KR101320905B1 - 백일해 독소의 정제방법 및 이에 유용한 펩타이드 - Google Patents

백일해 독소의 정제방법 및 이에 유용한 펩타이드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 백일해 독소(PT)를 정제하기 위한 시약 및 방법에 관한 것이다.
백일해 독소, 정제, 바이오티닐화, 거마린, pp26 펩타이드

Description

백일해 독소의 정제방법 및 이에 유용한 펩타이드{Methods for purifying pertussis toxin and peptides useful therefor}
본 발명은 백일해 독소(PT)를 정제하는 시약 및 방법에 관한 것이다.
보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)에 의해 생산되는 백일해 독소(PT)는 백일해에 대한 모든 백신의 주요 성분이다. PT는 일반적으로 파상풍 및 디프테리아 변성독소와 함께 사용된다. PT의 공업적 생산은 전형적으로 비. 퍼투시스를 특정 배지에서 배양하여 달성한다. 그 다음, PT를 상청액으로부터 분리하고 공지된 기술을 사용하여 정제한다[참조: 미국 특허 제6,399,076호; 제5,877,298호; 및 Sekura, et al., J. Biol. Chem. 258:14647-14651, 1983; Bogdan, et al. Appl. Env. Micro. 69(10): 6272-6279, Oct. 2003]. 공지된 방법은 대부분 매트릭스-결합된 소 페투인(BF) 또는 아시알로페투인의 사용을 필요로 하며, 이의 급원과 순도가 중요하다. 그러나, 소로부터 유래된 시약의 사용은 광우병(소 해면상 뇌병증; bovine spongioform encephalopathy(BSE))과 같은 소-관련 질병에 대한 몇가지 염려를 유발했다.
따라서, 당업계에서는 BF에 의존하지 않는 PT 정제방법이 요구되고 있다. 이러한 방법 중 하나는 보그던 등[참조: Bogdan et al., Appl.Env.Micro. 69(10): 6272-6279, Oct. 2003]에 의해 개시되었다. 여기서는 PT에 결합시켜 소 페투인의 배당체 잔기와 유사한 능력을 갖는 펩타이드를 파지 디스플레이 시스템을 사용하여 동정했다. 콘센서스 서열(consensus sequence) XGSFSGX(X는 임의의 아미노산이다; 서열번호 4)를 가진 3개의 펩타이드[3G5: NGSFDGF(서열번호 1); 3G8: NGSFSGC(서열번호 2); 및 3G2: DGSFSGF(서열번호 3)]는 PT 결합능이 있는 것으로 확인되었다. 또한, 3G2도 부분 정제된 PT 제제로부터 PT를 정제하는 친화성 컬럼에 사용되었다.
하지만, 당업계에서는 여전히 소의 산물의 부재하에 PT를 정제하는 펩타이드를 설계하고 이용하는 다른 방법이 요구되고 있다. 본 발명은 어떠한 형태의 페투인도 사용함이 없이 PT를 친화성 정제하기 위한 시약 및 방법을 제공한다.
도 1. A) 거마린 라이브러리의 개략도. 아미노산 서열로 해독되는 라이브러리의 위치가 강조되었다. 단백질 부분의 서열(59개 아미노산 길이)을 1문자 아미노산 코드로 도시했고, 여기서 X는 임의의 아미노산이다. 해독되지 않은 라이브러리의 부분은 회색 박스로 표시했다. (a) 라이브러리의 최적의 시험관내 전사를 위한 T7 프로모터, (b) TMV - 라이브러리의 완전한 시험관내 해독을 위한 담배 모자이크 바이러스 해독 개시 서열, (c) PROfusion™ 라이브러리의 효과적인 친화성 정제를 위한 His6-태그, (d) 구조적 가요성 링커, (e) 각각 5개 및 9개의 아미노산을 함유 하는 2개의 랜덤화 루프를 보유하는 거마린 코어, (f) 구조적 가요성 링커, 및 (g) 퓨로마이신-수용체-분자와 효과적으로 커플링하기 위한 최적화된 링커. B) 거마린 PROfusion™ 라이브러리의 작제는 다음과 같은 반응을 포함하는 다단계 공정이다: PCR, 시험관내 전사, 퓨로마이신-올리고뉴클레오타이드 링커와 RNA의 화학적 연결, 시험관내 해독, 올리고-dT 정제, 역전사 및 His-태그 정제.
도 2. PROfusion™ 선별 사이클의 개략도.
도 3. PT에 대한 결합 활성을 시험해야 하는 선별된 거마린 변이체. 보존적 서열 모티프는 강조했다. 열거된 변이체는 상부에서 하부 방향으로 서열번호 81 내지 101이다.
도 4. PT에 대한 거마린 선별 4 라운드의 서열 분석. 각 변이체의 아미노산 서열은 1문자 아미노산 코드로 나타냈다. 라이브러리의 불변 플랭킹 영역 및 거마린 스캐폴드의 불변 영역이 강조되었다. 랜덤화 루프 1 및 2의 위치도 표시되었다. 상기 변이체는 상부에서 하부까지 하기의 순서로 열거된다: 서열번호 102(3), 103, 102(3), 104 내지 110, 102 및 111 내지 147.
도 5. PT(에폭시)에 대한 거마린 선별 5a 라운드의 서열 분석. 각 변이체의 아미노산 서열은 1문자 아미노산 코드로 나타냈다. 라이브러리의 불변 플랭킹 영역 및 거마린 스캐폴드의 불변 영역이 강조되었다. 랜덤화 루프 1 및 2의 위치도 표시되었다. 상기 변이체는 상부에서 하부까지 하기의 순서로 열거된다: 서열번호 148(3), 149, 148(2), 150, 151(2), 148, 152, 151, 148(5), 153, 148, 154, 148(4), 154, 148, 155, 148(2), 156, 157, 155, 158(2), 159, 148(4), 160, 148(2), 161, 148(4), 162, 148(2) 및 163 내지 169.
도 6. PT(strep)에 대한 거마린 선별 5b 라운드의 서열 분석. 각 변이체의 아미노산 서열은 1문자 아미노산 코드로 나타냈다. 라이브러리의 불변 플랭킹 영역 및 거마린 스캐폴드의 불변 영역이 강조되었다. 랜덤화 루프 1 및 2의 위치도 표시되었다. 상기 변이체는 상부에서 하부까지 하기의 순서로 열거된다: 서열번호 170, 171(16), 172, 173, 174, 171(2), 175 내지 181, 182(2), 183(2), 184, 185(2), 186(2), 187 내지 195, 196(3), 197 및 198.
도 7. PT(스트렙타비딘)에 대한 거마린 선별 6a 라운드의 서열 분석. 각 변이체의 아미노산 서열은 1문자 아미노산 코드로 나타냈다. 라이브러리의 불변 플랭킹 영역 및 거마린 스캐폴드의 불변 영역이 강조되었다. 랜덤화 루프 1 및 2의 위치도 표시되었다. 상기 변이체는 상부에서 하부까지 하기의 순서로 열거된다: 서열번호 199(15), 200, 199(19), 201, 199(6), 202, 203(2), 204, 205(2), 206, 207, 203, 208, 209, 203, 210, 211, 204, 및 212.
도 8. PT(스트렙타비딘)에 대한 거마린 선별 6b 라운드의 서열 분석. 각 변이체의 아미노산 서열은 1문자 아미노산 코드로 나타냈다. 라이브러리의 불변 플랭킹 영역 및 거마린 스캐폴드의 불변 영역이 강조되었다. 랜덤화 루프 1 및 2의 위치도 표시되었다. 상기 변이체는 상부에서 하부까지 하기의 순서로 열거된다: 서열번호 213 (2), 214-217, 213, 218, 219, 213, 220, 213 (2), 221, 213 (16), 222, 213 (7), 223, 224, 213 (2), 225, 213, 226, 213 (4), 227-229, 213 (5), 229, 213, 231-242, 213, 242, 213, 243, 213, 및 244-252.
도 9. PT에 대한 결합 활성에 대해 시험될 선별된 PP26 변이체. 보존된 서열 모티프가 강조되었다. 상부에서 하부방향으로 열거된 변이체는 서열번호 253 내지 269이다.
도 10. PT에 대한 PP26 선별 4 라운드의 서열 분석. 각 변이체의 아미노산 서열은 1문자 아미노산 코드로 나타냈다. 라이브러리의 불변 플랭킹 영역이 강조되었다. 상기 변이체는 상부에서 하부까지 하기의 순서로 열거된다: 서열번호 253 (6), 270 (3), 271, 272, 271 (2), 273, 274, 275 (2), 및 276-305.
도 11. PT(에폭시)에 대한 PP26 선별 5a 라운드의 서열 분석. 각 변이체의 아미노산 서열은 1문자 아미노산 코드로 나타냈다. 라이브러리의 불변 플랭킹 영역은 표시했다. 보존적 서열 모티프는 강조되었다. 상기 변이체는 상부에서 하부까지 하기의 순서로 열거된다: 서열번호 306, 307 (4), 308-311, 307 (3), 312-315, 312 (6), 316, 312, 316, 312 (7), 317-320, 415, 320 (3), 321 (2), 322 (2), 323, 324 (3), 325-338, 339 (2), 341, 및 342.
도 12. PT(strep)에 대한 PP26 선별 5b 라운드의 서열 분석. 각 변이체의 아미노산 서열은 1문자 아미노산 코드로 나타냈다. 라이브러리의 불변 플랭킹 영역은 표시했다. 보존적 서열 모티프는 강조되었다. 상기 변이체는 상부에서 하부까지 하기의 순서로 열거된다: 서열번호 343 (7), 344-346, 345 (5), 347 (2), 345, 348, 347, 345 (2), 349 (4), 350-354, 355 (2), 356 (2), 및 357-367.
도 13. PT에 대한 PP26 선별 6a 라운드의 서열 분석. 각 변이체의 아미노산 서열은 1문자 아미노산 코드로 나타냈다. 라이브러리의 불변 플랭킹 영역은 표시했다. 보존적 서열 모티프는 강조되었다. 상기 변이체는 상부에서 하부까지 하기의 순서로 열거된다: 서열번호 368 (18), 369, 368 (3), 370 (11), 371, 372, 373 (15), 374, 373 (8), 375 (2), 376 (2), 377, 378 (4), 379, 380 (5), 및 381-393.
도 14. PT에 대한 PP26 선별 6b 라운드의 서열 분석. 각 변이체의 아미노산 서열은 1문자 아미노산 코드로 표시했다. 라이브러리의 불변 플랭킹 영역은 강조되었다. 상기 변이체는 상부에서 하부까지 하기의 순서로 열거된다: 서열번호 394, 395, 396, 397 (40), 398, 399 (5), 400, 399 (13), 401, 399 (7), 400 (2), 401, 402 (2), 및 403-414.
도 15. 스트렙타비딘 세파로스에 대한 합성 바이오티닐화(biotinylation)된 코어 펩타이드의 고정화 및 정제된 PT에 대한 결합의 검증. PT의 미결합된 분획을 MES 전개 완충액(running buffer)을 이용하여 12% NuPage 겔(상층 겔) 상에 결합시킨 후 상청액의 1/40 용적을 분리하여 분석했다. 세파로스에 결합된 PT를 분석하기 위하여 용출액의 50%를 MES 전개 완충액을 이용한 12% NuPage 겔(하부 겔)을 통해 분리시켰다. 검출은 은 염색으로 실시했다. 거마린 펩타이드 15 및 9를 제외하고, 정제된 PT의 규정된 양을 정량 분석용 표준물로서 사용했다.
도 16. 샘플 A(좌측 겔) 및 샘플 B(우측 겔)로부터 PT의 정제. 세파로스에 결합된 PT를 분석하기 위하여 용출액의 50%를 MES 전개 완충액을 이용하여 12% NuPage 겔(하부 겔)에서 분리시켰다. 검출은 은 염색으로 실시했다. 거마린 펩타이드 9를 제외하고, 정제된 PT의 규정된 양을 정량 분석용 표준물로서 사용했다.
도 17. 50mM Tris/HCl(pH 7.5) 또는 50mM 아세테이트(pH 6)으로의 3회 세척을 이용한, 고정된 펩타이드 pp26 클론 9 및 15와 거마린 클론 9 및 15에 대한 샘플 A 또는 B로부터의 결합된 PT의 세척 조건 최적화 시험. PT는 12% Bis Tris 겔에서 분석하고, 은 염색으로 가시화했다. PPM: 단백질 완전 마커.
도 18. 50mM Tris/HCl, pH 7.5 또는 50mM 아세테이트, pH 6으로의 3 내지 20회 세척을 이용한, 고정된 펩타이드 pp26 클론 9에 대한 샘플 B로부터의 결합된 PT의 세척 조건 최적화 시험. PT는 12% Bis Tris 겔을 통해 분석했고, 은 염색으로 가시화했다.
도 19. 50mM Tris/HCl 중의 0.2 내지 2.0M MgCl2을 이용한 펩타이드 스트렙타비딘 세파로스로부터 PT 용출. 펩타이드에 결합된 PT를 표시된 용출 완충액(각각 20㎕씩)으로 3회 연속 세척하여 펩타이드-스트렙타비딘 세파로스로부터 해리시켰다. 그 다음, 잔류 물질을 겔 부하 완충액(loadin buffer)으로 용출시켰다. 모든 용출액을 12% Bis Tris 겔(1x MES 전개 완충액)을 통해 분석하고, 은 염색으로 가시화했다.
도 20. 산성(50mM 글리신, pH2.5) 또는 염기성(100mM 탄산염 완충액, pH 10.5) 조건하에서 펩타이드 스트렙타비딘 세파로스로부터 PT의 용출. 펩타이드에 결합된 PT를 표시된 용출 완충액(각각 40㎕씩)으로 3회 연속 세척하여 펩타이드-스트렙타비딘 세파로스(한 펩타이드를 약 200pmol씩 함유하는 20㎕)로부터 해리시켰다. 그 다음, 잔류 물질을 겔 부하 완충액으로 용출시켰다. 모든 용출액을 12% Bis Tris 겔(1x MES 전개 완충액)을 통해 분석하고, 은 염색으로 가시화했다. 샘플 A와 함께 펩타이드 스트렙타비딘 세파로스를 항온처리한 후, 각 펩타이드마다 통류물의 1/40 용적을 상기와 같은 겔을 통해 분석했다.
도 21. 친화성 리간드로서 pp26 펩타이드 9가 고정화된 스트렙타비딘 세파로스에서 샘플 B로부터 PT의 소규모 컬럼 정제(A) 및 정제된 PT 수율의 겔 산정(B).
도 22. 친화성 리간드로서 거마린 펩타이드 15가 고정화된 스트렙타비딘 세파로스에서 샘플 B로부터 PT의 소규모 컬럼 정제(A) 및 정제된 PT 수율의 겔 산정(B).
도 23. 스트렙타비딘 세파로스(1ml)에 고정시키기 위해 사용된 다양한 양의 펩타이드(표시된 양)에 의존하는 펩타이드 스트렙타비딘 세파로스에 대한 PT의 결합. 결합된 PT의 양은 동일한 겔에서의 정제된 PT의 규정된 양과 비교하여 정량하였다. 예로서, pp26/9를 스트렙타비딘 세파로스 1ml당 고정화에 사용된 펩타이드의 양에 대해서 플롯팅하였다. 최대 결합은 약 100 내지 150pmol의 PT에서 확인되었다.
도 24. 1㎕ 펩타이드 스트렙타비딘 세파로스 또는 6.85㎕ 아시알로페투인 세파로스 당 다양한 양의 유입 물질(샘플 B)의 함수로서의 PT 수율. 용출된 PT 양을 동일한 겔에서의 정제된 PT의 규정된 양과 직접 비교하여 계산하였으며, 이는 표 12에 요약되어 있다.
도 25. 반복된 PT 결합 및 용출에 대한 펩타이드 세파로스의 재활용성. 스트렙타비딘 세파로스에 결합된 PT는 pH 10.5의 100mM 탄산염 완충액으로 4회 용출시키고, 컬럼 매트릭스를 10mM HCl로 재생시켰다.
도 26. pp26/9 펩타이드 스트렙타비딘 세파로스(0.5ml)에서 FPLC-컬럼 정제 후 수득되는, 샘플 B로부터 PT 용출 분획. 용출 분획(각 용출액 500㎕ 중의 0.5㎕)을 PAGE(12% Bis-Tris-Gel, MES 전개 완충액)로 분석하고 은 염색했다. 직접 비교하기 위하여 특정 양의 정제된 PT를 동일 겔을 통해 분리시켰다. PT의 농도는 용출 분획의 280nm(A280) 흡광도 분석으로 측정하고 정제된 PT 표준물과 비교했다(표 참조).
발명의 개요
본 발명은 백일해 독소(PT)를 정제하는 방법에 관한 것이다. 일 양태로서, 펩타이드 수용체에 결합된 핵산 역전사 프라이머를 RNA에 공유 결합시키는 단계, 상기 RNA를 해독하여, 상기 프라이머가 공유 결합된 펩타이드 산물을 제조하는 단계, 상기 RNA를 역전사하여 DNA-단백질 융합체를 제조하는 단계, 및 상기 융합 산물을 시험하여 PT 결합 펩타이드를 함유하는 산물을 동정하는 단계를 포함하는, DNA-단백질 융합체 제조방법을 제공한다. 그 다음, 펩타이드 서열을 서열분석으로 확인한다. 다른 양태에서, PT 결합능을 갖고 복합적인 생물학적 유체로부터 PT를 정제하는데 유용한 펩타이드가 제공된다. 또한, 복합적인 생물학적 유체로부터 PT를 정제하는데 사용하기 위한, 고체 지지체 및/또는 크로마토그래피 매질에 결합된 펩타이드 및 이러한 정제를 수행하는 방법도 제공된다.
