KR101309910B1 - Syndecan-2 peptide fragment as a marker for diagnosing colorectal cancer and as a therapeutic agent thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신데칸 단백질 단편을 포함하는 대장암 진단 마커, 치료 및 그 응용에 관한 발명이다.The present invention relates to colorectal cancer diagnostic markers, therapies and their applications, including synthecan protein fragments.
Description
본 발명은 신데칸 단백질 단편을 포함하는 대장암 진단 마커, 치료 및 그 응용에 관한 발명이다.
The present invention relates to colorectal cancer diagnostic markers, therapies and their applications, including synthecan protein fragments.
대장암은 병리학적으로는 대부분이 선암(adenocarcinoma)이며, 부위별로는 크게 결장암과 직장암으로 구분된다. 부위별 발생 빈도는 하부 대장, 즉 직장에서 발생하는 경우가 약 50%로 가장 높다. 최근의 연구 결과에 의하면, 식이 습관의 변화로 한국에서도 대장암의 발생률과 그에 따른 사망률이 현저하게 증가하고 있으며, 대장암의 발생률은 1995년 이후 2002년까지 420% 증가하여 암 중 발생률 1위를 나타내고 있다(2003 건강보험통계연보, 국민건강보험공단 발간). 또한 미국 및 유럽에서는 암 관련 사망의 두 번째 요인으로 작용한다(American Cancer Society statics for 2009).Colorectal cancer is most commonly adenocarcinoma, and it is divided into colon cancer and rectal cancer. The incidence of each site is highest in the lower colon, or rectum, about 50%. Recent studies have shown that the incidence and mortality rates of colorectal cancer are increasing in Korea due to changes in dietary habits, and the incidence of colorectal cancer has increased by 420% from 1995 to 2002, (2003 Annual Report on Health Insurance Statistics, National Health Insurance Corporation). It is also the second leading cause of cancer-related deaths in the United States and Europe (American Cancer Society statics for 2009).
대장암의 발병 원인은 아직 불분명하지만 유전적 요인, 고지방 및 저섬유 음식의 섭취와 관련된 식이습관 및 염증성 장질환 등이 고려되고 있다. 대장암은 모든 연령층에서 발생할 수 있으나, 연령이 증가함에 따라 발생빈도가 높아지며 50~60대에서 자주 발생한다. 남녀의 발생 비는 결장암은 여자, 직장암은 남자에서 다소 높게 나타난다.The cause of colorectal cancer is still unclear, but genetic factors, dietary habits associated with eating high-fat and low-fiber foods, and inflammatory bowel disease are considered. Colorectal cancer can occur in all age groups, but as the age increases, the incidence increases and occurs frequently in the 50s and 60s. The incidence ratios of men and women are higher in women with colon cancer and men with rectal cancer.
대장암의 치료는 외과적 절제술을 근간으로 항암화학요법 및 방사선요법이 병행된다. 수술적 요법, 항암화학요법 및 방사선요법 등의 진보에도 불구하고 특정한 증상이 없이 진행되는 대장암의 특성으로 인해 다른 장기로 전이된 후 진단되어 수술시점을 놓친 경우에는 사망률이 높은 것으로 알려져 있다. 5년 평균생존율은 1기의 경우 90% 이상, 2기의 경우 70% 이상, 3기의 경우 50% 이상이고 4기의 경우에는 5% 이하로 나타나지만(2004 암정보, 국립암센터 발간), 대장암을 조기에 발견하고 치료할수록 생존율이 현저히 증가하는 것을 알 수 있다. 따라서 대장암의 조기 진단 방법이 절실히 요구되고 있는 실정이다.The treatment of colorectal cancer is based on surgical resection combined with chemotherapy and radiotherapy. Despite advances in surgical therapies, chemotherapy, and radiation therapy, mortality is known to be high if patients miss the point of operation after metastasizing to other organs due to the characteristics of colorectal cancer that progress without specific symptoms. The 5-year average survival rate is above 90% in
대장암의 진단은 대장과 관련된 증세를 보이는 환자에게 직장 수지검사(rectal digital examination), 분변 잠혈검사(fecal occult blood test) 및 대장조영술에 의해 수행되고 있으며, 필요에 따라 결장경검사를 통한 조직검사가 행해진다. 현재 이용 가능한 가장 조기의 검출방법은 분변혈에 대한 시험 또는 내시경 과정을 수반한다.The diagnosis of colorectal cancer is performed by rectal digital examination, fecal occult blood test and colonography in patients with colon-related symptoms. Is done. The earliest detection methods currently available involve testing or endoscopic procedures for fecal blood.
그러나, 분변 혈이 검출되기 전까지 전형적으로는 상당한 종양 크기가 존재해야만 한다. 잠혈 기준(guaiacbased)의 분변 검사의 감수성은 26%로 이는 악성 병변이 있는 74%의 환자가 검출되지 않은 채로 있게 됨을 의미한다(Ahlquist et al., Gastroenterol. Clin. North Am. 26: 41-55, 1997). 전암성 및 암성 병변의 시각화는 조기 검출에 대한 최선의 접근법이지만, 결장내시경은 상당한 비용 뿐만 아니라 환자에게 고통과 위험을 초래할 수 있다는 문제점이 있다(Silvis et al., JAMA 235: 928-930, 1976; Geenen et al., Am. J. Dig. Dis. 20:231-235, 1975; Anderson et al., J. Natl. Cancer Institute 94: 1126-1133, 2002).However, significant tumor size must typically be present before fecal blood can be detected. The susceptibility of guaiacbased fecal testing is 26%, which means that 74% of patients with malignant lesions remain undetected (Ahlquist et al., Gastroenterol. Clin. North Am. 26: 41-55 , 1997). Visualization of precancerous and cancerous lesions is the best approach to early detection, but there is a problem that colonoscopy can cause pain and risk to the patient as well as significant costs (Silvis et al., JAMA 235: 928-930, 1976). Geenen et al., Am. J. Dig. Dis. 20: 231-235, 1975; Anderson et al., J. Natl. Cancer Institute 94: 1126-1133, 2002).
상기와 같은 종래의 방법들은 진단의 정확도가 낮을 뿐만 아니라, 대장암이 발병하기 이전의 환자들에 대한 조기 진단이 불가능하며, 피검체들에게 불편을 주는 문제점이 있다. 이러한 기존 진단방법의 단점을 보완하기 위한 방법으로 환자의 혈장에서 종양 표지자(marker)의 농도를 측정하여 대장암을 진단하려는 시도가 있었다(Clinton et al., Biomed. Sci. Instrum. 39: 408-414, 2003; Rui et al., Proteomics 3: 433-439, 2003;Soletormos et al., Dan. Med. Bull. 48: 229-255, 2001).Conventional methods as described above are not only low in accuracy of diagnosis, but also impossible for early diagnosis of patients before colorectal cancer develops, and are inconvenient to the subjects. In order to make up for the shortcomings of these conventional diagnostic methods, there have been attempts to diagnose colorectal cancer by measuring the concentration of tumor markers in the patient's plasma (Clinton et al., Biomed. Sci. Instrum. 39: 408-). 414, 2003; Rui et al., Proteomics 3: 433-439, 2003; Soltormos et al., Dan. Med. Bull. 48: 229-255, 2001).
현재, 태아성암항원(CEA), 종양-연관 당단백질을 근거로 한 진단적 혈장 시험만이 대장암 분야에서의 진단 보조에 이용가능하다. CEA는 대장암, 위암, 췌장암 및 대다수의 유방 암종, 폐 암종 및 두경부 암종을 가진 환자로부터 수득된 조직의 95%에서 증가한다(Goldenberg et al., J. Natl. Cancer Inst.(Bethesda) 57: 11-22,1976). 상승된 CEA 수준은 또한 비-악성 질환을 가진 환자에서도 보고되었으며, 대장암이 있는 대다수 환자가 혈청에서, 특히 질환의 조기 단계 동안에는 정상적인 CEA 수준을 나타내었다(Carriquiry et al., Dis. Colon Rectum 42: 921-929, 1999; Herrera et al., Ann. Surg. 183: 5-9, 1976; Wanebo et al., N. Engl. J. Med.299: 48-451, 1978). 검출 재발에서의 혈청 또는 혈장으로부터 측정된 CEA의 이용은 보고 상 논란의 여지가 있으며, 아직 널리 적용되지 못하고 있다(Martell et al., Int. J. Biol. Markers 13: 145-149, 1998; Moertelet al., JAMA 270: 943-947, 1993).
Currently, only diagnostic plasma tests based on fetal cancer antigens (CEA), tumor-associated glycoproteins are available for diagnostic assistance in the field of colorectal cancer. CEA is increased in 95% of tissues obtained from patients with colorectal cancer, gastric cancer, pancreatic cancer and the majority of breast carcinomas, lung carcinomas and head and neck carcinomas (Goldenberg et al., J. Natl. Cancer Inst. (Bethesda) 57: 11-22,1976). Elevated CEA levels have also been reported in patients with non-malignant diseases, with the majority of patients with colorectal cancer showing normal CEA levels in the serum, especially during the early stages of the disease (Carriquiry et al., Dis. Colon Rectum 42 : 921-929, 1999; Herrera et al., Ann. Surg. 183: 5-9, 1976; Wanebo et al., N. Engl. J. Med. 299: 48-451, 1978). The use of CEA measured from serum or plasma in detection relapse is controversial in reporting and not yet widely applied (Martell et al., Int. J. Biol. Markers 13: 145-149, 1998; Moertelet al., JAMA 270: 943-947, 1993).
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 대장암의 조기 진단을 위한 마커를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 신데칸(Syndecan)-2 펩티드 단편이 대장암 환자의 혈청 등의 시료에서 검출되는 것을 확인하는 동시에 신데칸(Syndecan)-2 펩티드 단편이 대장암 활성을 촉진하는 것을 규명하여 신데칸(Syndecan)-2 단편을 이용한 대장암 진단 가능성을 확인하였으며, 또한 대장암 환자 혈액에서 신데칸(Syndecan)-2 단편을 제거한 경우 대장암 환자 혈액의 암활성 촉진 효과가 없음을 확인하여, 이를 활용하면 대장암 치료효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
Against this background, the present inventors have made diligent efforts to develop markers for early diagnosis of colorectal cancer, confirming that Syndecan-2 peptide fragments are detected in samples such as serum of colorectal cancer patients. Syndecan-2 peptide fragment was promoted to promote colorectal cancer activity, confirming the possibility of diagnosing colorectal cancer using Syndecan-2 fragment, and syndecan-2 fragment in blood of colorectal cancer patients. When removed, it was confirmed that there is no effect of promoting cancer activity in the blood of colorectal cancer patients, and when it was used, it was confirmed that the treatment effect of colorectal cancer was completed and the present invention was completed.
본 발명의 하나의 목적은 대장암 마커인 신데칸-2 펩티드 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.One object of the present invention is to provide a composition for diagnosing colorectal cancer, which comprises an agent for measuring the expression level of a syndecan-2 peptide fragment, which is a colorectal cancer marker.
본 발명의 다른 목적은 상기 대장암 진단용 조성물을 포함하는 대장암 키트를 제공하는 것이다.Another object of the present invention to provide a colorectal cancer kit comprising the composition for diagnosing colorectal cancer.
본 발명의 또 다른 목적은 대장암 진단을 위한 정보의 제공을 위하여, 대장암 마커 신데칸-2 펩티드 단편을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide a method for detecting a colorectal cancer marker syndecan-2 peptide fragment in order to provide information for diagnosing colorectal cancer.
본 발명의 또 다른 목적은 대장암 마커 신데칸-2 펩티드 단편을 이용하여 대장암 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a method for screening a colorectal cancer therapeutic agent using a colorectal cancer marker syndecane-2 peptide fragment.
본 발명의 또 다른 목적은 신데칸-2 펩티드 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 대장암 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
Still another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating colorectal cancer, comprising an antibody that specifically binds to a Sindecan-2 peptide fragment.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 신데칸(Syndecan)-2 펩티드 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물을 제공한다.As one embodiment for achieving the above object, the present invention provides a composition for diagnosing colorectal cancer comprising an agent for measuring the expression level of the Syndecan-2 peptide fragment.
본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 대장암 발병 여부를 확인하는 것이다.As used herein, the term "diagnostic" means identifying the presence or characteristic of a pathological condition. For the purposes of the present invention, the diagnosis is to confirm the development of colorectal cancer.
본 발명에서 용어, "진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 대장암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 대장암을 가진 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 대장암 진단 마커는 정상 대장 조직의 세포에 비하여, 대장암 세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이는 신데칸(Syndecan)-2 펩티드 단편이다.As used herein, the term "diagnostic marker, diagnostic marker, or diagnostic marker" refers to a substance which can diagnose colon cancer cells separately from normal cells, and increases or decreases in cells with colorectal cancer as compared to normal cells. Organic biomolecules such as polypeptides or nucleic acids (eg, mRNAs), lipids, glycolipids, glycoproteins or sugars (monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, and the like) that exhibit a decrease. For the purposes of the present invention, the colorectal cancer diagnostic markers of the present invention are Syndecan-2 peptide fragments that exhibit a particularly high level of expression in colorectal cancer cells as compared to cells of normal colon tissue.
본 발명에서 용어, "신데칸(Syndecan)-2 펩티드 단편"은 이에 제한되지 않으나, 정상 개체와 대장암 개체를 구분할 수 있는 신데칸(Syndecan)-2 단백질의 일부 단편이다. 신데칸(Syndecan)-2는 세포 표면에 존재하는 세포결합 수용체로, 막횡단 헤파란-설페이트 프로테오글리칸이다(Carey, D.J. (1997). Syndecans: multifunctional cell-surface co-receptors. Biochem. J. Pt 1, 1-16). 그 유전자 및 단백질 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 에 등록되어 있다(NM_002998, NP_002989). 본 발명자들은 MMP-7이 신데칸-2의 세포외 도메인을 절단하여 대장암에서 신데칸-2 펩티드 단편이 혈청 내에 다수 존재하여 대장암을 특이적으로 진단할 수 있음을 확인하였다. 아울러, 잘려진 신데칸-2인 신데칸-2 펩티드 단편이 대장암의 이동에 중요한 역할을 하는 것을 확인하였다.As used herein, the term "Syndecan-2 peptide fragment" is not limited thereto, but is a fragment of the Syndecan-2 protein that can distinguish between normal and colorectal cancer individuals. Syndecan-2 is a cell-bound receptor on the cell surface that is a transmembrane heparan-sulfate proteoglycan (Carey, DJ (1997). Syndecans: multifunctional cell-surface co-receptors. Biochem.
바람직하게 상기 신데칸-2 펩티드 단편은 서열번호 1 또는 3에 기재된 아미노산 서열일 수 있다. 본 발명자들은 서열번호 2의 인간 신데칸-2 단백질의 N-말단의 세포외 도메인의 139번째 아미노산 또는 랫트 신데칸-2 단백질의 N-말단의 세포외 도메인의 149번째 아미노산인 루이신이 MMP-7의 절단 위치임을 최초로 규명하였으며, 상기 단편을 혈청에서 측정할 경우 비침습적인 방법으로 신속하게 대장암을 진단할 수 있음을 확인하였다. 이와 같은 신데칸-2의 대장암 마커로 사용될 수 있는 부분을 도 11에 나타냈다.Preferably the syndecan-2 peptide fragment may be an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or 3. The present inventors have found that leucine, which is the 139th amino acid of the N-terminal extracellular domain of the human syndecan-2 protein of SEQ ID NO: 2 or the 149th amino acid of the N-terminal extracellular domain of the rat syndecan-2 protein, is MMP-7 It was first identified that the cleavage position of, and when the fragment is measured in the serum it was confirmed that it is possible to diagnose colon cancer quickly by non-invasive method. The part which can be used as such a colorectal cancer marker of Cindecan-2 is shown in FIG.
본 발명에서 용어, "신데칸(Syndecan)-2 펩티드 단편의 발현수준을 측정하는 제제"란 상기와 같이 대장암 세포에서 발현이 증가하는 마커인 신데칸-2 펩티드 단편의 발현 수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 바람직하게는 마커에 특이적인 항체, 프라이머 또는 프로브를 말한다. 더 바람직하게는 항체일 수 있다. 이는 대장암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서의 대장암 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the term "agent for measuring the expression level of the Syndecan-2 peptide fragment" is a marker by confirming the expression level of the syndecan-2 peptide fragment, which is a marker for increasing expression in colorectal cancer cells as described above. Means a molecule that can be used for the detection of, preferably refers to an antibody, primer or probe specific for the marker. More preferably an antibody. This is a process of confirming the presence and expression of the protein expressed in the colorectal cancer marker gene in a biological sample in order to diagnose colorectal cancer, using an antibody that specifically binds to the protein of the gene. Check it. Analysis methods for this include Western blot, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, and rocket immunoelectrophoresis. , Tissue immunity staining, immunoprecipitation assay (Immunoprecipitation Assay), complement fixation assay (Complement Fixation Assay), FACS and protein chips (protein chip) and the like, but are not limited thereto.
단백질 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 항체이다.Agents for measuring protein levels are preferably antibodies.
본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 신데칸-2 펩티드 단편에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝 하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.As used herein, the term "antibody" refers to a specific protein molecule directed to an antigenic site as it is known in the art. For the purposes of the present invention, an antibody refers to an antibody that specifically binds to a Sindecan-2 peptide fragment, which is a marker of the present invention. Such an antibody may be obtained by cloning each gene into an expression vector according to a conventional method. The protein encoded by the gene can be obtained and prepared from conventional proteins by conventional methods. Also included are partial peptides that can be made from the protein, and the partial peptides of the invention include at least 7 amino acids, preferably 9 amino acids, more preferably 12 or more amino acids. The form of the antibody of the present invention is not particularly limited and a part thereof is included in the antibody of the present invention and all immunoglobulin antibodies are included as long as they are polyclonal antibody, monoclonal antibody or antigen-binding. Furthermore, the antibodies of the present invention include special antibodies such as humanized antibodies.
