote that gains energy by performing oxygen-producing photosynthesis in the same way as plants. The bacterium is a very old bacterium that appeared on Earth about 3.5 billion years ago. It is also known that the bacterium created the present atmosphere by supplying oxygen to the primordial atmosphere. . Some strains of S. aureus , such as Spirulina , are famous for health supplements, and Synechocystis species are used as a good model for photosynthesis research. In addition, the prospect of preventing global warming by regulating the growth of the bacteria that are abundant in the ocean has been raised. However, some bacterium can produce green algae in eutrophic freshwater lakes, causing various environmental problems, and threatening drinking water sources by producing toxins. In order to better understand the physiology and ecology of these bacteria and to use them more effectively, recently, DNA chips for microarrays for genome detoxification and aquatic monitoring through genome sequencing of the bacteria. ) Is being developed for more species. As a prerequisite for using this state-of-the-art technology, sterile microbial culture is required first and foremost. In other words, it is necessary to completely remove other bacteria and obtain only one species of bacterium. Since bacteria and contaminating bacteria are the same prokaryotic organisms, the use of antibiotics is also very limited. To make it more difficult. As a result, many microbial strains in Korea as well as foreign microalgal banks are cultured and maintained in a contaminated state, and aseptic strains are often recontaminated in the culture and experimental processes.

일반적으로 무균균주의 오염여부 판정은 평판법을 많이 사용하고 있다. LB, R2A, NA 등의 미생물 배양용 고체 배지에 남세균의 배양액을 도말하고 37℃ 암조건에서 최대 5일 배양하여 세균 또는 곰팡이 콜로니(colony)의 생성여부로 오염여부를 판별한다. 그러나, 이 방법은 판정하는 시간이 많이 소요되고, 사용한 배지 또는 온도 조건에서 잘 자라지 않는 미생물의 유무를 확신하기 어렵다는 단점이 있다. DNA를 형광 염색하여 현미경으로 세균의 유무를 직접 육안으로 확인하는 방법과 전자현미경으로 확인하는 방법도 있다. 그러나, 이들은 오염 여부 를 판정하는 방법이며, 남세균을 무균으로 만들기 위한 방법은 아니다. 남세균의 무균유도에 관한 특허는 매우 찾아보기가 힘들며, 국내에서는 항생제를 처리하여 남세균 스피루리나 프라텐시스를 무균으로 유도한 것이 유일하다[국내 특허 등록 제816877호]. 해외 특허에서도 남세균의 무균 유도방법에 대한 것은 검색이 되지 않으며, 한천(agar)의 농도를 변화시키거나, 비중의 차이를 이용하여 원심분리를 통해 오염세균을 분리한다거나 하는 등의 방법이 논문으로 나와 있을 뿐이다. 게다가 이러한 방법들도 다양한 남세균에 공통적으로 적용되는 방법은 아니며, 그 성공확률 또한 매우 저조하다. In general, the reputation of aseptic strains is widely used by the reputation method. The culture medium of the bacterium is smeared on a solid medium for microbial culture such as LB, R2A, and NA, and cultured for up to 5 days at 37 ° C. in a dark condition to determine whether the bacteria or fungal colonies are contaminated. However, this method is disadvantageous in that it takes a long time to determine and it is difficult to confirm the presence or absence of microorganisms that do not grow well in the medium or temperature conditions used. There is also a method of fluorescently staining DNA and visually confirming the presence of bacteria under a microscope and an electron microscope. However, they are a method of determining whether they are contaminated and are not intended to make aseptic bacteria. Patents related to sterility induction of S. aureus are very hard to find, and in Korea, the treatment of antibiotics induces S. spirulina pratensis to be aseptic (Korea Patent Registration No. 816877). Foreign patents do not search for sterile induction methods, and thesis suggests changing the agar concentration or separating the contaminating bacteria by centrifugation using the difference in specific gravity. There is only. Moreover, these methods are not commonly applied to various bacteria, and the probability of success is very low.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 연구 노력한 결과, 남세균 마이크로시스티스에 비해 오염세균에 대한 선택성이 높은 항생제를 선별하여 처리하고, 이차적으로는 미량의 배양액 내에 남세균 한 마리가 들어갈 정도로 희석하여 배양 개수를 하이 쓰루풋 수준으로 증가시킴으로써 무균유도 확률을 높이는 방법을 개발하였다. Accordingly, the present inventors have conducted research to solve the above problems, and as a result, the antibiotics having high selectivity to contaminating bacteria compared to the microbial microcistis is selected and processed, and secondly enough to enter a single microbial bacteria in a small amount of the culture medium. A method was developed to increase the aseptic induction probability by diluting and increasing the number of cultures to high throughput levels.

