KR101298130B1

KR101298130B1 - Genes enhancing resistance to stress and uses thereof

Info

Publication number: KR101298130B1
Application number: KR1020110082947A
Authority: KR
Inventors: 이재헌; 정은숙; 셀밤; 조창우; 소현아; 김경미
Original assignee: 동아대학교 산학협력단
Priority date: 2011-08-19
Filing date: 2011-08-19
Publication date: 2013-08-20
Also published as: KR20130020354A

Abstract

본 발명은 나문재(Suaeda asparagoides) 유래의 RNA 결합 단백질 (RNA binding protein)인 SaRBP1, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 유전자를 포함하는 스트레스 저항성 증진용 조성물, 상기 유전자를 발현하여 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 방법에 관한 것이다. The present invention is Suaeda asparagoides ) derived from SaRBP1 RNA binding protein (RNA binding protein), the gene encoding the protein, the recombinant vector containing the gene, a composition for enhancing stress resistance comprising the gene, resistance to stress by expressing the gene It is about how to promote.

Description

Genes that enhance stress resistance and uses thereof

본 발명은 삼투 스트레스, 냉동 스트레스 및 고온 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다. The present invention relates to genes and their use to enhance resistance to osmotic stress, freezing stress and high temperature stress.

보다 상세하게는, 본 발명은 나문재(Suaeda asparagoides) 유래의 RNA 결합 단백질 (RNA binding protein)인 SaRBP1, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 유전자를 포함하는 스트레스 저항성 증진용 조성물에 관한 것이다.
In more detail, the present invention is SaRBP1 , an RNA binding protein derived from Suaeda asparagoides , a gene encoding the protein, a recombinant vector comprising the gene, and a stress resistance enhancer including the gene. It relates to a composition.

환경 스트레스는 식물의 성장을 저해하고 많은 중요한 농업 분야에서 수확물의 생산성을 제한하는 요소로서 수분 스트레스, 저온 스트레스, 고온 스트레스, 염해 스트레스 등이 있다. 특히 탈수, 고염 및 추위 등 다양한 외부 조건에 의해서 야기되는 삼투 스트레스 (osmotic stress)는 식물에게 가장 가혹한 스트레스이다. Environmental stresses are factors that inhibit plant growth and limit yields in many important agricultural sectors, including water stress, low temperature stress, high temperature stress, and salt stress. In particular, osmotic stress caused by various external conditions such as dehydration, high salt and cold is the most severe stress for plants.

삼투 스트레스에 대한 저항성이 약간만 증가하여도 농업 생산성과 수율에 큰 영향을 미칠 수 있기 때문에, 삼투 스트레스에 대한 조절 기작과 이에 관련된 조절 인자에 대해 많은 연구가 진행되어 왔다. 최근 연구들은 식물이 삼투 스트레스에 대한 적응 반응의 일부로 정밀한 기작을 가지고 있으며, 이러한 스트레스 적응 반응의 중요한 기작 중 하나는 적응 반응에 필요한 단백질을 코딩하는 유전자의 전사 활성화라는 사실을 밝히고 있다 (Janget al., Plant Mol. Biol. 37:839-847, 1998; Liu et al., Science 280:1943-1945, 1998; Pardo et al., Proc. Acad. Natl. Sci. USA 95:9681-9686, 1998; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3730-3734, 2000).Since only a slight increase in the resistance to osmotic stress can have a significant effect on agricultural productivity and yield, much research has been conducted on the mechanism of regulation of osmotic stress and related regulatory factors. Recent studies have revealed that plants have precise mechanisms as part of their adaptive response to osmotic stress, and one of the important mechanisms of these adaptive responses is the transcriptional activation of genes encoding proteins required for adaptive response (Janget al. , Plant Mol. Biol. 37: 839-847, 1998; Liu et al., Science 280: 1943-1945, 1998; Pardo et al., Proc. Acad. Natl. Sci. USA 95: 9681-9686, 1998; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 3730-3734, 2000).

