KR101336980B1

KR101336980B1 - Microorganism capable of reducing methane produced by ruminant animals and its uses

Info

Publication number: KR101336980B1
Application number: KR1020110142063A
Authority: KR
Inventors: 이상석; 김선호; 구민정; 차부영; 정창대; 전체옥
Original assignee: 두산생물자원주식회사
Priority date: 2011-11-08
Filing date: 2011-12-26
Publication date: 2013-12-05
Also published as: KR20130050856A

Abstract

본 발명은 환원적 초산 생성균으로서 반추 동물의 반추위 내 메탄 생성 억제능을 갖는 프로테이니필리엄 아세타티게네스(Proteiniphilium acetatigenes) SROD1 (KCCM11219P) 및 이를 이용하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 프로테이니필리엄 아세타티게네스(Proteiniphilium acetatigenes) SROD1을 포함하는 미생물 제제를 반추 동물에 직접 급여하거나 상기 미생물 제제를 포함하는 축산용 사료를 반추 동물에게 섭취시키는 경우 반추 동물의 반추위 내 메탄 생성을 억제시킬 수 있다. 또한 인체나 동물에 해가 적고 안전하며, 지구 온난화의 주범인 메탄을 근본적으로 감소시키고 사료 이용 효율을 증가시키기 때문에 그 효용 가치는 매우 크다. The present invention relates to Proteiniphilium acetatigenes SROD1 (KCCM11219P) and a method for using the same as a reducing acetic acid producing bacterium , which has the ability to inhibit methane production in the rumen of ruminants. In the rumen of the ruminant when the microbial agent comprising the proteiniphilium acetatigenes SROD1 of the present invention is directly fed to a ruminant or the animal feed containing the microbial agent is ingested to the ruminant. Methane production can be suppressed. In addition, its useful value is very harmless and safe to humans and animals, and because it fundamentally reduces methane, the main culprit of global warming, and increases feed efficiency.

Description

Microorganism capable of reducing methane produced by ruminant animals and its uses}

본 발명은 환원적 초산 생성균으로서 반추 동물의 반추위 내 메탄 생성 억제능을 갖는 미생물, 이를 포함하는 미생물 제제, 상기 미생물 제제를 포함하는 축산용 사료에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 환원적 초산 생성균을 동물에게 급여하여 반추 동물의 반추위 내 메탄 생성을 억제시키는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a microorganism having a methane production inhibitory ability in the rumen of ruminants as a reducing acetic acid producing bacterium, a microbial preparation comprising the same, and a feed for livestock containing the microbial preparation. The present invention also relates to a method of inhibiting methane production in the rumen of a ruminant by feeding a reducing acetic acid producing bacterium to an animal.

최근 대기 중의 온실가스가 증가함에 따라 지구 온난화가 가속화되고 있다. 그 결과 지구의 평균 기온과 해수면이 상승하였으며, 사막화, 가뭄, 홍수, 태풍 등 기상 이변이 발생하고 있다. 이러한 원인의 하나가 메탄인데, 메탄은 이산화탄소에 비하여 온실 효과 능력이 약 30배 정도 높아 지구 온난화에 미치는 영향이 매우 크다. Global warming is accelerating with the recent increase in greenhouse gases. As a result, global temperatures and sea levels have risen, and extreme weather events such as desertification, droughts, floods, and typhoons are occurring. One of these causes is methane, which has a 30-fold higher greenhouse gas capacity than carbon dioxide, which has a significant impact on global warming.

한편, 축산업은 가축을 번식하고 길러 식육을 공급하는 농업의 한 분야로 사람들에게 고기, 가죽 등을 제공하는 국가의 기간산업이다. 그러나 지구 온난화 문제 등과 같은 환경에 대한 관심이 증대됨에 따라 축산업을 영위하는 동안 발생하는 메탄 및 이의 문제점에 대한 우려가 증대하였으며, 이에 따라 축사에서 발생되는 메탄의 원인 중 대부분을 차지하는 반추 동물이 음식을 소화하는 과정에서 발생하는 메탄을 감소시키는 방안에 대하여 관심이 높아지고 있다. On the other hand, the livestock industry is a sector of agriculture that breeds and raises livestock and supplies meat, which is the main infrastructure of the country that provides people with meat and leather. However, as environmental concerns, such as global warming, have increased, concerns about methane generated during livestock industry and its problems have increased, and ruminants, which account for most of the methane generated in livestock farms, feed food. There is a growing interest in reducing methane produced during digestion.

한편, 반추동물은 포유류 소목에 속하는 동물로 소화 형태상 한 번 삼킨 먹이를 다시 게워 내워 씹는 특성을 가진 동물로서 되새김 동물이라도 불리며, 낙타과, 애기사슴과, 사슴과, 기린과, 소과 등의 동물이 이에 해당한다. On the other hand, ruminants are animals belonging to mammalian cattle, which have the characteristics of re-leaking and chewing food once swallowed in digestive form, and are also called ruminants. Animals such as camel family, baby deer, deer family, giraffe family, and bovine family This corresponds.

반추 동물은 제1위 내지 제4위까지의 복위를 지니는데, 이처럼 여러 개의 위를 반추위라고 한다. 구체적으로, 반추위는 먹은 음식을 넣어두는 제1위, 벌집과 같은 모양의 벽이 있는 제2위, 점막이 주름 모양으로 된 제3위 및 위선이 분포된 제4위로 구성되어 있다. Ruminants have a stomach from the first to the fourth position, and thus several stomachs are called ruminants. Specifically, the rumen is composed of the first place to put the food, the second place with a honeycomb-like wall, the third place where the mucous membrane is corrugated, and the fourth place where the stomach line is distributed.

반추위에는 세균, 원생동물 및 진균 등의 혐기성 미생물이 다수 서식하고 있는데, 이들은 반추 동물이 섭취한 사료를 발효 과정을 통해 소화시키는 작용을 한다. The rumen is inhabited by a number of anaerobic microorganisms, such as bacteria, protozoa and fungi, which digest the feed consumed by ruminants through fermentation.

반추 동물이 탄수화물이 포함된 사료를 섭취하는 경우 반추위 내의 미생물에 의해 발효 및 분해되어 최종 분해 산물로 휘발성 지방산, 수소, 이산화탄소, 암모니아 등이 생성되는데, 이 중 휘발성 지방산이나 암모니아는 반추 동물 또는 반추위 내의 미생물이 이용하기 때문에 크게 문제가 되지 않는다. 그러나, 이산화탄소 및 수소는 반추 동물 내의 메탄 생성 미생물에 의해 메탄으로 생성되거나 경쟁적으로 초산 생성 미생물에 의해 초산을 생성하게 되며, 특히 메탄이 생성되는 경우에는 반추 동물의 체내에서 흡수되지 못하고 1시간에 15 내지 20회 정도 대기로 방출되기 때문에 문제가 되고 있다. When ruminants eat carbohydrate-containing feeds, they are fermented and decomposed by microorganisms in the rumen, resulting in volatile fatty acids, hydrogen, carbon dioxide, and ammonia, which are volatile fatty acids or ammonia. It is not a big problem because microorganisms use it. However, carbon dioxide and hydrogen are either produced as methane by methane-producing microorganisms in ruminants or competitively produced by acetic acid-producing microorganisms, especially when methane is produced and is not absorbed in the body of ruminants by 15 hours per hour. This is a problem because it is emitted to the atmosphere about 20 times.

반추동물의 반추위에서 생성되는 메탄은 산소가 없는 혐기 상태에서만 발생되는데, 전체 발생되는 메탄의 원인 중 약 15%를 차지하며 지구 온난화 현상을 야기하는 주요 물질이다. 또한, 반추동물이 사료로부터 섭취한 총 에너지의 3 내지 12%가 메탄의 생성으로 소실되는 결과를 초래하므로 사료 이용 효율과도 깊은 관련이 있다.Methane produced in the rumen of ruminants is generated only in anaerobic state without oxygen, accounting for about 15% of all methane generated and is a major cause of global warming. In addition, it is closely related to feed efficiency because ruminants result in the loss of 3-12% of the total energy consumed from feed by the production of methane.

이와 같이, 반추 동물의 반추위 내에서 메탄이 생성되는 경우 지구 온난화로 인한 환경 문제가 발생하고 사료 이용 효율이 감소되기 때문에 이의 생성을 억제하기 위한 여러 가지 방안이 연구되고 있다. As such, when methane is produced in the rumen of ruminants, various problems have been studied to suppress its production because of environmental problems due to global warming and reduced feed efficiency.