본 발명의 대장암 진단 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
Antibodies used in the detection of colorectal cancer diagnostic markers of the invention include functional fragments of antibody molecules as well as complete forms having two full length light chains and two full length heavy chains. A functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment having at least antigen binding function and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2 and Fv.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 대장암 진단용 조성물을 포함하는 대장암 진단용 키트를 제공한다.As another aspect, the present invention provides a kit for diagnosing colorectal cancer comprising the composition for diagnosing colorectal cancer.
본 발명의 키트는 대장암 진단 마커인 신데칸-2 펩티드 단편의 발현 수준을 확인함으로써 마커를 검출할 수 있다. 본 발명의 마커 검출용 키트에는 대장암 진단 마커의 발현 수준을 측정하기 위하여 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. The kit of the present invention can detect markers by confirming the expression level of the syndecane-2 peptide fragment, which is a colorectal cancer diagnostic marker. The kit for detecting markers of the present invention may include one or more other component compositions, solutions or devices suitable for analytical methods as well as antibodies that selectively recognize markers for measuring expression levels of colorectal cancer diagnostic markers.
또 다른 구체적인 일례로서, 본 발명에서 신데칸-2 펩티드 단편의 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.As another specific example, the kit for measuring the expression level of the syndecan-2 peptide fragment in the present invention is a secondary antibody labeled with a substrate, a suitable buffer, a chromogenic enzyme or a fluorophore, for the immunological detection of the antibody. Substrates and the like. The substrate may be a nitrocellulose membrane, a 96-well plate synthesized from polyvinyl resin, a 96-well plate synthesized from polystyrene resin, a slide glass made of glass, etc. The coloring enzyme may be peroxidase, Alkaline Phosphatase may be used as the fluorescent substance, FITC, RITC or the like may be used as the fluorescent substance, and ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) ) Or OPD (o-phenylenediamine), TMB (tetramethylbenzidine) can be used.
상기 키트는 i) SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법, 또는 ii) 항체에 부착된 형광표지에 의한 형광을 검출함으로써 양이 측정되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.The kit is preferably but not limited to i) a SPR (surface plasmon resonance) method or a SPRI (surface plasmon resonance imaging) method, or ii) fluorescence detection by fluorescent label attached to the antibody.
상기 항체는 본 발명의 에피토프를 대상으로 당업자에게 알려진 항체 제조방법에 의하여 제조될 수 있다.The antibody may be prepared by an antibody manufacturing method known to those skilled in the art for the epitope of the present invention.
본 발명의 키트는 암을 가진 개체와 정상 개체에서 발현에 차이가 있는 단백질 마커인 신데칸(Syndecan)-2 펩티드 단편을 측정하는데 사용될 수 있다. 상기 키트는 개체가 암인지 아닌지를 구별하여 진료 행위자가 진단 및 스크리닝하는 것을 가능하게 할 뿐 아니라, 치료에 대한 개체의 반응을 모니터하여 그 결과에 따라 치료를 변경하는 것을 가능하게 한다.The kits of the present invention can be used to measure Syndecan-2 peptide fragments, which are protein markers that differ in expression in individuals with cancer and in normal individuals. The kit not only makes it possible for the clinician to diagnose and screen the subject by discriminating whether the subject is cancerous or not, but also makes it possible to monitor the response of the subject to treatment and change the treatment according to the result.
본 발명의 키트는 상기 단백질 마커에 결합하는 1차 획득 시약(capture reagent) 및 1차 획득시약에 결합하지 않는 2차 획득 시약을 포함할 수 있다.The kit of the present invention may include a primary capture reagent that binds to the protein marker and a secondary capture reagent that does not bind to the primary capture reagent.
상기 1차 획득시약은 항체 또는 금속킬레이트, 바람직하게는 항체이고, 2차 획득시약은 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드로 표지한 접합체(conjugate)로 2차 항체이다. 발색효소는 퍼록시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 또는 산성 포스파타제(acid phosphatase)(예: 양고추냉이 퍼록시다제(horseradish peroxidase))일 수 있고 형광물질인 경우, 플루오레신카복실산(FCA), 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC), 플루오레신 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일,디하이드로테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸이 가능하다.The primary acquisition reagent is an antibody or a metal chelate, preferably an antibody, and the secondary acquisition reagent is a secondary antibody conjugated with a chromogenic enzyme, a fluorescent substance, a radioactive isotope or a colloid. The chromogenic enzyme may be a peroxidase, an alkaline phosphatase or an acid phosphatase (e.g. horseradish peroxidase), and in the case of a fluorescent substance, a fluorescenecarboxylic acid ( FCA), fluorescein isothiocyanate (FITC), fluorescein thiourea (FTH), 7-acetoxycarin-3-yl, fluorescein-5-yl, 2 ', 7'-dichlorofluorescein-6-yl, dihydrotetramethyl rosamin-4-yl, tetramethylrhodamine-5-yl, 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-ethyl or 4,4-difluoro- 5,7-diphenyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-ethyl.
개체로부터 수득된 시료를 1차 획득시약, 바람직하게는 마커에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키는 경우, 시료는 항체와 접촉 전에 알맞은 정도로 희석될 수 있고 항체는 세척이나 복합체의 분리 등 그 이후의 단계를 용이하게 하기 위해 고형상에 고정될 수 있다. 고형상은 유리나 플라스틱 예를 들어 미세역가 플레이트 (microtiter plate), 막대, 비드(bead) 또는 미세비드(microbead) 등이 될 수 있다. 항체는 또한 프로브 기질이나 단백질 칩에 결합될 수 있다. 시료를 항체와 정온배치한 후 세척하여 항체-마커 복합체를 측정할 수 있다. 이는 세척된 혼합물을 2차 획득시약, 바람직하게는 2차 항체와 정온 배치하여 수행된다. 항체-마커 복합체의 양 측정이나 존재 검출은 형광, 발광, 화학발광(chemiluminescence), 흡광도, 반사 또는 투과를 통해 이루어질 수 있다. 상기 방법 외에도 시료 내의 단백질 마커는 간접적인 분석방법 예를 들어, 단백질 마커의 다른 에피토프에 결합하는 모노클론 항체와 경쟁 또는 억제 반응 분석을 실시하여 검출할 수 있다.When a sample obtained from an individual is contacted with an antibody that specifically binds to a first acquisition reagent, preferably a marker, the sample may be diluted to an appropriate degree before contact with the antibody and the antibody may be diluted to a suitable degree And can be fixed in a solid form to facilitate the step. The solid form can be glass or plastic, for example a microtiter plate, rod, bead or microbead. Antibodies can also be conjugated to probe substrates or protein chips. The sample can be placed at a constant temperature with the antibody and then washed to measure the antibody-marker complex. This is done by placing the washed mixture at a constant temperature with a secondary acquisition reagent, preferably a secondary antibody. Determination of the amount or presence of the antibody-marker complex can be accomplished through fluorescence, luminescence, chemiluminescence, absorbance, reflection or transmission. In addition to the above methods, protein markers in a sample can be detected by indirect assay methods, for example, competition or inhibition assay analysis with a monoclonal antibody that binds to another epitope of a protein marker.
또한, 본 발명의 키트는 상기 단백질 마커에 결합하는 항체를 처리한 후 결합한 항체의 양을 탐색함으로써 대장암을 진단 및 스크리닝 할 수 있다.In addition, the kit of the present invention can diagnose and screen colorectal cancer by treating the amount of antibody bound to the antibody after binding to the protein marker.
상기 결합한 항체의 양을 탐색하는 방법으로는 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템을 이용하는 것이 바람직하고, 여기에는 형광 표지에 의한 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법, 형광물질의 표지없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The high throughput screening (HTS) system is preferably used as a method for searching for the amount of the bound antibody. For example, a fluorescence method performed by detecting fluorescence by fluorescence labeling, a method of detecting the surface plasmon resonance It is preferable to use a surface plasmon resonance (SPR) method for measuring changes in real time or a surface plasmon resonance imaging (SPRI) method for imaging and verifying an SPR system. However, the present invention is not limited thereto.
상기 형광법은 형광 스캐너 프로그램을 이용하여 상기 단백질 마커에 특이적 항체에 결합하는 항체를 형광물질로 라벨링한 후 스포팅하여 신호를 확인하는 방법으로, 이 방법을 적용하여 결합 정도를 확인할 수 있다. 상기 형광물질은 Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(poly L-lysine-fluoresceinThe fluorescence method is a method of labeling an antibody binding to a specific antibody to a protein marker using a fluorescence scanner program and spotting the antibody to confirm the signal, and the degree of binding can be confirmed by applying this method. The fluorescent material is Cy3, Cy5, poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate (poly L-lysine-fluorescein
isothiocyanate, FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트 (rhodamine-B-isothiocyanate, RITC), 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것 바람직하나 이에 한정되지 않는다.isothiocyanate (FITC), rhodamine-B-isothiocyanate (rhodamine-B-isothiocyanate, RITC), and any one selected from the group consisting of rhodamine (rhodamine), but is not limited thereto.
상기 SPR 시스템은 형광법과는 달리 시료를 형광물질로 표지할 필요가 없이 항체의 결합 정도를 실시간으로 분석하는 것이 가능하다. SPRI의 경우에는 미세정렬 방법을 이용하여 동시다발적인 시료 분석이 가능하다.Unlike the fluorescence method, the SPR system does not need to label the sample with a fluorescent material, and it is possible to analyze the binding degree of the antibody in real time. In the case of SPRI, it is possible to perform simultaneous multiple sample analysis using microarray method.
또한, 본 발명의 키트는 효소와 발색 반응할 기질 및 결합되지 않은 단백질 등은 제거하고 결합된 단백질 마커만을 보유할 수 있는 세척액 또는 용리액을 포함할 수 있다. 분석을 위해 사용되는 시료는 혈청, 뇨, 눈물 타액 등 정상적인 상태와 구별될 수 있는 질환 특이적 폴리펩타이드를 확인할 수 있는 생체 시료를 포함한다. 바람직하게는 생물학적 액체 시료, 예를 들어 혈액, 혈청, 혈장으로부터 측정될 수 있다. 시료는 단백질 마커의 탐지감도를 증가시키도록 준비될 수 있는데 예를 들어 환자로부터 수득한 혈청 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 액체 크로마토그래피, 연속추출(sequential extraction) 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전 처리될 수 있다.
In addition, the kit of the present invention may include a washing solution or an eluent which can remove the substrate and unbound protein and the like to develop a color reaction with an enzyme and retain only bound protein markers. Samples used for analysis include biological samples capable of identifying disease specific polypeptides that can be distinguished from normal conditions such as serum, urine, and tear saliva. Preferably from biological liquid samples such as blood, serum, plasma. The sample may be prepared to increase the detection sensitivity of the protein marker. For example, serum samples obtained from a patient may be subjected to anion exchange chromatography, affinity chromatography, size exclusion chromatography, liquid chromatography, Can be pretreated using methods such as sequential extraction or gel electrophoresis.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 대장암이 의심되는 개체의 시료로부터 신데칸-2 (syndecan-2) 펩티드 단편의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 신데칸-2 펩티드 단편의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 신데칸-2 펩티드 단편의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 대장암 마커인 신데칸-2 펩티드 단편을 검출하는 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method for detecting colorectal cancer, comprising the steps of: measuring the expression level of a syndecan-2 peptide fragment from a sample of a suspected colorectal cancer; And comparing the expression level of the syndecane-2 peptide fragment with the expression level of the syndecane-2 peptide fragment of a normal control sample. .
본 발명에서 용어 개체의 시료란 대장암 마커인 신데칸-2 펩티드 단편의 발현 수준이 차이나는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 혈액, 혈청 또는 혈청일 수 있다.In the present invention, a sample of an individual includes a sample such as tissue, cells, blood, serum, plasma, saliva, sputum, cerebrospinal fluid, or urine, in which the expression level of the syndecan-2 peptide fragment, which is a colorectal cancer marker, is different. It is not limited. Preferably, blood, serum or serum.
상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 신데칸-2 펩티드 단편 발현 수준을 대장암 의심 개체에서의 발현 수준과 비교함으로써 대장암 의심 개체의 실제 암 환자 여부를 진단할 수 있다. 즉, 대장암으로 추정되는 세포로부터 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하고, 정상 세포로부터 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 본 발명의 마커의 발현 수준이 정상 세포의 것보다 대장암으로 추정되는 세포 유래에서 더 많이 발현되면 대장암으로 추정되는 세포를 대장암으로 예측할 수 있는 것이다.Through the above detection methods, it is possible to diagnose whether a colorectal cancer suspect is an actual cancer patient by comparing the expression level of the syndecane-2 peptide fragment in the normal control group with that of the colorectal cancer suspect. That is, the expression level of the marker of the present invention is measured from cells presumed to be colon cancer, the expression level of the marker of the present invention is measured from normal cells, and the expression level of the marker of the present invention is compared with that of normal cells Colon cancer is more likely to be expressed in a cell derived from the presumed colon cancer can be predicted to colon cancer cells.
신데칸-2 펩티드 단편 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 대장암 의심 개체에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 대장암 마커 유전자에서 신데칸-2 펩티드 단편으로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여, 대장암 의심 환자의 실제 대장암 발병 여부를 진단할 수 있다.Analytical methods for measuring syndecan-2 peptide fragment levels include Western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoproliferation, oukteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement Fixed assays, FACS, protein chips, and the like. Through the above assay methods, the amount of antigen-antibody complex formation in a normal control group and the amount of antigen-antibody complex formation in a suspected colorectal cancer subject can be compared, and the significance of the colorectal cancer marker gene to the synthecan-2 peptide fragment is significant. By determining whether the expression level is increased, it is possible to diagnose whether colorectal cancer is suspected to actually develop colorectal cancer.
본 발명에서 용어 항원-항체 복합체란 대장암 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성 량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.In the present invention, the term antigen-antibody complex means a combination of a colorectal cancer marker protein and an antibody specific thereto, and the amount of antigen-antibody complex formation can be quantitatively measured through the size of a signal of a detection label. .
이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8 , [Os(bpy) 3 ] 2+ ,[RU(bpy) 3 ] 2+, [MO(CN) 8 ] 4- 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I , 186Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.Such a detection label may be selected from the group consisting of enzymes, fluorescent materials, ligands, luminescent materials, microparticles, redox molecules and radioisotopes, but is not necessarily limited thereto. When enzymes are used as detection labels, available enzymes include β-glucuronidase, β-D-glucosidase, β-D-galactosidase, urease, peroxidase or alkaline phosphatase, acetylcholinese Therapies, glucose oxidase, hexokinase and GDPase, RNase, glucose oxidase and luciferase, phosphofructokinase, phosphoenolpyruvate carboxylase, aspartate aminotransferase, phosphphenolpyruvate deca Carboxylase, β-latamase, and the like, but are not limited thereto. The minerals include, but are not limited to, fluorescein, isothiocyanate, rhodamine, picoeriterine, picocyanin, allophycocyanin, o-phthaldehyde, fluororescamine and the like. Ligands include, but are not limited to, biotin derivatives. Emitters include, but are not limited to, acridinium esters, luciferin, luciferase, and the like. Fine particles include, but are not limited to, colloidal gold, colored latex, and the like. Redox molecules include ferrocene, ruthenium complex compounds, Biology hydrogen, quinone, Ti ions, Cs ions, diimide, 1,4-benzoquinone, hydroquinone, K 4 W (CN) 8 , [Os (bpy) 3] 2+ , [RU (bpy) 3 ] 2+ , [MO (CN) 8 ] 4-, and the like. Radioisotope includes include 3 H, 14 C, 32 P , 35 S, 36 Cl, 51 Cr, 57 Co, 58 Co, 59 Fe, 90 Y, 125 I, 131 I, 186 Re are not limited to .
단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소 적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소 적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 대장암 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 대장암 발병 여부를 확인할 수 있다.Protein expression level measurement is preferably by using an ELISA method. ELISA is a direct ELISA using a labeled antibody that recognizes an antigen attached to a solid support, an indirect ELISA using a labeled antibody that recognizes a capture antibody in a complex of antibodies that recognize an antigen attached to a solid support, attached to a solid support Direct sandwich ELISA using another labeled antibody that recognizes the antigen in the antibody-antigen complex, a labeled antibody that recognizes the antibody after reacting with another antibody that recognizes the antigen in the complex of the antigen with the antibody attached to the solid support Various ELISA methods include indirect sandwich ELISA using secondary antibodies. More preferably, the antibody is attached to a solid support, reacted with a sample, and then labeled with a labeled antibody that recognizes the antigen of the antigen-antibody complex, for enzymatic color development or for an antibody that recognizes the antigen of the antigen-antibody complex. Detected by sandwich ELISA method by attaching labeled secondary antibody and enzymatic color development. By checking the degree of complex formation of the colorectal cancer marker protein and antibody, it is possible to determine whether colorectal cancer is developed.
또한, 바람직하게는, 상기 대장암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀룰로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 대장암 발병 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 유전자의 발현 량과 대장암이 발병한 세포에서의 마커 유전자의 발현 량을 조사하는 방법으로 이루어진다. 펩티드 단편의 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.Also preferably, Western blot using at least one antibody against the colorectal cancer marker. The whole protein is separated from the sample, and the protein is separated according to size by electrophoresis, and then transferred to the nitrocellulose membrane to react with the antibody. By checking the amount of the generated antigen-antibody complex using a labeled antibody, the amount of the protein produced by the expression of the gene can be confirmed to determine whether colorectal cancer is developed. The detection method comprises a method of examining the expression level of a marker gene in a control group and the expression level of a marker gene in a cell in which colon cancer has developed. The level of peptide fragments can be expressed as the absolute (eg μg / ml) or relative (eg relative intensity of signal) differences of the marker proteins described above.