본 발명은 백일해 독소(PT)를 정제하는 신규 방법을 위한 시약 및 방법론을 제공한다. 전술한 바와 같이, 이러한 방법 1가지는 보그단(Bogdan) 등에 의해 제시된 바 있다. 이 방법에서는 PT 결합성 펩타이드를 동정하기 위해 파지 디스플레이를 이용했다. 본 발명의 실시의 목적상, PT는 천연적으로 발현된 PT, 해독된 PT(유전자적 또는 다른 방식으로), 천연 또는 다른 PT 변이체, 재조합 PT, PT 단편 또는 다른 PT 형태를 포함한다(예컨대, 미국 특허 6,399,076; 6,168,928; 6,018,022; 5,977,304; 5,965,385; 5,856,122; 5,877,298; 5,433,945; 5,358,868; 5,332,583; 5,244,657; 5,221,618; 5,085,862; 4,997,915). 대부분의 경우에, PT 정제 후에는 화학적 해독이 실시되었다. 본 명세서에 기술된 시약이 특정 PT 형태에 결합하는 능력을 갖는 한 모든 형태의 PT가 본 발명의 실시에 사용하기에 적합하다. 본 명세서에서 인용된 문헌, 특허, 및 특허 출원은 모두 본원에 참고인용된 것이다.
또한, 본 발명은 PT 결합성 펩타이드를 동정하는데 사용되는 재조합 기술의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 당업계에 공지된 방법보다 우수한 이점을 제공한다. 또한, PT 정제에 유용한 신규 펩타이드도 제공한다. 일 양태에서, DNA-단백질 융합체의 제조방법은 펩타이드 수용체에 결합된 핵산 역전사 프라이머를 RNA에 공유 결합시키는 단계, 상기 RNA를 해독하여, 상기 프라이머가 공유 결합된 펩타이드 산물을 수득하는 단계, 상기 RNA를 역전사하여 DNA-단백질 융합체를 수득하는 단계, 및 상기 융합 산물을 시험하여 PT 결합 펩타이드를 함유하는 산물을 동정하는 단계를 포함한다. 그 다음, 펩타이드 서열을 서열분석으로 확인한다. 특정 양태에서, RNA 잔기는 RNase H와 같은 RNA-분해 화합물로 처리하여 복합체로부터 제거할 수 있다. 또한, 광가교 시약 및 펩타이드 수용체도 본 발명의 실시에 유용하다. 이러한 시스템 및 관련 시약은 예컨대 미국 특허 6,416,950(Lohse et al.); 6,429,300(Kurz, et al.); 6,436,665(Kuimelis, et al.); 6,602,685(Lohse, et al.); 및 6,623,926(Lohse, et al.)에 기술되어 있다.
본 발명의 실시에서, 핵산, 펩타이드, 융합체, 리간드, 친화성 복합체 등과 같은 시약은 고체 지지체에 비확산 결합되거나 부착될 수 있다. 이러한 비확산 결합 또는 부착을 위해서, 시약은 액체의 존재하에 고농도 시약 영역으로부터 저농도 시약 영역으로 이동하지 않도록 고체 지지체와 화학적 또는 물리적으로 결합된다. 고체 지지체는 시약이 직접 또는 간접(예컨대 항체, 프로테인 A, 프로테인 G, 스트렙타비딘, 바이오틴과 같은 다른 결합 파트너 중간체를 통해)으로 결합 또는 부착될 수 있는 임의의 컬럼(즉, 미충진 또는 충진된 크로마토그래피 매질, 컬럼 물질), 비드, 시험관, 미세역가 평판, 고체 입자(즉, 아가로스 또는 세파로스), 마이크로칩(즉, 실리콘, 실리콘-유리, 또는 금 칩), 막(즉, 리포좀 또는 소포의 막) 또는 기타 다른 매질이다.
바람직한 양태에서, 시약은 PT에 결합하는 능력을 갖는 물질 또는 화합물이다. 더 바람직하게는, 시약은 PT에 가역적으로 결합하는 능력을 갖는 물질 또는 화합물이다. 더욱 더 바람직하게는, 시약은 PT 외에도 다른 성분을 함유하는 액체 중에서 PT에 적어도 결합하는, 바람직하게는 PT에 가역적으로 결합하는 능력을 갖는 펩타이드이다. PT에 가역적으로 결합하는 시약은 특정 조건(흡착) 하에서 PT에 결합하고 다른 조건(탈착) 하에서 PT로부터 방출되는 것이다. 예를 들어, 시약은 중성 pH 조건에 노출될 때 PT에 결합하고 산성이나 염기성 pH의 조건에 노출 후 PT를 방출할 수 있다. 따라서, PT에 결합하는 시약의 성질(즉, 평형 해리 상수 또는 Kd)은 시약과 PT가 접촉되는 조건을 변경시켜 조작할 수 있다. 또한, 다른 조건도 변경될 수 있는데, 그 예에는 온도, 이온 강도(즉, 염화나트륨 또는 염화마그네슘과 같은 이온성 염의 농도), 용매 농도, 경쟁 시약/유리 리간드/유사체의 존재 또는 부재, 극성 특성, 및 당업계에 공지된 기타 다른 성질이 있다.
특정 양태에서, 친화성 매트릭스(즉, 고체 지지체에 결합된 PT 결합성 펩타이드)은 생물학적 액체 또는 다른 액체 내에서 발견되는 복합 혼합물로부터 원하는 성분(즉, PT)를 분리하는데 사용된다. 특정 경우에, 세균 용해물과 같은 복합적 생물학적 유체 또는 PT가 유체 중의 주요 성분이 아닌 다른 조성물(예컨대, SDS-PAGE 등으로 측정시)로부터 PT를 정제하는데 바람직할 수 있다. 다른 경우로서, PT는 유체 중의 주요 성분이 PT가 되도록 PT에 대해 부분 정제된 조성물(즉, 대략 50% 이상의 PT로 구성된 조성물)로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, SDS-PAGE로 측정시, PT가 조성물에 존재하는 총 단백질의 약 50% 이상을 구성하는 조성물은 대부분의 상황에서 부분 정제된 것으로 간주될 것이다.
PT를 정제하기 위해, PT를 함유하는 조성물은 고체 지지체에 결합된 PT 결합 시약, 바람직하게는 가역적 결합성 PT 결합 시약과, PT 및 PT 결합 시약이 서로 결합하여 복합체를 형성할 정도로 충분한 시간 동안 접촉시킬 수 있다. 그 다음, PT가 아닌 성분을 세척 제거한다. PT-PT 결합 시약 결합의 Kd가 증가하도록 1가지 이상의 조건(즉, pH)를 변경시키면, PT는 복합체로부터 방출된다. 그 다음, 방출된 PT를 수거하고, 이후 사용을 위해 저장한다. 이러한 분리는 친화성 정제라고 지칭할 수 있고, 이와 같이 정제된 산물은 친화성 정제된 산물이라 지칭한다.
또한, 당업자가 친화성 정제법보다 선택성이 적은 것으로 일반적으로 고려하고 있는 크로마토그래피 기술도 본 발명의 실시에 사용할 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 이 기술에는 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 및 소수성-상호작용 크로마토그래피가 있다. 이러한 기술들은 모두 저압 크로마토그래피(LPC), 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 또는 급속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC) 장치 등에서 적당한 고체 지지체를 사용하여 실시할 수 있다. 이러한 기술의 실시에 적당한 고체 지지체 및 장치는 당업계에 널리 알려져 있다. 본 발명의 실시에서, 친화성 크로마토그래피 및 더 일반적인 크로마토그래피 기술은 모두 출발 물질(즉, 세균 용해물과 같은 복합적 생물학적 유체)의 부분 정제, 물질의 정제 또는 친화성 정제 또는 다른 방식으로 정제된 물질(즉, 친화성 정제된 PT)의 추가 정제를 위해 필요에 따라 함께 사용될 수 있다.
PT에 결합하는 펩타이드가 동정되었고, 본 명세서에 개시했다. 특정 펩타이드는 높은 친화성으로 PT에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 바람직한 PT 결합 펩타이드는 다음을 포함한다:
RSSHCRHRNCHTITRGNMRIETPNNIRKDA (pp26-5; 서열번호 5);
STMNTNRMDIQRLMTNHVKRDSSPGSIDA (pp26-6; 서열번호 6);
RSNVIPLNEVWYDTGWDRPHRSRLSIDDDA (pp26-9; 서열번호 7);
RSWRDTRKLHMRHYFPLAIDSYWDHTLRDA (pp26-15; 서열번호 8);
SGCVKKDELCARWDLVCCEPLECIYTSELYATCG (G-9; 서열번호 9);
SGCVKKDELCELAVDECCEPLECFQMGHGFKRCG (G-10; 서열번호 10);
SGCVKKDELCSQSVPMCCEPLECKWFNENYGICGS (G-15; 서열번호 11); 및
SGCVKKDELCELAIDECCEPLECTKGDLGFRKCG (G-19; 서열번호 12).
이 중에서, 특히 바람직한 펩타이드는 다음과 같다:
RSNVIPLNEVWYDTGWDRPHRSRLSIDDDA(pp26-9; 서열번호 7); 및
SGCVKKDELCSQSVPMCCEPLECKWFNENYGICGS(G-1; 서열번호 115).
또한, 본 발명은 상기 펩타이드의 특징 또는 활성(즉, 활성, 항원성)을 1가지 이상 보유하는 단편, 변이체, 상동체(ortholog), 동족체 및 유도체와 같은 관련 펩타이드도 포함한다. 단편은 펩타이드의 아미노 말단(리더 서열과 함께 또는 리더 서열 없이) 및/또는 카르복시 말단에 서열의 절두(즉, 핵산 또는 폴리펩타이드)를 포함한다. 또한, 단편은 모 서열과 비교했을 때 하나 이상의 아미노산 첨가 또는 치환이나 내부 결실을 갖는 변이체, 상동체, 동족체 및 기타 변이체를 포함할 수도 있다. 바람직한 양태에서, 절두 및/또는 결실은 아미노산 약 1개, 2개, 5개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개 이상을 포함한다. 변이체는 모서열과 비교했을 때 하나 이상의 서열 치환, 결실 및/또는 첨가를 갖는 서열이다. 변이체는 천연 발생성이거나 인공적으로 작제될 수 있다. 이러한 변이체는 해당 핵산 분자로부터 제조할 수 있다. 바람직한 양태에서, 변이체는 1 내지 3개, 1 내지 5개, 1 내지 10개, 1 내지 15개, 1 내지 20개, 1 내지 25개, 1 내지 30개, 1 내지 40개, 1 내지 50개, 또는 50개 이상의 아미노산 치환, 삽입, 첨가 및/또는 결실을 갖는다.
치환은 보존적 또는 비보존적 치환이거나 이의 임의의 조합일 수 있다. 폴리펩타이드 서열에 대한 보존적 아미노산 변형( 및 이에 상응하는 암호화 뉴클레오타이드에 대한 변형)은 모 폴리펩타이드와 유사한 기능적 및 화학적 특징을 보유한 폴리펩타이드를 생산할 수 있다. 예를 들어, "보존적 아미노산 치환"은 치환 위치에서 아미노산 잔기의 크기, 극성, 전하, 소수성 또는 친수성에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않고, 특히 면역원성의 감소를 초래하지 않는, 천연 아미노산 잔기의 비천연 잔기로의 치환을 포함할 수 있다. 적당한 보존적 아미노산 치환의 예는 표 I에 제시했다.
Figure 112006035201269-pct00002
PT와 같은 성분은 본래 함께 발견되는 단백질, 지질, 탄수화물 또는 다른 물질(즉, 세균 용해물)의 적어도 약 50%로부터 분리된 경우에, 정제된 것이라 할 수 있다. 예를 들어, SDS-PAGE 등으로 측정시, 조성물의 총 단백질 함량의 적어도 약 95 내지 100%, 90 내지 95%, 80 내지 90%, 70 내지 80%, 60 내지 70% 또는 50 내지 60%로부터 성분이 분리되는 것이 바람직하다. 특정 양태에서, 정제된 성분은 이 성분이 단독으로 또는 다른 제제와 함께 투여된 숙주 내에서 면역 반응을 유도하는데 유용한 것이다. 면역 반응은 예컨대 PT 또는 보르데텔라 퍼투시스의 적어도 하나의 에피토프에 결합하는 항체의 생산 및/또는 PT를 발현하는 세포에 대한 세포 면역 반응의 발생을 포함할 수 있다. 이러한 반응은 항체 생산 증가, 항원에 대한 친화성이 증가된 항체의 생산 또는 세포 반응의 증가(즉, T 세포 증가)를 유발하여 현행 면역 반응을 증강시키는 것일 수 있다. 면역 반응의 다른 척도는 당업계에 공지되어 있고, 면역 반응의 발생 여부를 측정하는데 적당할 수 있다.
본 명세서에 기술된 방법을 이용하여 분리한 PT는 약제학적 조성물로서 제조할 수 있다. 바람직한 약제학적 조성물은 예컨대 현탁제, 시럽제 또는 엘릭서제와 같은 액체 제제 중에 예를 들면 PT를 포함한다. 바람직한 주사 제제에는 멸균 현탁제 또는 에멀젼과 같은 비경구, 피하, 피내, 근육내 또는 정맥내 투여에 적합한 펩타이드를 포함한다. 예를 들어, PT는 멸균수, 생리식염수, 글루코스 등과 같은 적당한 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합되어 조성물로 제조될 수 있다. 이러한 조성물은 또한 예를 들어 등장성 수성 식염수 완충액으로 재구성하기 위한 동결건조 형태로 제공될 수도 있다. 또한, 이러한 조성물은 미국 특허 제5,877,298호 및 제6,399,076호(Vose, et al.), 국제 출원 제PCT/CA96/00278호에 기술된 바와 같은 백신으로 제조되어 이용될 수도 있다. 본 명세서에 나타낸 바와 같이 제조된 PT는 또한 당업계에 공지된 코린박테리움(즉, 디프테리아), 클로스트리듐(즉, 파상풍), 소아마비 바이러스(즉, IPV, OPV), 간염 바이러스, 네이세리아(즉, 수막염), 스트렙토코커스, 헤모필러스와 같은 질병 유발 유기체 유래의 다른 항원 또는 다른 백일해 항원(즉, 사상 헤마글루티닌, 퍼탁틴 및 응집원) 등과 함께 사용될 수도 있다.
본 발명의 더 상세한 이해 및 이의 많은 장점에 대한 이해는 예시적으로 제시된 이하 실시예로부터 명확히 알 수 있을 것이다.
재료 및 방법
A. 백일해 독소(PT)
PT는 분자량이 109kD인 이종과량체 단백질 복합체이다(6개의 서브유닛, S1, S2, S3, 2x S4, S5로 구성된다). 황산암모늄 침전물로서 제형화된 고순도(>99.99%) 제제를 사용했다. 또한, 천연 육량체 복합체를 인식하는 PT-특이적 리간드(아시알로페투인)도 이용했다. 아시알로페투인은 가용성 형태 및 세파로스 고정화된 형태로서 입수할 수 있다.
B. 거마린 라이브러리 선별
거마린은 아스클레피아드(Asclepiad) 덩굴식물 Gymnea sylvestre 유래의 35 잔기 폴리펩타이드이다. 거마린은 래트에서 단맛 미각자극물질에 대한 신경 반응을 선택적으로 억제하는 능력으로 인해, 단맛 미각전달 연구에 약리학적 도구로서 사용되었다. 사람에서는 뚜렷한 효과가 없었다. 거마린의 미각 억제성은 이 펩타이드가 단맛 수용체에 직접 결합하거나 또는 단맛 미각전달 시스템 중의 하류 표적과 상호작용하기 때문일 수 있음이 제시되었다.
거마린은 일반적으로 길이가 40개 잔기 미만인 구조적 관련이 있는 단백질 그룹인 "노틴(knottin)" 계열에 속한다. 노틴은 단백질, 당 및 지질을 비롯한 다양한 분자 표적에 결합하지만, 소형 3본쇄 역평행 β-시트 및 이황화 결합된 주쇄(framework)를 포함하는 공통 스캐폴드를 공유한다.
다음에 제시되는 바와 같은 15개의 랜덤화 아미노산 위치를 보유하는 특정 거마린 라이브러리가 설계되었다:
야생형 거마린: qqCVKKDELCIPYYLDCCEPLECKKVNWWDHKCig (서열번호 13)
거마린 코어: CVKKDELCXXXXXXCCEPLECXXXXXXXXXC (서열번호 14)
거마린 코어 서열에서 X는 임의의 아미노산을 나타낸다. 이 라이브러리는 단백질 표적에 대해 높은 친화성 결합인자를 생산하는 것으로 확인되었다. 이러한 거마린 라이브러리는 적어도 다음과 같은 이유 때문에 PT 독소에 대한 선별에 있어서 최선의 선택을 가능하게 하는 일군의 장점을 겸비하고 있다: 표적 토폴로지에 일치시키는데 있어 높은 엔트로피 비용을 보상하는 제한된 유연성; 높은 친화성을 위해 필요한 선형 라이브러리보다 이론적으로 더 적은 수의 아미노산; 프로테아제에 대한 내성; 및 후속적 적용시 산화환원-용출 조건에 대한 민감성. 이러한 거마린 라이브러리는 도 1에 도시한 공정에 따라 작제했다.