삼투 스트레스에 적응하기 위한 기작을 이해하기 위해 특정한 스트레스에 의해 발현이 유도되는 다수의 유전자들이 분리되었고, 그 특성이 광범위하게 연구되었다. 그 결과, 삼투 스트레스 반응 유전자의 발현을 유도하는 다양한 신호전달 체계가 존재하며 (Jonak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11274-11279, 1996; Ishitani et al., Plant Cell 9:1935-1949, 1997), 이러한 신호전달 체계는 ABA-의존성 또는 ABA-비의존성 경로를 포함하고 (La Rosa et al., Plant Physiol. 85:174-181, 1987; Savoure et al., Mol. Gen. Genet. 254:104-109, 1997), 어떤 신호전달 경로는 추위, 고염 및 탈수와 같은 모든 삼투 스트레스 조건에서 공통적으로 작용한다는 것이 밝혀졌다 (Jang et al., Plant Mol. Biol. 37:839-847, 1998; Liu et al., Science 280:1943-1945, 1998; Pardo et al., Proc. Acad. Natl. Sci. USA 95:9681-9686, 1998; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:3730-3734, 2000).In order to understand the mechanism for adapting to osmotic stress, a number of genes whose expression is induced by specific stresses have been isolated and their characteristics studied extensively. As a result, various signaling systems exist that induce the expression of osmotic stress response genes (Jonak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11274-11279, 1996; Ishitani et al., Plant Cell 9 : 1935-1949, 1997), this signaling system comprises an ABA-dependent or ABA-independent pathway (La Rosa et al., Plant Physiol. 85: 174-181, 1987; Savoure et al., Mol. Gen. Genet. 254: 104-109, 1997), it has been found that certain signaling pathways work in common in all osmotic stress conditions such as cold, high salt and dehydration (Jang et al., Plant Mol. Biol. 37: 839-847, 1998; Liu et al., Science 280: 1943-1945, 1998; Pardo et al., Proc. Acad. Natl. Sci. USA 95: 9681-9686, 1998; Liu et al., Proc. Natl Acad.Sci. USA 97: 3730-3734, 2000).

RNA 결합 단백질 (RNA binding protein)은 세포에서 pre-rRNA 과정, mRNA 수송, 단백질 번역을 중재한다. 이러한 RNA binding protein의 기능은 후생동물과 효모에서 많이 연구되었으나(Dreyfuss et al., 1996), 식물에서 이들 단백질 기능은 많이 연구되지 않았다(Mar-Albe and Pages, 1998). 식물에서 가장 많이 연구된 RNA binding protein 종류로는 작은 사이즈(15-17 kDa) 단백질을 특징으로 하며, RNA binding RNA recognition motif(RRM)이라는 잘 보존된 도메인을 N-terminal 부분에 포함하고 있다. C-terminal 부분에서 Gly 잔기로 구성되며(70%), 소위 RGG 박스라고 하는 RNA binding 모티프가 존재한다(Mar-Albe and Pages, 1998). 핵으로 타겟팅되는 큰 사이즈의 RNA binding protein의 기능은 동물에서 hyaluronan binding protein과 상동성을 보인다(Huang et al., 2000). 히알루산(hyaluronan)은 글루쿠론산(glucuronic acid, glcA)과 N-아세틸글루코사민 (N-acetylglucosamine, GlcNAc)이 beta 1, 3 결합으로 결합된 이당류를 단위로 하여 이 이당류가 다시 beta-1, 4 결합으로 연결된 다당류 GAG(glycosaminoglycan)이다. 동물에서 히알루산과 결합하는 단백질은 CDC37, RHAMM/IHABP, P32 등이 있으며, 이들은 세포 기능에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Huang et al., 2000). 하지만, 정확한 이들 단백질 기능은 아직 잘 모르는 실정이다. RNA binding protein mediates pre-rRNA processes, mRNA transport, and protein translation in cells. The function of these RNA binding proteins has been studied in epigenetics and yeast (Dreyfuss et al., 1996), but these proteins in plants have not been studied much (Mar-Albe and Pages, 1998). The most studied RNA-binding protein in plants is characterized by small size (15-17 kDa) proteins and contains a well-conserved domain called the RNA-binding RNA recognition motif (RRM) in the N-terminal region. It consists of Gly residues in the C-terminal moiety (70%) and there is an RNA binding motif called RGG box (Mar-Albe and Pages, 1998). The function of large-sized RNA binding proteins targeted to the nucleus shows homology with hyaluronan binding proteins in animals (Huang et al., 2000). Hyaluronan is a disaccharide in which glucuronic acid (glcA) and N-acetylglucosamine (N-acetylglucosamine (GlcNAc) are combined by beta 1 and 3 bonds. Polysaccharide GAG (glycosaminoglycan) linked by a bond. Hyaluronic acid-binding proteins in animals include CDC37, RHAMM / IHABP and P32, which are known to play an important role in cellular function (Huang et al., 2000). However, the exact function of these proteins is still unknown.

그러나 지금까지 나문재의 RNA 결합 단백질에 대해서는 밝혀진 바가 없었다. 본 발명자들은 여러 가지 스트레스에 유도되는 나문재의 SaRBP1 유전자를 동정하고 그 기능을 규명하였다. 본 발명에 의한 SaRBP1 유전자를 효모에 발현시켰을 때, 삼투 스트레스, 냉동 스트레스 및 고온 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 기능이 있음을 확인하였으며, SaRBP1 재조합 단백질의 RNA 결합활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
However, until now, nothing was known about RNA binding protein of Namunjae. The present inventors have identified the SaRBP1 gene of Namuljae induced by various stresses and identified its function. SaRBP1 according to the present invention When the gene was expressed in yeast, it was confirmed that the function to enhance the resistance to osmotic stress, freezing stress and high temperature stress, and completed the present invention by confirming the RNA binding activity of SaRBP1 recombinant protein.