또한, 바람직하게는, 상기 대장암 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 대장암 발병 여부를 확인할 수 있다.Also, preferably, at least one antibody against the colon cancer marker is arranged at a predetermined position on the substrate, and the protein chip is immobilized at a high density. In the method of analyzing a sample using a protein chip, the protein is separated from the sample, and the separated protein is hybridized with the protein chip to form an antigen-antibody complex, which is read to confirm the presence or expression level of the protein, Colon cancer can be checked.
구체적인 일례로서, 신데칸-2 펩티드 단편의 발현 수준의 측정은 전기영동(Electrophoresis), MALDI-TOF MS(Matrix-assisted laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometry) 또는 SELDI-TOF MS(surface-enhanced laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometry) 방법을 이용하여 측정되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
As a specific example, the measurement of the expression level of the syndecane-2 peptide fragment can be performed by electrophoresis, matrix-assisted laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometry (SALDI-TOF MS) The measurement is preferably performed using an enhanced laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometry method, but is not limited thereto.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 대장암 치료용 후보물질 처리 후, 신데칸(Syndecan)-2 펩티드 단편의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 대장암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.As another aspect, the present invention provides a method for screening a colorectal cancer therapeutic agent, comprising measuring the expression level of a Syndecan-2 peptide fragment after treatment with a candidate substance for treating colorectal cancer.
구체적으로, 대장암 치료 후보 물질의 존재 및 부재 하에서 신데칸-2 펩티드 단편의 발현의 증가 또는 감소를 비교하는 방법으로 대장암 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용할 수 있다. 신데칸-2 펩티드 단편의 농도를 간접적으로 또는 직접적으로 감소시키는 물질은 대장암의 치료제로서 선택할 수 있다. 즉, 대장암 치료 후보 물질의 부재 하에 대장암 세포에서의 본 발명의 마커 신데칸-2 펩티드 단편의 발현 수준을 측정하고, 또한 대장암 치료 후보 물질의 존재 하에서 본 발명의 마커 신데칸-2 펩티드 단편의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 대장암 치료 후보 물질이 존재할 때의 본 발명의 마커의 발현 수준이 대장암 치료 후보 물질의 부재 하에서의 마커 발현 수준보다 감소시키는 물질을 대장암의 치료제로 예측할 수 있는 것이다.Specifically, it can be usefully used for screening a colorectal cancer therapeutic agent by a method of comparing the increase or decrease of the expression of the syndecane-2 peptide fragment in the presence and absence of a candidate for treating colorectal cancer. Substances that directly or indirectly reduce the concentration of syndecane-2 peptide fragments may be selected as therapeutic agents for colorectal cancer. That is, the expression level of the marker syndecan-2 peptide fragment of the present invention in colorectal cancer cells in the absence of a candidate for colorectal cancer treatment is measured, and also the marker syndecan-2 peptide of the present invention in the presence of a candidate for colorectal cancer treatment After measuring the expression levels of the fragments and comparing the two, the agent for reducing the expression level of the marker of the present invention in the presence of the candidate for treating colorectal cancer is lower than the marker expression level in the absence of the candidate for treating colorectal cancer. It can be predicted as
바람직하게는 MMP-7의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명자들은 신데칸-2 펩티드 단편의 발현 수준이 대장암에서 특이적으로 증가하는 것을 확인하였으며, 이는 MMP-7에 의한 것임을 확인하였다. 따라서, MMP-7의 발현 수준이 감소하면 대장암 치료제임을 알 수 있다.Preferably, the method may further include measuring the expression level of MMP-7. The inventors confirmed that the expression level of the syndecane-2 peptide fragment was specifically increased in colorectal cancer, which was confirmed by MMP-7. Therefore, it can be seen that the decreased expression level of MMP-7 is a therapeutic agent for colorectal cancer.
또한 본 발명자들은 신데칸-2의 서열번호 4의 세포외 도메인의 149번째 아미노산인 루이신을 이소루이신으로 돌연변이시키면 MMP-7에 의해 신데칸-2가 절단이 되지 않음을 최초로 규명하였다. 아울러, 서열번호 2의 세포외 도메인의 139번째 아미노산인 루이신을 이소루이신으로 돌연변이시키면 MMP-7에 의해 신데칸-2가 절단이 되지 않음을 최초로 규명하였다. In addition, the present inventors first identified that when mutant leucine, the 149th amino acid of the extracellular domain of SEQ ID NO: 4 of syndecane-2, is mutated to isoleucine, no synthecan-2 is cleaved by MMP-7. In addition, when mutant leucine, which is the 139th amino acid of the extracellular domain of SEQ ID NO: 2, is mutated to isoleucine, it was first identified that syndecane-2 was not cleaved by MMP-7.
이에 근거하여, 상기 치료제는 서열번호 4의 신데칸-2 세포외 도메인의 149번째 잔기인 루이신을 이소루이신으로 돌연변이시키는 것일 수 있다. 또는 서열번호 4의 신데칸-2 세포외 도메인의 149번째 잔기를 MMP-7이 절단하지 못하도록 보호하는 역할을 하는 항체일 수 있다. 또는 상기 치료제는 서열번호 2의 신데칸-2 세포외 도메인의 139번째 잔기인 루이신을 이소루이신으로 돌연변이시키는 것일 수 있다. 또는 서열번호 2의 신데칸-2 세포외 도메인의 139번째 잔기를 MMP-7이 절단하지 못하도록 보호하는 역할을 하는 항체일 수 있다.
Based on this, the therapeutic agent may be to mutate leucine, which is the 149th residue of the syndecane-2 extracellular domain of SEQ ID NO: 4, to isoleucine. Or an antibody that serves to protect MMP-7 from cleaving the 149th residue of the syndecane-2 extracellular domain of SEQ ID NO: 4. Alternatively, the therapeutic agent may be to mutate leucine, which is the 139th residue of the syndecan-2 extracellular domain of SEQ ID NO: 2, to isoleucine. Or the 139th residue of the syndecane-2 extracellular domain of SEQ ID NO: 2 may be an antibody that serves to protect MMP-7 from cleavage.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 신데칸-2 펩티드 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 대장암 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.In another aspect, the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating colorectal cancer, comprising an antibody that specifically binds to a Sindecan-2 peptide fragment.
이러한 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함하며, 신규한 항체 외에 이미 당해 기술분야에서 공지된 항체들도 포함될 수 있다. 상기 항체는 신데칸-2 펩티드 단편을 특이적으로 인식하는 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체의 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.Such antibodies include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies or antigen binding, some of which are included in the antibodies of the invention and all immunoglobulin antibodies. Furthermore, the antibodies of the present invention also include special antibodies such as humanized antibodies, and may include antibodies already known in the art in addition to novel antibodies. Such antibodies include functional fragments of antibody molecules, as well as complete forms having the full length of two heavy chains and two light chains, as long as they have the property of binding to specifically recognize synthecan-2 peptide fragments. The functional fragment of the molecule of an antibody means the fragment which has at least antigen binding function, and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2, and Fv.
본 발명의 상기 대장암 치료용 약제학적 조성물은 신데칸-2 펩티드 단편 특이적인 항체를 이용하여, 대장암 환자의 혈청 내에서 암의 이동을 증가시키는 활성을 가지는 신데칸-2 펩티드 단편을 제거하는 방법에 이용되어, 대장암을 치료할 수 있다. 본 발명자들은 혈청에 함유된 신데칸-2 펩티드 단편을 항체를 이용해 제거하였을 경우 대장암 세포의 이동 증가 효과가 사라지는 것을 확인하여 신데칸-2 펩티드 단편이 대장암 치료의 타겟이 될 수 있음을 규명하였다.The pharmaceutical composition for treating colorectal cancer of the present invention, using a synthecan-2 peptide fragment-specific antibody, to remove the synthecan-2 peptide fragment having the activity of increasing the movement of cancer in the serum of colorectal cancer patients It can be used in the method to treat colorectal cancer. The present inventors confirmed that synthecan-2 peptide fragment may be a target of colorectal cancer treatment by confirming that the effect of increasing the movement of colorectal cancer cells disappears when the decancetic-2 peptide fragment contained in the serum is removed using an antibody. It was.
이와 같은 대장암 치료용 조성물은 신데칸-2 펩티드 단편에 특이적으로 결합하여 신데칸-2 펩티드 단편에 의한 암 활성 촉진할 수 있는 물질은 제한없이 포함하나, 그 예로서 단백질, 앱타머, 펩티드, 탄수화물, 화합물일 수 있다. Such a composition for treating colorectal cancer includes, without limitation, a substance capable of specifically binding to a synthecan-2 peptide fragment to promote cancer activity by the synthecan-2 peptide fragment, for example, a protein, an aptamer, a peptide, and the like. , Carbohydrates, compounds.
본 발명의 조성물은 단독으로 사용할 수 있지만, 치료 효율을 증가시키기 위해 방사선 요법 또는 화학요법(세포 성장 정지 또는 세포 독성 물질, 항생 물질형 물질, 알킬화제, 항대사성 물질, 호르몬제, 면역제, 인터페론형 물질, 사이클로옥시게나제 억제제, 메탈로매트릭스프로테아제 억제제, 텔로머라제 억제제, 티로신 키나제 억제제, 항성장인자 수용체 물질, 항-HER 물질, 항-EGFR 물질, 항-혈관생성 물질, 파르네실 트랜스퍼라제 억제제, ras-raf 시그날 전도 경로 억제제, 세포 주기 억제제, 기타 cdk 억제제, 튜불린 결합체, 토포이소머라제Ⅰ 억제제, 토포이소머라제 Ⅱ 억제제 등)과 같은 다른 항암 치료법과 병용하여 사용할 수 있다.The composition of the present invention may be used alone, but radiation therapy or chemotherapy (cell arrest or cytotoxic substance, antibiotic-like substance, alkylating agent, anti-metabolic substance, hormone, immune agent, interferon type) may be used to increase the treatment efficiency. Substances, cyclooxygenase inhibitors, metallomatrix protease inhibitors, telomerase inhibitors, tyrosine kinase inhibitors, anti-growth factor receptor substances, anti-HER substances, anti-EGFR substances, anti-angiogenic substances, farnesyl transferase inhibitors , ras-raf signal conduction pathway inhibitors, cell cycle inhibitors, other cdk inhibitors, tubulin conjugates, topoisomerase I inhibitors, topoisomerase II inhibitors, etc.).
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있고, 경구 투여시에는 결합체, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조될 수 있다.The composition of the present invention may be administered with a pharmaceutically acceptable carrier, and when used orally, a binder, a lubricant, a disintegrant, an excipient, a solubilizer, a dispersant, a stabilizer, a suspending agent, a pigment, a perfume, and the like may be used. In the case of injections, buffers, preservatives, analgesic agents, solubilizers, isotonic agents, stabilizers and the like can be mixed and used. For topical administration, bases, excipients, lubricants, preservatives and the like can be used. Formulations of the compositions of the present invention may be prepared in a variety of ways by mixing with pharmaceutically acceptable carriers as described above. For example, in the case of oral administration, it may be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc., and in the case of injections, they may be prepared in unit dosage ampoules or in multiple dosage forms.
본 발명에서 사용되는 용어, 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.As used herein, the term administration refers to introducing a composition of the invention to a patient in any suitable manner, and the route of administration of the composition of the invention may be administered via any general route as long as it can reach the desired tissue. have. Oral administration, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, intranasal administration, pulmonary administration, rectal administration, intranasal administration, intraperitoneal administration, intradural administration, but are not limited thereto. Do not.
본 발명의 조성물의 유효 투여량의 범위는 성별, 체표면적, 질환의 종류 및 중증도, 연령, 약물에 대한 민감도, 투여경로 및 배출비율, 투여시간, 치료기간, 표적세포, 발현 수준 등 기타 의학 분야에 잘 알려진 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
The range of effective dosages of the compositions of the present invention may range from sex, body surface area, type and severity of disease, age, sensitivity to drugs, route of administration and rate of release, time of administration, duration of treatment, target cells, expression levels, etc. It may vary according to various well-known factors, and can be easily determined by those skilled in the art.
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 잘려진 신데칸-2 단편이 대장암 세포 이동 조절에 중요한 역할을 하고, 대장암 환자의 혈청에서 검출되고 있으므로 이것을 진단 마커로 사용할 수 있다. 아울러, 대장암 환자의 혈액에서 암활성을 촉진하는 잘려진 신데칸-2 단편을 제거하거나 활성을 억제하는 물질을 통해, 새로운 대장암 치료제의 개발에 사용될 수 있다.
As can be seen from the present invention, the present invention can be used as a diagnostic marker because the cut decane-2 fragment plays an important role in the regulation of colorectal cancer cell migration and is detected in the serum of colorectal cancer patients. In addition, it can be used in the development of a new colorectal cancer therapeutic agent through a substance that removes or inhibits a truncated syndecane-2 fragment that promotes cancer activity in the blood of colorectal cancer patients.
도 1은 MMP-7이 신데칸-2의 세포외 도메인의 절단을 조절한다는 것을 나타내는 도이다. (A) 표시된 대장암 세포로부터 얻은 조건화된 배지 (CM)를 모노클론-(#197) 또는 폴리클론 (M-140) 항-신데칸-2 항체를 이용하여 슬롯 블롯팅을 수행하였다. 무혈청 배지 (SFM)를 음성 대조군을 사용하였다. (B) HT-29 세포의 조건화된 배지 내의 수용성 신데칸-2를 DEAE-Sepharose 컬럼 크로마토그래피로 분리하였다. 각 DEAE 분획을 슬롯 블롯팅 (왼쪽 패널)에 사용하였다. proteoglycan 포함 용출 분획을 heparinase로 절단하고 항-신데칸-2 항체로 웨스턴 블롯팅을 수행하였다 (오른쪽 패널). (C) HT-29 세포에 표시된 시간 동안 APMA (1 mM)를 처리하고, 조건화된 배지를 항-신데칸-2 항체로 슬롯 블롯팅을 수행하였다. APMA-활성화된 (+) 및 비-활성화된 (-) 재조합-pro-MMP-7를 SDS-PAGE 겔로 분리하고, PVDF 막에 옮긴 후, MMP-7의 latent 형태 (28kDa)또는 활성화 형태 (19 KDa)를 인식할 수 있는 항-MMP-7 항체로 표지하였다. (D) HCT116 세포를 1.5㎍의 대조군(VEC) 또는 MMP-7 코딩 발현 벡터로 트랜스펙션하고 (왼쪽 패널), pSuper-only (VEC) 또는 MMP-7 shRNA 플라스미드로 트랜스펙션하였다 (오른쪽 패널). MMP-7의 발현 수준은 RT-PCR (윗쪽 패널) 및 웨스턴 블롯팅 (중간 패널)으로 측정하였다. HCT116 세포로부터 얻은 조건화된 배지를 표시된 항-신데칸-2 항체로 슬롯 블롯팅을 수행하였다. Ponceau S 염색을 loading 대조군으로 사용하였다 (아래쪽 패널). (E) HT-29 세포를 표시된 시간 및 농도로 pro-MMP-7을 처리하였다. 조건화된 배지를 표시된 항-신데칸-2 항체로 슬롯 블롯팅을 수행하였다. (F) HT-29 세포를 표시된 pro-MMPs (1 mg/ml)로 처리하였다. 조건화된 배지를 표시된 항-신데칸-2 항체로 슬롯 블롯팅을 수행하였다.
도 2는 MMP-7이 신데칸-2의 세포외 도메인 내의 N-말단 Leu 잔기를 절단하는 것을 나타낸 도이다. (A) 정제된 GST-신데칸-2 (GST-SDC2)를 37℃에서 1시간 동안 표시된 양의 pro-MMP-7과 배양하고, 8 % SDS-PAGE로 분리한 후, CBB R-250 (Coomassie Brilliant Blue R-250)으로 염색하였고 (왼쪽 패널), 항-신데칸-2 항체로 면역블롯팅을 하였다 (오른쪽 패널). 화살표는 신데칸-2의 이량체 (D) 및 단량체(M)를 나타내며, 화살표 머리는 신데칸-2의 잘린 단편을 나타낸다(S). (B) 동량의 GST-SDC2 및 신데칸-4(SDC4)를 pro-MMP-7과 37℃에서 1시간 동안 배양하고, 항-GST 항체로 면역블롯팅을 수행하였다. (C) 동량의 정제된 GST 또는 GST-SDC2를 정제된 pro-MMP-7과 37℃에서 1시간 동안 배양하고, SDS-PAGE로 분리하여 은으로 염색하거나 항-신데칸-2 항체로 면역블롯팅하였다. (D) 잘린 SDC2 폴리펩티드를 은-염색 겔에서 분리하고, 단백질이 없는 겔 plug를 절단 대조군으로 사용하였다. 트립신 자가 단백질 가수분해 생성물을 MassLynxTm (Waters Co., UK)을 이용한 MS spectra의 calibration을 위한 내부 표준으로 사용하였다.
도 3은 MMP-7이 신데칸-2의 내인성 당쇄화 세포외 도메인을 절단하는 것을 나타낸 도이다. (A) 신데칸-2의 세포외 도메인을 인간 IgG1의 Fc 영역에 연결하여 S2E-Fc를 제조하였다(위쪽 패널). HEK293T 세포를 VEC 또는 S2E-Fc cDNA로 트랜스펙션시키고, 신데칸-2의 mRNA 발현을 표시된 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 분석하였다: β-액틴을 대조군으로 증폭하였다. 조건화된 배지로 항-신데칸-2 또는 HRP 컨쥬케이티드 항-인간 IgG 항체와 슬롯 블롯팅을 수행하였다(위쪽 패널). (B) S2E-Fc로 트랜스펙션시킨 HEK293T 세포를 표시된 시간동안 37℃에서 pro-MMP-7와 배양하였다. 반응 혼합물을 protein A-Sepharose와 배양한 후, 결합된 물질을 15 % SDS-PAGE로 분리 후, 겔을 은-염색 또는 HRP 컨쥬케이티드 항-인간 IgG 항체와 면역 블롯팅으로 수행하였다. (C) VEC 또는 S2E-Fc 트랜스펙션된 HEK293T 세포로부터 얻은 조건화 된 배지를 37℃에서 1시간 동안 GM6001의 존재 또는 부존재하에서 pro-MMP-7과 배양하였다. 배양액을 protein A-Sepharose와 반응시킨 후, 결합한 물질을 15 % SDS-PAGE로 분리한 뒤 PVDF막에 이동시켰다. PVDF막 상의 단백질은 CBB R-250로 염색하였다. (D) CBB R-250으로 염색 된 PVDF막 상의 단백질을 Tufts Core Facility (미국)에 보내어 N-말단 단백질 시퀀싱 분석 (3 사이클) 의뢰를 맡겼다.