반추 동물의 반추위 내 메탄 생성을 억제하기 위한 방법은 크게 두 가지로 나눌 수 있다. 첫 번째 방법은 메탄 생성의 전구 물질인 수소의 발생량을 제어하기 위하여 수소를 이용할 수 있는 질산염이나 아질산염과 같은 화합물을 사용하는 것인데, 이 경우 세포에 필요한 산소의 공급이 부족하게 될 염려가 있다. 또 다른 방법은 메탄 생성 미생물에 독성을 주는 화합물인 이오노포어나 항생 물질 등을 사용하는 것인데, 장기간 투여하는 경우 메탄 생성 미생물이 적응을 하여 메탄 생성 억제 효과가 감소한다는 문제점이 있다. 또한, 상기의 방법들은 화합물을 이용하는 것이므로 이러한 물질이 축산물에 잔류하는 경우 안전성에 문제가 될 수 있으며 반추위 내의 유용한 미생물의 성장을 함께 저하시키므로 사료 이용 효율이 저하되고 생산성이 약화되는 문제점이 있다.There are two ways to suppress methane production in ruminants of ruminants. The first is to use compounds such as nitrates or nitrites that can use hydrogen to control the amount of hydrogen that is a precursor to methane production, which can lead to a lack of oxygen supply to the cells. Another method is to use ionophores or antibiotics, which are compounds that are toxic to methane producing microorganisms, but when administered for a long time, the methane producing microorganisms adapt to the methane producing inhibitory effect. In addition, since the above methods use a compound, when such a substance remains in the livestock product, there may be a problem in safety, and since the growth of useful microorganisms in the rumen is lowered together, the feed use efficiency is lowered and productivity is weakened.

반추 동물의 반추위 내 메탄 생성을 억제하기 위한 방법과 관련하여, 대한민국 공개특허 10-2006-0019062호는 생강, 부추 추출물 및 복합리놀레산 중 어느 하나 이상을 포함하는 반추 동물의 반추위 내의 프로토조아를 선택적으로 감소시키는 사료 조성물에 대하여 개시하고 있고, 대한민국 공개특허 10-2007-0033968호는 반추위 발효에 영향을 미치고 반추 동물의 에너지 및 단백질 유지를 개선시키기 위한 식물 추출물에 대하여 개시하고 있으며, 대한민국 공개특허 10-2011-0119370호는 농후사료 35 내지 45중량%, 티모시 35 내지 45중량% 및 볏짚 10 내지 30중량%를 포함하는 반추 동물의 온실가스 발생량을 억제시키기 위한 사료 조성물 및 반추 동물의 사육 방법에 대하여 개시하고 있다. 그리고, 대한민국 공개특허 특2002-0042866호는 폴리시클릭 퀴논 및 이오노포어 화합물을 포함하는 반추 동물에서 메탄 생성을 감소시키기 위한 조성물에 대하여 개시하고 있고, 대한민국 공개특허 10-2011-0036470호는 마늘을 포함하는 반추 동물의 메탄가스 생성 저감용 사료에 대하여 개시하고 있으며, 대한민국 공개특허 10-2011-0039540호는 동물 기원의 모든 지방을 배제하고 포화 지방산을 함유하는 식물성 오일의 외인성 섭취를 제한하는 방법 등을 이용하여 착유용 반추 동물에 의하여 생성되는 메탄의 양을 감소시키고 조절하기 위한 방법에 대하여 개시하고 있다. 또한, 대한민국 공개특허 특1995-7004060호는 안트라퀴논 화합물을 이용한 반추 동물의 메탄 생성 억제 방법에 대하여 개시하고 있고, 일본 공개특허 특개 2003-88301호는 유산균, 효모 및 올리고당으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 것을 특징으로 하는 반추동물용 메탄 생성 억제용 조성물에 대하여 개시하고 있으며, 일본 공개특허 특개 2002-281912호는 유칼리유, 페퍼민트 기름, 고추냉이 기름, 시네올, 옥소 및 사이클로덱스트린 포접 화합물 중 하나 이상 함유하는 것을 특징으로 하는 반추 동물용 메탄 생성 억제제 및 사료 조성물에 대하여 개시하고 있고, 대한민국 공개특허 특개평 11-46694호는 푸마르산을 함유하는 것을 특징으로 하는 반추동물의 메탄 생성 억제제 및 사료 조성물에 대하여 개시하고 있다. 그러나 본 발명의 프로테이니필리엄(Proteiniphilium) 속 미생물을 이용하여 반추 동물의 반추위 내에서 메탄 생성을 억제하기 위한 방법에 대해서는 개시되어 있지 않다.
Regarding a method for suppressing methane production in ruminants of ruminants, Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-2006-0019062 selectively discloses a protozoa in the rumen of a ruminant including any one or more of ginger, leek extract and complex linoleic acid. The present invention discloses a reducing feed composition, and Korean Patent Publication No. 10-2007-0033968 discloses a plant extract for affecting rumen fermentation and improving energy and protein maintenance of ruminants. 2011-0119370 discloses a feed composition and a method of breeding ruminants for suppressing the amount of greenhouse gas generated by ruminants, including 35 to 45% by weight thick food, 35 to 45% by weight timothy and 10 to 30% by weight straw. Doing. In addition, Korean Patent Laid-Open Publication No. 2002-0042866 discloses a composition for reducing methane production in ruminants including polycyclic quinone and ionophore compounds, and Korean Patent Publication No. 10-2011-0036470 discloses garlic. Disclosed is a feed for reducing methane gas production of ruminants, including the Republic of Korea Patent Publication No. 10-2011-0039540 excludes all fats of animal origin and limits the exogenous intake of vegetable oils containing saturated fatty acids, etc. A method for reducing and controlling the amount of methane produced by a milking ruminant is disclosed. In addition, the Republic of Korea Patent Publication No. 199595-7004060 discloses a method for inhibiting methane production of ruminant using an anthraquinone compound, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-88301 is one or more selected from the group consisting of lactic acid bacteria, yeast and oligosaccharides Disclosed is a composition for inhibiting methane production for ruminants, Japanese Patent Laid-Open No. 2002-281912 contains one or more of eucalyptus oil, peppermint oil, horseradish oil, cinema, oxo and cyclodextrin inclusion compounds. Disclosed is a methane production inhibitor and feed composition for ruminants, Korean Patent Laid-Open No. 11-46694 discloses a methane production inhibitor and feed composition of ruminants characterized in that it contains fumaric acid Doing. However, a method for inhibiting methane production in the rumen of ruminants using microorganisms of the genus Proteiniphilium of the present invention is not disclosed.

이에 본 발명자들은 근본적으로 온실가스의 한 종류인 메탄이 반추 동물의 반추위 내에서 생성되는 것을 억제시켜 지구 온난화를 막고 사료 이용 효율을 증대시키면서도 메탄 생성을 억제시키는 과정에서 인체나 동물에 해를 주지 않는 미생물을 개발하고자 시도하여 왔다. 그 결과, 가축의 반추위액에서 분리한 미생물로부터 신규한 미생물을 발견하고, 상기 미생물이 메탄 생성 미생물과 효과적으로 기질 경쟁을 하고 초산을 생성함으로써 메탄 생성을 억제하는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
Accordingly, the present inventors basically prevented methane, which is a kind of greenhouse gas, from being generated in the rumen of ruminants, thereby preventing global warming and increasing the efficiency of using feed, while not causing harm to humans or animals in the process of suppressing methane production. Attempts have been made to develop microorganisms. As a result, a novel microorganism was found from the microorganisms isolated from the rumen liquid of the livestock, and it was confirmed that the microorganisms effectively compete with the methane producing microorganisms and inhibit the methane production by producing acetic acid, thereby completing the present invention.

본 발명의 하나의 목적은 지구 온난화의 원인 중의 하나이며 사료 이용 효율을 감소시키는 메탄을 근본적으로 제거하거나 감소시키기 위해 안출된 것으로서, 환원적 초산 생성균으로서 반추 동물의 반추위 내 메탄 생성을 억제시키는 미생물인 프로테이니필리엄 아세타티게네스(Proteiniphilium acetatigenes) SROD1을 제공하는 것이다. One object of the present invention is one of the causes of global warming and devised to fundamentally remove or reduce methane, which reduces feed utilization efficiency, and is a microorganism that inhibits methane production in the rumen of ruminants as a reducing acetic acid producing bacterium. Proteiniphilium acetatigenes SROD1.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 미생물을 포함하는 것을 특징으로 하는 반추 동물의 반추위 내 메탄의 생성을 억제시키기 위한 미생물 제제를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a microbial agent for inhibiting the production of methane in the rumen of ruminants comprising the microorganism.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 미생물 또는 미생물 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 반추 동물의 반추위 내 메탄의 생성을 억제시키기 위한 축산용 사료를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a livestock feed for suppressing the production of methane in the rumen of ruminants comprising the microorganism or microbial agent.