본 발명의 목적은 환경 스트레스 저항성을 증진시키는 단백질 및 이를 암호화하는 유전자를 제공하는데 있다. It is an object of the present invention to provide a protein that enhances environmental stress resistance and a gene encoding the same.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는데 있다. Another object of the present invention to provide a recombinant vector comprising the gene.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 유효성분으로 포함하는 환경 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공하는데 있다. Still another object of the present invention is to provide a composition for enhancing environmental stress resistance, comprising the gene as an active ingredient.

또한 본 발명은 상기 유전자를 식물에서 발현하여 환경 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 방법을 제공한다.
The present invention also provides a method of expressing the gene in plants to enhance resistance to environmental stress.

상기 과제를 해결하기 위해 본 발명은 나문재 유래의 SaRBP1 단백질을 제공한다. The present invention to solve the above problems is SaRBP1 derived from Namunjae Provide protein.

또한 본 발명은 상기 단백질을 코딩하는 유전자을 제공한다.The present invention also provides a gene encoding the protein.

또한 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.The present invention also provides a recombinant vector comprising the gene.

또한 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 삼투 스트레스, 냉동 스트레스 및 고온 스트레스에 대한 저항성 증진용 조성물을 제공한다. The present invention also provides a composition for enhancing resistance to osmotic stress, freezing stress and high temperature stress comprising the gene.

또한 본 발명은 상기 유전자를 발현하여 삼투 스트레스, 냉동 스트레스 및 고온 스트레스에 대한 저항성을 증진시키는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method of expressing the gene to enhance resistance to osmotic stress, freezing stress and high temperature stress.

또한 본 발명은 상기 유전자를 발현하여 RNA 결합 활성을 분석하는 방법을 제공한다.
The present invention also provides a method of analyzing the RNA binding activity by expressing the gene.

본 발명에 따르면, 본 발명의 SaRBP1 유전자를 과발현시킴으로써 삼투 스트레스, 냉동 스트레스 및 고온 스트레스에 대한 저항성을 증진시킬 수 있어, 식물의 생산성을 향상시킬 수 있다.
According to the invention, SaRBP1 of the invention By overexpressing the gene, it is possible to enhance resistance to osmotic stress, freezing stress and high temperature stress, thereby improving plant productivity.