또한, 곰팡이로 남세균이 오염되었을 경우에는, 진핵생물용 항생제를 처리하면 어렵지 않게 제거할 수 있으나, 남세균과 같은 원핵생물인 세균에 의해 오염이 되었을 경우에는 원핵생물용 항생제 처리에 의해 남세균도 같이 사멸해 버린다는 문제가 있다. 이에, 본 발명은 항생제 처리 이외에, 낮은 무균유도 확률을 하이 쓰루풋 방식의 희석배양법을 추가로 도입하여 처리 개수를 획기적으로 증가시킴 으로써 결과적으로는 무균유도를 보다 확실하게 보장할 수 있는 방법을 개발하고자 하였다. 또한, 일부 고체배지에서 자라지 않는 남세균의 경우에도 액체 배양을 통하여 하나의 남세균 세포로부터 균주를 유도함으로써 기존의 무균 유도의 어려움을 극복하고자 하였다.In addition, if the bacteria are contaminated with mold, treatment with eukaryotic antibiotics can be easily removed.However, if the bacteria are contaminated with prokaryotic bacteria such as bacteria, they also die with prokaryotic antibiotics. There is a problem. Thus, the present invention, in addition to antibiotic treatment, by introducing a high throughput dilution culture method in addition to low aseptic induction probability to significantly increase the number of treatments, as a result, to develop a method that can more reliably ensure the aseptic induction It was. In addition, even in the case of the bacterium that does not grow in some solid medium, it was intended to overcome the difficulty of inducing the conventional sterility by inducing a strain from one bacterium cell through liquid culture.

따라서, 본 발명은 신속하면서도 무균 유도의 확률이 높은 새로운 남세균 마이크로시스티스의 무균 유도방법을 제공하는데 그 목적이 있다.Therefore, an object of the present invention is to provide a method for sterile induction of new microbial microcistis which is fast and has a high probability of sterile induction.

본 발명은 The present invention

5 ~ 100 ㎍/ml의 아미노글리코사이드(aminoglycoside)계 항생제를 기본으로 한 복합 처리를 통해 마이크로시스티스의 상대적 개체수를 높이는 단계;Increasing the relative population of microcistis through a complex treatment based on 5-100 μg / ml aminoglycoside antibiotics;

웰(well) 하나에 목적 마이크로시스티스 1개를 분주시켜 하이 쓰루풋(high throughput) 방식으로 희석 액체 배양하는 단계;Dispensing one target microsis into one well and culturing the diluted liquid in a high throughput manner;

상기 희석 액체 배양물에 포도당을 첨가하여 무균 여부를 확인하는 단계; 및Adding glucose to the diluted liquid culture to determine whether it is aseptic; And

무균 마이크로시스티스를 얻는 단계Steps to Get Sterile Microsis

를 포함하는 마이크로시스티스의 무균 유도방법을 그 특징으로 한다.It is characterized by a method of aseptic induction of microsis including.

