KR101309524B1 - Ｄｎａ 검출용 미세유체 반응기를 이용한 ｄｎａ 검출 방법 - Google Patents

Ｄｎａ 검출용 미세유체 반응기를 이용한 ｄｎａ 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 DNA 검출용 미세유체 반응기 및 이를 이용한 DNA 검출 방법에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 유리 기판과 PDMS 덮개 사이에 Y자 형태의 미세관이 가공되어 있고, 상기 Y자관은 두 개의 주입구와 하나의 배출구로 구성됨으로써 두 개의 주입구로 주입된 반응물이 합류하여 반응이 진행되며, 상기 두 개의 주입구로 반응물을 주입하는 두 개의 인젝터를 포함하고, 상기 Y자관 중에서 합류된 부분에 작동전극, 기준전극 및 상대전극이 차례로 설치되어 있는, 미세유체 반응기, 및 이를 이용한 DNA 검출 방법에 관한 것이다.

Description

ＤＮＡ 검출용 미세유체 반응기를 이용한 ＤＮＡ 검출 방법{Method for Detecting DNA Using Microfluidic Reactor}
본 발명은 DNA 검출용 미세유체 반응기 및 이를 이용한 DNA 검출 방법에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 유리 기판과 PDMS 덮개 사이에 Y자 형태의 미세관이 가공되어 있고, 상기 Y자관은 두 개의 주입구와 하나의 배출구로 구성됨으로써 두 개의 주입구로 주입된 반응물이 합류하여 반응이 진행되며, 상기 두 개의 주입구로 반응물을 주입하는 두 개의 인젝터를 포함하고, 상기 Y자관 중에서 합류된 부분에 작동전극, 기준전극 및 상대전극이 차례로 설치되어 있는, 미세유체 반응기, 및 이를 이용한 DNA 검출 방법에 관한 것이다.
최근, 인간의 유전자나 단백질 및 세포 등 나노단위의 생체분자 거동을 직접적으로 확인하고 조작할 수 있는 나노-바이오 기술에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 특히, 나노-바이오 기술은 질병을 진단, 분석하고 신약 개발을 위한 임상 검사를 빠르고 간단하게 수행할 수 있는 나노바이오칩으로 구체화되어 빠르게 우리 일상과 의료현장으로 다가오고 있다.
나노-바이오 기술을 가능하게 하는 새로운 도구(tool)라고 할 수 있는 나노바이오칩은 나노 단위의 생체 시료의 분석을 통해 DNA, 단백질 및 세포 등의 반응 메커니즘을 직접 분석함으로써 빠르고 정확하게 미세 생체분자의 현상을 파악할 수 있다는 장점이 있다.
나노스케일의 생체분자에 대한 다양한 정보를 얻기 위해서는 무엇보다 생체분자 자체에 대한 안정성의 확보가 필요하다. 즉, 외부로부터의 자극에 의한 비특이적인 반응을 원천적으로 봉쇄하고 특정 자극에 대해서만 반응할 수 있도록 안정된 조건을 유지할 수 있어야 한다. 이러한 비특이적인 반응은 물질의 특성 변화를 일으키게 되고, 결국 왜곡된 정보(noise)를 제공하게 되므로 나노스케일에서 생체분자의 분석 및 진단에 있어 많은 제약을 가져온다.
바이오칩(bio chip)이란 기질상에 분석하고자 하는 DNA, 단백질 등의 생분자(biomolecules) 프로브를 고밀도로 부착시킨 칩으로서, 상기 프로브와 샘플내 표적물질과의 혼성화(hybridization) 여부를 검출하여 유전자 발현 양상, 유전자 결함, 단백질 분포, 반응 양상 등을 분석해낼 수 있다. 바이오칩은 프로브의 종류에 따라 DNA 칩이나 단백질칩 등으로 나누고, 프로브의 부착형태에 따라 고체 기질상에 부착된 마이크로어레이 칩(microarray chip)과 미세유체 채널상에 부착된 미세유체 칩(반응기)(microfluidic chip (reactor))으로 나눌 수 있다.