1. 출발 올리고뉴클레오타이드의 PCR
겔-정제된 3개의 올리고를 사용하여 2개의 랜덤화 루프를 보유한 거마린 라이브러리를 작제했다. 1nmol의 거마린 주형(약 6x1014개 서열) 5'-AGT GGC TCA AGC TCA GGA TCA GGC TGC GTC AAG AAA GAC GAG CTC TGC NNS NNS NNS NNS NNS NNS TGC TGT GAG CCC CTC GAG TGC NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS TGC GGC AGC GGC AGT TCT GGG TCT AGC-3'(서열번호 15)을, 1μM의 5'-His-태그 프라이머 5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA ATG CAC CAT CAC CAT CAC CAT AGT GGC TCA AGC TCA GGA TCA-3'(서열번호 16) 및 1μM의 3'-프라이머 5'-TTT TAA ATA GCG GAT GCT ACT AGG CTA GAC CCA GAA CTG CCG CT-3'(서열번호 17)와 Taq-폴리머라제를 이용하여 6회 라운드의 PCR(94℃, 1분; 65℃, 1분; 72℃, 1분)로 증폭시키고, 2% 아가로스 겔을 통해 분석한 결과, 대표적인 라이브러리가 작제된 것으로 나타났다.
2. 시험관내 전사
dsDNA는 RiboMax Express 시험관내 전사 키트(제조원: Promega)를 사용하여 RNA로 전사시켰다. 37℃에서 45분간 항온처리한 후, DNaseI를 첨가하고, 15분간 더 37℃에서 항온처리했다. 이 혼합물을 페놀/클로로포름 추출로 처리했다. 과량의 NTP를 NAP-5 겔 여과(Pharmacia)로 제거했다. 6%-TBU-겔을 통해 RNA를 분석했는데, 이는 dsDNA가 효과적으로 전사되었음을 나타냈다.
3. RNA와 퓨로마이신-올리고뉴클레오타이드 링커의 화학적 커플링
정제된 RNA는 1.5배 과량의 퓨로마이신-올리고뉴클레오타이드 링커 PEG2A18: 5'-프소랄렌-UAG CGG AUG C A18 (PEG-9)2 CC 퓨로마이신(이탤릭체로 표시된 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 유도체를 나타낸다)에 어닐링된다(85℃, 1분 ∧ 0.3℃/s의 속도로 25℃까지 냉각). 공유 결합은 자외선(365nm)을 RT에서 15분 동안 조사하여 실시했다. 당해 반응 산물을 6%-TBU 겔을 통해 분석했고, 그 결과 결합 반응이 효과적으로 진행되었음을 확인했다.
4. 시험관내 해독
연결된 RNA를 15μCi 35S-메티오닌(1000 Ci/mmol)의 존재하에 토끼 망상적혈구 용해물(제조원: Promega)을 사용하여 해독했다. 30℃에서 30분간 항온처리한 후, KCl과 MgCl2를 각각 530mM과 150mM의 최종 농도로 첨가하고, 샘플을 4 내지 20% Tris/글리신-SDS-PAGE를 통해 분석했다. 이 겔은 해독 반응이 성공적이었음을 나타 냈다.
5. 올리고-dT 정제
분자(mRNA-단백질 융합체)를 올리고 dT 자기 비드(Miltenyi)와 함께 항온처리 완충액(100mM Tris-HCl pH 8.0, 10mM EDTA, 1mM NaCl 및 0.25% Triton X-100)에서 4℃로 5분 동안 항온처리하여 분리했다. PROfusion™ 분자를 MiniMACS-컬럼(Miltenyi)을 통해 여과하고, 항온처리 완충액으로 세척하고, 물로 용출시켜 분리했다. 샘플을 4 내지 20% Tris/글리신-SDS-PAGE 상에서 분석한 결과, 반응이 성공적이었음을 나타냈다.
6. 역전사
상응하는 cDNA 가닥을 SuperScript II 역전사효소(Gibco BRL)를 제조업자의 권장 조건하에서 5배 과량의 3'-프라이머와 함께 사용하여 역전사하여 생성시켰다. 샘플은 4 내지 20% Tris/글리신-SDS-PAGE를 통해 분석했고, 그 결과 반응이 성공적인 것으로 나타났다.
7. His-태그 정제
역전사된 PROfusion™ 분자를 HBS 완충액(20mM HEPES pH7.0, 150mM NaCl, 0.025% Triton X-100, 100㎍/ml 전단된 연어 정자 DNA, 1mg/ml BSA) 중에서 Ni-NTA-아가로스(50㎕/10pmol PROfusion™)(제조원: QIAGEN)와 혼합하고 저속 진탕 하에 RT에서 60분 동안 항온처리했다. 그 다음, Ni-NTA를 여과하고, HBS/5mM 이미다졸로 세척했고, PROfusions™을 HBS/150mM 이미다졸로 용출시켰다. 샘플을 4 내지 20% Tris/글리신-SDS-PAGE를 통해 분석했고, 그 결과 정제가 성공적이었음을 시사 했다. PROfusion™ 분자 20pmol(약 1x1013 서열)을 각 선별의 유입물로서 사용할 것이다.
B. 선별용 선형 펩타이드 라이브러리 PP26
또한, 26개의 랜덤화 아미노산 위치를 보유한 특정 선형 펩타이드 라이브러리 PP26을 다음과 같은 작제물을 사용하여 설계했다:
T7-TMV-MGRGS-HHHHHH-ARS-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-DANAPK-ASAI (서열번호 19)
단백질 부분(길이가 50개인 아미노산)의 서열은 1문자 아미노산 코드로 나타냈고, 여기서 X는 임의의 아미노산을 나타낸다. 해독되지 않은 라이브러리의 부분에는 다음이 포함된다: (a) T7: 라이브러리의 최적 시험관내 전사를 위한 T7 프로모터; 및 (b) TMV: 라이브러리의 완전한 시험관내 해독을 위한 담배 모자이크 바이러스 해독 개시 서열. MGRGS는 구조적 가요성 링커를 나타낸다. HHHHHH (서열번호 20)는 PROfusion™ 라이브러리의 효과적인 친화성 정제를 위한 His6-태그를 나타낸다. ARS는 제2의 구조적 가요성 링커를 나타낸다. DANAPK(서열번호 21)는 제3의 구조적 가요성 링커를 나타낸다. ASAI는 퓨로마이신-수용체-분자와의 효과적인 커플링을 위한 최적화된 링커를 나타낸다.
당해 라이브러리는 단백질 표적에 대해 높은 친화성 결합인자를 생산하는 것으로 확인되었다. PP26 라이브러리는 크로마토그래피 친화성 시약의 선별에 있어서 탁월한 선택을 할 수 있게 하는 다음의 2가지 주요 장점을 겸비한다: 즉 높은 가요성(표적의 토폴로지에 부합할 수 있다) 및 보존적 구조의 부재로 인한 견고함(결과 적으로 생성되는 결합인자는 가혹한 생물리적 조건에 내성적이다).
1. 출발 올리고뉴클레오타이드의 PCR
겔 정제된 3개의 올리고를 사용하여 2개의 랜덤화 루프를 보유한 거마린 라이브러리를 작제했다. 1nmol의 PP26 주형(약 6x1014 서열) 5'-AGC GGA TGC CTT CGG AGC GTT AGC GTC SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN AGA TCT AGC ATG ATG ATG ATG A-3'(서열번호 22)을, 1μM의 5'-His-태그 프라이머 5'-TAA TAC GAC TCA TAG GGA CAA TTA CTA TTT ACA ATT ACA ATG GGA CGT GGC TCA CAT CAT CAT CAT CAT CAT GCT AGA TCT-3'(서열번호 23) 및 1 μM의 3'-프라이머 5'-AA TTA AAT AGC GGA TGC CTT CGG AGC GTT AGC-3'(서열번호 24)와 Taq-폴리머라제를 이용하여 6회 라운드의 PCR(94℃, 1분; 65℃, 1분; 72℃, 1분)로 증폭시키고, 2% 아가로스 겔을 통해 분석했다.
2. 시험관내 전사
dsDNA를 RiboMax Express 시험관내 전사 키트(제조원; Promega)를 사용하여 RNA로 전사시켰다. 37℃에서 45분간 항온처리한 후, DNaseI를 첨가하고, 15분간 더 37℃에서 항온처리했다. 이 혼합물을 페놀/클로로포름으로 추출하였다. 과량의 NTP를 NAP-5 겔 여과(Pharmacia)로 제거했다. 6%-TBU-겔을 통해 RNA 전사를 확인했다.
3. RNA와 퓨로마이신-올리고뉴클레오타이드 링커의 화학적 커플링
정제된 RNA는 1.5배 과량의 퓨로마이신-올리고뉴클레오타이드 링커 PEG2A18: 5'-프소랄렌-UAG CGG AUG C A18 (PEG-9)2 CC 퓨로마이신(서열번호 18; 이탤릭체로 표시된 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 유도체를 나타낸다)에 어닐링된다(85℃, 1분 ∧ 0.3℃/s의 속도로 25℃까지 냉각). 공유 결합은 자외선(365nm)을 RT에서 15분 동안 조사하여 실시했다. 이 반응은 6%-TBU 겔을 통한 반응 산물의 분석으로 확인했다.
4. 시험관내 해독
연결된 RNA는 15μCi 35S-메티오닌(1000 Ci/mmol)의 존재하에 토끼 망상적혈구 용해물(제조원: Promega)을 사용하여 해독했다. 30℃에서 30분간 항온처리한 후, KCl과 MgCl2를 각각 530mM과 150mM의 최종 농도로 첨가하고, 4 내지 20% Tris/글리신-SDS-PAGE를 통한 분석으로 해독을 확인했다.
5. 올리고-dT 정제
분자(mRNA-단백질 융합체)를 올리고 dT 자기 비드(Miltenyi)와 함께 항온처리 완충액(100mM Tris-HCl pH 8.0, 10mM EDTA, 1mM NaCl 및 0.25% Triton X-100)에서 4℃에서 5분 동안 항온처리하여 분리했다. PROfusion™ 분자는 MiniMACS-컬럼(Miltenyi)을 통해 여과하고, 항온처리 완충액으로 세척하고, 물로 용출시켜 분리했다. 샘플을 4 내지 20% Tris/글리신-SDS-PAGE 상에서 분석하여 반응을 확인했다.
6. 역전사
상응하는 cDNA 가닥을 SuperScript II 역전사효소(Gibco BRL)를 제조업자의 권장 조건하에서 5배 과량의 3'-프라이머와 함께 사용하여 역전사하여 수득했다. 샘플은 4 내지 20% Tris/글리신-SDS-PAGE를 통해 분석하여 전사를 확인했다.
7. His-태그 정제
역전사된 PROfusion™ 분자를 HBS 완충액(20mM HEPES pH7.0, 150mM NaCl, 0.025% Triton X-100, 100㎍/ml 전단된 연어 정자 DNA, 1mg/ml BSA) 중에서 Ni-NTA-아가로스(50㎕/10pmol PROfusion™)(QIAGEN)와 혼합하고 저속 진탕 하에 RT에서 60분 동안 항온처리했다. 그 다음, Ni-NTA를 여과하고, HBS/5mM 이미다졸로 세척했고, PROfusions™은 HBS/150mM 이미다졸로 용출시켰다. 샘플은 4 내지 20% Tris/글리신-SDS-PAGE를 통해 분석하여 반응을 확인했다. PROfusion™ 분자 20pmol(약 1x1013 서열)을 각 선별의 유입물로서 사용할 것이다.
C. 표적 제조
PROfusion™ 기술에서, 최대 1013개의 상이한 PROfusion™ 분자(mRNA-단백질 융합체)로 구성된 고도로 다양한 물질의 라이브러리를 높은 친화력 결합성을 나타내는 목적 표적(단백질, 당 또는 지질)에 대하여 선별한다. 이 과정에서, 표적은 일반적으로 고상에 고정된다. 이러한 고상은 선별 과정 동안 신속하고 효과적으로 취급할 수 있고 낮은 배경값을 제공하는 자기 비드가 바람직하다.
1. 뉴클레아제 활성에 대한 표적 시험
표적 - PRP 5㎍ 및 PT 0.5㎍을 4℃ 및 RT에서 0.12pmol의 방사능동위원소로 표지된 PROfusion™ 라이브러리 분자와 접촉시킨 다음, 각각 1시간 및 16시간 동안 항온처리했다. 항온처리 후 PROfusion™ 분자의 보전성을 4 내지 20% Tris/글리신 SDS-PAGE 및 후속 자동방사선사진촬영술로 확인했다. PROfusion™ 분자의 분해는 검출되지 않았고, 이는 표적에 뉴클레아제가 없음을 입증한다.
2. 프로테아제 활성에 대한 표적 시험
표적 - PRP 5㎍ 및 PT 0.5㎍을 4℃ 및 RT에서 정제된 GST-단백질 1㎍과 접촉시킨 다음, 각각 1시간과 16시간 동안 항온처리했다. 항온처리 후 GST-단백질의 보전성을 4 내지 20% Tris/글리신 SDS-PAGE 및 후속적 쿠마시 브릴리언트 블루 염색으로 분석했다. GST-단백질의 분해는 검출되지 않았고, 이는 표적에 뉴클레아제가 없음을 입증한다.
D. PT의 고정화
1. PT의 재구성
아벤티스 파스퇴르에서 입수한 침전물(2.26mg/ml) 500㎕를 RT에서 21,400xg로 45분 동안 원심분리했다. 상청액을 폐기시키고, 펠릿을 1100㎕ CTW-완충액(50ml MilliQ H2O에 첨가된 NaHCO3 0.286g, Na2CO3 0.170g, Tween-80 50㎕)에 용해시켰다. 이러한 PT 제제의 품질을 조사하기 위하여 연속 희석액(250ng, 500ng, 1㎍, 2.5㎍, 5㎍ 및 15㎍)을 4-12% BisTris SDS-PAGE(MES-완충액으로 전개)를 통해 분리했다. 서브유닛 S1(28kD), S2(23kD), S3(22kD) 및 S4(11.7kD)에 상응하는 적어도 4개의 밴드가 분명하게 분리되었다. PT-복합체 내의 가장 작은 단백질인 S5(9.3kD)는 관찰할 수 없었다. 아마도, 이 밴드는 이 겔 시스템에서 약간 더 큰 S4 서브유닛과 함께 동시 이동한 것으로 추정된다.
2. 커플링 전략
단백질을 자기 입자에 고정시키기 위해 여러 가지 방법을 확립하였다. 원칙 적으로 2가지 주요 전략이 사용된다: 표적 단백질의 1차 아미노 그룹 및 설프히드릴 그룹을 에폭시-활성화된 자기 비드(Dynal)에 공유 결속시켜, 안정한 아미드 또는 티오에테르 결합을 형성시킨다. 당해 반응은 반응 촉진을 위해 황산암모늄의 존재하에 실시하면, 그 결과 일반적으로 표적 단백질이 매우 효율적으로 커플링된다. 여하튼, 특정 단백질은 이러한 조건하에서 구조적 변화를 일으켜, 그 결과 결합되었지만 천연이고/이거나 불활성이 아닌 형태를 형성하는 것으로 보이며; 표적 단백질의 1차 아미노 그룹과 설프히드릴 그룹은 NHS-에스테르 활성화된 바이오틴 유도체(Pierce)에 공유 결속되고, 그 다음 이러한 바이오티닐화된 단백질이 스트렙타비딘 자기 비드(Dynal)에 고정화된다.
일반적으로, 표적 단백질의 에폭시 비드에 대한 공유 커플링은, 반응 조건이 소정의 표적에 적합하다면 바람직한데, 그 이유는 당해 방법이 비드 상에 표적만이 존재함을 보장하기 때문이다. 바이오틴/스트렙타비딘 커플링의 경우, 비드는 또한 선별 동안 항-스트렙타비딘 결합인자의 집적을 유도할 수 있는 스트렙타비딘을 제시해준다. 따라서, 필로스(Phylos)는 소정의 표적에 대한 고품질의 결과를 수득하기 위해 스트렙타비딘 결합인자에 대한 PROfusion™ 라이브러리의 안정성을 사전에 보장하는 특수화된 방법을 설계했다. 하지만, 종합적으로 볼 때, 공유 커플링은 일반적으로 표적 특이적 결합인자를 더 빠르게 집적시킨다. PT의 구체적 경우에, 황산암모늄 항온처리는 PT-단백질의 기능성에 영향을 미치지 않는 것으로 공지되어 있기 때문에, 공유 커플링 전략으로 시작하는 것이 가장 합리적이다.