도 4는 MMP-7에 의해 절단되는 신데칸-2 세포외 도메인의 돌연변이체의 저항성을 나타내는 도이다. (A) 야생형 신데칸-2 (SDC2-WT, GenBank accession number NM_013082.3)의 세포외 도메인의 대표적인 개략도 및 다음의 SDC2 돌연변이체를 나타낸다: Leucine (L149)→Serine(S) (SDC2-NS), Asparagine (N148)/Leucine (L149)→Serine(S) (SDC2-SS), 및 Leucine (L149)→Isoleucine (I) (SDC2-NI). 절단 부위를 화살표 머리로 나타냈다 (위쪽 패널). 동량의 정제된 GST-SDC2-WT, -SDC2-NS, SDC2-SS, 및 -SDC2-NI을 정제된 pro-MMP-7와 37℃에서 1시간 동안 배양하고, SDS-PAGE로 분리하고, CBB R-250로 염색하였다 (아래 패널). (B) HCT116 세포를 SDC2-WT 또는 표시된 SDC2 돌연변이체로 트랜스펙션시켰다. 신데칸-2의 mRNA 발현을 표시된 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 분석하였다: β-액틴을 대조군으로 증폭하였다(위쪽 패널). 조건화된 배지를 항-신데칸-2 항체로 슬롯 블롯팅 하였다 (아래쪽 패널). (C) HT-29 (왼쪽 패널) 및 HCT116 (오른쪽 패널) 세포를 1.5㎍의VEC, SDC2-WT 또는 SDC2-NI 돌연변이체 (N148/L149I; NI)로 트랜스펙션하고, 신데칸-2의 mRNA 발현을 표시된 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 분석하였다: β-액틴을 대조군으로 증폭하였다(위쪽 패널). 표시된 세포로부터 분리한 조건화된 배지를 항-신데칸-2 항체로 슬롯 블롯팅 하였다. Ponceau S 염색을 loading 대조군으로 사용하였다 (아래쪽 패널).
도 5는 잘려진 신데칸-2가 암세포의 이동에 중요함을 나타낸 도이다. (A) HT-29 및 HCT116 대장암 세포를 0.2 ㎍/ml의 정제된 잘려진 신데칸-2를 처리하고, 트랜스웰 이동분석을 실시예의 방법으로 수행한 것이다. 오차 막대 = 95% 신뢰구간 (HT-29, P = .05, HCT116, P < .01 versus 대조군). (B) HT-29 (왼쪽 패널) 및 HCT116 (오른쪽 패널)세포를 1.5 ㎍의 VEC, SDC2-WT 또는 SDC2-NI 돌연변이체 (N148/L149I; NI)로 트랜스펙션하고, 트랜스펙션된 세포 (1 x 106)를 (A)에 개시된 바에 따라 이동시켰다. 실험은 3회 수행하였다. 오차 막대 = 95 % 신뢰구간 (HT-29, SDC2-WT: P < .01; SDC2-NI 돌연변이체: P < .05, HCT116, SDC2-WT 또는 -NI 돌연변이체: P < .01 versus VEC 대조군). (C) B16F10 흑색종 세포를 1 ㎍의 벡터 대조군 (VEC), SDC2-WT, 또는 SDC2-NI 돌연변이체 (N148/L149I; NI)로 트랜스펙션시키고, 신데칸-2의 mRNA 발현을 표시된 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 분석하였다: β-액틴을 대조군으로 증폭하였다(왼쪽, 위쪽 패널). 조건화된 배지를 항-신데칸-2 항체로 슬롯 블롯팅하였다(왼쪽, 중간 패널). 트랜스펙션된 세포(1 x 105)를 젤라텐-코팅된 Transwell apparatus에서 이동시켰다 (왼쪽, 아래쪽 패널, SDC-2 WT, -NI 돌연변이체, P < .01 versus VEC 대조군). 실험은 3회 수행하였다. 오차 막대 = 95 % 신뢰구간. B16F10 세포를 225 pmol의 마우스 신데칸-2를 표적하는 siRNA 혼자, 또는 표시된 1 ㎍의 렛트 신데칸-2 구조체와 함께 트랜스펙션하고, C57BL/6 마우스 (n = 10)에 주입하였다. 2주 후, 마우스를 희생하고 폐를 적출하여 조사하였다. 두 번의 독립적인 실험을 수행하였다 (그룹당 n = 3 마우스). 각 폐의 앞 및 뒷면을 사진촬영하였다. 막대 그래프는 폐 전이 결절의 수를 나타낸다 (오른쪽 패널). 막대는 ㅍ폐 전이 결절의 중앙값을 나타낸다 (n = 3). 오차 막대 = 95 % 신뢰구간.
도 6은 절단된 신데칸-2가 암세포 이동을 증가시키고, 증식 및 부착은 조절하지 않는다는 것을 나타낸다. (A) 신데칸-2 (Met1- Asn148)의 세포외 도메인을 인간 IgG1의 Fc 영역을 연결하여 Fc 수용체-잘려진 신데칸-2 키메라 (sS2E-Fc)를 제조 한 대표적인 개략도이다 (위쪽 패널). HCT116 세포를 VEC 또는 sS2E-Fc로 트랜스펙션시키고, 신데칸-2의 mRNA 발현을 표시된 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 분석하고, 표시된 트랜스펙션된 세포로부터 분리한 조건화된 배지를 수득하여 항-신데칸-2 항체로 슬롯 블롯팅을 하였다 (아래쪽, 왼쪽 패널). 그리고 이동 분석을 수행하였다 (아래쪽, 오른쪽 패널). HCT116 세포를 VEC- 및 sS2E-Fc로 트랜스펙션시킨 세포의 조건화된 배지로 처리하고, 이동을 분석하였다 (아래쪽, 오른쪽 패널). 실험을 3회 수행하였다. 오차 막대= 95 % 신뢰구간, P < .05 versus 대조군. (B) VEC- 및 sS2E-Fc-트랜스펙션된 세포의 조건화된 배지(최종 10% v/v)와 HCT116 세포 (1 x 105 세포/웰) 혼합물을 미리 굳힌 bottom agar에 첨가하고 콜로니를 2주 후에 계수하였다. Clonogenicity는 VEC 대조군에 대한 콜로니 형성으로 퍼센트를 계산하였다 (n = 3; p < 0.05). (C) HEK(Human embryonic kidney) 293T 세포를 VEC 또는 sS2E-Fc로 트랜스펙션하고, 표시된 트랜스펙션된 세포로부터 얻은 조건화된 배지로 항-신데칸-2 항체와 슬롯 블롯팅을 하였다. Ponceau S 염색을 loading 대조군으로 사용하였다. CI (Cell index)를 실시예의 방법으로 수행하였다 CI= slope*time + intercept. (D) HCT116 세포를 VEC- 및 sS2E-Fc-트랜스펙션된 HEK293 세포로부터 얻은 조건화된 배지 (최종 10% v/v)를 표시된 시간 동안 처리하고, 세포수를 MTT (3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) 분석으로 계수하였다. 실험은 3회 수행하였다. 오차 막대 = 95 % 신뢰구간. (E) 벡터 또는 sS2E-Fc 발현 조건화 된 배지(최종 10 % v/v)와 HCT116 세포 혼합물 (5 x 104 세포/웰)을 각 RTCA E-Plate wells(Roche Diagnostics GmbH)에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 5% CO2, 6시간 동안 배양하고 RTCA 소프트웨어로 결과를 분석하였다.
도 7은 절단 된 신데칸-2의 암 활성 부위를 보여주는 도이다. (A) 신데칸-2 (Met1- Asn148)까지의 세포외 도메인을 부분적으로 제거한 뒤 인간 IgG1의 Fc 영역을 연결하여 Fc 수용체-잘려진 신데칸-2 키메라 (sS2E-Fc-I, II, III, IV)를 제조 한 대표적인 개략도이다. (B) HEK293 세포에 각각의 VEC 또는 sS2E-Fc-I-IV를 트랜스펙션시키고, 표시된 트랜스펙션된 세포로부터 분리한 조건화된 배지를 수득하여 항-인간 IgG 항체로 슬롯 블롯팅 (왼쪽)과 항-신데칸-2 항체로 웨스턴 블롯팅을 하였다 (오른쪽). (C) (B)에서 얻은 조건화 된 배지(최종 10 % v/v)와 HCT116 세포 혼합물 (5 x 104 세포/웰)을 각 RTCA CIM-Plate wells(Roche Diagnostics GmbH)에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 5% CO2, 20시간 동안 배양하고 RTCA 소프트웨어로 결과를 분석하였다. (D) (B)에서 얻은 조건화 된 배지(최종 10 % v/v)와 HCT116 세포 혼합물 (5 x 104 세포/웰)을 젤라텐-코팅된 Transwell apparatus에서 이동시켰다. 실험은 3회 수행하였다. 오차 막대 = 95 % 신뢰구간.
도 8은 대장암 환자의 혈청에서 잘려진 신데칸-2의 양이 증가하는 것을 보여주는 도이다. (A) 정상 공여자(n) 또는 표시된 암 환자(Ade: adenoma(선종), CIS: carcinoma in situ(암종), AC: advanced carcinoma(진행성 대장암))로부터 수득한 혈청 샘플을 신데칸-2 특이적인 항체를 이용하여 슬롯 블럿팅을 수행하였다. (B) 정상 공여자(n) 또는 진행성 암종 환자로부터 수득한 혈청 샘플을 PBS 버퍼가 함유된 protein A sepharose와 1시간 배양한 후, 1M NaCl를 포함하는 PBS 버퍼로 용출하였다. 용출된 샘플 및 결합 상등액 단백질을 신데칸-2 항체을 이용한 슬롯 블럿팅을 수행하였다. (C) 정상 공여자(n) 및 진행성 암 환자로부터 유래한 혈청 샘플을 아질산으로 전처리하거나 전처리하지 아니하고 상기 B와 같이 슬롯 블럿팅을 수행하였다. (D) 정상 공여자(n) 또는 표시된 암 환자로부터 수득한 혈청 샘플을 아질산으로 전처리하고 신데칸-2 특이적인 항체를 이용하여 슬롯 블럿팅을 수행하였다. (E) 아질산으로 전처리한 혈청 샘플을 SDS-PAGE로 분석하고 신데칸-2 특이적인 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다. (F) 정상 공여자(n)와 대 장 혹은 위 진행성 암 환자로부터 수득한 혈청 샘플을 마우스 단클론(#197) 또는 토끼 다클론 (M-140) 신데칸-2 항체를 이용하여 슬럿 블럿팅을 수행하였다. (G) 정상 (N) 또는 Apc/Min 마우스로부터 유래한 혈청 샘플(각 40 ㎕)을 아질산으로 처리하고 신데칸-2 항체로 슬롯 블럿팅을 수행하였다. 진행성 암(AC) 환자로부터 유래한 혈청을 대조군으로 사용하였다. * 표시는 그 이미지가 더 긴 노출을 수행하였다는 것을 나타낸다.
도 9는 혈청 내의 잘려진 신데칸-2는 대장암의 동물 모델에서도 증가한다는 것을 나타내는 도이다. 정상 대장 점막 (대조군) 및 AOM 종양 마우스 모델 (실시예에 기재된 것과 같이 AOM-유도된)의 조직을 신데칸-2 항체로 면역 염색하였다.
도 10은 혈청에서 증가된 잘려진 신데칸-2의 레벨이 대장암 세포의 이동성 증가와 상관관계가 있다는 것을 나타내는 도이다. (A) 정상 공여자(n)와 잘려진 신데칸-2 단편이 많은 혈청(+)과 적은 혈청(-)의 선종 adenoma (Ade) 또는 진행성 암 (AC) 환자들로부터 수득한 혈청 샘플을 특이적인 신데칸-2 항체를 이용하여 슬롯 블럿팅을 수행하였다(위쪽 패널). 기재된 암 환자의 혈청을 사용하여 HCT116 세포의 Transwell 이동 분석을 수행하였다. 세포들을(1 X 105) 젤라틴 코딩된 transwell 플레이트에서 20시간 동안 이동하게 하였다. 세포를 고정한 뒤 0.6 % hematoxylin 및 0.5 % eosin으로 염색한 후, 이동한 세포의 수를 계수하였다 (*, P < 0.05; **, P < 0.01 대비 대조군). (B) 잘려진 신데칸-2 단편이 많은 혈청(+)과 적은 혈청(-)의 진행성 암 (AC) 환자로부터 수득한 혈청 샘플을 상온에서 30분간 protein A 세파로스와 배양한 후, 비 결합된 물질을 IgG- 또는 신데칸-2 항체가 부착된 protein G 세파로스와 다시 배양하였다. 상등액을 나이트로셀루로스 막에 블롯팅하고 특이적인 신데칸-2 항체로 슬럿 블롯팅을 수행하였다 (위쪽 패널). 또한, 상등액을 A에 기재된 것과 같이 HCT116 세포를 이용하여 Transwell 이동 분석에 사용하였다(왼쪽 패널, P < 0.05 대비 대조군). 오차범위는 평균±표준편차(시행횟수 = 3)로 나타내었다. (C) 신데칸-2 단편이 많은 혈청(+)과 적은 혈청(-)의 진행성 암 (AC) 환자 혈청 샘플을 기재된 암 세포들에 처리한 뒤, 젤라틴 코팅(10㎍/ml)된 Transwell 플레이트 상에서 이동하게 하였다. 배양 후, 세포들을 A에 기재된 것과 같이 hematoxylin-eosin로 염색하고 계수하였다 (**, P < 0.01 대비 대조군). (D) 표시된 대장암 환자의 생검 조직으로부터 총 RNA를 추출하여서 MMP-7의 발현 수준을 RT-PCR로 평가하였다 (왼쪽, 위쪽 패널). 표시된 암 환자로부터 수득한 혈청 샘플을 특정 신데칸-2 항체로 슬럿 블럿팅을 수행하였다 (왼쪽, 아래쪽 패널). Transwell 이동 분석은 A에 기재된 것과 같이 표시된 혈청 샘플을 처리한 HCT116 세포에서 수행하였다 (오른쪽, 위쪽 패널)(*, P < 0.05, **, P < 0.01 대비 대조군). AC 환자로부터 얻은 혈청 샘플 (최종 10 % v/v)과 HCT116 세포 (1 x 105 cells/well) 혼합물을 미리 굳힌 bottom agar에 첨가하고 2주 후 콜로니를 계수하였다. Clonogenicity를 VEC 대조군에 대한 콜로니 형성 퍼센트로 계산하였다 (오른쪽, 아래쪽 패널)(n = 3; p < 0.05).
도 11은 인간 및 랫트 각각의 신데칸-2 서열 및, 신데칸-2 펩티드 단편의 서열을 나타낸 도이다. 노란색으로 표시한 부분은 본 발명의 신데칸-2 펩티드 단편을 나타낸다.1 is a diagram showing that MMP-7 regulates cleavage of the extracellular domain of syndecane-2. (A) Slotted blotting was performed with conditioned media (CM) obtained from indicated colon cancer cells using monoclonal-(# 197) or polyclonal (M-140) anti-syndecan-2 antibodies. Serum-free medium (SFM) was used as negative control. (B) Water soluble decane-2 in conditioned medium of HT-29 cells was isolated by DEAE-Sepharose column chromatography. Each DEAE fraction was used for slot blotting (left panel). The proteoglycan containing elution fraction was digested with heparinase and western blotting was performed with anti-synthecan-2 antibody (right panel). (C) APMA (1 mM) was treated for the time indicated on HT-29 cells, and the conditioned medium was subjected to slot blotting with anti-synthecan-2 antibody. APMA-activated (+) and non-activated (-) recombinant-pro-MMP-7 were separated by SDS-PAGE gel, transferred to PVDF membrane, and then the latent form (28kDa) or activated form of MMP-7 (19 KDa) was labeled with an anti-MMP-7 antibody. (D) HCT116 cells were transfected with 1.5 μg control (VEC) or MMP-7 coding expression vector (left panel) and transfected with pSuper-only (VEC) or MMP-7 shRNA plasmid (right panel) ). Expression levels of MMP-7 were measured by RT-PCR (top panel) and western blotting (middle panel). Conditioned medium obtained from HCT116 cells was subjected to slot blotting with the indicated anti-syndecan-2 antibody. Ponceau S staining was used as a loading control (bottom panel). (E) HT-29 cells were treated with pro-MMP-7 at the indicated times and concentrations. The conditioned medium was subjected to slot blotting with the indicated anti-syndecan-2 antibody. (F) HT-29 cells were treated with the indicated pro-MMPs (1 mg / ml). The conditioned medium was subjected to slot blotting with the indicated anti-syndecan-2 antibody.
2 shows MMP-7 cleaving an N-terminal Leu residue in the extracellular domain of syndecane-2. (A) Purified GST-syndecan-2 (GST-SDC2) was incubated with indicated amounts of pro-MMP-7 at 37 ° C. for 1 hour, separated by 8% SDS-PAGE, followed by CBB R-250 ( Coomassie Brilliant Blue R-250) (left panel) and immunoblotting with anti-syndecan-2 antibody (right panel). Arrows indicate dimers (D) and monomers (M) of syndecane-2, and arrowheads indicate truncated fragments of syndecane-2 (S). (B) The same amount of GST-SDC2 and syndecane-4 (SDC4) were incubated with pro-MMP-7 at 37 ° C. for 1 hour and immunoblotting was performed with anti-GST antibody. (C) An equal amount of purified GST or GST-SDC2 was incubated with purified pro-MMP-7 at 37 ° C. for 1 hour, separated by SDS-PAGE, stained with silver, or immunosorbed with anti-synthecan-2 antibody. Lot. (D) The truncated SDC2 polypeptide was isolated on a silver-stained gel and a protein-free gel plug was used as a cleavage control. MassLynx Tm Trypsin Autologous Proteolysis Product As an internal standard for calibration of MS spectra using (Waters Co., UK).