본 발명의 다른 하나의 목적은 환원적 초산 생성균을 동물에게 급여하여 반추 동물의 반추위 내 메탄 생성을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
Another object of the present invention is to provide a method of inhibiting methane production in the rumen of a ruminant by feeding a reducing acetic acid producing bacterium to an animal.

하나의 양태로서, 본 발명은 환원적 초산 생성균으로서 반추 동물의 반추위 내 메탄 생성 억제능을 갖는 프로테이니필리엄 아세타티게네스(Proteiniphilium acetatigenes) SROD1을 제공한다.
In one embodiment, the present invention provides Proteiniphilium acetatigenes SROD1 having a reductive acetic acid producing bacterium having the ability to inhibit methane production in the rumen of ruminants.

본 발명에 있어서, 상기 환원적 초산 생성균은 반추 동물이 탄수화물이 포함된 사료를 섭취하는 경우 반추위 내의 미생물에 의해 발효 및 분해된 후의 최종 분해 산물 중 수소 또는 이산화탄소를 이용하여 초산을 생성하는 균을 말한다. 상기 환원적 초산 생성균은 메탄 생성 미생물과 효과적으로 기질 경쟁을 하여 초산을 생성하므로 반추 동물의 반추위 내 메탄 생성을 억제하는 데 효과적이다.In the present invention, the reductive acetic acid producing bacterium refers to a bacterium that produces acetic acid using hydrogen or carbon dioxide in the final degradation product after fermentation and degradation by microorganisms in the rumen when the ruminant eats a feed containing carbohydrate. . The reducing acetic acid-producing bacterium effectively competes with methane-producing microorganisms to produce acetic acid, which is effective in suppressing methane production in the rumen of ruminants.

본 발명에 있어서, 상기 반추 동물은 반추위가 있는 동물로서 되새김 동물이라고도 불리운다. 반추 작용을 하고 미생물에 의해 먹이의 분해가 이루어지지 않는 특징을 가지고 있으며 앞니가 없어 먹이를 삼킨 후 되새김질을 하여 소화시킨다. In the present invention, the ruminant is a ruminant animal and is also called a ruminant animal. It has a ruminant effect and does not decompose food by microorganisms. It has no incisors and swallows the food before rubbing it for digestion.

상기 반추 동물은 낙타과, 애기사슴과, 사슴과, 기린과, 소과에 속하는 소, 염소, 황소, 물소, 들소, 사슴, 낙타, 양 등의 반추위가 있는 동물이라면 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 소이다. The ruminant animal is not limited thereto if it is a ruminant animal such as a camel, a baby deer, a deer, a giraffe, a bovine, a goat, a bull, a buffalo, a bison, a deer, a camel, or a sheep, and is preferably a cow. .

본 발명에 있어서, 상기 메탄은 반추 동물이 탄수화물을 포함하는 사료를 섭취하는 경우 메탄 생성 미생물에 의해 반추위에서 생성되는데, 지구 온난화를 일으키는 주범 중 하나이며 사료 이용 효율을 떨어뜨리는 원인 중 하나이므로, 반추 동물의 반추위 내의 메탄 생성을 억제시키는 것이 중요하다.In the present invention, the methane is produced in the rumen by the methane-producing microorganisms when the ruminant ingests the feed containing carbohydrate, one of the main culprit causing global warming and one of the causes of reducing feed efficiency, ruminant It is important to inhibit methane production in the rumen of animals.

본 발명에 있어서, 상기 프로테이니필리엄 아세타티게네스(Proteiniphilium acetatigenes) SROD1은 본 발명자들에 의하여 재래산양의 반추위에서 분리한 신규한 미생물로서 환원적 초산 생성균이다.In the present invention, the proteiniphilium acetatigenes SROD1 is a novel microorganism produced by the present inventors as a novel microorganism isolated from the rumen of a native goat.

구체적으로, 본 발명자들은 젖소 및 재래산양의 반추위액을 수집하여 배양한 후 환원적 초산 생성균을 분리 및 확인한 결과 새로운 균주를 발견하게 되었고, 그 중 메탄 제거능이 우수한 균주인 GA3를 프로테이니필리엄 아세타티게네스(Proteiniphilium acetatigenes) SROD1으로 명명하였으며, 이를 2011년 11월 9일자로 한국미생물보존센터에 기탁번호 KCCM11219P로 기탁하였다. Specifically, the present inventors have found a new strain as a result of collecting and incubating the rumen liquid of cows and native goats, and then isolated and confirmed reducing acetic acid-producing bacteria, among which the strain GA3, which has excellent methane removal ability, Acetatigenes ( Proteiphilium acetatigenes ) SROD1 was named as November 9, 2011 was deposited with the Korean microbiological conservation center with the accession number KCCM11219P.

하나의 구체적 실시에서, AC-B1 배지에 각기 다른 균주들을 접종하여 배양한 다음 환원적 초산 생성 유전자를 이용하여 환원적 초산 생성균을 특이적으로 검출한 결과 총 4종의 균주인 DA02, GA01, GA02 및 GA03이 선별되었다. 또한, 상기에서 선별된 균주의 발효 특성을 살펴본 결과 선별된 군주 모두에서 많은 양의 초산이 검출되었으며, 특히 GA03인 프로테이니필리엄 아세타티게네스(Proteiniphilium acetatigenes) SROD1(KCCM11219P)에서 가장 많은 양의 초산이 검출되었다.In one specific implementation, inoculating different strains in the AC-B1 medium and incubating the cells, followed by specific detection of the reducing acetic acid producing bacteria using a reducing acetic acid producing gene, a total of four strains DA02, GA01, GA02 And GA03 were selected. In addition, as a result of examining the fermentation characteristics of the selected strains, a large amount of acetic acid was detected in all of the selected monarchs, in particular the highest amount in Proteiniphilium acetatigenes SROD1 (KCCM11219P) GA03 Acetic acid was detected.

다른 하나의 구체적 실시에서, 상기에서 선별된 4종의 균주를 이용하여 in vitro 발효 시스템에서 휘발성 지방산의 함량을 살펴본 결과, 녹말 및 카세인을 기질로 사용한 군 모두에서 아세테이트의 함량이 가장 높게 나타났으나, 대조군과는 달리 락테이트는 검출되지 않았다. In another specific embodiment, the contents of volatile fatty acids in the in vitro fermentation system using the four strains selected above showed that the acetate content was the highest in both the starch and casein groups. Unlike the control, lactate was not detected.

또 다른 하나의 구체적 실시에서, 상기에서 선별된 4종의 균주를 이용하여 메탄 생성 억제능을 살펴본 결과, 녹말을 기질로 사용한 경우 메탄 생성 억제능이 우수하게 나타났으며, 특히 GA03인 프로테이니필리엄 아세타티게네스(Proteiniphilium acetatigenes) SROD1의 메탄 생성 억제 정도가 우수하였다. In another specific embodiment, as a result of examining the methane production inhibitory ability by using the four strains selected above, it was shown that the methane production inhibitory ability was excellent when starch was used as a substrate, in particular, the proteniphyllium GA03. Acetatigenes ( Proteiniphilium acetatigenes ) SROD1 was excellent in inhibiting methane production.

따라서 본 발명의 프로테이니필리엄 아세타티게네스(Proteiniphilium acetatigenes) SROD1은 반추 동물의 반추위 내 메탄 생성을 억제시키는데 지금까지 보고된 어떠한 다른 미생물에 비하여 효과적으로 사용 가능하며, 특히 탄수화물을 근원으로 하여 메탄이 생성되는 것을 억제하는데 효과적으로 사용할 수 있다.
Therefore, the proteiniphilium acetatigenes SROD1 of the present invention can be effectively used to inhibit methane production in ruminants of ruminants compared to any other microorganisms reported so far, especially methane based on carbohydrates. It can be used effectively to suppress this generation.