3. 에폭시 비드(Dynal)에 대한 커플링 조건의 최적화
PT에 대한 커플링 조건은 수회의 독립적 실험을 통해 최적화했다(시간 의존성 및 온도 의존성(2분 내지 16시간; 8℃ 내지 RT)뿐만 아니라 상이한 황산암모늄 농도(0.5 - 2.0M) 및 다른 비드/표적 비율을 적용했다). 다음과 같은 반응 조건하에서 최상의 결과가 관찰되었다: PT 100㎍, 3.3x108개 비드 및 1M의 황산암모늄 최종 농도를 포함하는 최종 용적 300㎕를 2ml 에펜도르프 튜브에서 2분 내지 60분의 경과 시간에 따라 RT에서 항온처리했다. 항온처리 후, 튜브를 4분 동안 자석 위에 놓아서 비드를 침강시시키고, 후속적 겔 분석을 위해 상청액을 저장했다. 비드는 HEPES-완충액(20mM HEPES pH7.0, 150mM NaCl, 0.025% Triton-X100) 1ml로 세척하고, 비드의 분취량(비드의 5%)을 4-12% BisTris SDS-PAGE를 통해 분석하여 결합된 단백질의 양을 측정했다. 에폭시 비드에 대한 PT의 커플링은 단지 2분 반응 후에도 매우 효과적으로 일어난 것으로 관찰되었다.
4. 에폭시 비드에 대한 PT의 예비 커플링
무수 에폭시 활성화된 비드(M-270, Dynal) 2.6mg(약 1.7·108 비드)을 인산염 완충액(19mM NaH2PO4, 81mM Na2HPO4, pH 7.4) 1ml에 재현탁시키고, 10분 동안 평형화시켰다. 이러한 평형화를 새로운 인산염 완충액으로 2회 반복했다. 이어서, 비드를 1M 황산암모늄 중의 480pmol 재구성된 PT(CTW 완충액 중의 1㎍/㎕)와의 커플링 반응에 직접 사용했다(최종 용적 157㎕). 연속적 교반 하에 15분 동안 RT에서 항온처리한 후, 비드를 HBS-완충액 300㎕로 세척한 다음, HEPES-완충액으로 3회 세척하고, 마지막에 240㎕ HEPES-완충액에 재현탁시켜 분취량으로서 4℃에 저장했다. 커플링 반응의 유효성은 모든 세척 분획, 커플링 반응의 상청액, 및 세척된 비드로부터 SDS-부하 완충액에 의해 제거될 수 있는 PT 분획을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 분석하여 조사했다.
5. 에폭시-비드 고정화된 PT의 아시알로페투인에 대한 결합성 분석
PT 유도체화된 비드 40㎕를 HEPES-완충액(20mM HEPES pH 7.0, 150mM NaCl, 0.025% Triton-X100) 중의 320pmol 아시알로페투인과 함께 RT에서 1시간 동안 항온처리하고(최종 반응 용적 200㎕), 200㎕ HEPES-완충액으로 2 내지 7회 세척하고, 마지막에 30㎕ HEPES-완충액에 재현탁시켰다. 비드 50%를 SDS-PAGE를 통해 분석하여 반응을 확인했다.
이러한 PT-유도체화된 비드를 4℃에서 1주 동안 저장한 후 시험한 결과, 아시알로페투인의 감소된 결합능이 관찰되었으며, 이는 이 물질이 장기간 저장으로 인해 성능이 저하됨을 시사한다. 따라서, PT 유도체화된 비드는 각 선별 라운드마다 새로이 제조되고 품질이 조절되어야 한다. 이러한 과정이 매우 시간 소모적이기 때문에, PT 바이오티닐화를 수반한 대안적인 고정화 전략을 평가하였다.
6. PT의 반-예비 바이오티닐화
바이오티닐화 반응을, 0.4mg(약 3.65nmol)의 재구성된 PT(CTW 완충액 중의 1㎍/㎕)와 25㎍ EZ-연결-설포-NHS-LC-LC-바이오틴(PIERCE)을 최종 용적 740㎕의 50mM HEPES, 150mM NaCl, 0.2% Triton-X100 중에서 항온처리하여 수행했다. 지속적인 교반하에 빙상에서 2시간 동안 항온처리한 후, 1M Tris/HCl(pH7.0)을 74㎕ 첨가하여 바이오티닐화 반응을 퀀칭시켰다. 이어서, 단백질을 Slide-a-lyzer 카세 트(PIERCE, 3500MWCO 0.5-3ml)를 사용하여 4℃에서 HEPES-완충액(20mM HEPES pH 7.0, 150mM NaCl, 0.025% Triton X100)에 대해 투석하여 과량의 바이오티닐화 시약을 제거했다. 바이오티닐화된 PT를 투석 카세트로부터 취하여 분취량으로서 -20℃에 저장했다.
7. BIAcore 기기를 이용한 바이오티닐화된 PT의 품질 조절
바이오티닐화 반응의 품질은 BIAcore 기기(BIAcore 2000)를 이용하여 BIAcore 스트렙타비딘 칩과 바이오티닐화된 PT의 상호작용을 분석하여 조절했다. 또한, 칩에 고정화된 바이오티닐화된 PT에 대한 아시알로페투인의 결합성을 측정하는 것도 가능하다(고정화된 PT에 대한 약 400RU의 결합 시그널; 대조군 세포에 대한 약 100RU의 비특이적 결합)
F. 스트렙타비딘 자기 비드 및 아시알로페투인에 대한 바이오티닐화된 PT의 결합 분석
1. 스트렙타비딘 자기 비드에 대한 바이오티닐화된 PT의 결합성
스트렙타비딘 자기 비드(Dynal) 20㎕를 1xHBS-완충액(20mM HEPES pH 7.0, 150mM NaCl, 1mg/ml BSA, 100㎍/ml 연어 정자 DNA, 0.025% Triton-X100) 중의 바이오티닐화된 PT 20pmol과 실온에서 1시간 동안 항온처리하고, HEPES-완충액(20mM HEPES pH 7.0, 150mM NaCl, 0.025% Triton X100)으로 3회 세척하고, SDS 겔 부하 완충액 16㎕에 재현탁시켰다. 접합을 확인하기 위하여 8㎕를 SDS-PAGE로 분석했다. 비교 조건하의 음성 대조군 실험에서 유리 PT(바이오티닐화되지 않음)는 스트렙타비딘 자기 비드와 상호작용하지 않았다.
2. 비드에 고정화된 바이오티닐화된 PT에 대한 아시알로페투인의 결합성
스트렙타비딘 자기 비드(Dynal) 20㎕를 1x HBS 완충액 중의 20pmol의 바이오티닐화된 PT와 실온에서 1시간 동안 항온처리하고, HEPES-완충액(20mM HEPES pH 7.0, 150mM NaCl, 0.025% Triton X100)으로 4회 세척했다. 그 다음, 바이오티닐화된 PT가 고정화된 비드를 HEPES-완충액 중의 40pmol 아시알로페투인과 함께 실온에서 1시간 동안 항온처리했다. HEPES-완충액으로 4회 세척한 후, 비드를 SDS 겔 부하 완충액 16㎕에 재현탁시켰다. 8㎕를 SDS-PAGE를 통해 분석하여 결합을 확인했다. 일련의 항온처리 대신에 스트렙타비딘 자기 비드에 대한 바이오티닐화된 PT 및 아시알로페투인의 동시 항온처리에서도 바이오티닐화된 PT에 대한 아시알로페투인의 결합이 초래되었다. 비교용 대조 실험에서는 아시알로페투인이 비특이적으로 스트렙타비딘 자기 비드와 상호작용하지 않는 것으로 측정되었다. -20℃에서 1주 동안 저장된 바이오티닐화된 PT의 품질 대조군은 스트렙타비딘 및/EH는 아시알로페투인 결합 능력의 유의적 감소를 전혀 나타내지 않았다. 따라서, 바이오티닐화된 PT는 후속적 선별에서 표준 표적으로 사용했다.
실시예 2
PT에 선택적인 펩타이드의 분리
거마린 PROfusion™ 라이브러리와 자기 비드에 고정화된 PT를 엄격하게 조절되는 엄격성 조건(stringent condition)하에서 접촉시켰다. 이러한 조건은 PT에 대해 상승된 친화성을 나타내는 PROfusion™ 라이브러리의 변이체가 주로 표적에 결합되게 한다. 원치않는 비특이적 결합 변이체를 희석시키는 충분한 세척 후, 결합 된 PROfusion™ 분자를 비드로부터 용출시키고 도 2에 도시한 바와 같이 새로운 PROfusion™ 형성 사이클로 처리했다. 엄격성 조건을 적절히 적합화시키면서 연속적 선별을 수행하고 재증폭시킴으로써, 소정의 표적에 대한 고도로 특이적인 결합 분자의 집단을 집적시킨다(10). 이어서, 이 집단의 DNA 부분을 이. 콜라이(E. coli) 플라스미드에 클로닝하여 각 변이체를 분리하고, 이 변이체는 서열분석을 통해 상세하게 분석할 수 있다.
고정화된 PT에 대해 6회의 연속 선별 라운드를 거마린 PROfusion™ 라이브러리를 사용하여 실시했다. 전술한 인식에 따라, 스트렙타비딘 비드에 고정화된 바이오티닐화된 PT를 본 선별에 사용했다(표 1). 선별 라운드 4에서, 스트렙타비딘 비드에 대한 거마린 풀(pool)의 낮은 배경 결합이 관찰되었는데, 이러한 배경 결합은 비드 및/또는 스트렙타비딘 결합성 거마린 변이체의 초기 집적을 나타낼 수 있다. 따라서, 이후 5회의 선별 라운드에서는 2회의 개별적인 선별을 각각 표적 및 에폭시 비드 커플링된 PT로서 바이오틴/스트렙타비딘 고정화된 PT를 사용하여 실시했다. 두 선별 모두에서, 표적 결합의 명백한 배경값 보정된 집적이 관찰되었다(표 1). 이러한 경향은 바이오틴/스트렙타비딘 고정화된 PT를 사용한 6번째 선별 라운드에서 확인되었는데, 여기서는 PT 결합성 변이체의 축적이 분명하게 나타났다(표 1).
Figure 112006035201269-pct00003
A. 선별된 거마린 결합인자 풀의 클로닝
선별 라운드 R4, R5 및 R6에서 수득된 거마린 DNA 풀을 TOPO TA Cloning® 키트(Invitrogen)를 사용하여 pCR®2.1-TOPO®-벡터에 클로닝했다. 거마린 DNA를 여러 농도에서 pCR®2.1-TOPO®-벡터에 연결시켰다. 6㎕ 반응물 중에서, 0.5㎕, 2㎕ 및 4㎕의 거마린 풀 DNA를 각각 사용했다. 연결은 제조업자의 지시에 따라 실시했다.
이러한 연결물 2㎕을 사용하여 이. 콜라이 Top 10 F' 적격성 세포(Invitrogen) 20㎕를 형질전환시키고, 카나마이신 50㎍/ml와 0.5% 글루코스를 함유하는 LB 평판에 도말했다. 이러한 각 형질전환체로부터 150개의 단독 콜로니를 채취하여, T7 의존적 단백질 발현을 억제하기 위해 0.5% 글루코스와 50㎍/ml 카나마이신을 함유하는 마스터 평판으로, 청백색 스크리닝을 위해 X-Gal 및 IPTG를 함유하는 제2 평판으로 옮겼다. 각 형질전환마다, 청백색 시험으로부터의 백색 콜로니에 상응하는 억제된 마스터 평판으로부터의 콜로니 96개를 96웰 LB 한천 평판과 500㎕ 액체 배양액(카나마이신 50㎍/ml와 0.5% 글루코스를 함유하는 LB)에 접종했다. 96웰 한천 평판은 서열분석 서비스 회사로 보냈다. 액체 배양물을 40% 글리세롤 500㎕와 혼합하여 액체 질소 중에서 동결시키고, -80℃에 저장했다.
각 클론으로부터, 플라스미드 DNA를 제조하여 M13-프라이머 5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3'(서열번호 25)를 이용한 자동화 DNA 서열분석 과정으로 분석했다. 도 3 내지 8에 도시한 바와 같이, 하나의 거마린 서열 변이체가 선별 라운드 4에서 유의적으로 집적되기 시작했고, 선별 라운드 6 이후에는 전체 서열 중 90%를 초과하는 서열을 나타냈다. 이러한 결과는 상기 변이체가 아마도 PT에 대해 최고의 친화성으로 결합할 것이라는 것을 시사한다. 이러한 가장 주된 서열 변이체 외에도, 공통적인 서열 모티프를 부분적으로 공유하는 다양한 다른 거마린 서열이 집적되었다. 이러한 발견은 상기 다른 서열들도 또한 PT에 대해 친화성을 나타냄을 시사한다.
B. 고정화된 PT에 대한 PP26 친화성 선별
거마린 선별과 병행하여 고정화된 PT에 대한 연속적인 6회의 선별 라운드를 PP26 PROfusion™ 라이브러리로 실시했다. 스트렙타비딘 비드에 고정화된 바이오티닐화된 PT를 본 선별에 사용했다(표 2). 선별 라운드 4에서, 비드 및/또는 스트렙타비딘에 결합한 PP26 변이체의 초기 집적을 나타내는 것일 수도 있는 스트렙타비딘 비드에 대한 거마린 풀의 낮은 배경 결합성이 관찰되었다. 따라서, 이후 5회째 선별 라운드에서는 표적으로서 바이오틴/스트렙타비딘 고정화된 PT를 사용하고 에폭시 비드 커플링된 PT를 사용하는 2회의 개별적 선별 시험을 실시했다. 두 선별 모두에서, 표적 결합의 명백한 배경값 보정된 집적이 검출되었다(표 2). 이러한 경향은 바이오틴/스트렙타비딘 고정화된 PT를 사용한 6회째 선별 라운드에서 확인되었고, 이는 PT 결합성 변이체의 축적을 분명하게 보여준다.
Figure 112006035201269-pct00004
C. 선별된 PP26 결합인자 풀의 클로닝
선별 라운드 R4, R5 및 R6에서 수득한 PP26 DNA 풀을, TOPO TA Cloning® 키트(Invitrogen)를 이용하여 pCR®2.1-TOPO®-벡터에 클로닝했다. PP26 DNA를 여러 농도에서 pCR®2.1-TOPO®-벡터에 연결시켰다. 6㎕ 반응물 중에서, 0.5㎕, 2㎕ 및 4㎕의 거마린 풀 DNA를 각각 사용했다. 연결은 제조업자의 지시에 따라 실시했다. 이러한 연결물 2㎕을 사용하여 이. 콜라이 Top 10 F' 적격성 세포(Invitrogen) 20㎕를 형질전환시키고, 카나마이신 50㎍/ml와 0.5% 글루코스를 함유하는 LB 평판에 도말했다. 이러한 각 형질전환체로부터 150개의 단독 콜로니를 채취하여, T7 의존적 단백질 발현을 억제하기 위해 0.5% 글루코스와 50㎍/ml 카나마이신을 함유하는 마스터 평판으로, 청백색 스크리닝을 위해 X-Gal 및 IPTG를 함유하는 제2 평판으로 옮겼다. 각 형질전환마다, 청백색 시험으로부터의 백색 콜로니에 상응하는 억제된 마스터 평판로부터의 콜로니 96개를 96웰 LB 한천 평판과 500㎕ 액체 배양액(카나마이신 50㎍/ml와 0.5% 글루코스를 함유하는 LB)에 접종했다. 96웰 한천 평판은 서열분석 서비스 회사로 보냈다. 액체 배양물을 40% 글리세롤 500㎕와 혼합하여, 액체 질소 중에서 동결시키고, -80℃에 저장했다.
D. 각 결합인자 변이체의 서열분석
각 개별 클론으로부터, 플라스미드 DNA를 제조하여 M13-프라이머 5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3'(서열번호 25)를 이용한 자동화 DNA 서열분석 과정으로 분석했다. 도 9 내지 14에 도시한 바와 같이, 2개의 주요 변이체가 선별 라운드 동안 집적되었다. 두 변이체는 공통된 보존적 서열 모티프를 공유했다. 이러한 발견은 보존적 아미노산의 측쇄가 아마도 특정 PT 표면 영역과 직접적인 상호작용을 형성할 것이라는 것을 시사한다. 더욱이, 적어도 4개의 추가 변이체가 더 소량으로 집적되었다. 이러한 변이체는 전술한 보존적 서열 모티프를 포함하지 않으므로, 이러한 변이체들은 아마도 PT의 다른 표면 영역에 결합하는 것으로 추정될 수 있다.
E. 선별된 PT-결합 거마린- 및 PP26-변이체의 확인
선별을 PROfusion™ 분자-mRNA-펩타이드 융합체를 사용하여 수행하였기 때문에, 선별 후 분석의 제1 단계에서는 유리 펩타이드를 표적에 결합하는 능력에 대해 조사하는 것이 필요하다. 다음 단계에서는 핵산 부분이 아닌 펩타이드를 통해 표적과 결합을 형성하는 변이체들을 AP 공정 유체의 존재하에 특이성 시험을 실시했다. 이러한 시험에 의해 AP 공정에 가장 적합한 변이체들이 동정되어야 한다.
1. PT에 대한 결합능을 나타내는 유리 펩타이드 시험
1회 집적된 거마린- 및 PP26 결합인자 변이체들의 유리 펩타이드들을 결합성에 대해 정성 분석하기 위하여 TNT T7이 커플링된 망상적혈구 용해물 시스템(Promega #L5540)을 다음과 같이 사용했다. 단일 결합인자 후보들의 DNA를 결합인자 클론의 글리세롤 스톡 중에서 콜로니-PCR을 통해 증폭시켰다. PCR 동안의 돌연변이를 피하기 위하여 프루프리딩(proofreading) 폴리머라제(Pwo)를 사용했다. 상기 PCR 산물을 2% 아가로스 겔을 통해 분석했다. PCR 산물 5.0㎕를, TNT 시스템을 이용한 커플링된 시험관내 전사/해독 반응의 주형으로서 제조업자의 지침에 따라 최종 용적을 53㎕로 하여 사용했다. 그 다음, 발현된 결합인자 후보들을 Ni-NTA 킬레이트 크로마토그래피(QIAGEN)로 정제했다. 방사능동위원소로 표지된 His-태그 정제된 결합인자 후보(각 펩타이드 약 40 내지 70fmol)를 스트렙타비딘-자기 비드 상에 고정된 바이오티닐화된 PT와 함께 실온에서 1시간 동안 항온처리했다. 비드를 HBS 완충액으로 3회 세척하고, 그 다음 물에 재현탁시키고, 액체 신틸레이션 계수법으로 분석했다. 대조 실험으로서, 각 후보들을 오직 스트렙타비딘 비드(PT 없이)와 함께 항온처리했다. PP26 및 거마린의 최상의 결합인자 후보들이 동정되었고(이하, 표 3 및 표 4), 다음 특이성 시험에 사용했다.