도 1은 나문재로부터 분리한 RNA 결합 단백질 (RNA binding protein ) 유전자 (SaRBP1)의 cDNA 염기서열을 나타낸 것이다.
도 2는 나문재의 RNA 결합 단백질 (RNA binding protein )의 cDNA 염기서열로부터 연역된 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 나문재의 RNA 결합 단백질 (RNA binding protein )의 cDNA 염기서열로부터 연역된 아미노산 서열과 상동성을 가진 다른 식물로부터 보고된 단백질 서열을 비교한 그림이다. 박스 표시된 부분은 RGG repeat으로 구성된 RNA binding 도메인이며, 선으로 표시된 부분은 hyaluronan binding motif이다.
도 4는 나문재의 RNA 결합 단백질 (RNA binding protein )의 cDNA 염기서열로부터 연역된 아미노산 서열과 상동성을 가진 다른 식물로부터 보고된 단백질 서열을 생명나무로 분석하여 진화적 거리를 비교한 그림이다.
도 5은 나문재로부터 분리한 RNA 결합 단백질 (RNA binding protein ) 유전자의 발현양상을 알아보기 위하여 고염 스트레스 (0.2 M NaCl) 처리한 나문재 잎으로부터 전체 RNA를 분리하고 RT-PCR (A)과 Northern blot 분석을 (B) 수행한 결과이다.
도 6는 나문재로부터 분리한 RNA 결합 단백질 (RNA binding protein ) 유전자가 암호화하는 단백질의 GFP 재조합단백질을 담배 원형질체에 발현시켜 세포 내 위치를 분석하는 그림이다.
도 7는 효모(Saccaromyces cerevisiae) 발현 벡터 pYES-DEST52에 SaRBP1을 GAL1 프로모터 뒤에 클로닝 제작한 벡터 그림이다.
도 8은 WT(pYES-GFP) 효모와 SaRBP1을 발현하는 효모(pYES-SaRBP1)를 액체배지 SD(Ura- Raff 2%) 또는 SD(Ura- Gal 2%)에 접종하여 여러 가지 삼투 스트레스 (1 M NaCl,1 M KCl, 1.5 M sorbitol)에 대한 생장을 비교한 그래프이다.
도 9은 WT(pYES-GFP) 효모와 SaRBP1을 발현하는 효모(pYES-SaRBP1)의 희석액을 고체배지 SD(Ura- Raff 2%) 또는 SD(Ura- Gal 2%)에 접종하여 여러 가지 삼투 스트레스 (1 M NaCl,1 M KCl, 1.5 M sorbitol)에 대한 저항성을 콜로니 생장을 통해 비교한 사진이다.
도 10은 WT(pYES-GFP) 효모와 SaRBP1을 발현하는 효모(pYES-SaRBP1)를 냉동 스트레스 전과 후로 나누어 고체배지 SD(Ura- Glc 2%)에 배양하여 생존율을 비교한 그래프이다.
도 11은 대장균(Escherichia coli) 발현 벡터 pDEST15에 SaRBP1을 GST 뒤에 클로닝 하여 제작한 벡터이다.
도 12는 SaRBP1 재조합 단백질을 대장균에서 발현 및 분리하여 RNA 결합 활성을 분석한 그림이다. Figure 1 shows the cDNA sequence of the RNA binding protein ( RNA binding protein ) gene ( SaRBP1 ) isolated from the namuljae .
Figure 2 shows the RNA binding protein of RNA ( RNA binding protein ) shows the amino acid sequence deduced from the cDNA base sequence.
Figure 3 shows the RNA binding protein of RNA ( RNA binding This is a comparison of the amino acid sequence deduced from the cDNA sequence of protein ) and the protein sequence reported from other plants having homology. The boxed area is the RNA binding domain consisting of RGG repeats, and the lined area is the hyaluronan binding motif.
Figure 4 shows the RNA binding protein of RNA ( RNA binding Figure 2 shows a comparison of evolutionary distances from the sequence of amino acids deduced from cDNA sequences of proteins ) and protein sequences reported from other plants with homology.
Figure 5 is a RNA binding isolated from namunjae protein (RNA binding protein) high salt stress (0.2 M NaCl) to remove the total RNA from a namunjae leaf processing, and RT-PCR (A) and Northern blot analysis to examine the expression pattern of the gene (B) is the result.
Figure 6 is an illustration of a recombinant protein by expressing the GFP protein, which gene is encrypted RNA binding protein isolated from namunjae (RNA binding protein) in tobacco protoplast cell analysis your location.
7 is yeast ( Saccaromyces) cerevisiae ) Expression vector pYES-DEST52 cloned SaRBP1 after the GAL1 promoter.
FIG. 8 shows various osmotic stresses (1) by inoculating WT (pYES-GFP) yeast and SaRBP1 expressing yeast (pYES-SaRBP1) in liquid medium SD (Ura-Raff 2%) or SD (Ura-Gal 2%). M NaCl, 1 M KCl, 1.5 M sorbitol) is a graph comparing the growth.
9 is inoculated with a solid solution SD (Ura-Raff 2%) or SD (Ura-Gal 2%) inoculated with dilutions of WT (pYES-GFP) yeast and SaRBP1 expressing yeast (pYES-SaRBP1). (1 M NaCl, 1 M KCl, 1.5 M sorbitol) is a photograph comparing the colony growth.
FIG. 10 is a graph comparing survival rates by incubating WT (pYES-GFP) yeast and SaRBP1 expressing yeast (pYES-SaRBP1) before and after freezing stress and incubating in solid medium SD (Ura-Glc 2%).
Figure 11 is Escherichia coli ) is a vector produced by cloning SaRBP1 after GST in the expression vector pDEST15.
12 is a diagram illustrating RNA binding activity of SaRBP1 recombinant protein expressed and isolated from E. coli.

하나의 양태로서, 본 발명은 나문재(Suaeda asparagoides) 유래의 SaRBP1 ( S uaeda a sparagoides RNA binding protein)단백질을 제공한다.In one embodiment, the present invention provides a SaRBP1 ( S uaeda ) derived from Suaeda asparagoides . a sparagoides RNA binding protein ) provides a protein.

본 발명에 따른 SaRBP1 단백질의 범위는 나문재로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.The range of SaRBP1 protein according to the present invention includes a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 isolated from a palm tree and a functional equivalent of the protein. Is at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 90% or more, more preferably 90% or more, Quot; refers to a protein having a homology of at least 95% with a physiological activity substantially equivalent to that of the protein represented by SEQ ID NO: 2.

본 발명의 SaRBP1 단백질은 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. SaRBP1 단백질의 변이체란 SaRBP1 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아세틸화(acetylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파렌실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다. SaRBP1 proteins of the invention include not only proteins having their native amino acid sequence, but also amino acid sequence variants thereof are also included within the scope of the present invention. Variants of SaRBP1 protein refer to proteins in which the SaRBP1 native amino acid sequence and one or more amino acid residues have different sequences by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof. Amino acid exchange in proteins and peptides that do not alter the activity of the molecule as a whole is known in the art (H. Neuroath, RL Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). The most commonly occurring exchanges are amino acid residues Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Thy / Phe, Ala / Exchange between Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu, Asp / Gly. In some cases, it may be modified by phosphorylation, sulfation, acetylation, glycosylation, methylation, farnesylation, or the like.

상기 SaRBP1 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성 (Merrifleld, J. Amer. chem. Soc. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다 (Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).The SaRBP1 protein or variant thereof can be extracted from nature or synthesized (Merrifleld, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-2156, 1963) or produced by genetic recombination methods based on DNA sequences (Sambrook et al. al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 2nd edition, 1989).