하나의 구체화된 양태로서, 본 발명은 환원적 초산 생성균인 상기 프로테이니필리엄 아세타티게네스(Proteiniphilium acetatigenes) SROD1을 포함하는 반추 동물의 반추위 내에서 메탄이 생성되는 것을 억제시키기 위한 미생물 제제를 제공한다.In one embodiment, the present invention provides a microbial agent for inhibiting the production of methane in the rumen of ruminants comprising said proteiniphilium acetatigenes SROD1 , a reducing acetic acid producing bacterium. to provide.

본 발명에 있어서, 상기 미생물 제제는 본 발명자에 의하여 새로이 발견된 상기 프로테이니필리엄 아세타티게네스(Proteiniphilium acetatigenes) SROD1의 단일 종으로 사용될 수 있으며, 미생물이 2종 이상 혼합된 형태로도 사용될 수 있다. 미생물이 2종 이상 혼합된 경우는 프로테이니필리엄 아세타티게네스(Proteiniphilium acetatigenes) SROD1 외에 메탄 생성 억제능이 공지된 미생물로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 미생물을 포함할 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the microbial agent may be used as a single species of the Proteiniphilium acetatigenes SROD1 newly discovered by the present inventors, and microorganisms may also be used in a mixed form of two or more species. Can be. When two or more kinds of microorganisms are mixed, one or more microorganisms selected from the group consisting of microorganisms known to inhibit methane production in addition to Proteiniphilium acetatigenes SROD1 may be included, but are not limited thereto. no.

본 발명에 있어서, 상기 미생물 제제는 분말 또는 액상의 형태일 수 있다. In the present invention, the microbial agent may be in powder or liquid form.

상기 분말 형태의 미생물 제제의 경우 상기 미생물을 담체에 부착시킨 후 수분 함량이 0.1 내지 10 중량%가 되도록 건조시키고 분쇄하여 제품화한다. 수분 함량이 10 중량%를 초과하는 경우 미생물의 재활성화 효율이 떨어지거나 메탄 생성 억제 효과의 증가가 미미하여 경제적으로 바람직하지 않다. 분말 형태로 미생물 제제를 사용하는 경우 제조공정이 단순하고 제품 생산비가 낮으며 보존성이 좋다는 장점이 있다. In the case of the microbial preparation in powder form, the microorganisms are attached to a carrier, and then dried and pulverized so as to have a water content of 0.1 to 10% by weight and commercialized. If the water content is more than 10% by weight, the reactivation efficiency of the microorganism is reduced or the increase in the methane production inhibitory effect is not economically desirable. In the case of using the microbial preparation in powder form, the manufacturing process is simple, the product production cost is low, and the preservation is good.

상기 담체로는 분말상의 점토류, 활성탄, 코크스, 제철소 폐슬래그, 화산재 및 연소재로 구성되는 군에서 하나 이상 선택된 것이 사용될 수 있으며, 상기 점토류로는 제올라이트, 질석, 규조토, 고령토, 옹기토, 장석, 차지토 및 활석으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 것을 사용할 수 있으나, 반드시 이로 제한되는 것이 아니다.The carrier may be one or more selected from the group consisting of powdered clays, activated carbon, coke, steel mill waste slag, volcanic ash, and combustion ash, and the clays include zeolite, vermiculite, diatomaceous earth, kaolin, onggi, One or more selected from the group consisting of feldspar, charge clay and talc may be used, but is not necessarily limited thereto.

상기 분말 형태의 미생물 제제에는 부형제가 추가될 수 있다. 상기 부형제의 경우 아미노산, 비타민C, 비타민E, 키토산 및 포도당을 단독으로 사용하거나 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있으나 반드시 이로 제한되는 것이 아니다. An excipient may be added to the microbial preparation in powder form. In the case of the excipient, amino acids, vitamin C, vitamin E, chitosan and glucose may be used alone or in combination of two or more, but are not necessarily limited thereto.

상기 액상 형태의 미생물 제제의 경우 상기 미생물의 배양액을 혼합하거나 희석하고, 미생물을 안정화시키기 위해 포도당이나 글리세린을 혼합한 후 최종 농도가 1 내지 10 중량%, 바람직하게는 1 내지 5 중량%가 되도록 제조한다. 미생물이 1 중량% 미만인 경우에는 미생물 제제의 메탄 제거 효과가 미미할 수 있으며, 10 중량%를 초과하는 경우에는 메탄 생성 억제 효과의 증가가 미미하여 경제적으로 바람직하지 않다. 액상 형태로 미생물 제제를 사용하는 경우 분말 제품에 비하여 활성이 빠르고 취급이 간편한 장점이 있다.
In the case of the microbial preparation in the liquid form, the culture solution of the microorganisms is mixed or diluted, and after the glucose or glycerin is mixed to stabilize the microorganisms, the final concentration is 1 to 10% by weight, preferably 1 to 5% by weight. do. When the microorganism is less than 1% by weight, the methane removal effect of the microbial agent may be insignificant, and when it exceeds 10% by weight, the increase in the methane production inhibitory effect is insignificant and economically undesirable. When the microbial agent is used in liquid form, it has advantages of fast activity and easy handling compared to powder products.

다른 하나의 구체화된 양태로서, 본 발명은 상기 환원적 초산 생성균 또는 메탄 생성 억제용 미생물 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 축산용 사료를 제공한다. In another embodiment, the present invention provides a feed for livestock, characterized in that it comprises a microbial agent for inhibiting the production of reducing acetic acid or methane.

상기 사료는 반드시 이로 제한되는 것은 아니나 옥수수, 소백, 밀, 대두밀, 콩, 쌀 등의 어느 하나 또는 이들로 이루어진 군에서 2 이상을 선택한 혼합물을 분쇄하여 얻어지는 분쇄물과 이들을 가공하는 과정에서 얻어지는 쌀겨, 밀겨, 보리겨와 같은 가공 부산물이 사용될 수 있다.The feed is not necessarily limited thereto, but a pulverized product obtained by pulverizing a mixture selected from two or more selected from the group consisting of corn, soybean, wheat, soybean wheat, soybean, rice, and the like and rice bran obtained in the process of processing the same. Processing by-products such as wheat bran, barley bran can be used.

상기 환원적 초산 생성균은 반추 동물이 탄수화물이 포함된 사료를 섭취하는 경우 반추위 내의 미생물에 의해 발효 및 분해된 후의 산물 중 수소 또는 이산화탄소를 이용하여 초산을 생성하는 균으로, 반추 동물의 반추위 내에서 메탄 생성을 억제할 수 있는 있는 미생물이라면 그 종류가 이로 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 프로테이니필리엄 아세타티게네스(Proteiniphilium acetatigenes) SROD1이다. The reducing acetic acid producing bacterium is a bacterium that produces acetic acid using hydrogen or carbon dioxide in a product after fermentation and decomposition by the microorganisms in the rumen when the ruminant eats a feed containing carbohydrate, and methane in the rumen of the ruminant If the microorganism that can suppress the production is not limited to this kind. Preferably, Proteiniphilium acetatigenes SROD1.

상기 축산용 사료에는 상기 메탄 생성 억제용 미생물 제제가 사료의 총 중량에 대하여 0.1 내지 0.3 중량% 포함하는 것을 특징으로 하며 바람직하게는 0.2 중량%이다. 상기 미생물 제제가 0.1 중량% 미만 포함되는 경우 축산용 사료의 메탄 생성 억제 효능이 미미할 수 있으며, 0.3 중량% 초과하는 경우 효과가 그 이하일 경우와 거의 동일하며 효과 대비 비경제적이기 때문이다.The livestock feed is characterized in that the microbial agent for inhibiting methane production comprises 0.1 to 0.3% by weight relative to the total weight of the feed, preferably 0.2% by weight. When the microbial agent is included less than 0.1% by weight, the effect of inhibiting methane production of livestock feed may be insignificant.

상기 축산용 사료는 반드시 이로 제한되는 것은 아니나 낙타과, 애기사슴과, 사슴과, 기린과, 소과 등의 반추위가 있는 동물에 제공하기 위한 것이며, 바람직하게는 소에 제공하기 위한 것이다. The animal feed is not necessarily limited thereto, but is intended to be provided to ruminant animals such as camels, babies, deer, giraffes, and bovine, and is preferably provided to cows.

상기 축산용 사료 내의 미생물의 경우 무독성이며 산, 효소, 담즙에 대한 내성을 갖추고 있어 장으로 가는 동안 살아남는 특성을 가진다. 또한 혐기적 환경에서도 생리 활성을 보이며 장내 상피 세포나 점막에 흡착하여 착생할 수 있다. The microorganisms in the livestock feed are non-toxic and have resistance to acids, enzymes, and bile, and have the characteristics of surviving while going to the intestine. It also shows physiological activity in an anaerobic environment and can engraft by adsorbing to intestinal epithelial cells or mucosa.