미세유체 칩(microfluidic chip)은 샘플 주입, 혼성화 반응과 검출 등 실험의 전 과정을 하나의 작은 칩으로 자동적으로 처리하려는 것으로 랩온어칩(lab-a-chip)이라고도 불리며, 앞으로 실험실에서 플라스크와 실험관을 사라지게 할 획기적인 첨단기술 제품이다. 이 미세유체 칩은 유리, 석영, 플라스틱 또는 실리콘 등의 다양한 재료로 되어 있으며, 칩 내부에 머리카락보다 좁은 복수의 미세 채널이 엇갈려 있다. 이러한 미세 채널을 통해 유체를 흘려보내는 방식으로 여러 가지 복잡한 실험을 한꺼번에 수행할 수 있다.
본 발명의 기본적인 목적은 유리 기판과 PDMS 덮개 사이에 Y자 형태의 미세관이 가공되어 있고, 상기 Y자관은 두 개의 주입구와 하나의 배출구로 구성됨으로써 두 개의 주입구로 주입된 반응물이 합류하여 반응이 진행되며, 상기 두 개의 주입구로 반응물을 주입하는 두 개의 인젝터(injector)를 포함하고, 상기 Y자관 중에서 합류된 부분에 작동전극, 기준전극 및 상대전극이 차례로 설치되어 있는, 미세유체 반응기를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (i) 제1항의 반응기의 한쪽 주입구로 프로브 DNA, 염료(stain) 및 PBS 완충용액을 주입하고, 동시에 다른 한쪽 주입구로 표적 DNA 및 PBS 완충용액을 주입하는 단계; 및 (ii) 상기 주입된 반응물이 반응하는 동안 전압전류법(voltametry)를 수행하는 단계를 포함하는, DNA 검출 방법을 제공하는 것이다.
전술한 본 발명의 기본적인 목적은 기판과 마이크로 구조체 사이에 Y자 형태의 미세관이 가공되어 있고, 상기 Y자관은 두 개의 주입구와 하나의 배출구로 구성됨으로써 두 개의 주입구로 주입된 반응물이 합류하여 반응이 진행되며, 상기 두 개의 주입구로 반응물을 주입하는 두 개의 인젝터를 포함하고, 상기 Y자관 중에서 합류된 부분에 작동전극, 기준전극 및 상대전극이 차례로 설치되어 있는, 미세유체 반응기를 제공함으로써 달성될 수 있다.
좀 더 구체적으로 본 발명은 전극이 형성된 기판 ; 및 Y자 형태의 미세관이 형성된 구조체가 합지된 미세유체 반응기로서 상기 Y자 형태의 미세관은 두 개의 주입구와 하나의 배출구를 포함하여 두 개의 주입구로 주입된 반응물이 배출구에서 합류하여 반응이 진행되며, 상기 미세유체 반응기는 상기 두 개의 주입구로 반응물을 주입하는 두 개의 인젝터를 포함하고, 상기 전극은 상기 Y자 미세관의 배출구에 대응되는 기판 상에 차례로 형성된 작동전극, 기준전극 및 상대전극인 미세유체 반응기이다.
본 발명의 미세유체 반응기의 개념이 도 1에 나타나 있고, 이에 대한 구체적인 실시태양이 도 2에 나타나 있다.
인젝터를 이용하여 양쪽 주입구를 통해 반응물을 주입하면, 상기 반응물들이 합류하여 출구로 배출될 때까지 반응이 진행된다. 상기 반응이 진행되는 동안, 즉 반응물이 출구로 흐르는 경로에 작동전극(working electrode), 기준전극(reference electrode) 및 상대전극(counter electrode)이 설치되어 있다.
상기 전극들은 금(Au)과 같이 당업자에게 알려져 있는 재료를 사용하여 제작할 수 있다. 상기 전극들을 통하여 전기화학적 특성(전압, 전류 등)을 측정함으로써, 반응의 진행 여부 등을 확인할 수 있다.
본 발명의 미세유체 반응기는 종래의 세척용액(예를 들면, 20 mM Tris-HCl 및 500 mM NaCL, pH 7.0)을 사용하여 세척함으로써 지속적으로 사용할 수 있다.