FIG. 3 shows MMP-7 cleaving the endogenous glycated extracellular domain of syndecan-2. FIG. (A) S2E-Fc was prepared by connecting the extracellular domain of syndecane- 2 to the Fc region of human IgG 1 (top panel). HEK293T cells were transfected with VEC or S2E-Fc cDNA and mRNA expression of syndecane-2 was analyzed by RT-PCR using the indicated primers: β-actin was amplified as a control. Slot blotting was performed with anti-synthecan-2 or HRP conjugated anti-human IgG antibodies in conditioned medium (top panel). (B) HEK293T cells transfected with S2E-Fc were incubated with pro-MMP-7 at 37 ° C. for the indicated times. After the reaction mixture was incubated with protein A-Sepharose, the bound material was separated by 15% SDS-PAGE, and the gel was performed by silver staining or immunoblotting with HRP conjugated anti-human IgG antibody. (C) Conditioned media obtained from VEC or S2E-Fc transfected HEK293T cells were incubated with pro-MMP-7 in the presence or absence of GM6001 for 1 hour at 37 ° C. After the culture was reacted with protein A-Sepharose, the bound material was separated by 15% SDS-PAGE and transferred to PVDF membrane. Proteins on PVDF membranes were stained with CBB R-250. (D) Proteins on PVDF membranes stained with CBB R-250 were sent to Tufts Core Facility (USA) for N-terminal protein sequencing analysis (3 cycles).
4 is a diagram showing the resistance of the mutants of the syndecan-2 extracellular domain cleaved by MMP-7. (A) Representative schematic of the extracellular domain of wild type syndecan-2 (SDC2-WT, GenBank accession number NM_013082.3) and the following SDC2 mutants are shown: Leucine (L 149 ) → Serine (S) (SDC2-NS) ), Asparagine (N 148 ) / Leucine (L 149 ) → Serine (S) (SDC2-SS), and Leucine (L 149 ) → Isoleucine (I) (SDC2-NI). Cleavage sites are indicated by arrow heads (upper panel). Equal amounts of purified GST-SDC2-WT, -SDC2-NS, SDC2-SS, and -SDC2-NI were incubated with purified pro-MMP-7 at 37 ° C for 1 hour, separated by SDS-PAGE, CBB Stained with R-250 (bottom panel). (B) HCT116 cells were transfected with SDC2-WT or indicated SDC2 mutants. MRNA expression of syndecane-2 was analyzed by RT-PCR using the indicated primers: β-actin was amplified as a control (top panel). Conditioned media was slot blotted with anti-synthecan-2 antibody (bottom panel). (C) HT-29 (left panel) and HCT116 (right panel) cells were transfected with 1.5 μg of VEC, SDC2-WT or SDC2-NI mutants (N148 / L149I; NI) and synthesized from syndecan-2. mRNA expression was analyzed by RT-PCR using the indicated primers: β-actin was amplified as a control (top panel). Conditioned media isolated from indicated cells were slot blotted with anti-synthecan-2 antibody. Ponceau S staining was used as a loading control (bottom panel).
5 is a diagram showing that the cut off decande-2 is important for the movement of cancer cells. (A) HT-29 and HCT116 colorectal cancer cells were treated with 0.2 μg / ml of purified truncated syndecane-2, and transwell migration assays were performed by the method of Example. Error bar = 95% confidence interval (HT-29, P = .05, HCT116, P <.01 versus control). (B) HT-29 (left panel) and HCT116 (right panel) cells transfected with 1.5 μg of VEC, SDC2-WT or SDC2-NI mutants (N148 / L149I; NI) and transfected cells (1 × 10 6 ) was moved as described in (A). The experiment was performed three times. Error bar = 95% confidence interval (HT-29, SDC2-WT: P <.01; SDC2-NI mutant: P <.05, HCT116, SDC2-WT or -NI mutant: P <.01 versus VEC control ). (C) B16F10 melanoma cells were transfected with 1 μg vector control (VEC), SDC2-WT, or SDC2-NI mutant (N148 / L149I; NI) and mRNA expression of syndecane-2 was expressed in primers RT-PCR was analyzed using: β-actin was amplified as a control (left, top panel). Conditioned media was slot blotted with anti-synthecan-2 antibody (left , middle panel). Transfected cells (1 × 10 5 ) were moved in a gelatin-coated Transwell apparatus (left, bottom panel, SDC-2 WT, -NI mutant, P <.01 versus VEC control). The experiment was performed three times. Error bar = 95% confidence interval. B16F10 cells were transfected alone with siRNA targeting 225 pmol of mouse syndecane-2, or with the indicated 1 μg let synthecan-2 construct and injected into C57BL / 6 mice (n = 10). Two weeks later, mice were sacrificed and lungs were removed and examined. Two independent experiments were performed (n = 3 mice per group). The front and back of each lung were photographed. The bar graph shows the number of lung metastatic nodules (right panel). Bars represent median values of pulmonary metastasis nodules (n = 3). Error bar = 95% confidence interval.
6 shows that cleaved syndecane-2 increases cancer cell migration and does not regulate proliferation and adhesion. (A) Representative schematic diagram of the production of Fc receptor-cut truncated synthecan-2 chimera (sS2E-Fc) by linking the extracellular domain of syndecan-2 (Met 1 -Asn 148 ) to the Fc region of human IgG 1 (top) panel). HCT116 cells were transfected with VEC or sS2E-Fc, mRNA expression of syndecane-2 was analyzed by RT-PCR using the indicated primers, and conditioned media isolated from the indicated transfected cells was obtained to obtain anti- Slot blotting with syndecane-2 antibody (bottom, left panel). And a migration analysis was performed (bottom, right panel). HCT116 cells were treated with conditioned media of cells transfected with VEC- and sS2E-Fc and the migration was analyzed (bottom, right panel). The experiment was performed three times. Error bar = 95% confidence interval, P <.05 versus control. (B) A mixture of conditioned medium (final 10% v / v ) and HCT116 cells (1 × 10 5 cells / well) of VEC- and sS2E-Fc-transfected cells was added to the previously hardened bottom agar and colonies were added. Counted after 2 weeks. Clonogenicity was calculated as percentage by colony formation relative to the VEC control (n = 3; p <0.05). (C) Human embryonic kidney (HEK) 293T cells were transfected with VEC or sS2E-Fc and subjected to slot blotting with anti-synthecan-2 antibody with conditioned media obtained from the indicated transfected cells. Ponceau S staining was used as a loading control. CI (Cell index) was performed by the method of Example. CI = slope * time + intercept. (D) HCT116 cells were treated with conditioned medium (final 10% v / v ) obtained from VEC- and sS2E-Fc-transfected HEK293 cells for the indicated times and the cell number was treated with MTT (3- (4, 5) -dimethylthiazol-2-yl) -2 and 5-diphenyltetrazolium bromide) were counted. The experiment was performed three times. Error bar = 95% confidence interval. (E) Vector or sS2E-Fc expression conditioned medium (final 10% v / v) and HCT116 cell mixture (5 × 10 4 cells / well) were added to each RTCA E-Plate wells (Roche Diagnostics GmbH). Plates were incubated at 37 ° C. for 5% CO 2 , 6 hours and the results analyzed by RTCA software.
7 is a diagram showing the cancer active site of cleaved syndecane-2. (A) Partial removal of the extracellular domains up to syndecan-2 (Met 1 -Asn 148 ) followed by concatenation of the Fc region of human IgG 1 to the Fc receptor-cut synthecan-2 chimera (sS2E-Fc-I, II , III, IV) is a representative schematic. (B) Transfecting HEV293 cells with each VEC or sS2E-Fc-I-IV, obtaining conditioned media isolated from the indicated transfected cells and slot blotting with anti-human IgG antibody (left) Western blotting with anti-synthecan-2 antibody (right). (C) Conditioned medium (final 10% v / v) and HCT116 cell mixture (5 × 10 4 cells / well) obtained in (B) were added to each RTCA CIM-Plate wells (Roche Diagnostics GmbH). Plates were incubated at 37 ° C. for 5% CO 2 , 20 hours and the results analyzed by RTCA software. (D) The conditioned medium (final 10% v / v) and HCT116 cell mixture (5 × 10 4 cells / well) obtained in (B) were transferred in a gelatin-coated Transwell apparatus. The experiment was performed three times. Error bar = 95% confidence interval.
8 is a diagram showing an increase in the amount of syndecane-2 cut in the serum of colorectal cancer patients. (A) Serum samples obtained from normal donors (n) or indicated cancer patients (Ade: adenoma (adenoma), CIS: carcinoma in situ (carcinoma), AC: advanced carcinoma (advanced colorectal cancer)) Slot blotting was performed using specific antibodies. (B) Serum samples obtained from normal donors (n) or advanced carcinoma patients were incubated with protein A sepharose containing PBS buffer for 1 hour and then eluted with PBS buffer containing 1M NaCl. The eluted samples and binding supernatant proteins were subjected to slot blotting with syndecane-2 antibodies. (C) Serum samples from normal donors (n) and advanced cancer patients were subjected to slot blotting as in B above with or without pretreatment with nitrite. (D) Serum samples obtained from normal donors (n) or indicated cancer patients were pretreated with nitrous acid and slot blotting was performed with synthecan-2 specific antibodies. (E) Serum samples pretreated with nitrous acid were analyzed by SDS-PAGE and Western blotting was performed using syndecan-2 specific antibodies. (F) Slot blotting was performed using mouse monoclonal (# 197) or rabbit polyclonal (M-140) syndecan-2 antibodies on serum samples obtained from normal donors (n) and colon or gastric advanced cancer patients. It was. (G) Serum samples (40 μl each) from normal (N) or Apc / Min mice were treated with nitrous acid and slot blotting with synthecan-2 antibody. Serums from patients with advanced cancer (AC) were used as controls. * Indicates that the image has taken longer exposure.
9 is a diagram showing that truncated syndecane-2 in serum increases in animal models of colorectal cancer. Tissues of normal colon mucosa (control) and AOM tumor mouse model (AOM-derived as described in the Examples) were immunostained with syndecan-2 antibody.
FIG. 10 shows that the level of truncated syndecane-2 increased in serum correlates with increased mobility of colorectal cancer cells. (A) Serum samples from normal donors (n) and truncated syndecane-2 fragments from patients with high serum (+) and low serum (-) adenoma (Ade) or advanced cancer (AC) patients were identified. Slot blotting was performed with decan-2 antibody (top panel). Transwell migration assays of HCT116 cells were performed using the serum of the cancer patients described. The cells were allowed to migrate for 20 hours in (1 × 10 5 ) gelatin encoded transwell plates. After fixing the cells and staining with 0.6% hematoxylin and 0.5% eosin, the number of migrated cells were counted (*, P <0.05; **, compared to P <0.01 control). (B) Serum samples obtained from patients with advanced cancer (AC) with high serum (+) and low serum (-) with severely cut sindecan-2 fragments were incubated with protein A sepharose at room temperature for 30 minutes and then unbound. The material was reincubated with protein G Sepharose to which an IgG- or syndecane-2 antibody was attached. Supernatants were blotted onto nitrocellulose membranes and slot blotting with specific syndecane-2 antibodies (top panel). In addition, supernatants were used for Transwell migration assays using HCT116 cells as described in A (left panel, P <0.05 control). The error range is expressed as mean ± standard deviation (number of trials = 3). (C) Serine samples of advanced cancer (AC) patients with high serum (+) and low serum (-) concentrations of syndecan-2 fragments were treated with the described cancer cells, followed by gelatin coated (10 μg / ml) Transwell plates. Shifted in phase. After incubation, cells were stained and counted with hematoxylin-eosin as described in A (**, P <0.01 control). (D) Total RNA was extracted from the biopsy tissue of the indicated colorectal cancer patients to assess the expression level of MMP-7 by RT-PCR (left, top panel). Serum samples obtained from indicated cancer patients were subjected to slot blotting with specific syndecane-2 antibodies (left, bottom panel). Transwell migration assays were performed on HCT116 cells treated with the indicated serum samples as described in A (right, top panel) (*, P <0.05, **, P <0.01 control). Serum samples (final 10% v / v ) and HCT116 cells (1 × 10 5 cells / well) mixture from AC patients were added to the previously hardened bottom agar and colonies were counted after 2 weeks. Clonogenicity was calculated as percent colony formation relative to the VEC control (right, bottom panel) (n = 3; p <0.05).
FIG. 11 shows the sequence of the decane-2 sequence and the sequence of the decane-2 peptide fragment of human and rat, respectively. The part indicated in yellow represents the syndecan-2 peptide fragment of the present invention.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These embodiments are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not construed as being limited by these embodiments.
실시예Example 1: 세포 배양 및 1: cell culture and 트랜스펙션Transfection
인간 대장암 세포 HT-29(K30038), Caco-2(K30037.1), LoVo(K10229), 및 HCT116(K10247) 및 마우스 흑색종 세포 B16F10(K80008)는 한국세포 은행(http://cellbank.snu.ac.kr)으로부터 구입하였다. 상기 세포들을 37℃, 5% CO2 습도 환경에서 gentamycin (50 ㎍/ml, Sigma)과 10% (v/v) 혹은 20% (v/v) 우태혈청이 첨가 된 MEM (Caco-2), McCoy's 5a (HT-29, HCT116), RPMI (LoVo), DMEM (B16F10)로 배양하였다. LipofectAMINE LTX 시약(Invitrogen (Carlsbad, CA))을 사용하여 HT-29 세포에 트랜스펙션 또는 Effectene 시약(Qiagen (Hilden, Germany))을 사용하여 HCT116 및 B16F10에 제조회사의 프로토콜을 사용하여 수행하였다.
Human colorectal cancer cells HT-29 (K30038), Caco-2 (K30037.1), LoVo (K10229), and HCT116 (K10247) and mouse melanoma cells B16F10 (K80008) were described in the Korean Cell Bank (http: // cellbank. snu.ac.kr). The cells were 37 ° C., 5% CO 2 MEM (Caco-2), McCoy's 5a (HT-29, HCT116) with gentamycin (50 μg / ml, Sigma) and 10% (v / v) or 20% (v / v) fetal calf serum in a humid environment Cultured with RPMI (LoVo), DMEM (B16F10). Transfection into HT-29 cells using LipofectAMINE LTX reagent (Invitrogen (Carlsbad, Calif.)) Or effectene reagent (Qiagen (Hilden, Germany)) using HCT116 and B16F10 using manufacturer's protocol.
실시예Example 2: 슬롯 2: slot 블럿팅Blotting
조건화된 배지 또는 환자의 혈청을 Bio-Rad 장치를 사용하여 나이트로셀룰로즈 막 위로 슬롯-블럿팅하고 PBS로 1회 세척하였다. 그 후 그 막을 5% 무지방유를 함유한 TBS (Tris-buffered saline: 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl), 5 % Tween-20 하에서 블록킹한 뒤, 세척하고 4℃에서 24시간 동안 적당한 1차 항체로 표지한 후, Amersham Life science (West Grove, Pennsylvania)로부터 구입한 종-특이적인 서양고추냉이 퍼옥시데이즈-결합된 2차 항체로 표지하였다. 그 신호들을 ECL (enhanced chemiluminescence; Anigen, Korea)에 의하여 검출하였다. 일부 실험에서, 마이크로튜브에 인간 혈청 40㎕에 30 ㎕(최종 43% v/v)의 0.5M H2SO4 및 5.5M NaNO2로 이루어진 아질산을 상온에서 10분 동안 처리하였다.
Conditioned medium or patient's serum was slot-blotted onto nitrocellulose membrane using a Bio-Rad device and washed once with PBS. The membrane was then blocked under TBS (Tris-buffered saline: 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl), 5% Tween-20 containing 5% fat free oil, washed and washed for 24 hours at 4 ° C. After labeling with an appropriate primary antibody, it was labeled with a species-specific horseradish peroxidase-bound secondary antibody purchased from Amersham Life Science (West Grove, Pennsylvania). The signals were detected by ECL (enhanced chemiluminescence; Anigen, Korea). In some experiments, nitrous acid consisting of 30 μl (final 43% v / v ) of 0.5 MH 2 SO 4 and 5.5 M NaNO 2 in 40 μl of human serum in a microtube was treated at room temperature for 10 minutes.
실시예Example 3: 수용성 3: water soluble 신데칸Sindecan -2의 부분 정제Partial purification of -2
수용성 신데칸-2를 Koda, J.E., Rapraeger, A. and Bernfield, M. (1985). J. Biol. Chem. 13, 8157-8162에 기재된 방법의 변형을 통해서 HT-29 세포의 조건화된 배지로부터 분리하였다. HT-29 세포들을 24시간 동안 무혈청 배지에서 배양하고, 배양 배지를 수득하여, 원심분리 후 (1,000 rpm, 10분), 상등액을 buffer 1 [50 mM Tris-HCl pH 8.0, 4 M Urea, 200 mM NaCl, 0.1% Tween-20, 10 mM NEM, 25 mM EDTA 및 2 mM PMSF]로 평형화된 DEAE-Sepharose 컬럼(Amersham Biosciences)에 적용하였다. 상기 컬럼을 10배 부피의 buffer 1로 세척한 후 buffer 2 [30mM Sodium acetate pH 4.0, 4M Urea, 200mM NaCl, 0.1% Tween-20, 10mM NEM, 25mM EDTA 및 2mM PMSF pH 4.0]를 적용하였다. 상기 컬럼을 세척한 후, 결합된 단백질을 buffer 3 [150mM Sodium acetate pH 4.0, 4M GuHCl, 0.1% Tween-20]으로 용출하였다.