2. 공정 유체의 존재하에 거마린 및 PP26 변이체의 특이성 시험
아벤티스 파스퇴르 공정 유체의 존재하에 유리 거마린 및 PP26 펩타이드들에 대한 반정량적 결합성 및 특이성 분석을 위해, 먼저 PROfusion™에 따라 펩타이드를 생산하고, 균질해질 때까지 정제하고, S1 뉴클레아제 분해를 통해 유리 펩타이드로 전환시켰다. 선별된 결합인자 변이체들(거마린 클론 10개와 PP26 클론 7개)의 DNA를 충분한 양으로 증폭시키기 위해, 주형으로서 TNT 발현 유래의 PCR 산물을 사용하여 PCR을 실시했다. 10회 사이클의 PCR(94℃, 30초; 60℃, 30초; 72℃, 30초) 후, 샘플을 2% 아가로스 겔을 통해 분석했다. dsDNA(PCR 산물)를 RiboMax Express 시험관내 전사 키트(제조원: Promega)를 사용하여 RNA로 전사시켰다. 37℃에서 45분 동안 항온처리한 후, DNaseI를 첨가하고, 37℃에서 항온처리를 추가 15분 동안 계속했다. 이 혼합물을 페놀/클로로포름으로 추출했다. 과량의 NTP는 NAP-5 겔 여과(Pharmacia)로 제거했다. RNA를 6%-TBU-겔을 통해 분석했다.
정제된 RNA를 1.5배 과량의 퓨로마이신-올리고뉴클레오타이드 링커 PEG2A18: 5'-프소랄렌-UAG CGG AUG C A18 (PEG-9)2 CC 퓨로마이신(이탤릭체로 표시된 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 유도체를 나타낸다; 서열번호 17)에 어닐링시켰다(85℃, 1분 ∧ 0.3℃/s의 속도로 25℃까지 냉각). 공유 커플링은 자외선(365nm) 하에 RT에서 15분 동안 조사하여 실시했다. 이 반응 산물은 6%-TBU 겔을 통해 분석했다. 연결된 RNA를 15μCi S-메티오닌(1000 Ci/mmol)의 존재하에 토끼 망상적혈구 용해물(제조원: Promega)을 사용하여 해독했다. 30℃에서 30분간 항온처리한 후, KCl 및 MgCl2를 각각 최종 농도 530mM 및 150mM로 첨가하고, 샘플을 4 내지 20% Tris/글리신-SDS-PAGE를 통해 분석했다. mRNA-단백질 융합체(PROfusions™)를 항온처리 완충액(100mM Tris-HCl pH 8.0, 10mM EDTA, 1mM NaCl 및 0.25% Triton X-100)에서 올리고 dT 자기 비드(Miltenyi)와 4℃에서 5분 동안 항온처리하여 분리했다. PROfusion™ 분자를 MiniMACS 컬럼(Miltenyi)을 통해 여과하여 분리한 다음, 항온처리 완충액으로 세척하고, 물로 용출시켰다. 샘플을 4 내지 20% Tris/글리신-SDS-PAGE를 통해 분석했다.
mRNA-단백질 융합체의 mRNA 부분을 제거하기 위해 올리고 dT 정제된 분자를 제조업자의 지침에 따라 S1 뉴클레아제(S1 뉴클레아제는 퓨로마이신 링커의 DNA 부분을 절단한다)를 이용하여 절단했다. S1 절단 전과 후에 PROfusion 분자의 샘플을 4-12% Bis/Tris SDS-PAGE를 통해 분석했다. 스트렙타비딘 비드(M280 Dynal)를 HBS로 세척하고 4℃에서 하룻밤 동안 항온처리했다. 바이오티닐화된 PT(900pmol)를 900㎕ Strepbead(HBS 완충액에서 예비차단된)와 함께 RT에서 1시간 동안 항온처리했다. PT 고정화 후, 비드를 바이오틴(HBS 중의 2mM 바이오틴)으로 1분 동안 차단시킨 다음, 즉시 HBS 완충액으로 4회 세척하여 미량의 바이오틴을 제거하였다. 대조군 비드(PT 없이)는 동일한 방법으로 바이오틴으로 차단시켰다.
선별된 펩타이드의 결합 분석을 위해, 다음과 같은 여러 동등한 반응을 설정하였다: 바이오틴 차단된 스트렙타비딘 비드만을 함유한 음성 대조군; 스트렙타비딘 비드에 PT를 고정시킨 양성 대조군; 1/4 용적의 아벤티스 파스퇴르 샘플-용액 C와 혼합된 바이오틴 차단된 비드의 배경 대조군(통류물 1. AF 컬럼); 1/4 용적의 샘플-용액 C와 혼합된 PT 혼합물; 1/4 용적의 아벤티스 파스퇴르 샘플-용액 E(배양 배지)와 혼합된 바이오틴 차단된 비드의 배경 대조군; 1/4 용적의 샘플-용액 E와 혼합된 PT 혼합물; 아벤티스 파스퇴르에서 입수한 샘플의 존재하에 PT에 특이적으로 결합하는 선별된 펩타이드의 성능을 조사하기 위하여 반응을 3 내지 6회 실시했다. 결합은 펩타이드의 분해를 피하기 위해 프로테아제 억제제 혼합물(완전한 mini™ ROCHE)의 존재하에 RT에서 1시간 동안 실시했다. HBS 용액으로 세척한 후, 비드를 신틸레이션 계수기로 분석했다.
표 3에 제시한 바와 같이, 시험된 10개의 거마린 변이체 중에서 3개(#9, 10, 19)는 AP 공정 유체에 의해 전혀 영향을 받지 않는 PT에 대한 표적 결합을 나타냈다. 이러한 변이체들은 AP 공정에 따른 친화성 크로마토그래피 용도의 가장 바람직한 후보들이다.
표 4에 제시한 바와 같이, 시험된 7개의 PP26 변이체 중 3개(5번, 6번, 9번)는 AP 공정 유체에 의해 감소되지 않는 PT에 대한 표적 결합성을 나타냈다. 이러한 변이체들은 AP 공정에 따른 친화성 크로마토그래피 적용에 가장 바람직한 후보들이다.
거마린 변이체의 선별후 분석*
번호 서열번호 펩타이드 서열 시험 1 시험 2 서열번호
1 194227 MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCAGSVGHCCEPLECLRRFLNLRWCGSGSSGSS - n.d. 26
2 194238 MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCIVMRAPCCEPLECLRRYMLKHMCGSGSSGSS - n.d. 27
3 194239 MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCKAFRYSCCEPLECLRKWLKARFCGSGSSGSS - n.d. 28
4 194251 MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCLRSSIDCCEPLECLYKWMQRRLCGSGSSGSS - n.d. 29
5 194210 MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCWPRRHKCCEPLECLLEMLERKRCGSGSSGSS - n.d. 30
6 194261 MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCMSMACVCCEPLECKYHGYFWLCGSGSSGSS - n.d. 31
7 194214 MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCAVWFDVCCEPLECTYQSGYYWLCGSGSSGSS - n.d. 32
8 194226 MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCEPWYWRCCEPLECVYTSGYYYSCGSGSSGSS - n.d. 33
9 194259 MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCARWDLVCCEPLECIYTSELYATCGSGSSGSS ∨ ∨ 34
12 194297 MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCVFYFPNCCEPLECRWVNDNYGWCGSGSSGSS ∨ - 35
13 194330 MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCMSMACVCCEPLECKYHGYFWLCGSGSSGSS ∨ - 36
14 194479 MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCTTASKSCCEPLECKWTNEHFGTCGSGSSGSS ∨ - 37
15 194511 MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCSQSVPMCCEPLECKWFNENYGICGSGSSGSS ∨ - 38
16 194533 MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCARWDLVCCEPLECIYTSELYATCGSGSSGSS ∨ - 39
17 194486 MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCARWDLVCCEPLECLGHGLGYAYCGSGSSGSS - n.d. 40
18 194668 MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCMWSREVCCEPLECYYTGWYWACGSGSSGSS - - 41
10 194264 MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCELAVDECCEPLECFQMGHGFKRCGSGSSGSS ∨ ∨ 42
19 194737 MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCELAVDECCEPLECTKGDLGFRKCGSGSSGSS ∨ ∨ 43
20 194716 MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCELAIDVCCEPLECLGHGLGYAYCGSGSSGSS ∨ n.d. 44
21 194720 MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCELAIDVCCEPLECLGHGLGYAYCGSGSSGSS - - 45
11 194328 MHHHHHHSGSSSGSGCVKKDELCNWVTPMRCEPLECLGHGLGYAYCGSGSSGSS ∨ n.d. 46

* 시험 1은 유리 펩타이드의 표적 결합성을 나타내고(0)
시험 2는 AP 공정 유체의 존재하에 변이체의 결합 특이성을 나타낸다(0).
두 시험 모두에서 양성인 변이체는 9, 10 및 19이다.
PP26-변이체의 선별후 분석*
번호 서열번호 펩타이드 서열 시험 1 시험 2 서열번호
1 197569 MGRGSHHHHHHARSDWELSPPHVAITTRHLINCTDGPLLRDANAPKASAI - n.d. 47
2 197536 MGRGSHHHHHHARSLNGESTSNILTTSRKVTEWTGYTASVDANAPKASAI - n.d. 48
3 197611 MGRGSHHHHHHARSQVTWHHLADTVTTKNRKCTDSYIGWNXANAPKASAI - n.d. 49
4 197530 MGRGSHHHHHHARSIIVIHNAIQTHTPHQVSIWCPPKHNRDANAPKASAI - n.d. 50
5 197557 MGRGSHHHHHHARSSHCRHRNCHTITRGNMRIETPNNIRKDANAPKASAI ∨ ∨ 51
6 197596 MGRGSHHHHHHARSTMNTNRMDIQRLMTNHVKRDSSPGSIDANAPKASAI ∨ ∨ 52
7 197552 MGRGSHHHHHHARSLSALRRTERTWNTIHQGHHLEWYPPADANAPKASAI - n.d. 53
8 197541 MGRGSHHHHHHARSWTSMQGETLWRTDRLATTKTSMSHPPDANAPKASAI - n.d. 54
9 197588 MGRGSHHHHHHARSNVIPLNEVWYDTGWDRPHRSRLSIDDDANAPKASAI ∨ ∨ 55
10 197635 MGRGSHHHHHHARSCLATRNGFVMNTDRGTYVKRPTVLQDANAPKASAI ∨ - 56
11 197797 MGRGSHHHHHHARSWGLSGTQTWKITKLATRLHHPEFETNDANAPKASAI - n.d. 57
12 197888 MGRGSHHHHHHARSWRWHNWGLSDTVASHPDASNSLNMMYDANAPKASAN - n.d. 58
13 197897 MGRGSHHHHHHLDLWGPPSGSPRTRSTTGTSTTSSPSTPGTLTLRRHPH - n.d. 59
14 197825 MGRGSHHHHHHARSWQPEVKMSSLVDTSQTVGAAVETRTTDANAPKASA ∨ - 60
15 198000 MGRGSHHHHHHARSWRDTRKLHMRHYFPLAIDSYWDHTLRDANAPKASAI ∨ - 61
16 197983 MGRGSHHHHHHARSWTSMQGETLWRTDRLATTKTSMSHPPDANAPKASAI - n.d. 62
17 197998 MGRGSHHHHHHHARSPLWYHYNCWDTICLADWLKDRPHGVYDANAPKASA - n.d. 63
18 197947 MGRGSHHHHHHARSVGTTIRIAQDTEHYRNVYHKLSQYSRDANAPKASAI ∨ - 64
19 197954 MGRGSHHHHHHARSVGTTIRIAQDTEHYRNVYHKLSQYSRDANAPKASAI - n.d. 65
20 197971 MGRGSHHHHHHARSNVIPLNEVWYDTGWDRPHRSRLSIDDDANAPKASAI - n.d. 66

* 시험 1은 유리 펩타이드의 표적 결합성을 나타내고(0), 시험 2는 AP 공정 유체의 존재하에 변이체의 결합 특이성을 나타낸다(0). 두 시험 모두에서 양성인 변이체는 5, 6 및 9이다.
F. 화학적 합성에 의해 펩타이드 생산
8가지 다른 펩타이드를 N-말단 바이오티닐화된 펩타이드 형태로서 화학적 합성하여 제조하였다. 바이오틴 그룹은 짧은 친수성 링커(PEG2 = 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산)를 통해 이격시켰다. 이러한 8개 펩타이드 중 2개(PP26-5c 및 거마린-9c)는 C 말단-태그된 바이오티닐화된 펩타이드 형태(추가 C-말단 리신을 통해)로 추가 합성했다. 이러한 펩타이드들을 쉐퍼드에 따른 Fmoc/But 전략을 사용하여 자동화 합성하고, HPLC로 정제하고 동결건조시켰다. 정제된 모든 펩타이드의 품질은 질량 분광분석법으로 확인했다. 각 펩타이드 합성의 표적 함량은 정제된 펩타이드 5mg이었다. 정제 후 합성 펩타이드의 수율 및 순도는 표 5에 개략하여 나타냈다.
백일해 독소 결합 펩타이드의 펩타이드 합성*
선별 클론 서열번호 서열 순도 (%) 수율 (mg) 서열번호
pp26 5 c 197557-1 RSSHCRHRNCHTITRGNMRIETPNNIRKDAK 90 - 95 7,7 67
pp26 5 n 197557-2 RSSHCRHRNCHTITRGNMRIETPNNIRKDA 90 - 95 7,6 68
pp26 6 n 197596-1 RSTMNTNRMDIQRLMTNHVKRDSSPGSIDA 90 - 95 6,3 69
pp26 9 n 197588-1 RSNVIPLNEVWYDTGWDRPHRSRLSIDDDA 90 - 95 5,8 70
pp26 15n 198000-1 RSWRDTRKLHMRHYFPLAIDSYWDHTLRDA 90-95 4,8 71
gurmarin 9 c 194259-1 SGCVKKDELCARWDLVCCEPLECIYTSELYATCGK 70 1,0 72
gurmarin 9 n 194259-2 SGCVKKDELCARWDLVCCEPLECIYTSELYATCG 80 - 90 4,0 73
gurmarin 10 n 194264-1 SGCVKKDELCELAVDECCEPLECFQMGHGFKRCG 90 - 95 4,9 74
gumarin 15n 194511-1 SGCVKKDELCSQSVPMCCEPLECKWFNENYGICGS 90-95 6,3 75
gurmarin 19 n 194737-1 SGCVKKDELCELAIDECCEPLECTKGDLGFRKCG 90 - 95 6,7 76

* 클론 명칭 중 약어 c는 C-말단 바이오티닐화된 펩타이드를 나타내고, 약어 n은 N-말단 바이오티닐화된 펩타이드를 나타낸다.
pp26 펩타이드는 모두 100mM HEPES, pH 7.4, 200mM NaCl에 100μM의 최종 농도로 용해시켰다. 거마린 펩타이드는 모두 100mM HEPES, pH 7.4, 200mM NaCl, 2mM GSH, 1mM GSSG에 최종 농도 100μM로서 용해시키고, 이어서 구조적 폴딩이 이루어도록 적어도 48시간 동안 질소하에 항온처리했다.
삭제
G. 세균성 발현에 의한 펩타이드 생산
백일해 독소에 대한 결합인자로서 동정된 펩타이드를 글루타티온-S-트란스퍼라제(GST)에 프레임내 서브클로닝하고 세균에서 발현시켰다. GST-태그는 가용성을 증가시키고 글루타티온 세파로스를 이용한 정제를 가능케한다. 특이적 PreScission™ 프로테아제에 의해 인식되는 조작된 프로테아제 절단 부위는 GST-태그를 제거하여 펩타이드를 방출시킨다. PreScission™ 프로테아제 자체는 GST와 사람 리노바이러스(HRV) 14형 3C 프로테아제의 융합 단백질로서, Gln과 Gly 잔기 사이의 서열 Leu-Phe-Gln*Gly-Pro 절단을 특이적으로 인식한다. 절단 후, 미절단 산물 및 프로테아제는 글루타티온 세파로스를 이용하여 절단 반응물로부터 제거할 수 있다.