본 발명의 유전자는 SaRBP1 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함하며 게놈 DNA 및 cDNA는 당업계의 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다.Genes of the present invention include both genomic DNA and cDNA encoding SaRBP1 protein and genomic DNA and cDNA can be prepared according to methods known in the art.

게놈 DNA는 예를 들어, SaRBP1 유전자를 가지는 세포로부터 게놈 DNA를 추출하고 게놈 라이브러리(벡터는 예를 들면 플라스미드, 파지, 코스미드, BAC, PAC 등이 이용될 수 있다)를 제작하고 상기 라이브러리를 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA (예를들어, 서열번호 1) 를 기초로 제작한 프로브를 이용하여 콜로니 또는 플라그 혼성화를 수행하거나, 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA (예를들어, 서열번호 1) 에 특이적인 프라이머를 작성하고, 이를 이용한 폴리머라제 연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행함으로써 제조할 수도 있다.Genomic DNA extracts genomic DNA from, for example, cells with the SaRBP1 gene, constructs a genomic library (vectors can be used, for example, plasmids, phages, cosmids, BACs, PACs, etc.) and looks at the library. Colony or plaque hybridization is performed using a probe constructed on the basis of DNA encoding the protein of the invention (eg, SEQ ID NO: 1), or DNA encoding the protein of the present invention (eg, SEQ ID NO: 1). It can also be prepared by preparing a primer specific for the polymerase chain reaction (Polymerase Chain Reaction, PCR) using the same.

cDNA는 예를 들어, SaRBP1 유전자를 가지는 세포에서 추출한 mRNA를 기초로 cDNA를 합성하고, 상기 합성된 cDNA를 λZAP 등의 벡터로 삽입하여 cDNA 라이브러리를 제작하고, 상기 cDNA 라이브러리를 전개하여, 상기와 동일하게 콜로니 또는 플라그 혼성화를 수행하거나 또는 PCR을 수행하여 제조할 수 있다.For example, cDNA synthesizes a cDNA based on mRNA extracted from a cell having a SaRBP1 gene, inserts the synthesized cDNA into a vector such as λZAP, prepares a cDNA library, and expands the cDNA library. Can be prepared by colony or plaque hybridization or by PCR.

바람직하게는, 본 발명의 SaRBP1 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 SaRBP1 단백질을 코딩하는 유전자로서 사용될 수 있는 SaRBP1 핵산분자는 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, SaRBP1 핵산 분자의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, SaRBP1 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.Preferably, SaRBP1 gene of the present invention may comprise a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. In addition, variants of the above nucleotide sequences are included within the scope of the present invention. A SaRBP1 nucleic acid molecule that can be used as a gene encoding the SaRBP1 protein of the present invention is a functional equivalent of a nucleic acid molecule constituting the same, for example, some nucleotide sequences of the SaRBP1 nucleic acid molecule are deleted, substituted or inserted. It is a concept that includes variants that have been modified by insertion, but that can function functionally the same as the SaRBP1 nucleic acid molecule. Specifically, the gene has a base sequence having a sequence homology of at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, most preferably at least 95% with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, respectively. It may include. "% Of sequence homology to polynucleotides" is ascertained by comparing the comparison region with two optimally aligned sequences, and a portion of the polynucleotide sequence in the comparison region is the reference sequence for the optimal alignment of the two sequences (I. E., A gap) relative to the < / RTI >

한편, 본 발명의 SaRBP1 단백질을 코딩하는 유전자는 세포 내 전달을 위한 재조합 벡터에 포함되어 제공될 수 있다. On the other hand, the gene encoding the SaRBP1 protein of the present invention can be provided included in a recombinant vector for intracellular delivery.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.The term "recombinant" refers to a cell in which a cell replicates a heterologous nucleic acid, expresses the nucleic acid, or expresses a protein encoded by a peptide, heterologous peptide or heterologous nucleic acid. The recombinant cell can express a gene or a gene fragment that is not found in the natural form of the cell in one of the sense or antisense form. In addition, the recombinant cell can express a gene found in a cell in its natural state, but the gene has been re-introduced into the cell by an artificial means as modified.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 효모 발현 벡터 또는 재조합 식물 발현 벡터이다. The term "vector" is used to refer to a DNA fragment (s), nucleic acid molecule, which is transferred into a cell. The vector replicates the DNA and can be independently regenerated in the host cell. The term "carrier" is often used interchangeably with "vector ". The term "expression vector" means a recombinant DNA molecule comprising a desired coding sequence and a suitable nucleic acid sequence necessary for expressing a coding sequence operably linked in a particular host organism. The recombinant vector is preferably a recombinant yeast expression vector or a recombinant plant expression vector.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 저항성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The expression vector preferably comprises one or more selectable markers. The marker is typically a nucleic acid sequence having properties that can be selected by chemical methods, and all genes that can distinguish transformed cells from non-transformed cells. Examples include herbicide resistance genes such as glyphosate or phosphinotricin, antibiotic resistance genes such as kanamycin, G418, bleomycin, hygromycin, and chloramphenicol. However, the present invention is not limited thereto.