상기 축산용 사료를 섭취하는 경우 반추 동물의 반추위 내 메탄의 생성을 억제시켜 지구 온난화 효과를 방지할 수 있으며, 사료 이용 효율을 증대시킬 수 있다. Ingesting the feed for animal husbandry can prevent the global warming effect by inhibiting the production of methane in the rumen of the ruminant, it is possible to increase the feed utilization efficiency.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 환원적 초산 생성균을 동물에게 급여하여 반추 동물의 반추위 내 메탄 생성을 억제하는 방법을 제공한다. In another aspect, the present invention provides a method of feeding a reducing acetic acid producing bacterium to an animal to suppress methane production in the rumen of a ruminant.

본 발명에 있어서, 상기 환원적 초산 생성균은 반추 동물이 탄수화물이 포함된 사료를 섭취하는 경우 반추위 내의 미생물에 의해 발효 및 분해된 후의 산물 중 수소 또는 이산화탄소를 이용하여 초산을 생성하는 균을 말한다. 상기 환원적 초산 생성균은 반추 동물의 반추위 내에서 메탄 생성을 억제할 수 있는 있는 미생물이라면 그 종류가 이로 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 프로테이니필리엄 아세타티게네스(Proteiniphilium acetatigenes) SROD1이다. In the present invention, the reductive acetic acid producing bacterium refers to a bacterium that produces acetic acid using hydrogen or carbon dioxide in a product after fermentation and degradation by microorganisms in the rumen when the ruminant eats a feed containing carbohydrate. The reducing acetic acid producing bacterium is a microorganism capable of inhibiting methane production in the ruminant of the ruminant, but the type thereof is not limited thereto, but is preferably Proteiniphilium acetatigenes SROD1.

상기 프로테이니필리엄 아세타티게네스(Proteiniphilium acetatigenes) SROD1은 본 발명자들에 의하여 재래산양의 반추위에서 분리한 신규한 환원적 초산 생성균으로서 메탄 생성 미생물과 효과적으로 기질 경쟁을 하여 초산을 생성하므로 반추 동물의 반추위 내 메탄 생성을 억제하는 데 효과적이다.The proteiniphilium acetatigenes SROD1 is a novel reducing acetic acid producing bacterium isolated from the rumen of a native goat by the present inventors, and thus efficiently competes with methane producing microorganisms to produce acetic acid, thus ruminants It is effective in suppressing methane production in the rumen.

본 발명에 있어서, 상기 반추 동물은 반추위가 있어 되새김질을 하여 음식을 소화시키는 동물을 말한다. 상기 반추 동물은 낙타과, 애기사슴과, 사슴과, 기린과, 소과에 속하는 소, 염소, 황소, 물소, 들소, 사슴, 낙타, 양 등의 반추위가 있는 동물이라면 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 소이다. In the present invention, the ruminant animal refers to an animal that has rumen and ruminates to digest food. The ruminant animal is not limited thereto if it is a ruminant animal such as a camel, a baby deer, a deer, a giraffe, a bovine, a goat, a bull, a buffalo, a bison, a deer, a camel, or a sheep, and is preferably a cow. .

본 발명에 있어서, 상기 급여는 상기 환원적 초산 생성균이 포함된 미생물 제제 또는 상기 미생물 제제를 포함하는 축산용 사료를 상기 반추 동물에 제공하는 것을 말하나, 반추 동물에 상기 환원적 초산 생성균을 제공하는 방법이라면 그 방법이 이로 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the feeding refers to providing the ruminant with the microbial agent containing the reducing acetic acid producing bacterium or the feed for livestock containing the microbial agent, the method for providing the reducing acetic acid producing bacteria to the ruminant If so, the method is not limited to this.

상기 미생물 제제는 분말 또는 액상 형태로 제조된 것으로 그 형태가 제한되지 않으며, 상기 환원적 초산 생성균이 1종 또는 2종 이상 혼합된 형태로 사용될 수 있다. 상기 미생물 제제의 특성 및 함량은 상술한 바와 같다.The microbial agent is prepared in powder or liquid form, and the form thereof is not limited, and the reducing acetic acid producing bacterium may be used in one or two or more types. The properties and contents of the microbial agent are as described above.

상기 축산용 사료는 반추 동물이 성장하기 위해 반추 동물에 급여하는 먹이로서, 본 발명의 축산용 사료는 상기 환원적 초산 생성균이 포함된 미생물 제제를 포함하고 있는 것을 말하며 그 특성 및 함량은 상술한 바와 같다.The livestock feed is a food for feeding ruminants to grow ruminants, the livestock feed of the present invention is said to include a microbial agent containing the reducing acetic acid producing bacteria and its properties and contents as described above same.

상기 환원적 초산 생성균을 동물에게 급여하여 반추 동물이 이를 섭취하는 경우 반추 동물의 반추위 내 메탄 생성을 억제하여 지구 온난화를 방지할 수 있으며 사료 이용 효율을 증대시킬 수 있다.
By feeding the reducing acetic acid producing bacteria to the ruminant ingesting it can prevent global warming by inhibiting the production of methane in the rumen of the ruminant can increase the feed utilization efficiency.

본 발명의 프로테이니필리엄 아세타티게네스(Proteiniphilium acetatigenes) SROD1(KCCM11219P)은 재래산양의 반추위에서 분리한 것이므로 화학적인 방법을 사용하여 메탄 생성을 억제시키는 것에 비하여 인체나 동물에 해가 적고 안전하며, 환원적 초산 생성균으로서 메탄을 생성하는 원인을 근본적으로 감소시키기 때문에 그 효용 가치는 매우 크다고 할 것이다. 이외에도 상기 미생물을 이용하여 미생물제제 및 가축용 사료 등을 제조한다면 부가적인 경제적 이득을 취할 수 있다.
Proteiniphilium acetatigenes SROD1 (KCCM11219P) of the present invention is isolated from the rumen of conventional goats, so it is less harmful and safe for humans or animals than chemicals to inhibit methane production. In addition, the utility value is very large because it fundamentally reduces the cause of methane production as a reducing acetic acid producing bacterium. In addition, if the microorganisms and livestock feed are manufactured using the microorganisms, additional economic benefits may be obtained.

도 1은 본 발명에서 선별한 환원적 초산 생성균인 DA02, GA01, GA02 및 GA03의 계통학적 소속을 확인하기 위한 계통수를 나타낸 것이다.
도 2는 녹말을 기질로 사용한 경우 환원적 초산 생성균인 DA02, GA01, GA02 및 GA03의 휘발성 지방산 함량을 나타낸 것이다.
도 3은 카세인을 기질로 사용한 경우 환원적 초산 생성균인 DA02, GA01, GA02 및 GA03의 휘발성 지방산 함량을 나타낸 것이다.
도 4는 녹말을 기질로 사용한 경우 환원적 초산 생성균인 DA02, GA01, GA02 및 GA03의 메탄 생성 억제 정도를 나타낸 것이다.
도 5는 카세인을 기질로 사용한 경우 환원적 초산 생성균인 DA02, GA01, GA02 및 GA03의 메탄 생성 억제 정도를 나타낸 것이다.Figure 1 shows a phylogenetic tree for confirming the systematic membership of the reducing acetic acid producing bacteria DA02, GA01, GA02 and GA03 selected in the present invention.
Figure 2 shows the volatile fatty acid content of reducing acetic acid producing bacteria DA02, GA01, GA02 and GA03 when starch is used as a substrate.
Figure 3 shows the volatile fatty acid content of the reductive acetic acid producing bacteria DA02, GA01, GA02 and GA03 when casein is used as a substrate.
Figure 4 shows the degree of methane production inhibition of reducing acetic acid producing bacteria DA02, GA01, GA02 and GA03 when starch is used as a substrate.
Figure 5 shows the degree of methane production inhibition of the reduced acetic acid producing bacteria DA02, GA01, GA02 and GA03 when casein is used as a substrate.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. These examples are only for illustrating the present invention in detail, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention.