H. 발현 벡터의 작제
1. pp26 변이체의 GST 융합체 작제
PCR용 주형으로서, PT에 대해 동정된 pp26 결합인자의 서열을 함유하는 pCR2.1 벡터를 사용하였다. Pwo DNA 폴리머라제(Roche)와 올리고뉴클레오타이드 #467(5'-CATGCCATGGGACGTGGCTCACATCATC-3'; 서열번호 77) 및 #468(5'-포스페이트-GGGTTAAATAGCGGATGCCTTCGGAGCGTTAGCGTC-3'; 서열번호 78)를 사용하여 PCR에서 수득한 산물을 NcoI(New England Biolobs)로 분해했다. 변형된 벡터(추가 NcoI 부위를 함유하는 pGEX6P(Amersham/Pharmacia)를 NcoI/SmaI(New England Biolobs)로 절단하고, 이 벡터의 NcoI/SmaI 부위에 PCR 산물을 직접 클로닝했다. TOP10(Invitrogen)에 형질전환 후, 양성 클론을 콜로니 PCR로 동정하고 서열분석으로 확인했다.
2. 거마린 변이체의 GST 융합체의 작제
PCR 주형으로서, PT에 대해 동정된 거마린 결합인자의 서열을 함유하는 pCR2.1 벡터를 사용하였다. Pwo DNA 폴리머라제(Roche)와 올리고뉴클레오타이드 #464(5'-GGAGATCTCATATGCACCATCACCATCACCATAGTGGC-3'; 서열번호 79) 및 #465(5'-포스페이트-GGGTTAAATAGCGGATGCTACTAGGC-3'; 서열번호 80)를 사용하여 PCR에서 수득한 산물을 NdeI(New England Biolobs)로 분해했다. 변형된 벡터(추가 NdeI 부위를 함유하는 pGEX6P(Amersham/Pharmacia))를 NdeI/SmaI(New England Biolobs)로 절단하고, 이 벡터의 NdeI/SmaI 부위에 PCR 산물을 직접 연결시켰다. TOP10(Invitrogen)에 형질전환 후, 양성 클론을 콜로니 PCR로 동정하고 서열분석으로 확인했다(표 6).
Figure 112006035201269-pct00008
3. GST-pp26 융합체의 발현 및 정제
세균 균주 Rosetta(DE3) pLysS(Novagen)를 플라스미드 DNA로 형질전환시켰다(표 참조). pp26 변이체의 형질전환체를 37℃ 및 250rpm에서 약 0.5의 OD500까지 증식시키고, 1mM IPTG를 첨가하여 4시간 동안 유도시켰다. 거마린-GST 융합체의 경우에는, 유도를 0.33mM IPTG를 사용하여 2.5시간 동안 실시했다. 세균을 수거한 후, 세포를 1mM 2-머캅토에탄, 프로테아제 억제제 및 1mM 리소자임을 함유하는 PBS-KMT(10mM 인산나트륨 pH 7.5, 130mM NaCl, 3mM KCl, 1mM MgCl, 0.1% Tween-20)에 재현탁시키고, RT에서 30분 동안 항온처리하고, 초음파처리로 붕괴시켰다. 원심분리 후 가용성 상청액을 정제용 GSG 세파로스 컬럼으로 옮겼다. 20mM Hepes pH 7.5, 150mM NaCl 10개의 컬럼 용적으로 컬럼을 세척한 후, GST 융합 단백질을 20mM GSH로 용출시키고 SDS 겔을 통해 분석하여 발현을 확인했다.
4. PreScission™ 프로테아제를 이용한 절단에 의한 GST 태그의 제거를 통한 펩타이드 생산
GST-펩타이드 융합체로부터 하나의 펩타이드를 PreScission™ 절단의 한 예는 하기에 제시한다. GST-태그를 PreScission™ 프로테아제(Amersham Pharmacia)와 항온처리하여 제거했다: 융합 단백질 2.5mg을 160U PreScission™와 함께 항온처리하고, 결합된 GST 융합 단백질을 함유하는 밀봉된 GSTrap FF 컬럼에서 5℃에서 16시간 동안 절단했다. 하룻밤동안 항온처리한 후, 제2 GSTrap FF 컬럼을 연결하여 GST-태그된 프로테아제 PreScission™을 제거했다. 샘플을 0.2ml/분의 유속으로 적용하고, 통류물을 일정량씩 소량의 분취액의 샘플로 수거하여 SDS 겔 전기영동을 통해 분석하고, OD280 측정을 통해 펩타이드의 양을 계산했다(약 700㎍).
실시예 3
PT의 친화성 정제
A. 변성 겔에서의 발효 상청액의 분석
친화성 크로마토그래피 과정의 잠재적인 출발 물질로서 다음의 2가지 공정 유체가 고려되었다:
샘플 A: 10 내지 50㎍/ml(약 0.09 내지 0.45μM)의 미정제 PT를 함유하는 농축된 배양 여과액, 발효 상청액
샘플 B: 9 내지 45㎍/ml(약 0.08 내지 0.4μM)의 미정제 PT를 함유하는 흡착 크로마토그래피 상청액
이러한 공정 유체의 복합성을 가시화하기 위하여 두 샘플을 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석했다. 주로 샘플 A의 고분자량 성분이 흡착 크로마토그래피에 의해 제거되었다(샘플 B).
B. 스트렙타비딘 세파로스에 대한 바이오티닐화된 합성 코어 펩타이드의 고정화 및 정제된 PT에의 결합의 확인
1. 스트렙타비딘 세파로스에 대한 펩타이드 고정화
바이오티닐화된 펩타이드를 스트렙타비딘 세파로스(Amersham High Performance 71-5004-40)에 결합시키기 위해, 예비세척된 스트렙타비딘 세파로스 50% 슬러리 200㎕를 1ml HEPES-완충액(20mM HEPES, pH 7.5, 150mM NaCl, 0.025% TritonX-100) 중의 1nmol 펩타이드(100μM 펩타이드 용액 10㎕)와 4℃에서 항온처리했다. 적용된 조건하에서, 스트렙타비딘 세파로스의 높은 결합능은 바이오티닐화된 펩타이드(충진된 세파로스 1㎕당 10pmol 펩타이드)의 100%를 고정화시킨다.
2. 고정화된 펩타이드에 대한 정제된 PT의 결합성
펩타이드가 부하된 세파로스 200㎕(고정화된 펩타이드 약 200pmol을 함유하는 10% 슬러리)를 Mobicol 컬럼(MoBiTec, 10㎛ 필터)으로 옮기고, 2000rpm에서 1분 동안 원심분리하여 상청액을 제거했다. HEPES-완충액으로 4회 세척한 후, 세파로스를 다시 정제된 백일해 독소 100pmol을 함유하는 HEPES-완충액 200㎕에 재현탁시키고, 회전 휠에서 1시간 동안 실온으로 항온처리했다. 미결합 분획을 원심분리로 제거했다(결합 후 상청액; 겔 분석함). 그 다음, 펩타이드-스트렙타비딘 세파로스를 저온 HEPES-완충액(각 200㎕)으로 3회 세척하고, 20㎕ 부하 완충액(30mM Tris, pH 6.8, 1% SDS, 1% β-머캅토에탄올, 12.5% 글리세롤, 0.005% 브롬페놀 블루)에 재현탁시켜 결합된 PT를 용출시켰다. 95℃에서 5분 항온처리한 후, 부하 완충액을 원심분리로 수거하고, 이어서 겔 분석에 사용했다(도 15). 대조군으로서 펩타이드가 없는 스트렙타비딘 세파로스를 동일한 조건하에 PT와 접촉시켰다. 적용된 조건하에서, 백일해 독소 펩타이드 결합인자 클론 pp26 5n, 5c, 9n, 15n 및 거마린 클론 10n, 19n, 15n, 9n은 정제된 PT에 대한 명백한 결합을 나타냈다. 양성 결합인자 후보는 모두 온전한 육량체 PT에 결합할 수 있었다.
C. 바이오티닐화된 합성 코어 펩타이드의 스트렙타비딘 세파로스에 대한 고정화 및 발효 상청액으로부터의 PT에 대한 결합성 확인
스트렙타비딘 세파로스에 대한 펩타이드 고정화 및 발효 상청액으로부터의 PT에 대한 결합성 분석을, 펩타이드 스트렙타비딘 세파로스를 샘플 A(발효 상청액) 200㎕ 또는 샘플 B(흡착 크로마토그래피 상청액 컬럼, 챕터 0 참조)와 함께 항온처리하는 것을 제외하고는 챕터 0에 기술한 바와 같이 수행하고, 이어서 HEPES-완충액으로 실온에서 4회 세척했다. 결합 분석의 결과는 도 16에 제시했다. 적용된 조건하에서 백일해 독소 pp26 결합인자 클론 9n, 15n 및 거마린 클론 9n, 15n을 발효 상청액 샘플 A 및 샘플 B로부터의 온전한 PT 육량체에 매우 효과적으로 결합할 수 있었다. 또한, 적용된 조건하에 pp26 결합인자 클론 5 및 거마린 결합인자 클론 10 및 19는 보다 낮은 친화성으로 PT에 결합할 수 있음을 주지한다. 이러한 조건하에서 샘플 A 및 샘플 B로부터의 상기 펩타이드들에 대한 PT 결합이 검출되지 않았지만, 상기 결합인자들은 친화성 크로마토그래피 컬럼(컬럼은 재결합 효과에 의해 PT를 잔류시켜 문제의 koff를 최소화할 수 있다)의 리간드로서 사용하는데 적격이다.
D. 고정화된 펩타이드에 대한 열역학적 데이터
펩타이드 결합능을 평가하기 위하여 세파로스 고정화된 펩타이드 20pmol을 200㎕ HEPES-완충액 용적 중의 과량의 100pmol PT(500nM PT에 해당한다)와 함께 항온처리했다. 세척 후, 펩타이드-스트렙타비딘 세파로스 결합된 PT의 분획을 겔 분석으로 정량했다. 이는 적용된 조건하에서 결합 활성의 펩타이드 분획을 직접 계산할 수 있게 해준다(PT/펩타이드 결합 비율을 1:1로 추정한다). 500nM PT의 농도가 모든 펩타이드들의 Bmax에 도달하는데 충분히 높다고 가정한다. 분석 결과는 표 7에 제시한다. 표 7에 제시된 값들은 펩타이드의 예상된 결합능에 대한 추정값이다. 또한, 가장 적당한 결합인자의 결합능(Bmax) 및 해리 상수(KD)에 대한 정확한 평가도 수행될 수 있다.
적용된 실험 조건하에 결합 활성 펩타이드의 비율 대한 개요
펩타이드 명칭 pp26
5n		 pp26
9n		 pp26
15n		 거마린
9n		 거마린
10n		 거마린
15n		 거마린
19n
결합 활성 펩타이드의 비율 >5%1 >50% >12.5% >12.5% >5%1 >50% >5%1
1시그널이 검출 한계치 부근이기 때문에 계산이 곤란하다.
E. 허용되는 품질 등급의 원료 대 보건국 기준을 이용한 규정된 완충액 조건(pH, 염 농도, 세제)하에 정제된 백일해 독소 육량체의 안정성 분석
백일해 독소 육량체 안정성을 BIAcore 2000 기기상에서 광범위한 pH 및 염 조건하에 시험했다. 이를 위해, 바이오티닐화된 PT 약 2000RU를 스트렙타비딘 칩 상에 부하했다. 그 다음, 상이한 완충액을 칩 고정된 PT에 30㎕/분의 유속으로 2분 동안 적용했다. 각 완충액 주입을 종결한 후, 칩을 HBS/EP 전개 완충액(0.01M HEPES, pH 7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% 폴리소르베이트 20(v/v), 30㎕/분의 유속으로 적어도 2분 동안)으로 평형화시켰다. 완충액 주입 전과 후에 측정된 RU 시그널의 차이는 칩 상의 PT 육량체의 감소와 상관관계가 있다. 이러한 감소는 적용된 완충액 조건하에 PT 육량체의 안정성 상실로서 해석되었다.
분석된 pH 범위는 다음과 같은 완충액을 사용한 경우에 pH 2 내지 10.5였다: 10mM 글리신 완충액(BIAcore, pH2; 2.5; 3), 10mM 아세테이트 완충액(BIAcore, pH 4; 4.5; 5; 5.5), 50mM Tris/HCl(pH 8.5) 및 100mM 탄산염 완충액(pH 9.6 및 10.5). PT 육량체 안정성에 미치는 pH 영향을 입증하는 BIAcore 센소그램을 수득했고, 이 BIAcore 분석 결과는 표 8에 요약되어 있다. 적용된 조건하에서 백일해 독소 육량체는 pH 2.5 내지 10.5 사이의 광범위한 pH 범위에서 안정한 것으로 보였다.
상이한 pH 조건하에서의 백일해 독소 육량체 안정성
pH 2 2.5 3 4 4.5 5 5.5 8.5 9.6 10.5
PT 육량체 안정성(%) 93 98 100 100 100 100 100 100 98 95
PT 육량체 안정성에 미치는 상이한 염 조건의 영향을 각각 pH 5.0(10mM 아세테이트 완충액) 및 pH 8.5(50mM Tris/HCl)에서 NaCl, KCl 및 MgCl2에 대하여 BIAcore 2000 기기상에서 비교 실험으로 조사했다. 적용된 염 조건하의 PT 육량체 안정성에 대한 개요는 표 9에 제시한다. 육량체는 최대 2.5M NaCl 또는 최대 2M KCl을 함유하는 완충액(pH 5 및 pH 8.5에서)에서 안정적이었다. MgCl2의 경우에 PT 육량체는 pH 8.5에서 최대 2M MgCl2를 함유하는 완충액에서 안정하였다.
상이한 염 조건하에서의 백일해 독소 육량체 안정성
PT 육량체 안정성 pH 5 pH 8.5
NaCl 0 내지 2.5M
안정		 0 내지 2.5M
안정
KCl 0 내지 2.0M
안정		 0 내지 2.0M
안정
MgCl2 측정하지 않음 0 내지 2.0M
안정
F. 발효 상청액로부터의 PT의 특이적 친화성 정제를 허용하는 규정된 세척 및 용출 조건의 확립(pH, 염 농도, 계면활성제)
백일해 독소 육량체가 안정적인 조건하에서 측정한 후, 다음 단계로서 고정화된 펩타이드 pp26 클론 9 및 15와 거마린 클론 9 및 15에 결합된 백일해 독소의 세척 및 용출 조건을 조사했다.
1. BIAcore 2000 기기를 이용한 PT/펩타이드 안정성의 평가
PT/펩타이드 복합체의 안정성은 앞서 PT 육량체 안정성을 방해하지 않는 것으로 나타난 상이한 pH 및 염 조건하에 BIAcore 2000 기기를 이용하여 조사했다. 합성 펩타이드 500 내지 1000 RU를 BIAcore 스트렙타비딘 칩 위에 고정시켰다. 고정화된 펩타이드에 PT를 결합시키기 위해, HEPES-완충액 중의 20nM 정제된 PT를 1분 동안 주입했다. HBS/EP 전개 완충액(0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% 폴리소르베이트 20(v/v))으로 평형화한 후, PT/펩타이드 복합체를 다음 용액을 주입하여 세척했다:
(a) pH 10.5 및 9.5의 100mM 탄산염 완충액
(b) pH 5.5, 5.0, 4.5 및 4.0의 10mM 아세테이트 완충액
(c) pH 3.0 및 2.5의 10mM 글리신 완충액
(d) 10mM 아세테이트 완충액(pH 6.0) 중의 0.5, 1.0, 1.5, 2.0M NaCl
(e) 50mM Tris/HCl 완충액(pH 8.5) 중의 0.5, 1.0, 1.5, 2.0M NaCl
(f) 10mM 아세테이트 완충액(pH 6.0) 중의 0.5, 1.0, 1.5, 2.0M KCl
(g) 50mM Tris/HCl 완충액(pH 8.5) 중의 0.5, 1.0, 1.5, 2.0M KCl
(h) 10mM 아세테이트 완충액(pH 6.0) 중의 0.5, 1.0, 1.5, 2.0M NaCl
(i) 50mM Tris/HCl 완충액(pH 8.5) 중의 0.5, 1.0, 1.5, 2.0M NaCl.
각 완충액 주입을 종결한 후, 칩을 HBS/EP 전개 완충액과 평형화시켰다. 적용된 완충액 조건하에서 칩 상의 PT 육량체의 손실(완충액 주입 전과 후의 측정된 RO 시그널의 차이)은 PT/펩타이드 복합체 안정성을 반영한다. 모든 PT/펩타이드 복합체의 pH 범위 안정성 및 염 안정성에 대한 개요는 표 10에 요약되어 있다. 모든 PT/펩타이드 복합체는 10mM 글리신(pH 2.5)뿐만 아니라 100mM 탄산염(pH 10.5)의 존재하에서 완전하게 탈안정화되었다. 거마린 펩타이드 9의 경우, 2.5M NaCl 또는 적어도 0.5M MgCl2을 함유하는 완충액은 PT/펩타이드 복합체 안정성을 방해한다. 거마린 펩타이드 15를 보유한 PT 복합체도 또한 50mM Tris/HCl, pH 8.5 중의 적어도 1.5M MgCl2의 존재하에서 탈안정화되었다.