본 발명은 세균에 의한 오염에 취약한 남세균을 신속하고도 높은 확률로 무균 유도할 수 있는 방법으로서, 무균상태의 남세균 균주를 요구하는 여러 가지 최신 분석기법의 활용에서 기존에 받던 제약을 해결할 수 있을 것이다. 특히, 남세균의 생리 및 생태 연구에 새로운 돌파구를 마련할 것으로 기대되는, 유전체 해 독 및 DNA 칩 제작에는 우선적으로 무균 균주가 요구되는데, 본 발명을 통해 보다 간단하게 무균 상태의 남세균을 확보함으로써 이러한 오믹스 연구의 기반을 마련할 수 있다. The present invention is a method capable of inducing sterile bacteria with rapid and high probability of vulnerable to contamination by bacteria, and will be able to solve the existing limitations in the use of various modern analytical methods that require sterile bacteria. . In particular, sterile strains are required for genome detoxification and DNA chip production, which are expected to provide new breakthroughs in the physiological and ecological studies of Nam bacteria, and through the present invention, the bacterium in sterile conditions is more easily obtained through the present invention. Can lay the groundwork for a mix study.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명은 2단계의 남세균 무균 유도방법으로서, 먼저 오염세균에 선택성이 높은 항생제를 처리하여 남세균의 오염세균에 대한 상대적 농도를 증가시키고, 다음 단계에서 희석을 통해 96 웰 플레이트(well plate)의 웰 하나에 확률적으로 남세균 세포 하나 미만이 들어가도록 함으로써, 수백 개의 웰 중 최소 몇 개의 웰에서는 무균의 남세균을 확보할 수 있는 하이 쓰루풋 방식에 관한 것이다. The present invention is a two-step method for inducing bacillus bacteria, first of all, by treating a highly selective antibiotic with contaminating bacteria to increase the relative concentration of contaminating bacteria of contaminants, and by dilution in the next step, a well of a 96-well plate. By having a probability that less than one bacterium cell enters one, at least some of the hundreds of wells are related to a high throughput method capable of securing sterile bacteria.

다양한 남세균 중에서도 국내 담수의 주요 녹조 생성종이며, 마이크로시스틴(microcystin)이라는 간독소(hepatotoxin)를 생산하는 것으로 알려진 마이크로시스티스(Microcystis)를 주된 대상으로 하여 본 발명을 진행하였다. 특히, 마이크로시스티스는 고체배지에서 잘 자라지 않는 대표종으로서 액체배양을 통한 무균 유도방법이 요구되는 종이다. 이를 위해 국내 호소로부터 마이크로시스티스 에어루기노사 KW 균주를 분리하고, 광학현미경 형태 관찰과 16S rRNA 및 cpc-IGS 유전자의 염기서열 분석을 통해 동정하였으며, BG11 배지를 이용하여 수차례 계대 배양하면서 광학현미경 관찰을 통하여 단조 균주(unialgal strain)로 유지하면서 보존하였다. 상기 분리된 마이크로시스티스 에어루기노사 KW를 2009년 6월 11일자로 생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC 18162P를 부여받았다.Among the variety of cyanobacteria and algae produce major species of domestic fresh water, it was carried out the present invention when the micro seutiseu (Microcystis) are known to produce toxin (hepatotoxin) between that Microcystin (microcystin) as a main target. In particular, microcistis is a representative species that does not grow well in a solid medium, and is a species requiring a sterile induction method through liquid culture. To this end, microcystis aeruginosa KW strains were isolated from domestic appeal and identified by optical microscope morphology and sequencing of 16S rRNA and cpc-IGS genes, followed by several passages using BG11 medium. Through observation, it was preserved while maintaining as a monogal strain. The isolated microcystis aeruginosa KW was deposited on June 11, 2009 to the BRC to receive the accession number KCTC 18162P.

상기 분리된 마이크로시스티스 에어루기노사 KW 균주는 수백 개 이상의 세포가 하나의 덩어리를 이루는 전형적인 마이크로시스티스의 특징을 보여 주었다. 그리고 세포 하나하나에서는 기낭(gas vesicle)에 의한 빛의 산란에 의해 세포 내부가 불균일하게 어둡거나 밝게 보이는 현상을 나타내었다. 본 균주는 26 ㅁ 2 ℃인 광 조건에서 조류 배양용 배지인 MA 배지를 이용하여 2일간 배양하였을 때 세균용 고체 배지에서 오염세균 콜로니가 3 x 10⁴ cells/ml개 이상 발견되었다.The isolated microcistis aeruginosa KW strain showed the characteristics of a typical microcistis in which hundreds of cells form one clump. In each cell, the inside of the cell appeared unevenly dark or bright due to scattering of light by gas vesicles. This strain was found to be more than 3 x 10 ⁴ cells / ml of contaminating bacterial colonies in the solid medium for bacteria when cultured for 2 days in the medium of the algae culture medium under light conditions of 26 ㅁ 2 ℃.