실시예 1: 젖소 및 재래산양 사육 환경 및 위액의 수집과 배양Example 1 Collection and Cultivation of Dairy and Native Goat Breeding Environments and Gastric Fluids

1-1. 젖소 및 재래산양 사육 환경1-1. Dairy and Native Goat Breeding Environments

젖소는 순천대학교 부설농장에서 사육하였고, 재래산양은 전라남도 구례에서 방목하여 사육하였으며, 실험에는 반추위 누관이 장착된 홀스테인 프리에시안(hostein friesian) 종 젖소 및 재래산양을 사용하였다. 실험 기간 동안 젖소는 볏짚과 농후사료를 6 : 4의 비율로 체중의 2% 수준으로 1일 2회 급여하였고, 재래산양은 볏짚을 자유 급여하고 비육용 농후사료를 매일 800g 급여하였다.
Dairy cows were reared at Sunchon National University Farm, and native goats were grazed in Gurye, Jeollanam-do, and Holstein friesian species with native rumen fistula were used. During the experimental period, cows were fed rice straw and rich feed twice a day at a ratio of 6: 4 at 2% of body weight, and native goats were given free straw of rice straw and 800g daily feed of fat concentrates.

1-2. 반추위액의 수집 및 배양1-2. Collection and Culture of Rumen Fluid

반추위액은 상기 실시예 1-1의 젖소 및 재래산양으로부터 수집하였다. 상기 젖소 및 재래산양에서 반추위액을 채취한 다음, 사료 입자를 제거한 후, 보온 및 혐기 상태의 용기에 보관하였다. 그 후 상기 채취된 반추위액 50㎖에 최종 농도가 50mM이 되도록 BES(bromoethanesulfonic acid)를 첨가한 후 한 시간동안 80% N₂-20% CO₂(vol%)가스로 버블링하였다. 80% N₂-20% CO₂(vol%) 가스를 주입한 배양액을 대조구로 하고, 80% H₂-20% CO₂(vol%) 가스를 주입한 배양액을 실험구로 하여 고무 스트로퍼와 알루미늄 캡으로 봉하였다. 그 후 상기 대조구 및 실험구를 39℃에서 쉐이킹 인큐베이터에서 120 rpm의 속도로 1주일간 배양하였다.
Rumen fluid was collected from the cow and the native goat of Example 1-1. The rumen fluid was collected from the cow and the native goat, and then the feed particles were removed, and then stored in a container of warm and anaerobic condition. Thereafter, BES (bromoethanesulfonic acid) was added to 50 mL of the collected rumen liquid to a final concentration of 50 mM, followed by bubbling with 80% N ₂ -20% CO ₂ (vol%) gas for one hour. A rubber stripper and aluminum were used as a control, using a culture solution in which 80% N ₂ -20% CO ₂ (vol%) gas was injected, and a culture solution in which 80% H ₂ -20% CO ₂ (vol%) gas was injected. Sealed with a cap. The control and experimental groups were then incubated for one week at a speed of 120 rpm in a shaking incubator at 39 ° C.

실시예 2 : 균주의 분리 및 DNA 추출Example 2 Isolation and DNA Extraction of Strains

2-1. 균주의 분리2-1. Isolation of strain

상기 실시에 1-2에서 수집 및 배양한 반추위액에서 메탄 생성 미생물(methanogens)과 효과적으로 기질 경쟁을 하는 환원적 초산 생성균을 분리하기 위하여 선택배지로 사용되고 있는 하기 표 1의 성분을 가지는 AC-B1 배지(Le Van 등, 1998) 5㎖에 배양된 반추위액을 5% 접종한 후 39℃의 쉐이킹 인큐베이터에서 120 rpm의 속도로 1주일간 배양하였다. 그 후, 1차 배양액 0.5㎖을 신선한 AC-B1 배지에서 같은 조건으로 계대 배양하였으며, 3차 계대 배양까지 실시하였다. 계대 배양시에는 추가적으로 80% H₂-20% CO₂(vol%) 가스를 주입하였다.AC-B1 medium having the components shown in Table 1, which is used as a selective medium to separate the reducing acetic acid producing bacteria that effectively compete with the methanogens in the rumen liquid collected and cultured in Example 1-2 (Le Van et al., 1998) After 5% inoculation of the rumen solution incubated in 5ml in a shaking incubator at 39 ℃ incubated for 1 week at a speed of 120 rpm. Thereafter, 0.5 ml of the primary culture was passaged under the same conditions in fresh AC-B1 medium, and the culture was carried out up to the third passage. In subculture, additional 80% H ₂ -20% CO ₂ (vol%) gas was injected.

환원적 초산 생성균의 순수분리를 위하여 상기에서 배양한 1 내지 3차 배양액을 AC-B1 배지를 사용하여 십진희석법으로 10⁰∼10^-9까지 희석한 다음, 10^-2∼10^-9 희석액을 AC-B1 아가 배지에 도말한 후, 혐기 챔버 (Visionbionex, N₂: 90%, H₂: 5%, CO₂: 5%) 내의 39℃ 인큐베이터에서 1주일간 배양하였다. 그 후, 최종적으로 환원적 초산 생성균을 분리하기 위해 재도말 및 배양한 후 분리 균주를 냉동 보관하였다.
It was diluted to 1 to the third culture solution cultured in the above for the pure separation of reductive acid producing bacteria to the decimal dilution method using the AC-10 medium B1 ^0-10 ^-9 then 10 ^-2 to 10 ^-9 dilutions AC After plating on B1 agar medium, the cells were incubated for one week in a 39 ° C. incubator in an anaerobic chamber (Visionbionex, N ₂ : 90%, H ₂ : 5%, CO ₂ : 5%). Thereafter, after re-plating and incubation to separate the reductive acetic acid producing bacteria, the isolated strain was stored frozen.

2-2. DNA 추출2-2. DNA extraction

상기 2-1에서 분리한 균주를 고체 배지에서 배양한 후, 콜로니를 튜브에 넣은 후 100㎕의 5% Chelex(Biorad)를 넣었다. 그 후 95℃에서 10분간 둔 후 상층액에서 DNA를 추출하였다.
After culturing the strain isolated in 2-1 in a solid medium, colonies were placed in a tube, and then 100 μl of 5% Chelex (Biorad) was added thereto. After 10 minutes at 95 ℃ extracted DNA from the supernatant.

실시예 3 : 균주의 동정 Example 3 Identification of Strains

3-1. PCR의 수행 및 DNA의 확인3-1. Perform PCR and Confirm DNA

상기 실시예 2-1에서 분리한 균주의 종을 확인하기 위해, 분리한 균주의 16S rDNA를 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 실험을 수행하였다. 프라이머로는 보편적인 프라이머인 27F(5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3′; 서열번호 1)와 1492R(5′- TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3′; 서열번호 2)을 사용하였다(Nubel et al. 1996. Sequence heterogeneities of genes encoding 16S rRNAs in Paenibacillus polymixa detected by temperature gradient gel electrophoresis. J. Bacteriol. 178, 5636??5643). 94℃에서 5분간 초기 변성(pre-denaturation)시킨 후 94℃에서 45초간 단일가닥으로 변성(denaturation)시키고, 55℃에서 45초간 결합시킨(annealing) 후 72℃에서 1분간 연장(extension)하는 과정을 총 32회 반복하여 수행하였다. 후기 연장(Post-extension)은 72℃에서 10분간 수행하였다. 상기 실험은 Applied Biosstem사의 Gene Amp PCR System 2700 thermocycler를 이용하여 수행하였다. In order to identify the species of the strain isolated in Example 2-1, a polymerase chain reaction (PCR) experiment was performed using the 16S rDNA of the isolated strain. The primers include 27F (5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3 ′; SEQ ID NO: 1) and 1492R (5′- TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3 ′; SEQ ID NO: 2). Nubel et al. 1996. Sequence heterogeneities of genes encoding 16S rRNAs in Paenibacillus polymixa detected by temperature gradient gel electrophoresis. J. Bacteriol. 178, 5636 ?? 5643. Initial denaturation at 94 ° C. for 5 minutes, denaturation at 94 ° C. for 45 seconds, annealing at 55 ° C. for 45 seconds, and extension at 72 ° C. for 1 minute. Was repeated a total of 32 times. Post-extension was performed at 72 ° C. for 10 minutes. The experiment was performed using a Gene Amp PCR System 2700 thermocycler from Applied Biosstem.

그 후 상기에서 증폭한 DNA를 EtBr(ethidium bromide)을 이용하여 전기영동법에 의하여 DNA를 확인한 결과, 젖소에서 13종, 재래산양에서 36종의 균주를 분리하였다.
Thereafter, the DNA amplified above was identified by electrophoresis using EtBr (ethidium bromide). As a result, 13 strains from cows and 36 strains from native goats were isolated.