PT/펩타이드 복합체의 안정성에 미치는 여러 pH 및 염 조건의 효과
pp26 펩타이드 9 pp26 펩타이드 15 거마린 펩타이드 9 거마린 펩타이드 15
pH 범위
복합체의 안정성		 3 내지 9
안정,
pH 2.5 또는 10.5에서 불안정		 3 내지 9
안정,
pH 2.5 또는 10.5에서 불안정		 3 내지 9
안정,
pH 2.5 또는 10.5에서 불안정		 3 내지 9
안정,
pH 2.5 또는 10.5에서 불안정
pH 6 pH 8.5 pH 6 pH 8.5 pH 8.5 pH 6 pH 8.5
NaCl
복합체의 안정성		 2M
안정		 2M
안정		 2M
안정		 2M
안정		 염에 대해 상당히 민감 염에 대해 민감
KCl
복합체의 안정성		 2M
안정		 2M
안정		 2M
안정		 2M
안정		 염에 대해 상당히 민감 염에 대해 민감
MgCl 2
복합체의 안정성		 안정 125mM부터 안정,
완전한 용출≥2M		 최대 2M에서 안정 용출≥1.5, 그러나 완전하지 않음 용출≥0.5M 용출≥1M,
완전한 용출≥2M		 용출≥1M,
완전한 용출≥2M
2. 펩타이드 스트렙타비딘 세파로스에서 PT 정제시의 세척 조건에 대한 평가
세척 조건은 아시알로페투인에서의 백일해 독소 정제 공정에 대해 확립된 조건와 유사하게 시도했다(1M NaCl 존재 또는 부재하에 50mM Tris/HCl pH 7.5로 세척). 백일해 독소 정제 프로토콜은 펩타이드 pp26 클론 9 및 15와 거마린 클론 9 및 15에 대해 최적화되었다. 20㎕ 세파로스에 고정화된 각 펩타이드 200pmol을 100㎕의 50mM Tris/HCl, pH7.5 및 100㎕ 샘플 A 또는 샘플 B와 함께 항온처리하여 PT를 결합시켰다. 그 다음, 결합된 PT 분획을 보유한 펩타이드 세파로스를 하기 제시한 3가지 상이한 조건하에 세척했다:
(a) 200㎕의 50mM Tris/HCl, pH 7.5로 3회;
(b) 200㎕의 50mM 아세테이트 pH 6.0으로 3회; 및
(c) 200㎕의 50mM 아세테이트 pH 6.0으로 6회.
세척 후, 잔류 물질을 20㎕ 부하 완충액(30mM Tris, pH 6.8, 1% SDS, 1% β-머캅토에탄올, 12.5% 글리세롤, 0.005% 브롬페놀 블루)을 이용하여 세파로스로부터 용출시켰다. 그 다음, 모든 용출액을 12% Bis-Tris-Gel(MES 전개 완충액)에서의 PAGE 및 은 염색으로 분석하였다(도 17).
50mM 아세테이트 pH 6.0으로의 세척은 50mM Tris/HCl, pH 7.5로의 세척보다 더욱 엄격하고, 고분자량 불순물의 배경값을 더 효과적으로 감소시켰다. 이러한 세척 조건하에서 PT/펩타이드 복합체는 특히 거마린 펩타이드 9 및 50mM 아세테이트 pH 6.0으로의 반복된 세척(6회 세척)의 경우에 덜 안정하다. 펩타이드 고정화된 PT의 손실은 50mM Tris/HCl(pH 7.5)와 대조적으로 50mM 아세테이트(pH6.0)으로 10 내지 20회 반복 세척시(도 18에서 pp26 펩타이드 9로 제시된 예에서처럼) 보다 급격하였다.
3. 펩타이드 스트렙타비딘 세파로스에서 PT 정제시의 용출 조건에 대한 평가
펩타이드 세파로스로부터의 PT 용출은 육량체 안정성에 적합한 조건하에서 시험했다.
a. MgCl 2 에 의한 용출
BIAcore 2000 측정으로 상기 제시한 바와 같이 모든 PT/펩타이드 복합체는 PT 육량체 안정성에 중요하지 않은 것으로 관찰된 조건인 2M MgCl2에 대해 민감했다. 규정된 MgCl2 농도의 용출 효율은 4가지 고정화된 합성 펩타이드 중 하나를 통해 스트렙타비딘 세파로스에 결합된 PT에 대해 평가했다. 20㎕ 세파로스에 고정화된 각 펩타이드 400pmol을 100㎕의 50mM Tris/HCl, pH 7.5 및 100㎕ 샘플 A와 항온처리하여 PT를 결합시켰다. 50mM Tris/HCl, pH 7.5로 4회 세척한 후(각각 200㎕씩), PT의 결합된 분획은 다음의 용액 20㎕ 용적을 3회 연속 사용하여 용출시켰다:
(a) 50mM Tris/HCl, pH 8.5 중의 0.2M MgCl2,
(b) 50mM Tris/HCl, pH 8.5 중의 0.5M MgCl2,
(c) 50mM Tris/HCl, pH 8.5 중의 1.0M MgCl2,
(d) 50mM Tris/HCl, pH 8.5 중의 1.5M MgCl2 또는
(e) 50mM Tris/HCl, pH 8.5 중의 2.0M MgCl2.
잔류 물질을 이후에 20㎕ 부하 완충액(30mM Tris, pH 6.8, 1% SDS, 1% β-머캅토에탄올, 12.5% 글리세롤, 0.005% 브롬페놀 블루)을 사용하여 펩타이드 스트렙타비딘 세파로스로부터 용출시켰다. 모든 용출액을 12% Bis-Tris-Gels(MES 전개 완충액)을 통해 PAGE로 분석하고 은 염색했다(도 19). 본 실험에서 관찰되는 바와 같이, MgCl2로의 용출은 상당량의 PT가 여전히 펩타이드 스트렙타비딘 세파로스에 잔류할지라도 pp26 펩타이드보다 거마린 펩타이드에 더 효과적이었다.
b. pH 이동에 의한 용출
BIAcore 측정법은 PT 육량체 안정성에 중요하지 않은 산성(pH 2.5) 또는 염기성(pH 10.5) 완충액 조건에 의해 PT가 모든 펩타이드로부터 용출될 수 있음을 밝혀냈다(PT 육량체 안정성 측면에서 50mM 글리신, pH 2.5는 100mM 탄산염 완충액 pH 10.5보다 더욱 완만한 조건이다, xxx 참조). 20㎕ 세파로스에 고정화된 각 펩타이드 200pmol을 50mM Tris/HCl(pH 7.5) 100㎕ 및 샘플 A 100㎕와 함께 항온처리하여 PT를 결합시켰다. 50mM Tris/HCl, pH 7.5로 4회 세척한 후(각각 200㎕씩), 50mM 글리신(pH 2.5) 또는 100mM 탄산염 완충액(pH 10.5)를 이용하여 펩타이드 스트렙타비딘 세파로스로부터 PT를 3회 연속 40㎕ 용출액으로서 용출시켰다. 그 다음, 잔류 물질을 20㎕ 부하 완충액(30mM Tris, pH 6.8, 1% SDS, 1% β-머캅토에탄올, 12.5% 글리세롤, 0.005% 브롬페놀 블루)을 이용하여 펩타이드 스트렙타비딘 세파로스로부터 용출시켰다. 모든 용출액은 12% Bis-Tris-Gel(MES 전개 완충액)에서 PAGE로 분석하고 은 염색했다(도 20). 100mM 탄산염 완충액 pH 10.5뿐만 아니라 50mM 글리신 pH 2.5를 사용한 경우에 거의 모든 PT가 펩타이드 스트렙타비딘 세파로스로부터 용출되었다.
4. 결합능을 확인시키는, 소규모 정제 계획용으로 최적화된 조건의 적용
a. 최적화된 세척 및 용출 조건(4㎕ 컬럼)하에 샘플 B로부터 PT의 정제
펩타이드 스트렙타비딘 세파로스상에서 샘플 B로부터 PT를 정제하기 위하여 최적화된 세척 및 용출 조건을 조합하였다. PT의 비특이적 결합을 감소시키기 위해 사전에 각 펩타이드마다 최적의 펩타이드/스트렙타비딘 세파로스 비를 적정했다. 그 다음, 샘플 B/펩타이드 스트렙타비딘 세파로스 비를 펩타이드당 예상되는 높은(중간) 유입량의 PT의 높은 회수율에 대하여 최적화했다. 이러한 조건들은 소량의 컬럼 정제 후에 적용했다.
pp26 펩타이드 9 및 거마린 펩타이드 15의 경우, 스트렙타비딘 세파로스에 대한 고정화를 1600pmol 펩타이드와 함께 16㎕ 스트렙타비딘 세파로스를 항온처리하여 실시했다. pp26 펩타이드 15의 경우에는 6000pmol 펩타이드와 함께 16㎕ 스트렙타비딘 세파로스를 항온처리했다(pp26/15는 스트렙타비딘 세파로스에 보다 낮은 효율로 결합하는데, 이는 불완전한 펩타이드 바이오티닐화로 설명될 수 있다). 거마린 펩타이드 9의 경우, 8000pmol을 80㎕ 스트렙타비딘 세파로스 위에 고정화시켰다. 그 다음, 세척된 펩타이드 스트렙타비딘 세파로스를 동등하게 분할하여 4 Mobilcom 컬럼(10μM 필터 보유)으로 이동시켰다.
각 컬럼(pp26/9 및 gur/15의 경우 400pmol 펩타이드와 4㎕ 세파로스를 함유; 불특정량의 결합된 펩타이드 pp26/15와 4㎕ 세파로스를 함유; gur/9의 경우 2000pmol 펩타이드와 20㎕ 세파로스를 함유)을 샘플 B(HCl을 첨가하여 pH 7.0 내지 7.5로 조정) 400㎕와 항온처리하여 PT를 결합시켰다. 50mM Tris/HCl, pH 7.5로 5회 세척한 후(각각 100㎕), PT를 펩타이드 스트렙타비딘 세파로스로부터 다음과 같은 연속적 용출에 의해 용출시켰다(pp26/9의 경우에는 3회 용출, pp26/15 및 gur/9의 경우에는 4회 용출):
(a) 컬럼 1의 경우 50mM 글리신, pH 2.5(각각 20㎕);
(b) 컬럼 2의 경우 100mM 탄산염 완충액, pH 10.5(각각 20㎕); 또는
(c) 컬럼 3의 경우 50mM Tris pH 8.5 중의 2M MgCl2(각각 20㎕).
후속적으로, 컬럼 1 내지 3 뿐만 아니라 컬럼 4에 잔류하는 물질을 20㎕ 부하 완충액(30mM Tris, pH 6.8, 1% SDS, 1% β-머캅토에탄올, 12.5% 글리세롤, 0.005% 브롬페놀 블루)으로 용출시켜 펩타이드 스트렙타비딘 세파로스로부터 용출시켰다. 모든 용출액은 12% Bis-Tris-Gels(MES 전개 완충액)에서의 PAGE 및 은 염색으로 분석하였다(도 21, 22). 펩타이드 스트렙타비딘 세파로스에서 정제 후의 PT 수율을 계산하기 위하여, 수집된 용출액 1 내지 3을 PAGE 및 은 염색으로 분석하고, 동일한 겔에서 분리된 규정된 양의 정제된 PT와 비교하여 추정값을 수득했다(도 21B 및 22B). 이러한 겔 추정값은 근거로 하여, 정제된 PT의 수율을 계산했고 그 결과는 표 11에 제시했다.
친화성 리간드로서 pp26 펩타이드 9 또는 거마린 펩타이드 15를 이용한 샘플 B로부터의 소규모 컬럼 정제 후 백일해 독소 수율의 계산
펩타이드 다음을 이용하여 용출 도 13B 및 14B로부터 추정 PT의 총 수율 샘플 B 중의 유입된 PT에 대한 수율 세파로스 결합된 펩타이드의 양에 대한 수율
pp26 펩타이드 9

 글리신 pH 2.5 수집된 용출액 120개 중 3개에서의 2pmol PT 80pmol >48% 20%
탄산염 pH 10.5 용출액 수집된 용출액 120개 중 3개에서의 2pmol PT 80pmol >48% 20%
MgCl2 수집된 용출액 120개 중 36개에서의 12pmol PT 20pmol >12% 5%
거마린 펩타이드 15

 글리신 pH 2.5 수집된 용출액 120개 중 3개에서의 2pmol PT 80pmol >48% 20%
탄산염 pH 10.5 용출액 수집된 용출액 120개 중 3개에서의 2pmol PT 80pmol >48% 20%
MgCl2
수집된 용출액 120개 중 3개에서의 12pmol PT 40pmol
 >24%
 10%
* PT와 관련된 문헌에 따라서, 샘플 B의 예상 PT 농도는 9 내지 45㎍/ml로서, 0.8 내지 0.41pmol/㎕에 상응한다. 계산은 다음과 같이 실시했다: 샘플 B 400㎕ x 0.41pmol/㎕ = 164pmol 유입된 PT
b. 스트렙타비딘 세파로스 상의 다양한 밀도의 펩타이드를 이용한 친화성 정제 동안의 PT 수율의 측정
펩타이드 스트렙타비딘 세파로스에 대한 PT 결합성을 친화성 리간드로서 스트렙타비딘 세파로스 상에 고정화된 다양한 농도의 펩타이드에 의존하여 조사했다. 고정화 후, 스트렙타비딘 세파로스 1㎕ 용적을 증가되는 양의 펩타이드 pp26/9 또는 거마린/15(펩타이드 100, 200, 300, 400, 500, 1000pmol)와 함께 항온처리했다. 미결합 펩타이드 분획은 50mM Tris/HCl, pH 7.5(컬럼 상에서)로 3회 세척하여 세파로스로부터 제거했다. 그 다음, 각 펩타이드 스트렙타비딘 매트릭스를 샘플 A 600㎕와 항온처리하여 PT를 결합시켰다. 80분 후, 각 매트릭스를 50mM Tris/HCl, pH 7.5로 4회 세척하고(각각 200㎕씩), 그 다음 20㎕ 겔 부하 완충액(30mM Tris, pH 6.8, 1% SDS, 1% β-머캅토에탄올, 12.5% 글리세롤, 0.005% 브롬페놀 블루; 95℃에서 10분 동안 항온처리)으로 용출시켰다. 용출액을 12% Bis-Tris-Gel(MES 전개 완충액)에서의 PAGE 및 은 염색으로 분석하였다(도 23). 펩타이드 스트렙타비딘 세파로스에 결합된 PT의 양은 농도계 평가로 계산하고 스트렙타비딘 세파로스에 고정화시키는데 처음 사용했던 펩타이드의 양의 함수로서 플로팅했다(도 23에 pp26/9에 대해 도시했다). 최대 PT 결합은 300 내지 400pmol 펩타이드를 1㎕ 스트렙타비딘 세파로스에 고정화시키기 위해 사용하였을 때 도달하였다. 더 많은 양의 펩타이드는 PT 결합성을 더 증가시키지 못했는데, 이는 아마도 PT의 입체 장애 효과 때문일 것이다.
400pmol 펩타이드 유입량이 1㎕ 스트렙타비딘 세파로스에 고정화시키기 위해 사용되었을 때 효과적으로 결합된 펩타이드(pp26/9 또는 거마린/15) 분획을 겔 부하 완충액으로 용출시킨 후 12% Bis-Tris-Gel(MES 전개 완충액)에서의 PAGE 및 은 염색으로 평가하였다(95℃에서 10분 동안 가열함). 용출성 펩타이드의 양은 동일 한 겔에서 정제된 PT의 규정된 양과 직접 비교하여 추정했다(데이타는 제시하지 않음): pp26/9에 대해서는 100-150pmol; 거마린/15에 대해서는 50pmol).
c. 친화성 정제 동안 일정한 농도의 펩타이드 세파로스 하에 샘플 B의 다양한 양을 이용한 PT 수율의 측정
펩타이드 고정을 위해 pp26/9 또는 거마린/15 400pmol을 스트렙타비딘 세파로스 1㎕와 함께 RT에서 1시간 동안 항온처리했다. 펩타이드 세파로스를 200㎕ 50mM Tris pH 7.5 완충액으로 3회 세척하고, 그 다음 다양한 양의 샘플 B(HCl을 첨가하여 사전에 pH 7.0-7.5로 조정된 50, 66, 100, 200, 400, 600㎕)와 실온에서 1시간 동안 항온처리했다. 친화성 매트릭스를 50mM Tris/HCl, pH 7.5 100㎕로 4회 세척하고, 100mM 탄산염 완충액 pH 10.5로 4회 연속 용출시켰다(각각 20㎕). 수집된 용출액(총 80㎕) 5㎕를 12% Bis-Tris-Gels(MES 전개 완충액)에서의 PAGE 및 은 염색으로 분석하였다. 용출된 PT 양을 질량 표준물로서 동일 겔 상의 규정된 양의 정제된 PT와 직접 비교하여 계산했다(도 24, 표 12).