상기 기판은 유리, 석영, 플라스틱, 또는 실리콘으로 형성될 수 있으며, 바람직하게는 유리기판이다.
상기 구조체로 사용될 수 있는 재질로는 당업계에서 통상적으로 사용되는 임의의 재질, 예를 들어 실리콘 웨이퍼, 유리, PDMS(polydimethylsiloxane), 플라스틱 등 대부분의 재질이 사용될 수 있다.
상기 구조체는, 예를 들어, 실리콘 기판에 사진제판(photolithography) 공정으로 만들어진 SU-8 마스터몰드에 PDMS(polydimethylsiloxane)를 부어서 주조할 수 있다.
상기 기판, 예를 들면, 유리기판 위의 전극은 열증착기를 이용하여 독립적으로 제작한다. 이후 유리 기판에 오존 처리를 하여 반응기 몸체와 기판을 붙임으로서 미세유체 반응기를 완성한다.
전술한 본 발명의 또 다른 목적은 (i) 제1항의 반응기의 한쪽 주입구로 프로브 DNA, 염료(stain) 및 PBS 완충용액을 주입하고, 동시에 다른 한쪽 주입구로 표적 DNA 및 PBS 완충용액을 주입하는 단계; 및 (ii) 상기 주입된 반응물이 반응하는 동안 전압전류법(voltametry)를 수행하는 단계를 포함하는, DNA 검출 방법을 제공함으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 다른 한쪽 주입구로 염료를 추가로 주입할 수도 있다. 즉, 상기 염료는 양쪽 주입구 모두, 또는 한쪽 주입구로만 주입할 수 있다.
상기 염료는, 예를 들면 Hoechst 33258, 페로세닐 나프탈렌 디이미드(ferrocenyl naphthalene diimide), 코발트(II)-트리스-(1,10-페난트롤린)(cobalt(II)-Tris-(1,10-phenanthroline)), 루테늄(II)-트리스-(1,10-비피리딘)(ruthenium(II)-Tris-(1,10-bipyridine)), 메틸렌 블루(methylene blue), 멜돌라 블루(meldola blue) 또는 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)와 같이, DNA를 염색할 수 있는 물질일 수 있다.
상기 Hoechst 33258(2'-(4-hydroxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl_2,5'-bi(1H-benzimidazole))은 아래 화학식 (I)의 구조를 갖는 화합물로서, 형광현미경 및 FACS(fluorescence-activated cell sorting)에서 DNA를 표지하기 위한 형광 염료(fluorescent stain)로 사용된다.
Figure 112011031748010-pat00001
화합물 (I)
Hoechst 33258은 DNA 인터칼레이터(intercalator)로서, 이중가닥 DNA의 홈(groove)에 결합한다. 또한, Hoechst 33258은 낮은 전위(약 550 mV)에서 비가역적으로 산화되는 것으로 알려져 있다.
예를 들어, Hoechst 33258은 전기 화학적인 활성을 띠고 있기 때문에 미세 유체 반응기에 주입되어 전기화학적 신호를 나타내게 한다. 그런데 프로브와 표적 DNA의 염기서열이 상보적으로 매치되는 경우에는 이중가닥 DNA를 형성하게 되며 상당한 량의 Hoechst 33258이 그루브에 흡입된다. 이 경우 Hoechst 33258의 감소는 전기화학신호의 감소를 야기하게 되며 이러한 전기화학신호차이를 이용하여 원하는 염기서열의 DNA를 검출할 수 있다.
상기 (ii)단계의 전압전류법은 LSV(linear sweep voltametry) 또는 CV(cyclic voltametry)일 수 있다. 또한, 상기 LSV(linear sweep voltametry) 또는 CV(cyclic voltametry)는 50 - 200 mV/s로 수행될 수 있다.
상기 DNA 검출 방법은 황산 용액, Tris-HCl 및 NaCL의 세척용액으로 세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 세척단계에 의해, 상기 미세유체 반응기에 잔류하고 있는 DNA와 Hoechst 33258를 제거할 수 있어 상기 미세유체 반응기의 재사용율을 현저히 높일 수 있다.