본 발명은 또한, 본 발명의 SaRBP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된, 삼투 스트레스, 냉동 스트레스 또는 고온 스트레스에 대한 저항성이 증진된 식물체를 제공한다. The present invention also provides a plant having improved resistance to osmotic stress, freezing stress or high temperature stress transformed with a recombinant vector comprising the SaRBP1 gene of the present invention.

본 발명에 따른 상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있다. The plant according to the present invention is Arabidopsis, potato, eggplant, tobacco, pepper, tomato, burdock, garland chrysanthemum, lettuce, bellflower, spinach, chard, sweet potato, celery, carrot, buttercup, parsley, Chinese cabbage, cabbage, gall radish, watermelon, It may be a dicotyledonous plant such as melon, cucumber, pumpkin, gourd, strawberry, soybean, mung bean, kidney bean, pea, or monocotyledonous plant such as rice, barley, wheat, rye, corn, sugar cane, oat, onion.

본 발명은 또한, 본 발명의 SaRBP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 형질전환하여 SaRBP1 유전자를 발현하는 단계를 포함하는 삼투 스트레스 또는 냉동스트레스 저항성을 증진시키는 방법을 제공한다. 상기 식물은 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물이다. The present invention also relates to the SaRBP1 of the present invention. Provided is a method for enhancing osmotic stress or cryostress resistance, comprising the step of transforming a plant with a recombinant vector comprising the gene to express the SaRBP1 gene. The plants are Arabidopsis, potato, eggplant, tobacco, pepper, tomato, burdock, garland chrysanthemum, lettuce, bellflower, spinach, chard, sweet potato, celery, carrot, buttercup, parsley, cabbage, cabbage, gatchi, watermelon, melon, cucumber, Dicotyledonous plants such as pumpkins, gourds, strawberries, soybeans, green beans, kidney beans and peas or monocotyledonous plants such as rice, barley, wheat, rye, corn, sugar cane, oats and onions.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법 (Krens, F.A. et al., Nature 296, 72-74, 1982), 원형질체의 전기천공법 (Shillito R.D. et al., Bio/Technol. 3, 1099-1102, 1985), 식물 요소로의 현미주사법 (Crossway A. et al., Mol. Gen. Genet. 202, 179-185, 1986), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법 (Klein T.M. et al., Nature 327, 70, 1987), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. Transformation of a plant means any method of transferring DNA to a plant. Such transformation methods do not necessarily have a period of regeneration and / or tissue culture. Transformation of plant species is now common for plant species, including both terminal plants as well as dicotyledonous plants. In principle, any transformation method can be used to introduce the hybrid DNA according to the present invention into suitable progenitor cells. Methods include calcium / polyethylene glycol methods for protoplasts (Krens, FA et al., Nature 296, 72-74, 1982), electroporation of protoplasts (Shillito RD et al., Bio / Technol. 3, 1099-1102, 1985), microscopic injection into plant elements (Crossway A. et al., Mol. Gen. Genet. 202, 179-185, 1986), particle bombardment methods (DNA or RNA-coated) of various plant elements (Klein TM) et al., Nature 327, 70 , 1987), Agrobacterium Tome by infiltration or mature transgenic plant pollen or sopoja Pacific Enschede (Agrobacterium tumefaciens ) may be appropriately selected from infection by (incomplete) virus in mediated gene transfer.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다."Plant cell" used for transformation of a plant may be any plant cell. The plant cell may be any of a cultured cell, a cultured tissue, a culture or whole plant, preferably a cultured cell, a cultured tissue or culture medium, and more preferably a cultured cell.

본 발명은 또한, 본 발명의 SaRBP1 유전자를 포함하는 삼투 스트레스, 냉동 스트레스 또는 고온 스트레스 저항성 증진용 조성물을 제공한다.
The present invention also provides a composition for enhancing osmotic stress, freezing stress or high temperature stress resistance comprising the SaRBP1 gene of the present invention.

이하, 본 발명을 제조예 및 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 제조예 및 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Production Examples and Examples. However, the following Preparation Examples and Examples are illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited by the following Production Examples and Examples.

실시예Example 1. One. SaRBP1SaRBP1 ( ( SuaedaSuaeda asparagoidesasparagoides RNARNA bindingbinding proteinprotein )) 의 동정 The identification of