Figure 112006035201269-pct00009
펩타이드 스트렙타비딘 세파로스의 정제 효율을 아시알로페투인 세파로스와 비교하기 위해, 유사한 조건하에(반응 당 동일한 양의 친화성 리간드를 세파로스에 고정시켰다. 세파로스에 효과적으로 결합된 약 100pmol 친화성 리간드에 상응한다) 아시알로페투인 세파로스를 이용한 적정 실험을 동시에 실시했다. 이는 다양한 양의 샘플 B(HCl을 첨가하여 사전에 pH 7.0-7.5로 조정한 50, 66, 100, 171.3, 200, 400㎕)를 6.85㎕의 아시알로페투인 세파로스(뱃치 번호 FA 053198: 밀도 1.1mg/ml, 14.6 pmol/㎕)와 함께 실온에서 1시간 동안 항온처리하여 달성하였다. 그 다음, 아시알로페투인 세파로스를 세척하고, 결합된 PT를 전술한 바와 같이 용출 및 분석했다. 적용된 정제 조건하에서 펩타이드 스트렙타비딘 세파로스의 결합 효율은 아시알로페투인 세파로스의 결합 효율로부터 훨씬 높았다.
d. 반복된 PT 결합 및 용출에 대한 펩타이드 세파로스의 재활용성
PT의 반복된 결합과 용출에 대한 펩타이드 부하된 세파로스(pp26/9 및 거마린/15)의 재활용성을 조사하기 위하여, PT 결합, 용출 및 재생의 반복 사이클에 대하여 세파로스를 적용했다(총 4회). 펩타이드 고정을 위해 600pmol pp26/9 또는 거마린/15를 2㎕ 스트렙타비딘 세파로스와 함께 실온에서 밤새 항온처리하고, HEPES-완충액으로 3회 세척했다. PT의 결합을 위해 각 펩타이드 스트렙타비딘 세파로스를 샘플 B 400㎕(HCl 첨가로 pH 7.0-7.5로 조정했다)와 함께 실온에서 1시간 동안 항온처리하고 50mM Tris/HCl, pH 7.5로 4회 세척했다(각각 200㎕씩). PT는 100mM 탄산염 완충액 pH 10.5로 각각 4회 연속 용출시켰다(각각 20㎕). 그 다음, 컬럼 매트릭스를 10mM HCl로 3회 세척(1x 20㎕, 2x 100㎕)하여 재생시키고, 그 다음 50mM Tris/HCl, pH7.5 200㎕로 2회 세척하여 중화시켰다. 이러한 결합, 용출 및 재생 과정을 펩타이드 세파로스에 3회 더 실시했다. 수집된 용출액 4㎕(총 80㎕) 및 각 결합/용출/재생 사이클에서의 1차 재생 완충액 7㎕를 12% Bis-Tris_Gels(MES 전개 완충액)에서의 PAGE 및 은 염색으로 분석한 결과, 펩타이드 세파로스는 재활용될 수 있는 것으로 나타났다(도 25).
5. PT의 대규모 FPLC 정제
PT 결합 및 용출의 최적 조건을 이하에 제시된 바와 같이 대량 FPLC 정제(0.5ml 컬럼)에 적용했다.
A) 바이오티닐화된 펩타이드의 스트렙타비딘-세파로스에 대한 고정화: 200nmol 펩타이드 pp26/9를 10ml(HEPES-완충액) 용적 중의 50% 스트렙타비딘-세파로스 1ml와 함께 함께 회전 휠에서 실온으로 1시간 30분 동안 항온처리했다. 항온처리 후, 세파로스를 50mM Tris, pH 7.5로 3회 세척했다.
B) PT(샘플 B로부터)의 결합: 500㎕ 세파로스에 효과적으로 고정화된 펩타이드의 추정 양은 50nmol 이었다. 펩타이드-세파로스를 헤드 오버 테일 회전기에서 실온 하에 1시간 30분 동안 샘플 B 25ml와 항온처리했다(PT의 추정 농도 약 0.5pmol/㎕, 25ml 중의 12.5nmol에 상응함, 고정화된 펩타이드 대 PT의 비 4:1에 상응함).
C) FPLC 컬럼: 항온처리 후, 세파로스를 컬럼(Pharmacia HR 5/5)으로 옮겼다. 컬럼 충진 동안 세파로스를 50mM Tris pH 7.5(2-3ml)로 세척했다. 그 다음, 컬럼을 유동로 중에서 취하여 20 컬럼 용적(10ml)의 50mM Tris pH 7.5로 세척했다. 고정화된 PT를 11ml의 100mM 탄산염 완충액(pH 10.5)으로 용출시켰다. 용출 분획을 500㎕ 분획으로 수집하고(Pharmacia Fraction Collector FRAC-100), 280nm에서 UV 흡광도를 측정하여 용출 프로필을 조사했다. 용출 후 컬럼을 50mM Tris pH 7.5, 1.5ml로 세척하고, 2.5ml 10mM HCl로 재생시킨 다음 10ml 50mM Tris pH 7.5로 중화시켰다.
D) 용출 분획의 분석 및 수율 계산: 용출 분획은 PAGE(12% Bis-Tris-Gel, MES 전개 완충액) 및 은 염색으로 분석하였다(도 26). PT 농도는 280nm에서 용출 분획의 흡광도를 측정하고(A280), 이 결과를 정제된 PT로 작도한 보정 곡선(calibration curve)과 비교하여 확인했다(도 26의 표 참조).
또한, PT의 양은 동일 겔을 통해 정제된 PT의 특정 양을 분석한 질량 표준물과 직접 비교하여 계산했다. 겔 추정값은 8100pmol PT였다. 이는 A280를 사용한 농도 측정값과 매우 높은 상관관계가 있었다. 샘플 B 25ml가 PT 1125㎍을 함유한다고 가정하면, 이러한 조건하에서 PT의 69% 내지 72% 이상이 용출되었다. 이러한 결과는 재생 후 동일한 펩타이드-세파로스를 이용하여 FPLC 수행을 반복하여 샘플 B 25ml로부터의 PT를 결합시킴으로써 확인했다. 당해 실험에서 803㎍의 PT가 정제되었다(A280)(표 13).
A280을 이용한 용출 분획(FPLC 수행 #2) 중의 PT 농도의 측정
A280 ㎍/ml
용출액 1 0 0
용출액 2 0 0
용출액 3 0.091 85
용출액 4 0.4185 391
용출액 5 0.354 331
용출액 6 0.2835 265
용출액 7 0.212 198
용출액 8 0.148 138
용출액 9 0.0975 91
용출액 10 0.0585 55
용출액 11 0.0315 29
용출액 12 0.025 23
전체 3 내지 12 = 803㎍
PT 정제 결과의 요약
12×0.5mL 분획(6ml)에서의 PT 수율 PT의 유입량에 대한 상대적 수율(26ml 중의 1125㎍)(pmol/pmol 또는 ㎍/㎍) 순도
1. 정제 수행 772 내지 813㎍ 69 내지 72% 아시알로페투인 세파로스상에서 정제된 PT와 유사함, 100%
2. 정제 수행 803㎍ 71% 아시알로페투인 세파로스상에서 정제된 PT와 유사함, 100%
6. pp26 펩타이드 9/백일해 독소 복합체 형성의 평형 상수 및 속도 상수의 평가
pp26K9/PT 복합체 형성의 평형 상수 및 속도 상수는 HBS/EP 전개 완충액(0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005%(v/v) 폴리소르베이트 20)에서 실온에서 BIAcore 2000 기기를 사용하여 평가했다. CM5 칩에 고정화된 PT(아민 커플링 방법을 통해 6000 RU 고정화)에 대한 다양한 농도의 pp26-K9(2.5nM 내지 100nM 사이의 농도)의 결합성을 30㎕/분의 유속에서 평가했다. PT 결합된 펩타이드의 정량적 용출은 3mM HCl, pH 2.5를 사용하여 수득했다. BIAevaluation 소프트웨어를 사용하여 추론가능한 평형 상수 및 속도 상수를 분석했고, 그 결과는 하기에 제시한다:
해리 평형 상수 KD → 7.5 x 10-9M
결합 평형 상수 KA → 1.3 x 10-8M-1
결합 속도 상수 kon → 1.3 x 105M-1x s-1
해리 속도 상수 koff → 10-3s-1
본 발명을 바람직한 양태의 측면에서 설명했지만, 당업자라면 이의 변형과 수정이 가능함을 잘 알고 있을 것이다. 따라서, 첨부된 청구의 범위는 청구된 본 발명의 범위 내에 이러한 모든 등가의 변형을 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
<110> Sanofi Pasteur, Inc. <120> METHODS FOR PURIFYING PERTUSSIS TOXIN AND PEPTIDES USEFUL THEREFOR <130> 10-2006-7009867 <150> 60/523,881 <151> 2003-11-20 <160> 415 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Asn Gly Ser Phe Ser Gly Phe 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Asn Gly Ser Phe Ser Gly Cys 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 Asp Gly Ser Phe Ser Gly Phe 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(7) <223> Xaa is any amino acid <400> 4 Xaa Gly Ser Phe Ser Gly Xaa 1 5 <210> 5 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 Arg Ser Ser His Cys Arg His Arg Asn Cys His Thr Ile Thr Arg Gly 1 5 10 15 Asn Met Arg Ile Glu Thr Pro Asn Asn Ile Arg Lys Asp Ala 20 25 30 <210> 6 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 Ser Thr Met Asn Thr Asn Arg Met Asp Ile Gln Arg Leu Met Thr Asn 1 5 10 15 His Val Lys Arg Asp Ser Ser Pro Gly Ser Ile Asp Ala 20 25 <210> 7 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 7 Arg Ser Asn Val Ile Pro Leu Asn Glu Val Trp Tyr Asp Thr Gly Trp 1 5 10 15 Asp Arg Pro His Arg Ser Arg Leu Ser Ile Asp Asp Asp Ala 20 25 30 <210> 8 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 8 Arg Ser Trp Arg Asp Thr Arg Lys Leu His Met Arg His Tyr Phe Pro 1 5 10 15 Leu Ala Ile Asp Ser Tyr Trp Asp His Thr Leu Arg Asp Ala 20 25 30 <210> 9 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 9 Ser Gly Cys Val Lys Lys Asp Glu Leu Cys Ala Arg Trp Asp Leu Val 1 5 10 15 Cys Cys Glu Pro Leu Glu Cys Ile Tyr Thr Ser Glu Leu Tyr Ala Thr 20 25 30 Cys Gly <210> 10 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 10 Ser Gly Cys Val Lys Lys Asp Glu Leu Cys Glu Leu Ala Val Asp Glu 1 5 10 15 Cys Cys Glu Pro Leu Glu Cys Phe Gln Met Gly His Gly Phe Lys Arg 20 25 30 Cys Gly <210> 11 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 11 Ser Gly Cys Val Lys Lys Asp Glu Leu Cys Ser Gln Ser Val Pro Met 1 5 10 15 Cys Cys Glu Pro Leu Glu Cys Lys Trp Phe Asn Glu Asn Tyr Gly Ile 20 25 30 Cys Gly Ser 35 <210> 12 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 12 Ser Gly Cys Val Lys Lys Asp Glu Leu Cys Glu Leu Ala Ile Asp Glu 1 5 10 15 Cys Cys Glu Pro Leu Glu Cys Thr Lys Gly Asp Leu Gly Phe Arg Lys 20 25 30 Cys Gly <210> 13 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 13 Gln Gln Cys Val Lys Lys Asp Glu Leu Cys Ile Pro Tyr Tyr Leu Asp 1 5 10 15 Cys Cys Glu Pro Leu Glu Cys Lys Lys Val Asn Trp Trp Asp His Lys 20 25 30 Cys Ile Gly 35 <210> 14 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(30) <223> Xaa is any amino acid <400> 14 Cys Val Lys Lys Asp Glu Leu Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Cys 1 5 10 15 Glu Pro Leu Glu Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys 20 25 30 <210> 15 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (49)..(113) <223> n is a, g, t or c <400> 15 agtggctcaa gctcaggatc aggctgcgtc aagaaagacg agctctgcnn snnsnnsnns 60 nnsnnstgct gtgagcccct cgagtgcnns nnsnnsnnsn nsnnsnnsnn snnstgcggc 120 agcggcagtt ctgggtctag c 141 <210> 16 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 16 taatacgact cactataggg acaattacta tttacaatta caatgcacca tcaccatcac 60 catagtggct caagctcagg atca 84 <210> 17 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 17 ttttaaatag cggatgctac taggctagac ccagaactgc cgct 44 <210> 18 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 18 uagcggaugc 10 <210> 19 <211> 53 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(43) <223> Xaa is any amino acid <400> 19 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Sequence <220> <223> Synthetic <400> 24 aattaaatag cggatgcctt cggagcgtta gc 32 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 25 tgtaaaacga cggccagt 18 <210> 26 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 26 Met His His His His His His Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ser Gly Cys 1 5 10 15 Val Lys Lys Asp Glu Leu Cys Ala Gly Ser Val Gly His Cys Cys Glu 20 25 30 Pro Leu Glu Cys Leu Arg Arg Phe Leu Asn Leu Arg Trp Cys Gly Ser 35 40 45 Gly Ser Ser Gly Ser Ser 50 <210> 27 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 27 Met His His His His His His Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ser Gly Cys 1 5 10 15 Val Lys Lys Asp Glu Leu Cys Ile Val Met Arg Ala Pro Cys Cys Glu 20 25 30 Pro Leu Glu Cys Leu Arg Arg Tyr Met Leu Lys His Met Cys Gly Ser 35 40 45 Gly Ser Ser Gly Ser Ser 50 <210> 28 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 28 Met His His His His His His Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ser Gly Cys 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Ser 35 40 45 Ala Ile 50 <210> 409 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 409 Met Gly Arg Gly Ser His His His His His His His Ala Arg Ser Pro 1 5 10 15 Leu Trp Tyr His Tyr Asn Cys Trp Asp Thr Ile Cys Leu Ala Asp Trp 20 25 30 Leu Lys Asp Arg Pro His Gly Val Tyr Asp Ala Asn Ala Pro Lys Ala 35 40 45 Ser Ala Ile 50 <210> 410 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 410 Met Gly Arg Gly Ser His His His His His His Ala Arg Ser Gly Arg 1 5 10 15 Tyr His Arg Asp Arg Trp Leu Ala Thr Met Arg Tyr Pro Asp Pro Ser 20 25 30 Gln Val Trp Ser Arg Tyr Val Pro Asp Ala Asn Ala Pro Lys Ala Ser 35 40 45 Ala Ile 50 <210> 411 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 411 Met Gly Arg Gly Ser His His His His His His Ala Arg Ser Thr Met 1 5 10 15 Asn Thr Asn Arg Met Asp Ile Gln Arg Leu Met Thr Asn His Val Lys 20 25 30 Arg Asp Ser Ser Pro Gly Ser Ile Asp Ala Asn Ala Pro Lys Ala Ser 35 40 45 Ala Ile 50 <210> 412 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 412 Met Gly Arg Gly Ser His His His His His His Ala Arg Ser Asn Leu 1 5 10 15 Tyr Ile Thr Gly Glu Phe Lys Arg Gln Thr Asp Asn Asn Gly Ser Glu 20 25 30 Leu Arg Arg Met Ser Arg Pro Arg Asp Ala Asn Ala Pro Lys Ala Ser 35 40 45 Ala Ile 50 <210> 413 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 413 Met Gly Arg Gly Ser His His His His His His Ala Arg Ser Asn Cys 1 5 10 15 Leu Ile Ser Leu Thr Ala Glu Glu Lys Ala Leu Asn Arg Met Met Asn 20 25 30 Val Ser Val Pro Arg Val Met Thr Asp Ala Asn Ala Pro Lys Ala Ser 35 40 45 Ala Ile 50 <210> 414 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 414 Met Gly Arg Asp Ser His His His His His His Ala Arg Ser Ile Ala 1 5 10 15 Asn Met Tyr Gln Leu Trp Ser Met Asn Arg Ser Asp His Asn Leu Val 20 25 30 Ile Lys Lys Gln Met Ser Leu Leu Asp Ala Asn Ala Pro Lys Ala Ser 35 40 45 Ala Ile 50 <210> 415 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 415 Met Gly Arg Gly Ser His His His His His His Ala Arg Ser Leu Ser 1 5 10 15 Arg Leu Ala Thr Val Leu Asp Glu Pro Asp Arg Ser Leu Gln Thr Arg 20 25 30 Thr Asn Arg Pro His Arg Met Ile Asp Ala Asn Ala Pro Lys Ala Ser 35 40 45 Ala Ile 50

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  52. Figure 712013002086415-pct00039
    (서열번호 72);
    Figure 712013002086415-pct00040
    (서열번호 73);
    Figure 712013002086415-pct00051
    (서열번호 74);
    Figure 712013002086415-pct00045
    (서열번호 75); 및
    Figure 712013002086415-pct00050
    (서열번호 76)
    으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진, 백일해 독소에 결합하는 능력을 갖는 분리된 펩타이드.
  53. 삭제
  54. 제52항에 있어서, 아미노산 서열 SGCVKKDELCSQSVPMCCEPLECKWFNENYGICGS (서열번호 75)로 이루어진 펩타이드.
  55. 제52항 또는 제54항에 있어서, 하나 이상의 아미노산이 보존적으로 치환된, 펩타이드.
  56. 제55항에 있어서, 바이오티닐화된 펩타이드.
  57. 삭제
  58. 삭제
  59. 제52항 또는 제54항에 있어서, 글루타티온-S-트란스퍼라제에 부착된 펩타이드.
  60. 삭제
  61. 제52항 또는 제54항에 있어서, 고체 지지체에 부착된 펩타이드.
  62. 삭제
  63. 제61항에 있어서, 상기 고체 지지체가 세파로스인, 펩타이드.
  64. 삭제
  65. 삭제
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  67. 제52항 또는 제54항에 있어서, 상기 펩타이드에 결합된 백일해 독소를 추가로 포함하는 펩타이드.
  68. 삭제
  69. 제52항 또는 제54항에 있어서, 상기 펩타이드가 백일해 독소의 정제에 사용되는, 펩타이드.
  70. 백일해 독소를 포함하는 생물학적 용액을 제52항 또는 제54항의 펩타이드와 접촉시켜 백일해 독소-펩타이드 복합체를 형성하고 상기 복합체를 분리함을 포함하는, 백일해 독소를 정제하는 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 펩타이드가 고체 지지체에 결합된, 방법.
  72. 삭제
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