상기 세척용액은 예룰 들면, 30% 황산, 20mM Tris-HCl 및 500mM NaCL을 혼합하여 사용할 수 있다. 상기 세척단계는 상기 세척용액으로 1시간 내지 5시간 정도 세척할 수 있다. 또한, 상기 세척단계는 먼저 황산용액으로 1시간 내지 4시간 씻어내고, 이어서 Tris-HCl 및 NaCL으로 1분 내지 1시간 정도 세척할 수 있다. 상기 세척단계는 PBS 완충용액으로 1분 내지 1시간 동안 추가로 미세유체 반응기를 세척할 수 있다.
본 발명의 미세유체 반응기(칩)를 본 발명의 방법에 따라 사용하면, 표적 DNA를 간단하고 빠르게 검출할 수 있게 한다. 또한, 본 발명의 미세유체 반응기(칩)는 세척 후 다시 사용할 수 있을 정도로 성능이 양호하게 유지된다.
도 1은 본 발명의 Y자 분지관형태의 미세유체 반응기 및 (바이오)칩에 대한 개념도이다.
도 2는 본 발명의 미세유체 반응기(또는 바이오칩)에 대한 하나의 실시 태양으로서, 실시예 2에서 사용된 것이다.
도 3은 실시예 1에서 사용된 전기화학적 마이크로셀을 보여 준다.
도 4는 실시예 1의 LSV 결과이다. 표적 DNA 및 불일치 DNA의 존재 하에서 LSV에 의해 검출된 Hoechst 33258의 산화극 전류 피크를 측정한 것이다((a) 무변형(bare) 전극, (b) 티올화된(thiolated) 프로브 단일가닥 DNA로 변형된 전극).
도 5는 실시예 2에서 사용된 미세유체 반응기에 대한 그림이다.
도 6은 실시예 2의 CV 결과이다. CV sweep rate가 100 mV/s, 인젝터 유량이 50 μl/min인 조건 하에서 CV에 의해 검출된 Hoechst 33258의 산화극 전류 피크를 측정한 것이다((a) 양쪽 주입구로 Hoechst 33258 주입, (b) 한쪽 주입구로만 Hoechst 33258 주입).
도 7은 실시예 2의 새로운 바이오칩과 사용 후 세척한 바이오칩의 성능 변화를 보여 준다.
이하, 본 발명을 첨부된 실시예 및 도면을 참조하여 자세히 설명한다. 그러나 첨부된 실시예 및 도면은 본 발명의 구체적인 실시태양을 예시할 뿐, 본 발명의 권리범위를 이에 한정하려는 의도는 아니다.
재료
프로브 단일가닥 DNA로서 5'-GTG TTG TCT CCT AGG TTG GCT CTG-3(Human p53_exon7_sense), 표적 단일가닥 DNA로서 5'-CAG AGC CAA CCT AGG AGA CAA CAC-3'(Human p53_exon7_antisense) 그리고 미스매치 단일가닥 DNA로서 5'-ATA TCG ACC TTG GCC GAG ACG GTG-3를 준비하였다.
상기 DNA를 용해하는 데 사용하기 위해 50 mM의 인산염완충용액(K2HPO4 40 mM, KH2PO4 10 mM, pH 7.0)을 준비하였다.
전극을 세척하기 위하여, 세척용액(20 mM Tris-HCl 및 500 mM NaCL, pH 7.0)을 준비하였다.
실시예 1. 전기화학적 마이크로셀을 사용한 DNA 검출
Au 작동전극, Pt 상대전극 및 Ag/AgCl 기준전극을 갖춘 전기화학적 마이크로셀(Prinston Applied Research)을 사용하였다(도 3 참조). 또한, 100 μM의 Hoechst 33258, 50 mM의 PBS 완충용액 및 1 μM의 DNA를 사용하였다.
먼저, 전극에 변형을 가하지 아니한 상태로, (i) 프로브 DNA, 표적 DNA, PBS 완충용액 및 Hoechst 33258과, (ii) 프로브 DNA, 불일치 DNA(mismatch DNA), PBS 완충용액 및 Hoechst 33258에 대하여 LSV(linear sweep voltametry)를 수행하였다(LSV 속도: 100 mV/s). 상기 LSV 결과를 도 4(a)에 나타내었다.