나문재(Suaeda asparagoides) 종자는 대전 생명공학연구원 자생식물사업단에서 분양받았다. 나문재 종자를 발아시킨 후 온실에서 6주 이상 키운 나문재 잎을 채취해 NaCl(200 mM)에 담근 후 0, 3, 6 그리고 24시간 처리한 후 액체 질소에 얼려 total RNA를 추출하였다. Total RNA로부터 mRNA를 분리하여 cDNA로 합성, dsDNA 합성, adaptor 연결하였다. 이 후 pBluescript-SK에 클로닝하여 SOLR cell에 형질전환한 후, cDNA library를 제작하였다(마크로젠회사). 나문재 EST library에서 총 932개를 분석하였다. 획득된 유전자의 염기서열 분석을 한 후 염기서열 정보를 NCBI(National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 등을 이용하여 유전자 정보를 수집하였다. 염기서열 분석에 의하여 SaRBP1 유전자의 전체 염기서열을 확보하였다. Suaeda asparagoides ) Seeds were distributed by Daejeon Biotechnology Research Institute. After germinating the seedlings of the ramen, the leaves of the ramen, which were grown in the greenhouse for more than 6 weeks, were soaked in NaCl (200 mM), treated with 0, 3, 6 and 24 hours, and then frozen in liquid nitrogen to extract total RNA. MRNA was isolated from total RNA and synthesized as cDNA, dsDNA synthesis, and adapter. Thereafter, cloned into pBluescript-SK and transformed into SOLR cells, cDNA library was prepared (Macrogen). A total of 932 items were analyzed in Namunjae EST library. After sequencing the obtained gene, gene information was collected using NCBI (National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ). The entire sequence of SaRBP1 gene was obtained by sequencing .

염기서열 분석 결과, 염분 스트레스에 의하여 유도되는 RNA binding protein 유전자의 cDNA는 전체 1,080 bp의 염기서열로 구성되어 있었다 (서열번호 1). 서열번호 1의 염기서열에 의해 359개의 아미노산을 연역하였다 (서열번호 2). 상기 염기서열 및 연역 아미노산 서열은 데이터베이스 검색에 의해 염분 스트레스에 의해 유도되는 새로운 유전자임이 판명되었다. Sequencing shows RNA induced by salt stress binding protein The cDNA of the gene was composed of a total of 1,080 bp sequences (SEQ ID NO: 1). 359 amino acids were deduced by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 2). The base sequence and deduced amino acid sequence was found to be a new gene induced by salinity stress by database search.

SaRBP1 유전자가 암호화하는 아미노산 서열을 데이터베이스 검색에 의해 유사도 분석을 한 결과, 상기 유전자가 인코딩하는 단백질과 가장 유사한 단백질 서열은 비트(Beta vulgaris)의 유전자(유전자은행 ID: CAC85228)와 78%의 상동성을 가지는 것으로 나타났으며, 상기 유전자로부터 얻어진 아미노산 서열 분석을 통하여, RNA binding motif인 RGG repeat이 여러 개 존재하며 hyaluronan binding motif도 존재하는 것을 알 수 있었다 (도 1). 또한 SaRBP1 유전자가 암호화하는 아미노산 서열과 상동성이 높다고 판단되는 단백질을 생명나무로 분석하여 진화상 유연관계를 살펴보았다 (도 2). 상기 SaRBP1이 암호화하는 단백질과 식물 및 이끼의 RNA binding protein 단백질과 상동성이 40-78% 정도였으며 아직까지 이들 유전자의 기능이 밝혀지지 않았다. 단백질 비교분석과 생명나무 분석에 이용된 유전자는 다음과 같다. Similarity analysis of the amino acid sequence encoded by the SaRBP1 gene by database search showed that the protein sequence most similar to the protein encoded by the SaRBP1 gene was 78% homologous to the gene of Beta vulgaris (GenBank ID: CAC85228). It was found that the amino acid sequence obtained from the gene, it was found that there are several RGG repeat RNA binding motif and hyaluronan binding motif also exists (Fig. 1). In addition, by analyzing the protein which is determined to have high homology with the amino acid sequence encoded by the SaRBP1 gene as a tree of life, the evolutionary relationship was examined (Fig. 2). The homology between the protein encoded by SaRBP1 and the RNA-binding protein proteins of plants and moss was about 40-78%, and the function of these genes has not been revealed. The genes used for protein comparison and tree analysis are as follows.

Beta vulgaris(유전자은행 ID: CAC85228); Spinacia oleracea (AF110228_1); Vitis vinifera(CBI29539); Populus trichocarpa(EEE78352); Vicia faba var. minor(CAA66481); Trifolium pratense(BAE71280); Ricinus communis (XP_002531778); Glycine max (ACU21122); Solanum tuberosum(ABA81884); Arabidopsis thaliana(At4g16830, AAM64962); Zea mays(ACG24258); A. thaliana(At5g47210, NP_199532); Physcomitrella patens subsp. Patens(XP_001760974); A. thaliana(At4g17520, NP_193416).
Beta vulgaris (GenBank ID: CAC85228); Spinacia oleracea (AF110228_1); Vitis vinifera (CBI29539); Populus trichocarpa (EEE78352); Vicia faba var. minor (CAA66481); Trifolium pratense (BAE71280); Ricinus communis (XP_002531778); Glycine max (ACU21122); Solanum tuberosum (ABA81884); Arabidopsis thaliana (At4g16830, AAM64962); Zea mays (ACG24258); A. thaliana (At5g47210, NP_199532); Physcomitrella patens subsp. Patens (XP_001760974); A. thaliana (At4g17520, NP_193416).