Water soluble syndecane-2 is described in Koda, JE, Rapraeger, A. and Bernfield, M. (1985). J. Biol. Chem. 13, 8157-8162 was isolated from the conditioned medium of HT-29 cells via a modification of the method described. The HT-29 cells were incubated in serum-free medium for 24 hours, culture medium was obtained, and after centrifugation (1,000 rpm, 10 minutes), the supernatant was buffered [50 mM Tris-HCl pH 8.0, 4 M Urea, 200]. mM NaCl, 0.1% Tween-20, 10 mM NEM, 25 mM EDTA and 2 mM PMSF] were applied to a DEAE-Sepharose column (Amersham Biosciences) equilibrated. The column was washed with 10 volumes of
실시예Example 4: 4: HeparinaseHeparinase 처리 process
수용성 신데칸-2 세포외 도메인 (ectodomain)을 2 U/ml heparinase III 및 20 U/ml chondroitinase ABC의 혼합물과 heparinase 반응 버퍼(50 mM Hepes pH 6.5, 50 mM NaOAc, 150 mM NaCl, 및 5 mM CaCl2)상에서 37℃에서 8시간 처리하였다.
A water-soluble synthecan-2 extracellular domain (ectodomain) was mixed with a mixture of 2 U / ml heparinase III and 20 U / ml chondroitinase ABC and heparinase reaction buffer (50 mM Hepes pH 6.5, 50 mM NaOAc, 150 mM NaCl, and 5 mM CaCl). 2 ) was treated at 37 ° C for 8 hours.
실시예Example 5: 5: 신데칸Sindecan -2의 부위 특이적 돌연변이체의 구축 Construction of Site-Specific Mutants of -2
신데칸-2 세포외 도메인의 단백질 가수분해 절단 부위의 부위-특이적 돌연변이는 Clontech (Palo Alto, CA)으로부터 구입한 QuikChange site-directed mutagenesis 키트를 사용하여 수행하였다. 신데칸-2 세포외 도메인의 Asn148 및 Leu149 잔기를 Ser 및/또는 Ile로 대체하였다. 그 프라이머 서열은 다음과 같다: Site-specific mutation of the proteolytic cleavage site of the syndecan-2 extracellular domain was performed using a QuikChange site-directed mutagenesis kit purchased from Clontech (Palo Alto, Calif.). Asn 148 and Leu 149 residues of the syndecan-2 extracellular domain were replaced with Ser and / or Ile. The primer sequence is as follows:
신데칸-2 NS forward 5'-GTACACCGAGAAACATTCAGACAATTCAAGCGGACGG-3'(서열번호 5)Synthecan-2 NS forward 5'-GTACACCGAGAAACATTCAGACAATTCAAGCGGACGG-3 '(SEQ ID NO: 5)
신데칸-2 SS forward 5'-ACGTGTACACCGAGAAACATTCAGACTCGTCGTTCAAGCGG-3'(서열번호 6)Syndecane-2 SS forward 5'-ACGTGTACACCGAGAAACATTCAGACTCGTCGTTCAAGCGG-3 '(SEQ ID NO: 6)
신데칸-2 NI forward 5'-ACGTGTACACCGAGAAACATTCAGACAATATCTTCAAGCGG-3'(서열번호 7) 및Syndecan-2 NI forward 5'-ACGTGTACACCGAGAAACATTCAGACAATATCTTCAAGCGG-3 '(SEQ ID NO: 7) and
reverse 5'-CCGTCCGCTTGAACGAATTGTCTGAATGTTTCTCGGTGTAC-3'(서열번호 8). reverse 5'-CCGTCCGCTTGAACGAATTGTCTGAATGTTTCTCGGTGTAC-3 '(SEQ ID NO: 8).
신데칸-2 부위-특이적 돌연변이 산물을 EcoRI/XhoI 클로닝 사이트를 이용하여 pcDNA 3 벡터에 삽입하였다.
Syndecane-2 site-specific mutant products were inserted into
실시예Example 6: 6: GSTGST -융합 단백질의 인 비트로 절단 및 질량 분석In vitro cleavage and mass spectrometry of fusion proteins
Oh, E.S., Woods, A. and Couchman, J.R. (1997). J. Biol. Chem. 18, 11805-11811 에 기재된 방법과 같이 glutathione-sepharose 4B로 정제된 GST 융합 신데칸-2 (GST-SDC2) 및 -4 (GST-SDS4)를 1 mM APMA (Sigma, St. Louis, MO)가 존재 또는 부존재 조건하의 절단 버퍼(50 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1mM CaCl2)상에서 pro-MMP-7과 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 상기 절단체를 SDS-PAGE에 의해서 분리하고, 은 염색을 수행하여 분석하였다. 펩타이드 및 절단 산물의 질량들은 이화여대 Center for Proteolytic Pathways의 Autoflex II 질량 분광기(Brucker Daltonics)를 사용한 MALDI-TOF MS (matrix-assisted laser-desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry)에 의해서 결정하였다.
Oh, ES, Woods, A. and Couchman, JR (1997). J. Biol. Chem. GST fusion syndecan-2 (GST-SDC2) and -4 (GST-SDS4) purified with glutathione-sepharose 4B as described in 18, 11805-11811 were converted into 1 mM APMA (Sigma, St. Louis, MO). Incubated for 1 hour at 37 ° C. with pro-MMP-7 in cleavage buffer (50 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM CaCl 2 ) in the presence or absence of conditions. The cleavage was separated by SDS-PAGE and analyzed by silver staining. The masses of peptides and cleavage products were determined by matrix-assisted laser-desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) using an Autoflex II mass spectrometer (Brucker Daltonics) from Ewha Womans University for Proteolytic Pathways.
실시예Example 7: 이동( 7: move ( MigrationMigration ) 분석) analysis
Corning costar (Cambridge, MA)로부터 구입한 트랜스웰 플레이트의 각 웰에 gelatin (10 ㎍/ml in PBS)을 첨가하고; 8-um 포어 사이즈, 그 막을 25에서 1시간 건조하였다. 그 트랜스웰을 24-웰 플레이트에 연결하고, 그 아래쪽 챔버를 10% FBS 및 100ng/ml bFGF(B16F10) 를 포함하는 DMEM 또는 10% FBS 및 0.1% BSA (HT29, HCT116)를 포함하는 Mccoy5A로 충진하였다. 세포들을 각 위쪽 챔버에 첨가하고 그 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 8 또는 20 시간 동안 배양하였다. 그 필터의 아래쪽 표면으로 이동한 세포들을 0.6 % hematoxylin 및 0.5 % eosin으로 염색하고 계수하였다.
Gelatin (10 μg / ml in PBS) was added to each well of a transwell plate purchased from Corning costar (Cambridge, Mass.); 8-um pore size, the membrane was dried at 25 for 1 hour. Connect the transwell to a 24-well plate and fill the lower chamber with DMEM containing 10% FBS and 100 ng / ml bFGF (B16F10) or Mccoy5A containing 10% FBS and 0.1% BSA (HT29, HCT116). It was. Cells were added to each upper chamber and the plates were incubated at 37 ° C., 5% CO 2 for 8 or 20 hours. Cells migrated to the bottom surface of the filter were stained with 0.6% hematoxylin and 0.5% eosin and counted.
실시예Example 8: 종양 전이 분석 8: Tumor Metastasis Assay
인 비보 폐 전이 분석을 위해서, B16F10 흑색종 세포(1 X 105 세포/마우스)를 0일에 C57BL/6 마우스(n=10) 꼬리 정맥에 주사하였다. 13일째에, 폐를 절제하여 전이 결절의 계수를 위하여 촬영하였다.
For in vivo lung metastasis analysis, B16F10 melanoma cells (1 × 10 5 cells / mouse) were injected into the tail vein of C57BL / 6 mice ( n = 10) on
실시예Example 9: 9: SDCSDC -2에 대한 항체 생산Antibody Production Against A-2
신데칸-2 단클론 항체는 AdipoGen Inc.에 의뢰하여 제작하였다. 랫트 신데칸-2의 세포외 도메인을 PCR을 통하여 증폭시킨 후 인간 면역글로불린 중쇄인 일정 부위 (Fc)와 자연에 존재하는 리더 염기서열인 pAGCF 그리고 플라스미노젠 활성 저해-1 리더 펩타이드 pAGPCF2를 넣어 클로닝하였다. Fc 융합물을 HEK293 세포에 트랜스펙션 시킨 뒤, 세포가 꽉 찬 상태에서 무혈청 배지 조건에서 2일 배양하여 랫트 신데칸-2-Fc 융합 단백질이 함유된 세포 배지를 얻었다. 세포 배지를 모은 뒤 원심분리를 통하여 세포를 제거하고 1M Tris를 사용하여 pH를 8.0으로 적정하였다. 이 배지를 0.4-㎛ 필터를 이용하여 필터링한 뒤, Protein A column에 걸어주고 100 mM glycine, pH 3.0 조건에서 용출하였다. 그리고 즉시 1 M Tris, pH 8.0을 사용하여 중성화 시켰다. BALB/c mice 가 강한 면역 반응을 통해 다클론 sera를 함유할 수 있도록 S2E-Fc fusion protein으로 면역반응을 일으켰다. 마우스로부터 비장을 적출하고 마우스 골수종 Sp2/0 세포에 융합을 시킨 후, 스크리닝과 단일 세포 클로닝을 정해진 프로토콜에 따라 진행하였다. 면역반응이 일어나지 못하는 BALB/c mice로 부터 복수를 얻어낸 뒤, Protein G를 통한 면역글로불린 단편(fraction)을 얻어 내어 신데칸-2에 대한 단클론 항체를 분비하는 안정적인 하이브리도마 클론(clone 197) 을 제작하였다.
Syndecane-2 monoclonal antibody was produced by AdipoGen Inc. The extracellular domain of rat syndecan-2 was amplified by PCR and cloned into a certain region (Fc), a human immunoglobulin heavy chain, pAGCF, a leader sequence present in nature, and a plasminogen activity inhibition-1 leader peptide, pAGPCF2. It was. The Fc fusions were transfected into HEK293 cells, and then cultured for 2 days in serum-free medium conditions in which the cells were full to obtain a cell medium containing the rat syndecane-2-Fc fusion protein. After collecting the cell medium, the cells were removed by centrifugation, and the pH was adjusted to 8.0 using 1M Tris. The medium was filtered using a 0.4-㎛ filter, and then hung on a Protein A column and eluted under 100 mM glycine, pH 3.0. And immediately neutralized with 1 M Tris, pH 8.0. The BALB / c mice generated an immune response with the S2E-Fc fusion protein to contain polyclonal sera through a strong immune response. After spleens were removed from the mice and fused to mouse myeloma Sp2 / 0 cells, screening and single cell cloning were performed according to a defined protocol. After obtaining ascites from BALB / c mice that do not have an immune response, a stable hybridoma clone (clone 197) was obtained that produced an immunoglobulin fragment via Protein G to secrete monoclonal antibodies against syndecan-2. Produced.
실시예Example 10: 10: AOMAOM -유도된 대장암 모델의 확립Establishment of an Induced Colorectal Cancer Model
4 주령 수컷 FVB/J 마우스를 6 주 동안 10 mg/kg AOM(azoxymethane)로 1 주일에 1회 복강 주사하였다. 마우스를 AOM 최종 주사 후 30주에 희생하였다. 모든 동물들을 수의과 대학(서울대학교, 대한민국)에 실험동물 시설의 SPF 장벽 지역에서 유지하였다. 모든 동물들은 제한된 습도(50±5%), 빛(12/12 h 명/암 주기) 및 온도(23±2℃) 하에서 플라스틱 케이지에서 사육하였다. 모든 과정은 서울대학교의 실험동물 사육 관리 위원회에 따라 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인을 받았다.
Four-week-old male FVB / J mice were intraperitoneally injected once weekly with 10 mg / kg AOM (azoxymethane) for six weeks. Mice were sacrificed 30 weeks after the AOM final injection. All animals were maintained in the SPF barrier area of the experimental animal facility at the veterinary college (Seoul National University, Korea). All animals were housed in plastic cages under limited humidity (50 ± 5%), light (12/12 h light / dark cycle) and temperature (23 ± 2 ° C.). All courses were approved by IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) in accordance with Seoul National University's Experimental Animal Breeding Management Committee.
실시예 11: Fc 수용체-수용성 신데칸-2 키메라 제조Example 11: Preparation of Fc Receptor-Soluble Cindecan-2 Chimera
세포외 도메인 (Met1- Asn148, 서열번호 3) 및 절단 (sS2E-Fc-I, II, III) 수용성 신데칸-2 키메라 (sS2E-Fc)를 인간 IgG1의 Fc 영역에 연결하였다. 444개 염기의 FcR-SDC2 cDNA를 Fc 영역을 포함하는 pcDNA 3.1 발현 벡터의 EcoRI/XhoI 효소 부위를 절단하여 삽입하였다.
The extracellular domain (Met 1 -Asn 148, SEQ ID NO: 3) and cleavage (sS2E-Fc-I, II, III) water soluble syndecan-2 chimera (sS2E-Fc) were linked to the Fc region of human IgG 1 . A 444 base FcR-SDC2 cDNA was inserted by cleaving the EcoRI / XhoI enzyme site of the pcDNA 3.1 expression vector comprising the Fc region.
실시예Example 12: 12: 신데칸Sindecan -2--2- FcFc 수용체 Receptor 키메라의Chimeric 인 비트로 절단 및 N-말단 서열분석 In vitro cleavage and N-terminal sequencing
HETK293T 세포를 벡터 또는 플라스미드 S2E-Fc로 트랜스펙션시키고 조건화된 배지를 절단 버퍼(50 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1mM CaCl2)상에서 pro-MMP-7과 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. protein A-Sepharose slurry를 첨가하고, 추가로 1시간동안 25℃에서 1시간 동안 배양하였다. 결합된 물질을 15% (w/v) SDS-PAGE에 가하고, PDVF 막 (GE Healthcare Life Sciences)으로 블롯팅하였다. 막-결합 단백질을 CBB R-250 (Coomassie Brilliant Blue R-250)으로 염색하고, 막 상의 절단된 S2E-Fc 단편을 N-말단 서열 분석을 Tufts Core Facility (Tufts University, MA, USA)에서 Edman 절단 방법으로 수행하였다.
HETK293T cells were transfected with the vector or plasmid S2E-Fc and the conditioned medium was conditioned for 1 hour at 37 ° C. with pro-MMP-7 on cleavage buffer (50 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM CaCl 2 ). Incubated. Protein A-Sepharose slurry was added, and further incubated for 1 hour at 25 ℃ for 1 hour. Bound material was added to 15% (w / v) SDS-PAGE and blotted onto PDVF membrane (GE Healthcare Life Sciences). Membrane-binding proteins were stained with CBB R-250 (Coomassie Brilliant Blue R-250), and N-terminal sequencing of the cleaved S2E-Fc fragment on the membrane was performed by Edman cleavage at Tufts Core Facility (Tufts University, MA, USA). It was performed by the method.
실시예Example 13: 세포 증식 분석 13: Cell proliferation assay
HCT116 세포의 증식을 sS2E-Fc (최종 10 % v/v)를 포함하는 조건화된 배지 존재 하에서 Park, H., et al., (2002). J. Biol. Chem. 33, 29730-29736.에 기재된 방법에 따라 MTT (3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) 방법으로 분석하였다.
Proliferation of HCT116 cells was confirmed by Park, H., et al., (2002) in the presence of conditioned medium containing sS2E-Fc (final 10% v / v ). J. Biol. Chem. 33, 29730-29736. MTT (3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltetrazolium bromide) method according to the method described in.
실시예Example 14: 소프트 14: soft 아가로스Agarose ( ( softsoft agaroseagarose )상에서 부착-비의존성(Adhesion-independent on) AnchorageAnchorage -- independentindependent ) 성장 분석A) growth analysis
6웰 플레이트의 각 웰을 3ml의 bottom agar 혼합물(Mccoy's 5A/10%FBS/0.6% agar)로 코팅하였다. bottom agar 막이 굳어진 후, VEC(대조군) 또는 sS2E-Fc를 포함하는 조건화된 배지 혹은 정상 또는 암 환자 혈청을 HCT116 세포 및 Mccoy's 5A/10%FBS/0.3%과 섞어 top agar 혼합물을 만들어 각 웰에 첨가하고, 상기 배양물을 37℃, 5% CO2 에서 배양하였다. 콜로니 형성을 광현미경으로 매일 모니터하고, 콜로니를 14일 동안 배양 후 카메라로 촬영하였다.
Each well of a 6 well plate was coated with 3 ml bottom agar mixture (Mccoy's 5A / 10% FBS / 0.6% agar). After the bottom agar membrane solidified, conditioned medium containing VEC (control) or sS2E-Fc or normal or cancer patient serum was mixed with HCT116 cells and Mccoy's 5A / 10% FBS / 0.3% to create a top agar mixture and added to each well. The culture was incubated at 37 ° C., 5% CO 2 . Colony formation was monitored daily with light microscopy, and colonies were photographed with a camera after 14 days of incubation.
결과result
1.One. MMPMMP -7은 -7 is 세포외Extracellular 신데칸Sindecan -2의 절단을 조절한다.Adjust the cleavage of -2.
신데칸-2 절단 (syndecan-2 shedding) 메카니즘을 분석하기 위해, 본 발명자들은 우선 암세포 조건화된 배지 내의 신데칸-2 수용성 형태의 존재를 확인하였다.To analyze the syndecan-2 shedding mechanism, we first identified the presence of syndecan-2 soluble forms in cancer cell conditioned media.