다음으로, 프로브 DNA로 변형한(modified) 전극을 사용하여, (i) 변형 전극, 표적 DNA, PBS 완충용액 및 Hoechst 33258과, (ii) 변형 전극, 불일치 DNA, PBS 완충용액 및 Hoechst 33258를 사용하여 LSV를 수행하였다(LSV 속도: 100 mV/s). 상기 LSV 수행 결과를 도 4(b)에 나타내었다.
실시예 2. 본 발명의 바이오칩을 사용한 DNA 검출
도 2 및 도 5에 나타나 있는 DNA 바이오칩을 사용하여 본 실험을 수행하였다. 또한, 100 μM의 Hoechst 33258, 50 mM의 PBS 완충용액 및 1 μM의 DNA를 사용하였다. 반응물 주입 속도는 50 μl/min이었다.
먼저, DNA 바이오칩의 양쪽 주입구로 Hoechst 33258을 주입하여 실험하였다. (i) 불일치하는 경우(mismatch case)로서, A 주입구로 프로브 DNA, Hoechst 33258 및 PBS 완충용액을 주입하였고, B 주입구로 불일치 DNA, Hoechst 33258 및 PBS 완충용액을 주입하였다. (ii) 일치하는 경우(match case)로서, A 주입구로 프로브 DNA, Hoechst 33258 및 PBS 완충용액을 주입하였고, B 주입구로 표적 DNA, Hoechst 33258 및 PBS 완충용액을 주입하였다. 이후, 각각에 대하여 CV(cyclic voltametry)를 수행하였다(CV sweep rate = 100 mV/s). 상기 CV 결과를 도 6에 나타내었다.
다음으로, DNA 바이오칩의 한쪽 주입구로만 Hoechst 33258을 주입하여 실험하였다. (i) 불일치하는 경우(mismatch case)로서, A 주입구로 프로브 DNA, Hoechst 33258 및 PBS 완충용액을 주입하였고, B 주입구로 불일치 DNA 및 PBS 완충용액을 주입하였다. (ii) 일치하는 경우(match case)로서로서, A 주입구로 프로브 DNA, Hoechst 33258 및 PBS 완충용액을 주입하였고, B 주입구로 표적 DNA 및 PBS 완충용액을 주입하였다. 이후, 각각에 대하여 CV(cyclic voltametry)를 수행하였다(CV sweep rate = 100 mV/s). 상기 CV 결과를 도 6에 나타내었다.
이후, 세척용액을 사용하여 상기 미세유체 반응기(Y자 배관 및 전극)를 세척한 후 성능 변화를 측정하였다. 세척 과정은, 황산 용액으로 2시간, 세척용액으로 5분 및 PBS 완충용액으로 2분간 실시하였다. 도 7에 미세유체 반응기(바이오칩)의 신규 및 세척 후의 성능 변화에 대한 CV 결과를 나타내었다. 도 7에서 볼 수 있듯이, 단지 12.7%의 감소만이 관찰되었다.

Claims (6)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. (i) 두 개의 주입구와 하나의 배출구를 구비하는 미세유체 반응기의 한쪽 주입구로 프로브 DNA, Hoechst 33258 및 PBS 완충용액을 주입하고, 동시에 다른 한쪽 주입구로 표적 DNA, Hoechst 33258 및 PBS 완충용액을 주입하는 단계; 및
    (ii) 상기 주입된 프로브 DNA와 표적 DNA가 상기 배출구에서 반응하는 동안 LSV(linear sweep voltametry) 또는 CV(cyclic voltametry) 전압전류법(voltametry)를 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 검출 방법.
  4. 삭제
  5. 제3항에 있어서, 상기 전압전류법은 50 - 200 mV/s로 수행되는 것을 특징으로 하는 DNA 검출 방법.
  6. 제 3항에 있어서, 상기 DNA 검출 방법은 황산 용액, Tris-HCl 및 NaCL의 세척용액으로 상기 미세유체 반응기를 세척하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 검출 방법.

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