5 ~ 100 μg/ml의 아미노글리코사이드(aminoglycoside)계 항생제를 기본으로 한 복합처리를 통해 마이크로시스티스의 상대적 개체수를 높이는 단계;Increasing the relative population of microcistis through a complex treatment based on an aminoglycoside antibiotic of 5-100 μg / ml;

상기 아미노글리코사이드계 항생제인 네오마이신(neomycin)을 기본으로 하고, 스트렙토마이신(streptomycin), 마크로라이드(macrolide)계 항생제인 에리스로마이신(erythromycin), 베타 락탐계인 페니실린(penicillin G) 및 린코사마이드(lincosamide)계인 클린다마이신(clindamycin) 중에서 선택된 1종 이상을 추가로 복합 처리한 것으로 1 ~ 48 시간, 18 ~ 37 ℃에서 처리하여 마이크로시스티스의 상대적 개체수를 높인다.Neomycin (neomycin), the aminoglycoside antibiotic, is based on streptomycin, a macrolide antibiotic, erythromycin, erythromycin beta lactam penicillin G, and lincosamide (penicillin G) Lincosamide (clindamycin) is one or more selected from the complex treatment of 1 to 48 hours at 18 ~ 37 ℃ to increase the relative population of microcistis.

배양 웰(well) 하나당 마이크로시스티스 1개를 분주시켜 하이 쓰루풋(high throughput) 방식의 희석 액체 배양한다.One microsisti per aliquot of the culture well is dispensed and cultured in a high throughput dilution liquid.

무균 상태의 검정을 위하여 세균 성장을 촉진하는 포도당을 첨가하여 재배양하고, 무균 유도된 마이크로시스티스를 확보한다.For aseptic assay, glucose is added to promote bacterial growth and cultured to ensure sterile induced microsis.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail based on the following examples, but the present invention is not limited thereto.

실시예 1: 남세균의 분리 및 동정Example 1 Isolation and Identification of Southern Bacteria

경기도 소재 왕송 저수지에서 마이크로시스티스에 의한 녹조가 가장 극심했던 8월 표층수를 채취하여 MA 배지[표 1]에 접종하고, 조류배양기[광도: 100 ± 5 μE/m²/s, 온도: 26 ± 2℃]에서 진탕 배양을 실시하였다. 수차례의 계대 배양을 통해 안정된 단조균주 상태를 유지하였으며, 광학현미경(Nikon Microphot FX-A) 및 도립현미경(Nikon TMS) 관찰을 통해 마이크로시스티스로 동정하였다[도 1]. 16S rRNA 및 cpc-IGS 유전자의 염기서열 분석을 통해 다시 한 번 마이크로시스티스 에어루기노사임을 확인하였다[표 2]. Gyeonggi material Aug. MA medium to collected surface water where the algae by micro-hour seutiseu most severe in wangsong pool table 1 vaccination and bird incubator ^{Luminance: 100 ± 5 μE / m 2} / s, temperature: 26 ± 2 ° C.] was shaken. Through several passages, stable monochromatic strains were maintained and identified as microsis through observation of optical microscope (Nikon Microphot FX-A) and inverted microscope (Nikon TMS) [FIG. 1]. The sequencing of the 16S rRNA and cpc-IGS genes confirmed that it was once again microcystis aeruginosa [Table 2].