그 결과, 신데칸-2의 수용성 형태는 HT-29, Caco-2, LOVO 및 HCT116 세포를 포함하는 다양한 인간 대장암 세포의 조건화된 배지에서 검출되었다 (도 1A). 수용성의 잘려진 신데칸-2는 슬롯 HT-29 세포의 배지에서 부분적으로 분리하여 슬롯 블롯팅 (도 1B 왼쪽) 또는 웨스턴 블롯팅 (도 1B 오른쪽)으로 존재를 확인하였다. 흥미롭게도, 잘려진 신데칸-2의 수준은 잘 알려진 MMP 활성제인 APMA(4-aminophenylmercuric acetate)로 처리한 후에 증가하였으며 (도 1C), 이는 MMP가 절단의 조절에 관여되어 있다는 것을 시사한다.
As a result, soluble forms of syndecane-2 were detected in conditioned media of various human colorectal cancer cells, including HT-29, Caco-2, LOVO, and HCT116 cells ( FIG. 1A ). The water-soluble truncated syndecane-2 was partially separated from the medium of the slot HT-29 cells and confirmed its presence by slot blotting (FIG. 1B left) or western blotting (FIG. 1B right). Interestingly, the level of truncated syndecane-2 increased after treatment with the well-known MMP activator, 4-aminophenylmercuric acetate (APMA) (FIG. 1C), suggesting that MMP is involved in the regulation of cleavage.
다음으로 본 발명자들은 신데칸-2 절단이 MMP-7에 의해 일어나는지 여부를 조사하였다.Next we examined whether syndecane-2 cleavage was caused by MMP-7.
그 결과, HCT116 세포에서 MMP-7의 과발현은 조건화된 배지에서 수용성 신데칸-2의 수준을 증가시키는 반면, pSuper-MMP-7 shRNA 플라스미드를 사용하여 MMP-7을 넉다운시키면 반대의 효과가 나타나는 것을 확인하였다 (도 1D). HT-29 세포에 pro-MMP-7을 전처리한 경우, MMP-7은 시간- 및 농도-의존적으로 신데칸-2 절단을 증가시켰다 (도 1E). 또한, MMP-7-매개 신데칸-2 절단은 MMP-2 또는 MMP-9 보다 더 효과적이었다 (도 1F).As a result, overexpression of MMP-7 in HCT116 cells increased the level of soluble syndecan-2 in conditioned media, whereas knocking down MMP-7 using the pSuper-MMP-7 shRNA plasmid had the opposite effect. It was confirmed (FIG. 1D). When pre-MMP-7 was pretreated in HT-29 cells, MMP-7 increased syndecane-2 cleavage time- and concentration-dependently (FIG. 1E). In addition, MMP-7-mediated syndecane-2 cleavage was more effective than MMP-2 or MMP-9 (FIG. 1F).
상기와 같은 결과들은 신데칸-2 절단은 특히, MMP-7이 매개한다는 것을 뒷받침하는 것이다.
These results support that syndecane-2 cleavage is mediated, in particular, by MMP-7.
2. 2. MMPMMP -7은 -7 is 신데칸Sindecan -2의 -2 세포외Extracellular 도메인의 N-말단 N-terminal of the domain LeuLeu 잔기를The residue 절단한다. Cut.
신데칸-2의 절단 부위를 동정하기 위하여, GST-재조합 신데칸-2 (GST-SDC2)를 인 비트로에서 정제된 pro-MMP-7 효소와 배양하였다. To identify cleavage sites for syndecane-2, GST-recombinant syndecane-2 (GST-SDC2) was incubated with purified pro-MMP-7 enzyme in vitro.
그 결과, 예상대로 MMP-7은 신데칸-2를 용량 의존적으로 절단하였다 (도 2A). 그러나, MMP-7은 신데칸-2와 가장 근접한 상동성을 갖는 재조합 신데칸-4는 효과적으로 절단하지는 못하였다 (도 2B).As a result, MMP-7 cleaved syndecane-2 dose-dependently as expected (FIG. 2A). However, MMP-7 did not effectively cleave recombinant syndecane-4, which had the closest homology to syndecane-2 (FIG. 2B).
신데칸-2의 절단 부위를 동정하기 위하여, 정제된 GST-SDC2를 인 비트로에서 MMP-7와 배양하고, SDS-PAGE로 분석하였다.To identify the cleavage site of syndecane-2, purified GST-SDC2 was incubated with MMP-7 in vitro and analyzed by SDS-PAGE.
그 결과, MMP-7은 GST-재조합 신데칸-2를 절단해서, 약 45 kDa의 절단 산물을 생성하였다 (도 2C). MALDI-TOF(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight) 질량 분석 결과, 신데칸-2가 세포외 도메인의 N-말단 Leu149 잔기에서 절단된다는 것을 확인하였다 (도 2D). As a result, MMP-7 cleaved the GST-recombinant syndecane-2, resulting in a cleavage product of about 45 kDa (FIG. 2C). Matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry confirmed that syndecane-2 was cleaved at the N-terminal Leu 149 residue of the extracellular domain (FIG. 2D).
신데칸-2는 다수의 글리코스아미노글리칸 사슬(glycosaminoglycan chain)을 갖고 있어서, 코어 단백질이 단백질 가수분해 절단으로부터 보호를 받을 수 있다. 이와 같은 문제를 밝히기 위해, 본 발명자들은 신데칸-2 세포외 도메인 (Met1- Glu154)을 인간 IgG1의 Fc 영역에 연결한 신데칸-2 세포외 도메인-Fc 수용체 키메라 (syndecan-2 extracellular domain-Fc receptor chimera, S2E-Fc) 구조체를 구축하고, 상기 구조체를 코딩하는 발현 벡터를 HEK293T 세포에 트랜스펙션하여, 내생적으로 당쇄화된 단백질 (endogenously glycosylated protein)을 수득하였다.Syndecane-2 has a number of glycosaminoglycan chains so that core proteins can be protected from proteolytic cleavage. To address this problem, the present inventors have identified a syndecan-2 extracellular domain-Fc receptor chimera (syndecan-2 extracellular) that linked the syndecan-2 extracellular domain (Met 1 -Glu 154 ) to the Fc region of human IgG 1 . A domain-Fc receptor chimera (S2E-Fc) construct was constructed and the expression vector encoding the construct was transfected into HEK293T cells to obtain an endogenously glycosylated protein.
그 결과, S2E-Fc의 수용성 형태를 HEK293T 세포가 자란 조건화된 배지에서 확인하였다 (도 3A). 정제된 S2E-Fc은 SDS-PAGE 상에서 smear 되었으며, 이는 당쇄화의 일반적인 형태이다. MMP-7은 S2E-Fc를 절단하여 약 36kDa 크기의 절단 생성물을 수득하였고, 이는 신데칸-2의 세포외 도메인에서 절단이 일어난다는 것을 시사한다 (도 3B). 다양한 범위의 MMP 억제제인 GM6001은 완전히 S2E-Fc 절단을 막았다 (도 3C). N-말단 서열 분석 결과는 MMP-7은 당쇄화된 S2E-Fc의 N-말단의 Leu149를 절단한다는 것을 나타냈다 (도 3D). 이와 같은 결과들은 MMP-7이 신데칸-2의 절단을 매개한다는 것을 뒷받침한다.As a result, the soluble form of S2E-Fc was confirmed in conditioned medium in which HEK293T cells were grown (FIG. 3A). Purified S2E-Fc was smeared on SDS-PAGE, which is a common form of glycosylation. MMP-7 cleaved S2E-Fc to yield a cleavage product of about 36 kDa size, indicating that cleavage occurs in the extracellular domain of syndecane-2 (FIG. 3B). GM6001, a diverse range of MMP inhibitors, completely blocked S2E-Fc cleavage (FIG. 3C). N-terminal sequencing results showed that MMP-7 cleaves Leu 149 at the N-terminus of glycated S2E-Fc (FIG. 3D). These results support that MMP-7 mediates the cleavage of syndecane-2.
신데칸-2의 절단에 있어 MMP-7의 기능을 더 분석하기 위해서, 본 발명자들은 Asn148 및 Leu149 잔기가 Ser 또는 Ile로 대체된 다양한 신데칸-2 돌연변이체(절단 부위 돌연변이체)를 구축하였다(도 4A). 재조합 신데칸-2 및 신데칸-2 절단 부위 돌연변이체는 GST-재조합 단백질로서 발현되었고, glutathione-agarose 비드를 사용하여 정제하고, 인 비트로에서 MMP-7과 배양하였다. 0.05 unit의 MMP-7은 재조합 야생형 신데칸-2의 50 %를 절단한 반면, Leu149를 Ile149로 대체한 (Asn148-Ile149)은 절단이 5 배 정도 감소하였다. Asn148-Leu149 를 Ser (Ser148-Ser149)로 대체한 돌연변이체는 MMP-7에 의한 절단이 크게 감소하였다. 반면, Ser148-Ser149 돌연변이체는 MMP-7에 의한 절단에 대해서 5배 정도 더 저항성을 가졌다 (도 4A). 흥미롭게도, 신데칸-2 Asn148-Ile149 돌연변이체의 아미노산 서열은 그것의 최고로 근접한 동족체인 신데칸-4와 유사하고, 이것은 pro-MMP-7에 의해서 효과적으로 절단되지 않는다는 개념을 지지한다 (도 4A). In order to further analyze the function of MMP-7 in cleaving syndecan-2, we constructed various syndecan-2 mutants (cleavage site mutants) in which Asn 148 and Leu 149 residues were replaced with Ser or Ile. (FIG. 4A). Recombinant synthecan-2 and syndecan-2 cleavage site mutants were expressed as GST-recombinant proteins, purified using glutathione-agarose beads and incubated with MMP-7 in vitro. 0.05 units of MMP-7 cleaved 50% of the recombinant wild-type syndecane-2, whereas the replacement of Leu 149 with Ile 149 (Asn 148 -Ile 149 ) reduced the cleavage by a factor of five. Asn 148 -Leu 149 a mutant replaced by Ser (Ser 148 -Ser 149) is decreased significantly by cutting MMP-7. In contrast, Ser 148 -Ser 149 The mutants were five times more resistant to cleavage by MMP-7 (FIG. 4A). Interestingly, the amino acid sequence of the Cindecan-2 Asn 148 -Ile 149 mutant is similar to its closest homologue, Cindecan-4, which supports the concept that it is not effectively cleaved by pro-MMP-7 (Fig. 4A).
예상한대로, 잘려진 신데칸-2의 수준은 대조군인 벡터로 트랜스펙션시킨 세포보다 야생형, Asn148-Ser149, Ser148-Ser149 신데칸-2 돌연변이체를 발현하는 벡터로 트랜스펙션된 HCT116 세포에서 증가하였다. 그러나, Asn148-Ile149 돌연변이체를 발현하는 벡터로 트랜스펙션된 세포에서는 그렇지 않았다 (도 4B). 유사한 결과를 HT-29세포에서도 얻었다 (도 4C). Level as expected, a truncated Shin decane -2 wild type cells than were transfected with control vector, Asn 148 -Ser 149, Ser 148 -Ser 149 Increased in HCT116 cells transfected with a vector expressing syndecan-2 mutant. However, Asn 148- Ile 149 This was not the case in cells transfected with the vector expressing the mutant (FIG. 4B). Similar results were obtained in HT-29 cells (FIG. 4C).
다음으로 본 발명자들은 잘려진 신데칸-2 돌연변이체가 대장암 이동을 조절하는지를 조사하였다. 신데칸-2로 트랜스펙션된 HCT116 세포의 이동은 벡터가 트랜스펙션된 세포에 비하여 현저하게 증가하였다. 그러나 신데칸-2 절단 부위 돌연변이체에 의한 세포 이동은 모두에서 감소하였다(도 4B;P < 0.05). 특히 최소 절단을 보인 Ser148-Ser149 돌연변이체가 대장암 세포의 이동을 최고로 감소(가장 효과적인 저해 결과) 시켰다. 이러한 효과는 HT-29 및 HCT116 세포 모두에서 유사하였다(도 4C;P < 0.05). 이들 결과들은 신데칸-2의 절단이 대장암 세포의 이동의 조절에 관여한다는 것을 나타낸다.
Next we examined whether the cut decane-2 mutant regulates colorectal cancer migration. Migration of HCT116 cells transfected with syndecane-2 was significantly increased compared to cells transfected with vectors. However, cell migration by syndecan-2 cleavage site mutants was reduced in all (FIG. 4B; P <0.05). In particular, Ser 148 -Ser 149 mutants with minimal cleavage resulted in the greatest reduction of colon cancer cell migration (the most effective inhibition result). This effect was similar in both HT-29 and HCT116 cells (FIG. 4C; P <0.05). These results indicate that cleavage of syndecane-2 is involved in the regulation of migration of colorectal cancer cells.
3. 3. 잘려진Clipped 신데칸Sindecan -2 외부도메인(-2 external domain ( ectodomainectodomain )은 암 세포 이동을 촉진한다.) Promotes cancer cell migration.
본 발명자들은 잘려진 신데칸-2가 자가 분비를 통해 암세포 이동을 촉진하는지를 조사하였다.We investigated whether truncated syndecane-2 promotes cancer cell migration through self-secretion.
도 5A에서 나타난 바와 같이, 배양액으로부터 정제된 잘려진 신데칸-2의 처리는 HT-29 및 HCT116 세포 모두에서 세포 이동을 촉진시켰다(*P < 0.05, **P < 0.01). As shown in FIG. 5A, treatment of truncated syndecane-2 purified from the culture promoted cell migration in both HT-29 and HCT116 cells (* P <0.05, ** P <0.01).
본 발명자들은 다음으로 신데칸-2 돌연변이체가 대장암 세포 이동을 조절할 수 있는지 조사하고자 하였다. 비록 세포 이동은 벡터-트랜스펙션된 세포보다 야생형 신데칸-2를 발현하는 벡터로 트랜스펙션시킨 HT29 및 HCT116 세포에서 현저하게 증가했지만, 이는 신데칸-2 Asn148-Ile149 돌연변이체를 발현하는 세포에서 신데칸-2-매개 세포 이동이 현저하게 감소하는 것을 확인하였고, 이는 절단이 최소화된다는 것을 의미한다 (도 5B. HT-29, 벡터 =1.0배, 야생형 = 2.59배, Asn148-Ile149 =1.54-배, 차이, 벡터 vs. 야생형 = 1.59-배, 95% CI = 1.54- 내지 1.64-배, P < .01; 차이, 벡터 vs. Asn148-Ile149 =0.54-배, 95% CI = 0.53- 내지 0.56-배, P < .01; HCT116, 벡터 =1.0-배, 야생형 = 2.12-배, Asn148-Ile149 = 1.26-배, 차이, 벡터 vs. 야생형 = 1.12-배, 95% CI = 1.07- 내지 1.16-배, P < .01; 벡터 vs. Asn148-Ile149 = 0.26-배, 95% CI = 0.24- to 0.27-배, P < .01). We next sought to investigate whether syndecan-2 mutants could regulate colon cancer cell migration. Although cell migration was markedly increased in HT29 and HCT116 cells transfected with a vector expressing wild type Sindecan-2 than vector-transfected cells, it expresses the Sindecan-2 Asn 148 -Ile 149 mutant. It was confirmed that syndecane-2-mediated cell migration was significantly reduced in the cells to be treated, which means that cleavage was minimized (FIG. 5B. HT-29, vector = 1.0-fold, wild-type = 2.59-fold, Asn 148 -Ile 149 = 1.54- fold, difference, vector vs. wild type = 1.59- fold, 95% CI = 1.54- to 1.64- fold, P <.01; difference, vector vs. Asn 148 -Ile 149 = 0.54- fold, 95% CI = 0.53- to 0.56- fold, P <.01; HCT116, vector = 1.0- fold, wild type = 2.12- fold, Asn 148 -Ile 149 = 1.26- fold, difference, vector vs. wild type = 1.12- fold, 95 % CI = 1.07- to 1.16-fold, P <.01; vector vs. Asn 148 -Ile 149 = 0.26-fold, 95% CI = 0.24- to 0.27-fold, P <.01).
본 발명자들은 이전에 신데칸-2가 B16F10 마우스 흑색종 세포에서 전이 잠재성을 조절한다는 것을 보고한 바가 있다. 대장암 세포와 유사하게 본 발명자들은 야생형 신데칸-2를 발현하는 B16F10 세포로부터 조건화된 배지에서 잘려진 신데칸-2의 수준이 증가되지만 Asn148-Ile149 돌연변이체에서는 그렇지 않다는 것을 확인하였다 (도 5C, 위). 유사하게, 신데칸-2가 과발현된 B16F10 세포는 세포 이동이 증가하지만 돌연변이체를 발현하는 세포에서는 이동 능력이 감소하였다 (도 5C, 아래, 벡터 = 1.0-배, 야생형 = 2.53-배, Asn148-Ile149 = 1.48-배).We have previously reported that dedecane-2 regulates metastatic potential in B16F10 mouse melanoma cells. Similar to colorectal cancer cells, we found that Asn 148 -Ile 149 increased levels of cutincan-2, which was truncated in conditioned media from B16F10 cells expressing wild type syndecan-2. In mutants it was confirmed that it is not (Fig. 5C, above). Similarly, B16F10 cells overexpressed with dedecane-2 increased cell migration but decreased cell migration capacity in cells expressing mutants (FIG. 5C, below, vector = 1.0-fold, wild-type = 2.53-fold, Asn 148). -Ile 149 = 1.48-fold).
잘려진 신데칸-2가 인 비보에서도 세포 이동을 유도할 수 있는 지를 분석하였다. B16F10 세포 내에서 마우스 신데칸-2 (mSDC2)를 마우스 특이적 siRNA로 넉다운시키고, 랫트 신데칸-2(rSDC2) cDNA (야생형 또는 절단 돌연변이체)를 코딩하는 벡터를 이용하여 재-발현시키고, 상기 B16F10 세포를 6주령의 C57BL/6 마우스 꼬리 정맥으로 주사하여 폐 전이 모델을 제작하였다.We analyzed whether cutindecan-2 can induce cell migration even in vivo. Knock down mouse synthecan-2 (mSDC2) to mouse specific siRNA in B16F10 cells and re-express with a vector encoding rat syndecan-2 (rSDC2) cDNA (wild-type or cleavage mutant), and Lung metastasis model was constructed by injecting B16F10 cells into the 6-week-old C57BL / 6 mouse tail vein.