3-2. DNA의 염기서열의 분석3-2. DNA sequence analysis

상기 실시예 3-1에서 증폭한 DNA를 Qiagen사의 QIAquick PCR Purification Kits을 사용하여 분리하였다. 그 후, 분리한 DNA는 마크로젠(Macrogen)사에 보내어 양 방향 DNA의 염기서열을 분석하였다.
The DNA amplified in Example 3-1 was isolated using QIAgen's QIAquick PCR Purification Kits. Thereafter, the separated DNA was sent to Macrogen, and the base sequences of the bidirectional DNA were analyzed.

실시예 4 : 환원적 초산 생성균 관련 유전자의 검출 및 계통수의 작성Example 4: Detection of genes related to reductive acetic acid producing bacteria and preparation of phylogenetic tree

4-1. 환원적 초산 생성균 관련 유전자의 검출4-1. Detection of genes related to reductive acetic acid

환원적 초산 생성(Reductive acetogenesis) 미생물의 분리를 위해서 환원적 초산 생성(Reductive acetogenesis) 관련 유전자(Formyl tetrahydrofolate synthetase (FTHFS))를 이용하여 분리 및 동정된 환원적 초산 생성균을 특이적으로 검출하였다.Reductive acetogenesis For the isolation of microorganisms, reductive acetogenesis-specific genes (Formyl tetrahydrofolate synthetase (FTHFS)) were specifically detected for reductive acetic acid production.

프라이머로는 FTHFSf (5'-TTYACWGGHGAYTTCCATGC-3'; 서열번호 3)와 FTHFSr (5'-GTATTGDGTYTTRGCCATACA-3'; 서열번호 4)을 사용한 후 상기 실시예 3-1의 방법으로 PCR을 수행하였다. PCR was performed by the method of Example 3-1 after using FTHFSf (5′-TTYACWGGHGAYTTCCATGC-3 ′; SEQ ID NO: 3) and FTHFSr (5′-GTATTGDGTYTTRGCCATACA-3 ′; SEQ ID NO: 4) as a primer.

그 후 상기에서 증폭한 DNA를 EtBr(ethidium bromide)을 이용하여 전기영동법에 의하여 DNA를 확인한 결과 1 kb의 크기를 가진 DNA를 확인하였다. 그 결과, FTHFS 유전자를 가지고 있는 미생물을 젖소에서 1종(DA02) 및 재래산양에서 3종(GA01, GA02, GA03)으로 총 4종 선별하였으며, 선별된 미생물의 염기서열을 National Center Biotechnology Information(NCBI)의 Blast Network Service를 이용하여 비교한 결과를 하기 표 2에 나타내었으며, 이 중에서 GA03 균주의 분석된 염기서열을 서열번호 5에 나타내었다.
Thereafter, the DNA amplified above was identified by DNA by electrophoresis using EtBr (ethidium bromide). As a result, DNA having a size of 1 kb was confirmed. As a result, four microorganisms carrying the FTHFS gene were selected from cows (DA02) and native goats (GA01, GA02, and GA03). The nucleotide sequences of the selected microorganisms were selected from the National Center Biotechnology Information (NCBI). The results of comparison using the Blast Network Service of) are shown in Table 2 below, and the analyzed base sequences of the GA03 strains are shown in SEQ ID NO: 5.

4-2. 환원적 초산 생성균의 계통수의 작성4-2. Creation of phylogenetic tree of reductive acetic acid producing bacteria

상기 실시예 4-1에서 선별한 미생물의 계통학적 소속을 결정하기 위하여 BLAST 프로그램 및 EzTaxon을 이용하여 NCBI의 Gene Bank에 있는 16s rRNA 유전자의 염기서열과 비교하였다. In order to determine the systematic membership of the microorganism selected in Example 4-1, it was compared with the nucleotide sequence of 16s rRNA gene in Gene Bank of NCBI using BLAST program and EzTaxon.

염기서열의 정렬은 CLUSTAL W version 1.6을 이용하여 수행하였다(Thompson et al. 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22, 4673-4680). Kimura two-parameter model(Kimura, M., 1980. A simple method of estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. J. Mol. Evol. 16, 111-120)에 따라 계산된 distance matrix를 사용하고 NJ(neighbor-joining) 방법에 의해 계통수를 작성하였으며 부트스트랩(bootstrap) 값은 1000회 반복하여 계산하였다. 상기와 같은 방법으로 작성된 계통수를 하기 도 1에 나타내었다.
Sequence alignment was performed using CLUSTAL W version 1.6 (Thompson et al. 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice.Nucleic Acids Res. 22, 4673-4680). Using a distance matrix calculated according to the Kimura two-parameter model (Kimura, M., 1980. A simple method of estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences.J. Mol. Evol. 16, 111-120). The phylogenetic tree was prepared by NJ (neighbor-joining) method, and the bootstrap value was repeatedly calculated 1000 times. The phylogenetic tree prepared by the above method is shown in FIG. 1.

실시예 5 : 환원적 초산 생성균의 발효 특성 측정Example 5 Measurement of Fermentation Characteristics of Reducing Acetic Acid Producing Bacteria

상기 실시예 4에서 선별한 균주들의 발효 특성을 비교하기 위해 하기 표 3과 같은 조성을 가지는 RM02 배지(Kenters 등, 2009)를 이용하여 39℃의 쉐이킹 인큐베이터에서 100rpm의 속도로 4일간 배양하였다. 비교 균주로는 기존의 반추위 내에서 분리된 환원적 초산 생성균인 유박테리엄 리모숨(Eubacterium limosum) ATCC 8486을 사용하였다. 배양 조건은 80% N₂-20% CO₂(vol%) 가스를 주입한 배지에서 성장한 균주를 대조구로 하고, 80% H₂-20% CO₂(vol%) 가스를 주입한 배지 및 5mM 글루코오스가 첨가된 배지에서 성장한 균주를 실험구로 하였다. In order to compare the fermentation characteristics of the strains selected in Example 4 was incubated for 4 days at a speed of 100rpm in a shaking incubator at 39 ℃ using RM02 medium (Kenters et al., 2009) having a composition as shown in Table 3. As a comparative strain, Eubacterium limosum ATCC 8486 , a reducing acetic acid-producing bacterium isolated from the existing rumen, was used. Cultivation conditions were the strain grown in the medium injected with 80% N ₂ -20% CO ₂ (vol%) gas, the medium and 5mM glucose injected with 80% H ₂ -20% CO ₂ (vol%) gas The strain grown in the medium to which was added was used as a test zone.

그 후, 상기에서 배양한 균주의 배양액을 10,000g에서 15분간 원심분리하고 상층액을 0.45μm 필터로 여과하여 HPLC(Agilent Technologies 1200 Series, USA)로 각 균주의 발효 특성을 분석하였다. 컬럼은 METACARB 87H(Varian, USA), 디텍터는 Agilent 1200 Series diode-array detector(210nm/ 220nm)를 사용하였으며 35℃에서 0.6㎖/min의 유속으로 균주 시료를 이동시켰다. 이동상 용매는 0.0085N H₂SO₄를 사용하였으며, 오토샘플러를 이용하여 10㎕를 컬럼에 주입하여 분석한 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
Thereafter, the culture solution of the cultured strains was centrifuged at 10,000 g for 15 minutes, and the supernatant was filtered with a 0.45 μm filter to analyze fermentation characteristics of each strain by HPLC (Agilent Technologies 1200 Series, USA). The column was METACARB 87H (Varian, USA), the detector was Agilent 1200 Series diode-array detector (210nm / 220nm) and strain samples were transferred at a flow rate of 0.6ml / min at 35 ℃. Mobile phase solvent was used as 0.0085NH ₂ SO ₄ , 10μ was injected into the column using an autosampler and the analysis results are shown in Table 4 below.

실험 결과, 상기 실시예 4에서 선별된 균주인 DA02, GA01, GA02 및 GA03 모두에서 비교 균주에 비하여 많은 양의 초산을 생성하였으며, 특히 재래산양에서 분리한 균주인 GA03에서 가장 많은 초산이 검출되었다.
As a result, all of the strains DA02, GA01, GA02 and GA03 selected in Example 4 produced more acetic acid than the comparative strain, and in particular, the most acetic acid was detected in GA03, a strain isolated from a native goat.