실시예 2: 마이크로시스티스 오염세균의 항생제 감수성 실험Example 2: Antibiotic Susceptibility Testing of Microcistis Contaminated Bacteria

본 발명에서는 오염세균은 사멸하고 마이크로시스티스는 생장하는 선택적 항생제를 선별하기 위해 감수성 실험을 실시하였다. 조류배양기[온도: 26 ± 2℃]에서 진탕 배양하면서, 총 10 종류의 항생제를 다양한 농도로 48시간 처리한 결과, 마이크로시스티스는 폴리믹신 B(polymyxin B)와 네오마이신(neomycin), 그리고 페니실린 G(penicillin G)의 최종 농도가 각각 1, 5, 10 ㎍/ml일 때 항생제에 대한 내성을 보였으며, 앰피실린(ampicillin)은 1 ㎍/ml의 농도에서 항생제 감수성을 보였다. 콜리스틴(colistin)과 이미페넴(imipenem), 그리고 스트렙토마이신(streptomycin)은 5 ㎍/ml의 농도에서 감수성을 보였으며, 오플록사신(ofloxacin)과 에리스로마이신(erythromycin)은 각각 10 ㎍/ml과 15 ㎍/ml의 농도에서, 클린다마이신(clindamycin)은 20 ㎍/ml의 농도에서 감수성을 보였다. 마이크로시스티스에 오염되어 있는 세균은 총 10가지 항생제 중에 앰피실린(ampicillin)만이 10 ㎍/ml의 농도까지 항생제 내성을 보였으며 네오마이신의 농도를 5 ㎍/ml으로 처리하였을 때 가장 높은 감수성을 보였으나 오염세균이 완전히 사멸하지는 않았다[도 3]. 마이크로시스티스의 항생제 선택성을 높이기 위해, 오염세균에 대한 내성을 보인 앰피실린을 제외한 9종류의 항생제를 감수성이 가장 높았던 네오마이신을 기본으로 해 항생제를 교차 처리한 결과를 다음 표 3에 나타내었다. 따라서, 본 발명에서는 마이크로시스티스의 무균 유도를 위해 네오마이신과 스트렙토마이신을 5 ㎍/ml의 농도로, 에리스로마이신을 20 ㎍/ml의 농도로 각각 교차 처리하였다. In the present invention, susceptibility experiments were performed to select selective antibiotics that killed contaminating bacteria and grew microsis. Microcystises were treated with polymyxin B, neomycin, and penicillin for 48 hours with 10 different antibiotics at various concentrations in agitation incubator [temperature: 26 ± 2 ℃]. The final concentration of penicillin G was 1, 5, and 10 μg / ml, respectively, and antibiotic resistance was shown. Ampicillin showed antibiotic sensitivity at a concentration of 1 μg / ml. Colistin, imipenem, and streptomycin were susceptible at concentrations of 5 μg / ml, while ofloxacin and erythromycin were 10 μg / ml and 15, respectively. At concentrations of μg / ml, clindamycin showed sensitivity at concentrations of 20 μg / ml. Bacteria contaminated with microcistis showed only antibiotic resistance up to 10 ㎍ / ml of ampicillin among 10 antibiotics, and showed the highest sensitivity when neomycin was treated at 5 ㎍ / ml. B contaminated bacteria were not completely killed [Fig. 3]. In order to increase the antibiotic selectivity of microcistis, cross-treatment of antibiotics based on neomycin, which had the highest susceptibility to nine kinds of antibiotics except ampicillin, which showed resistance to contaminating bacteria, is shown in Table 3 below. Therefore, in the present invention, neomycin and streptomycin were cross-treated at a concentration of 5 μg / ml and erythromycin at a concentration of 20 μg / ml, respectively, for aseptic induction of microcistis.

항생제 처리 후에는 세척과 희석을 통하여 마이크로시스티스 내의 세균을 더욱 최소화하였다. 항생제 교차처리를 한 마이크로시스티스 배양액을 GF/C filter(Whatman)를 이용하여 여과한 뒤 멸균한 증류수 300 ml로 재여과하여 세척하였다. 멸균수를 이용하여 2회의 세척을 한 뒤 MA 배지 100 ml로 다시 1회 세척하였다. MA 배지 2 ml을 여과지 위해 첨가한 뒤 파이펫팅을 통해 수확하였다. 이와 같은 세척방법의 반복을 통하여 마이크로시스티스 배양액의 여과액에 있는 세균을 최소화하였다.After antibiotic treatment, microbial bacteria were further minimized by washing and dilution. Antimicrobial cross-treated microbial cultures were filtered using a GF / C filter (Whatman) and washed again by filtration with 300 ml of sterile distilled water. After washing twice with sterile water, it was washed once again with 100 ml of MA medium. 2 ml of MA medium was added to the filter paper and harvested by pipetting. By repeating this washing method to minimize the bacteria in the filtrate of the microcistis culture.