그 결과, 돌연변이체로 트랜스펙션된 B16F10 세포가 주입된 마우스로부터 분리된 폐 샘플은 야생형이 트랜스펙션된 세포가 주입된 마우스에 비해 폐전이가 감소하였다 (도 5D). 이와 같은 데이터는 신데칸-2에 의해 유도되는 전이 활성이 세포외 도메인의 절단과 연관되어 있음을 뒷받침한다.As a result, lung samples isolated from mice injected with B16F10 cells transfected with mutants had reduced lung metastasis compared to mice injected with cells transfected with wild type (FIG. 5D). These data support that metastatic activity induced by syndecane-2 is associated with cleavage of the extracellular domain.
암 세포 이동에 대한 잘려진 신데칸-2의 효과를 더 테스트하기 위해서, 본 발명자들은 인간 IgG1의 Fc 부분을 잘려진 신데칸-2의 세포외 도메인(아미노산 Met1- Asn148)에 연결하여서 Fc 수용체-신데칸-2 키메라(sS2E-Fc)를 구축하고 이 구축물을 코딩하는 벡터를 HCT116 세포에 트랜스펙션시켰다. 세포 이동은 벡터 트랜스펙션된 세포에 비하여 sS2E-Fc로 트랜스펙션된 HCT116 세포에서 크게 증가하였고(P < 0.05), sS2E-Fc를 발현하는 HCT116세포로부터 유래한 조건화된 배지는 HCT116 세포의 이동을 촉진하였다 (도 6A; P < 0.05).To further test the effect of truncated synthecan-2 on cancer cell migration, we linked the Fc portion of human IgG 1 to the truncated extracellular domain (amino acids Met 1 -Asn 148 ) to the Fc receptor. -Sindecan-2 chimera (sS2E-Fc) was constructed and the vector encoding this construct was transfected into HCT116 cells. Cell migration was significantly increased in HCT116 cells transfected with sS2E-Fc compared to vector transfected cells (P <0.05), and conditioned media derived from HCT116 cells expressing sS2E-Fc migrated to HCT116 cells. (FIG. 6A; P <0.05).
유사하게, sS2E-Fc 과발현은 soft agar 상의 HCT116 세포의 접착-의존성 성장을 증가시켰다 (도 6B). xCELLigence system을 이용하여 sS2E-Fc가 HCT116 세포의 이동을 증가시킨다는 것을 뒷받침하였다(도 6C, 벡터=1.0-배, sS2E-Fc = 3.16-배). 그러나 sS2E-Fc는 세포 증식(도 6D) 또는 HCT116 세포의 접착(도 6E)에는 영향이 없었다. 이와 같은 결과들은 잘려진 신데칸-2가 대장암 세포의 이동 및 콜로니 형성을 촉진한다는 것을 나타낸다. Similarly, sS2E-Fc overexpression increased adhesion-dependent growth of HCT116 cells on soft agar (FIG. 6B). The xCELLigence system was used to support that sS2E-Fc increased the migration of HCT116 cells (FIG. 6C, Vector = 1.0-fold, sS2E-Fc = 3.16-fold). However, sS2E-Fc had no effect on cell proliferation (FIG. 6D) or adhesion of HCT116 cells (FIG. 6E). These results indicate that truncated syndecane-2 promotes colon cancer cell migration and colony formation.
나아가, 잘려진 신데칸-2 조각의 암 활성 부위를 구명하기 위하여 인간 IgG1의 Fc 부분을 잘려진 신데칸-2의 세포외 도메인을 부분적으로 제거 한 신데칸-2 세포외 도메인 (sS2E-Fc-I: Met1- Asp58 , sS2E-Fc-II: Met1- Ser88 , sS2E-Fc-III: Met1- Asp118)에 연결하여서 다양한 Fc 수용체-신데칸-2 키메라를 구축하고 (도 7A), 이 구축물을 HEK293T 세포에 트랜스펙션시킨 뒤 배양액을 얻어 제대로 발현 되는 지 확인하였다 (도 7B). 이를 xCELLigence system (도 7C) 및 trasnewell (도 7D)을 이용하여 sS2E-Fc-II 부위에서(Asp58 - Ser88) HCT116 세포의 이동을 증가시킨다는 것을 뒷받침하였다. 이는 흥미롭게도 MMP-7이 결합할 것이라 예상되는 부위와 일치 한다.
Furthermore, to determine the cancerous active site of the truncated syndecane-2 fragment, the Fc portion of human IgG 1 partially eliminated the extracellular domain of the truncated syndecane-2 (sS2E-Fc-I). : Met 1 -Asp 58 , sS2E-Fc-II: Met 1 -Ser 88 , sS2E-Fc-III: Met 1 -Asp 118 ) to construct various Fc receptor-syndecan-2 chimeras (FIG. 7A) , The constructs were transfected into HEK293T cells and cultured to confirm that they were properly expressed (FIG. 7B). This was performed at the sS2E-Fc-II site using the xCELLigence system (FIG. 7C) and trasnewell (FIG. 7D) (Asp 58). - Ser 88 ) to increase the migration of HCT116 cells. This is interestingly consistent with the site where MMP-7 is expected to bind.
4. 혈청 내 4. In serum 잘려진Clipped 신데칸Sindecan -2의 양은 대장암 Amount of -2 colon cancer 환자에서In patients 증가한다. Increases.
대장암에 대한 바이오마커로서의 신데칸-2의 기능을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 대장암 환자의 여러 단계로부터 혈청을 모아서 슬롯 블럿팅을 사용하여 혈청에서 잘려진 신데칸-2 레벨을 분석하였다. 잘려진 신데칸-2는 2/16 (12.5 %) 선종(Ade), 4/16 (25 %) 암종(carcinoma) in situ (CIS) 및 11/16 (69 %) 진행성(advanced) 대장암(AC) 환자에서 검출된 반면, 잘려진(shed) 신데칸-2는 정상 (N) 혈청에서는 검출되지 않았다(0/16, 도 8A), 이것은 대장암 환자는 잘려진 신데칸-2를 생성한다는 것을 나타낸다. 흥미롭게도 잘려진 신데칸-2의 혈청 양은 대장암의 발달 동안에 증가한다(도 8A). 신데칸-2 항체들과 혈청 면역글로불린 사이의 비특이적인 상호작용을 회피하기 위하여, 대장암 환자 혈청을 protein A-비드와 미리 배양하였다. 혈청 면역글로불린의 사전 제거 후, 잘려진 신데칸-2 검출은 많이 개선되었고(도 8B), 이것은 혈청에서 떨어진 신데칸-2와 신데칸-2 항체 사이의 특이적 결합을 나타낸다. 혈청에서 잘려진 신데칸-2의 검출을 더 개선하기 위해서, 대장암 환자 혈청을 아질산(HNO2)으로 처리하였다. 도 8C에서 알 수 있는 바와 같이, 혈청의 비특이적인 단백질의 제거는 잘려진 신데칸-2 검출을 더욱 향상시켰다. 떨어진 신데칸-2는 70 %의 선종, 80 %의 암종 in situ 및 90 %의 진행성 대장암 환자에서 검출되었다(도 8D). 유사한 결과들은 마우스 단클론 신데칸-2 항체를 사용한 웨스턴 블럿팅에서도 얻었다(도 8E). 한편 잘려진 신데칸-2는 또 다른 위장관암인 위암의 혈청에서는 검출되지 않았다(도 8F). 이들 데이터는 신데칸-2 잘려짐이 대장암 발달 동안에 일어나고 잘려진 신데칸-2는 대장암 발달과 상관관계가 있다는 것을 나타낸다.To investigate the function of syndecane-2 as a biomarker for colorectal cancer, we collected serum from different stages of colorectal cancer patients and analyzed the cutincan-2 level cut in serum using slot blotting. Truncated syndecane-2 is 2/16 (12.5%) ade, 4/16 (25%) carcinoma in While shed sindecan-2 was not detected in situ (CIS) and 11/16 (69%) advanced colorectal cancer (AC) patients (0/16, 8A), indicating that colorectal cancer patients produce truncated syndecane-2. Interestingly, the amount of cut off can be increased in the development of colorectal cancer (FIG. 8A). To avoid nonspecific interactions between syndecan-2 antibodies and serum immunoglobulins, colon cancer patient serum was preincubated with protein A-beads. After prior removal of serum immunoglobulin, truncated syndecane-2 detection was greatly improved (FIG. 8B), indicating specific binding between syndecane-2 and syndecane-2 antibodies away from serum. To further improve detection of cutincan-2 cut in serum, colon cancer patient serum was treated with nitrite (HNO 2 ). As can be seen in FIG. 8C, removal of nonspecific proteins in serum further enhanced truncated syndecane-2 detection. Fallen Cindecan-2 has 70% adenomas and 80% carcinomas in It was detected in situ and 90% of advanced colorectal cancer patients (FIG. 8D). Similar results were obtained with Western blotting using mouse monoclonal syndecane-2 antibody (FIG. 8E). On the other hand, the cut decane-2 was not detected in the serum of gastric cancer, another gastrointestinal cancer (FIG. 8F). These data indicate that syndecane-2 truncation occurs during colorectal cancer development and that syndecane-2 truncation is correlated with colorectal cancer development.
이러한 것과 일치하게, 본 발명자들은 신데칸-2 발현이 AOM(azoxymethane)-유도된 마우스의 대장에서 증가하는 것을 발견하였다(도 9). AOM 주사 30주 후, 모든 AOM-주사된 FVB/J 마우스들은 현저한 대장암 병변을 보였다. 현저한 신데칸-2 발현이 이들 마우스의 대장 병변의 증식적인 상피에서 관찰되었으나 정상 대조군 FVB/J 마우스에서는 그러한 발병이 관찰되지 않았다. 또 다른 대장암 동물 모델인 가족성 선종성 용종증(familial adenomatous polyposis)의 Apc/min 마우스 모델에서도 잘려진 신데칸-2가 혈청에서 검출되었다(도 9). 이들 발견은 잘려진 신데칸-2가 인간 및 동물 모델 모두에서 대장암 발암현상 동안 혈청으로 분비된다는 것을 시사하는 것으로, 신데칸-2 펩티드 단편이 특이적인 대장암 진단 마커로 사용될 수 있음을 뒷받침하는 것이다.
Consistent with this, we found that syndecane-2 expression increased in the colon of AOM (azoxymethane) -induced mice (FIG. 9). Thirty weeks after AOM injection, all AOM-injected FVB / J mice showed significant colorectal cancer lesions. Significant syndecane-2 expression was observed in the proliferative epithelium of the colon lesions of these mice, but no such occurrence was observed in normal control FVB / J mice. In the Apc / min mouse model of another colon cancer animal model, familial adenomatous polyposis, cutinc-2 was detected in serum (FIG. 9). These findings suggest that truncated syndecane-2 is secreted into the serum during colorectal carcinogenesis in both human and animal models, supporting the fact that syndecane-2 peptide fragments can be used as specific markers for colorectal cancer. .
5. 대장암 환자의 혈청에서 5. In the Serum of Colorectal Cancer Patients 잘려진Clipped 신데칸Sindecan -2의 증가 정도는 대장암 세포의 이동성 증가와 상관관계가 있다.The increase of -2 correlates with the increased mobility of colorectal cancer cells.
본 발명자들은 대장암 환자의 혈청에서 잘려진 신데칸-2가 대장암 활성과 관련이 있는지를 분석하였다. 신데칸-2의 잘려진 정도는 신데칸-2 항체를 사용한 슬롯 블럿팅을 사용하여 조사하였고, 대장암 환자의 각 혈청은 암 세포 이동 분석에 대한 화학 유인물질(chemoattractant)로 사용하였다. 선종, 진행성 암종으로부터 유래한 잘려진 신데칸-2를 많이 함유한 혈청은 상대적으로 적은 양의 잘려진 신데칸-2를 함유하고 있는 혈청을 처리한 세포와 비교해서 HCT116 대장암 세포의 세포 이동을 현저하게 촉진하였다(도 10A; *P < 0.05, **P < 0.01). 또한 혈청에 함유된 잘려진 신데칸-2를 제거하였을 경우, 이 혈청에 의한 대장암 세포의 이동 증가 효과는 사라졌다(도 10B; P < 0.05). We analyzed whether syndecane-2, cut from the serum of colorectal cancer patients, is associated with colorectal cancer activity. The extent of cutincan-2 was examined using slot blotting with syndecan-2 antibodies, and each serum of colon cancer patients was used as a chemoattractant for cancer cell migration assays. Serum containing a lot of truncated syndecane-2 from adenomas, advanced carcinomas significantly reduced cell migration of HCT116 colorectal cancer cells compared to cells treated with a relatively small amount of truncated syndecane-2. (FIG. 10A; * P <0.05, ** P <0.01). In addition, when the truncated syndecane-2 contained in the serum was removed, the effect of increasing the migration of colorectal cancer cells by the serum disappeared (FIG. 10B; P <0.05).
흥미롭게도, 진행성 암종으로부터 유래한 잘려진 신데칸-2-함유 혈청을 테스트한 결과 세포 증식은 변하지 않고(데이터 도시 안 함) 대부분의 대장암 세포의 이동성이 증가한 반면, 유방암, 위암, 간암 및 폐암과 같은 다른 암 세포에서는 효과가 없었다(도 10C). 이것은 대장암 세포의 이동에 특이성을 가진다는 것을 의미한다. 또한 조직의 MMP-7 발현이 높을 경우 혈청에 잘려진 신데칸-2 레벨 역시 높았으며, 이동도 증가하였다 (*P < 0.05, **P < 0.01). 아울러, 부착-의존성 콜로니 형성도 증가하였다 (도 10D). Interestingly, testing of truncated syndecane-2-containing serum derived from advanced carcinoma resulted in unchanged cell proliferation (data not shown) and increased mobility of most colorectal cancer cells, whereas breast, gastric, liver and lung cancers It was not effective in the same other cancer cells (FIG. 10C). This means that they have specificity for the migration of colon cancer cells. In addition, when the expression of MMP-7 in the tissues was high, the cutincan-2 level cut in the serum was also high and the mobility was increased (* P <0.05, ** P <0.01). In addition, adhesion-dependent colony formation also increased (FIG. 10D).
이 모든 데이터들은 혈청에 존재하는 잘려진 신데칸-2가 대장암 세포의 이동성을 증가시킨다는 것을 강하게 의미한다.All these data strongly imply that truncated syndecane-2 present in serum increases the mobility of colon cancer cells.
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Claims (16)
A composition for diagnosing colon cancer, comprising an agent for measuring the expression level of a Syndecan-2 peptide fragment consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
The composition for diagnosing colorectal cancer according to claim 2, wherein the agent for measuring the expression level of the peptide fragment comprises an antibody specific for a Syndecan-2 peptide fragment.
A kit for diagnosing colorectal cancer, comprising the composition of claim 2.
The kit for diagnosing colorectal cancer according to claim 4, wherein the kit is a protein chip kit.
5. The colon of claim 4, wherein the kit is measured in quantity by i) detecting fluorescence by a surface plasmon resonance (SPR) method or surface plasmon resonance imaging (SPRI) method, or ii) a fluorescent label attached to an antibody. Cancer diagnostic kit.
To provide information necessary for diagnosing colorectal cancer, the expression level of a syndecan-2 peptide fragment consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 from an isolated sample of a suspected colon cancer Measuring; And comparing the expression level of the syndecane-2 peptide fragment with the expression level of the syndecane-2 peptide fragment of the normal control sample.
8. The method of claim 7, wherein the sample is any one selected from blood, serum or plasma.
The method of claim 7, wherein the expression level of the Syndecan-2 peptide fragment is electrophoresis, Matrix-assisted laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometry (SELD-TOF) or SELDI-TOF The method is measured using the surface-enhanced laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometry (MS) method.
The method of claim 7, wherein the expression level of the Syndecan-2 peptide fragment is measured using an antibody that specifically binds to the Syndecane-2 peptide fragment.
A candidate for treating colorectal cancer is treated with a sample expressing a syndecan-2 peptide fragment consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, and then the expression level of the Syndecan-2 peptide fragment is adjusted. A method for screening a colorectal cancer therapeutic agent, comprising the step of measuring.
The method of claim 12, further comprising measuring the expression level of MMP-7 (Matrix metalloprotease-7).
The method of claim 12, wherein the therapeutic agent mutates leucine, which is the 139th residue of the sindecan-2 extracellular domain of SEQ ID NO: 2 to isoleucine, or the 149th residue of the sindecan-2 extracellular domain of SEQ ID NO: The leucine is mutated to isoleucine.
A pharmaceutical composition for treating colorectal cancer, comprising an antibody that specifically binds to a Sindecan-2 peptide fragment consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
The composition of claim 2, wherein the composition is for early colon cancer diagnosis.
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Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030225018A1 (en) * | 2002-01-18 | 2003-12-04 | Ekker Stephen C. | Syndecans and angiogenesis |
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030225018A1 (en) * | 2002-01-18 | 2003-12-04 | Ekker Stephen C. | Syndecans and angiogenesis |
KR100920731B1 (en) * | 2008-05-20 | 2009-10-07 | 주식회사 바이오인프라 | Protein markers for diagnosis and screening and the method of mesurement thereof for colon cancer diagnosis |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. 2002, Vol. 277, No. 33, pp. 29730-29736. * |
THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. 2009, Vol. 284, No. 51, pp. 35692-35701. * |
THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. 2009, Vol. 284, No. 51, pp. 35692-35701.* |
Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10907131B2 (en) | 2012-02-10 | 2021-02-02 | Orbsen Therapeutics Limited | Stromal stem cells |
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