실시예 6 : in vitro 발효 시스템에서 실험의 수행Example 6 Conducting Experiments in an In vitro Fermentation System

6-1. 휘발성 지방산 함량의 측정6-1. Determination of Volatile Fatty Acid Content

상기 실시예 4에서 선별한 균주들의 휘발성 지방산 함량을 측정하기 위해, 혐기성 환경에 있는 여과한 반추위액에 완충액을 1 : 2의 비율로 혼합하였다. 상기 완충액은 물 1ℓ에 K₂HPO₄ 5g, KH₂PO₄ 4g, NaCl 0.52g, MgSO₄·7H₂O 70mg, CaCl₂ 35mg, NaHCO₃ 5.9g, cystein HCl 174g을 각각 혼합한 후 pH가 6.8이 되도록 적정하여 제조하였다.In order to measure the volatile fatty acid content of the strains selected in Example 4, the buffer solution was mixed in a 1: 2 ratio to the filtered rumen in the anaerobic environment. The buffer was prepared by mixing 5 g of K ₂ HPO ₄ , ₄ g of KH ₂ PO ₄ , ₄ g of NaCl, 0.52 g of NaCl, 70 mg of MgSO ₄ · 7H ₂ O, 5.9 g of CaCl ₂ , 5.9 g of NaHCO ₃ , and 174 g of cystein HCl, respectively. It was prepared by titrating to be.

그 후, 멸균한 각각의 병에 기질인 녹말과 카세인을 각각 0.25g 넣은 후, 상기 반추위액과 혼합된 완충액을 25㎖ 첨가한 다음, 상기 실시예 4에서 선별한 4개의 균주를 각각 5㎖ 접종하였다. 그 후 상기 병들을 쉐이킹 인큐베이터에 넣은 후 120rpm의 속도로 39℃에서 혐기 배양한 후, 배양 0시간, 24시간 및 48시간 후 휘발성 지방산 수치를 측정하였다. Thereafter, 0.25 g of starch and casein as substrates were added to each of the sterilized bottles, and 25 ml of the buffer solution mixed with the rumen solution was added thereto, followed by 5 ml of each of the four strains selected in Example 4. It was. The bottles were then placed in a shaking incubator and anaerobicly cultured at 39 ° C. at a speed of 120 rpm, followed by measurement of volatile fatty acid levels after 0, 24 and 48 hours of culture.

휘발산 지방산은 락테이트(lactate), 부틸레이트(butylate), 프로피오네이트(protionate) 및 아세테이트(acetate) 함량을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 측정하였다. 용매로는 0.0085 노르말의 황산을 0.6 ㎕/min의 속도로 흘려주었으며 컬럼의 온도는 35℃로 유지하였다. 시료는 사용 전 13,000rpm의 속도로 4℃에서 10분간 원심분리 후 상층액을 취해 밀리포어(Milipore)사의 0.2㎛ 필터로 필터한 후 20㎕씩 주입하였다. 녹말을 기질로 사용한 경우 실험 결과는 하기 도 2에, 카세인을 기질로 사용한 경우 실험 결과는 하기 도 3에 나타내었다.Volatile fatty acids were measured for lactate, butylate, propionate and acetate content using high performance liquid chromatography (HPLC). 0.0085 normal sulfuric acid was flowed into the solvent at a rate of 0.6 μl / min and the temperature of the column was maintained at 35 ° C. Samples were centrifuged at 4 DEG C for 10 minutes at a speed of 13,000 rpm, and then the supernatant was collected, filtered with a Millipore 0.2 µm filter, and injected into each 20 µl. In the case of using starch as a substrate, the experimental results are shown in FIG. 2, and in the case of using casein as the substrate, the experimental results are shown in FIG. 3.

실험 결과, 녹말을 기질로 사용한 경우 및 카세인을 기질로 사용한 경우 모두에서 배양 시간이 길어질수록 총 휘발성 지방산 함량이 증가되었으며, 모든 군에서 아세테이트의 함량이 가장 높게 나타났다. 또한, 녹말을 기질로 사용한 경우 대조군 및 실험군 모두에서 배양 24시간 후부터 부틸레이트가 생성되었다. 그리고, 대조군의 경우 배양 24시간 후 락테이트가 검출된 반면 실험군에서는 검출되지 않았다. As a result, the total volatile fatty acid content increased as the incubation time increased in both starch and casein substrates, and acetate content was the highest in all groups. In addition, when starch was used as a substrate, butyrate was produced after 24 hours of culture in both the control and experimental groups. In the control group, lactate was detected after 24 hours of culture, but not in the experimental group.

그리고, 카세인을 기질로 사용한 경우에는 배양 0시간에 GA03군을 제외한 실험군 및 대조군에서 부틸레이트가 검출되었으나, 배양이 시작되면서 모든 군에서 부틸레이트가 검출되지 않았다. 또한, 대조군의 경우 배양 24시간 후 락테이트가 검출된 반면 실험군에서는 검출되지 않았다.
When casein was used as a substrate, butyrate was detected in the experimental and control groups except for the GA03 group at 0 hours of cultivation, but no butyrate was detected in all groups as the culture started. In addition, lactate was detected after 24 hours of culture in the control group, but not in the experimental group.

6-2. 메탄 가스 함량의 측정6-2. Measurement of Methane Gas Content

상기 실시예 4에서 선별된 균주의 메탄 생성 억제능을 평가하기 위해, 상기 실시예 6-1의 방법을 사용하여 각 균주의 메탄 생성 억제 정도를 관찰한 결과, 녹말을 기질로 사용한 경우 각 균주의 메탄 생성 억제 정도를 하기 도 4에, 카세인을 기질로 사용한 경우 각 균주의 메탄 생성 억제 정도를 관찰한 결과를 하기 도 5에 나타내었다. In order to evaluate the methane production inhibitory ability of the strains selected in Example 4, the degree of inhibition of methane production of each strain was observed using the method of Example 6-1. The degree of inhibition of production is shown in Figure 4 below, the results of observing the degree of inhibition of methane production of each strain when casein is used as a substrate.

실험 결과, 녹말을 기질로 사용한 경우 배양 48시간 후부터 모든 실험군에서 메탄의 생성을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났으며, GA03군의 메탄 생성 억제능이 가장 우수한 것으로 관찰되었다. As a result, when starch was used as a substrate, it was shown that after 48 hours of culture, methane production was effectively suppressed in all experimental groups, and the methane production inhibition ability of the GA03 group was the best.

그리고, 카세인을 기질로 사용한 경우에는 배양 24시간 후에 실험군의 메탄 농도가 대조군에 비하여 증가하였으나, 배양 48시간 후에는 메탄 농도가 감소하였으며 특히 GA02 및 GA03의 경우 대조군에 비하여 메탄 농도가 감소하는 것으로 나타났다. In case of using casein as a substrate, the methane concentration of the experimental group increased after 24 hours of cultivation compared to the control group, but after 48 hours of cultivation, the methane concentration decreased, and especially in the case of GA02 and GA03, the methane concentration decreased. .

상기 실시예들에서 확인한 바와 같이, 본 발명자들이 재래산양에서 추출한 균주인 GA03의 메탄 생성 억제능이 우수한 것을 확인하였는바, 상기 균주를 프로테이니필리엄 아세타티게네스(Proteiniphilium acetatigenes) SROD1으로 명명하고 한국미생물보존센터에 2011년 11월 9일자로 기탁번호 KCCM11219P로 기탁하였다.
As confirmed in the above examples, the inventors of the present invention confirmed that the superior methane production inhibitory ability of the strain GA03 extracted from the native goat, the strain is proteiniphilium acetatigenes ( Proteiniphilium acetatigenes ) was named SROD1 and deposited with the Korea Microorganism Conservation Center on November 9, 2011 with accession number KCCM11219P.

한국미생물보존센터(국외)Korea Microorganism Conservation Center (overseas) KCCM11219PKCCM11219P 2011110920111109

서열목록 전자파일 첨부Attach an electronic file to a sequence list

Claims

Proteiniphilium acetatigenes SROD1 (KCCM 11219P) having the ability to inhibit methane production in ruminants of ruminants.

A microbial agent for inhibiting methane production in ruminant of a ruminant, comprising the microorganism of claim 1.

Livestock feed comprising the microorganism of claim 1 or the microbial agent of claim 2.

A method of inhibiting ruminant methane production in rumen by feeding proteiniphilium acetatigenes SROD1 (KCCM 11219P) to animals.

delete

The method of claim 4, wherein the salary is characterized in that the ruminant is provided with a microbial agent containing the proteiniphilium acetatigenes SROD1 or a feed for livestock containing the microbial agent Method of inhibiting methane production in ruminants of ruminants.