다음 표 4는 각 무균 유도 단계별 감소되는 세균의 콜로니수를 보여주고 있다.Table 4 shows the colony counts of bacteria decreased by each sterile induction step.

실시예 3: 하이 쓰루풋 방식의 남세균 희석 배양법Example 3: Cytobacterial Dilution Culture Method of High Throughput Method

마지막 단계로서, 항생제 처리와 세척, 희석을 통해 무균 유도된 마이크로시스티스를 하이 쓰루풋(high throughput) 기법으로 배양하였다. 앞 단계에서 얻어진 마이크로시스티스의 수를 계수한 뒤 96 웰에 1개의 마이크로시스티스가 들어가도록 MA 배지를 이용하여 희석하였다. 96 웰에 각 100 ㎕의 희석액을 분주한 뒤 26 ± 2 ℃, 150 rpm의 조건인 항온 진탕 배양기에서 3일 간 배양하였다. 무균상태의 검정을 위하여 세균의 성장을 촉진하는 포도당을 0.1%로 첨가하여 재 배양한 뒤 무균 유도된 마이크로시스티스를 선별하였다.As a final step, sterile-derived microcistis through antibiotic treatment, washing and dilution were incubated in a high throughput technique. After counting the number of microcistis obtained in the previous step was diluted using MA medium so that one microcistis into the 96 wells. 100 μl of the dilutions were dispensed into 96 wells and then incubated for 3 days in a constant temperature incubator at 26 ± 2 ° C. and 150 rpm. For sterile assay, sterile-derived microcistis was selected after recultivation by adding 0.1% glucose to promote bacterial growth.

본 발명을 이용하여, 자연수계에서 분리한 마이크로시스티스 KW 균주의 액체배양을 통한 무균 유도 균주를 확보할 수 있으며, 이외에 다양한 남세균의 무균 유도에 유용하게 활용될 수 있으리라 사료된다.Using the present invention, it is possible to secure the sterile inducing strain through the liquid culture of the microcistis KW strain isolated from the natural water system, in addition to the sterile induction of various bacteria can be useful.

도 1은 분리한 마이크로시스티스 에어루기노사 KW 균주의 광학현미경 사진이다.1 is an optical micrograph of the isolated microcystis aeruginosa KW strain.

도 2는 항생제와 하이 쓰루풋 기법에 의한 남세균 무균 유도방법의 전체적인 순서 개략도이다.Figure 2 is a general sequence diagram of the bacteriophage sterility induction method by the antibiotic and high throughput technique.

도 3은 항생제 처리에 따른 세균의 사멸과 남세균의 생존 확률을 비교한 것이다[1: colistin 2: ofloxacin 3: clindamycin 4: erythromycin 5: polymyxinFigure 3 compares the survival rate of bacteria and death of bacteria by antibiotic treatment [1: colistin 2: ofloxacin 3: clindamycin 4: erythromycin 5: polymyxin

6: imipenem 7: streptomycin 8: neomycin 9: ampicillin 10: penicillin G].6: imipenem 7: streptomycin 8: neomycin 9: ampicillin 10: penicillin G].

Claims

Increasing the relative population of microcistis through cross-treatment of 5-100 μg / ml neomycin-based streptomycin, macrolide antibiotics, or lincosamide antibiotics;

Diluting the liquid of the microcistis strain, dispensing the dilution solution so that one microcistis enters each well of a well plate using a high throughput method, and then culturing the dilution solution;

Adding glucose to the diluted liquid culture to determine whether it is aseptic; And

Steps to Get Sterile Microsis

Sterile induction method of microcystises comprising a.

delete

The method of claim 1, wherein the antibiotic is treated at 18 to 37 ° C. for 1 to 48 hours.

The method of claim 1, wherein the microcistis is Microcystis ( Microcystis) aeruginosa ).