실시예Example 2. 신규 2. New RNARNA bindingbinding proteinprotein 유전자, gene, SaRBP1SaRBP1 의 염분 스트레스 처리에 따른 발현 검정Expression test according to salinity stress treatment of

생육상에서 6주 이상 재배한 나문재에 고염분(0.2 M NaCl) 스트레스 처리를 시간별로 가한 잎을 샘플링한 후, 전체 RNA를 RNA extraction kit(Ambion 사 구입)을 이용하여 분리하였다. After sampling the leaves subjected to high-salt (0.2 M NaCl) stress treatment over 6 months, the whole RNA was grown using RNA extraction kit (Ambion).

분리된 RNA를 이용하여 RT-PCR을 다음과 같이 수행하였다. Total RNA(2 μg)으로 cDNA를 합성하여, 각 샘플별로 제작된 cDNA를 template으로 이용하여 housekeeing gene인 tubulin 발현은 앞쪽 5‘-tubulin primer (5'-ATGAGGGAGTGCATTTCAATCCA-3')로, 뒤쪽 3’-tubulin primer (5'-AAGAACACTGTTGTAGGGCTCC-3')를 이용하였고, SaRBP1 발현을 분석하기 위해서 앞쪽 5‘-SaRBP1 primer (5'-ATGGCATCCACTAACCCTTTCG-3')로, 뒤쪽 3’-SaRBP1 primer (5'-TTCATACACCGTCCTAGAGCGG-3')를 이용하였다. PCR은 95°C, 5 분간 denaturation; 95°C, 1분간 denaturation, 55°C, 1분간 annealing; 72°C, 1분간 extension, 26 cycle; 72°C, 7분간 final extension의 조건으로 수행하였다. 그 결과 SaRBP1 PCR 산물이 염분 스트레스 후에 점점 증가하는 것을 알 수 있었다 (도 3). RT-PCR was performed using the isolated RNA as follows. Synthesizing cDNA with total RNA (2 μg), using the cDNA prepared for each sample as a template, the expression of tubulin , the housekeeing gene, was the front 5'-tubulin primer (5'-ATGAGGGAGTGCATTTCAATCCA-3 ') and the rear 3'- tubulin primer (5'-AAGAACACTGTTGTAGGGCTCC-3 ') was used, and the front 5'-SaRBP1 primer (5'-ATGGCATCCACTAACCCTTTCG-3') and the rear 3'-SaRBP1 primer (5'-TTCATACACCGTCCTAGAGCGG- to analyze SaRBP1 expression 3 ') was used. PCR denaturation at 95 ° C. for 5 minutes; 95 ° C., 1 min denaturation, 55 ° C., 1 min annealing; 72 ° C, 1 minute extension, 26 cycles; It was carried out at 72 ° C, 7 minutes under the condition of the final extension. As a result SaRBP1 PCR products were found to increase gradually after saline stress (FIG. 3).

또한 분리된 RNA를 이용하여 노던 분석을 수행하였다. 분리한 전체 RNA를 1.0 % 포름알데히드 겔 (formaldehyde gel)에 전기영동 한 후, 겔을 20 × SSC 용액 (3 M NaCl, 0.3 M Sodium citrate)으로 나일론 막 (AP Biotech 사 구입)에 전이시키고 방사성 동위원소 [α-³²P] dCTP로 표식된 RNA binding protein 유전자의 단편 1,080 bp cDNA를 탐침으로 하여 Northern blot 분석을 수행하였다. 그 결과, 염분 스트레스에 의해서 SaRBP1 전사체양이 점점 증가하여 6시간째 최대양이 발현되며 그 후 24시간째까지도 발현하는 것을 확인할 수 있었다 (도 4). In addition, Northern analysis was performed using the isolated RNA. The whole RNA was electrophoresed on a 1.0% formaldehyde gel, and then the gel was transferred to a nylon membrane (purchased by AP Biotech) with 20 × SSC solution (3 M NaCl, 0.3 M Sodium citrate) and radioisotope. RNA binding labeled with the element [α- ³² P] dCTP protein Northern blot analysis was performed using a 1,080 bp cDNA fragment as a probe. As a result, SaRBP1 transcripts were gradually increased by salinity stress, and the maximum amount was expressed at 6 hours, and was expressed up to 24 hours afterwards (FIG. 4).

실시예Example 3. 식물 발현 3. Plant Expression 벡터계를Vector 이용하여 using GFPGFP 재조합 융합 단백질 발현 Recombinant Fusion Protein Expression

식물에서 발현시킨 GFP 융합 단백질의 세포 내 위치를 분석하는지를 알아보기 위해서 식물 발현 binary 벡터 중 GFP를 이용하였다. 상기 실시예 1에서 분리된 SaRBP1 유전자 cDNA 전체를 template으로 이용하여 CACC-SaRBP1 primer (5'-CACCATGGCATCCACTAACCC-3')와 3NS-SaRBP1 primer (5'-GTTGGCACCCAAGGATGGG-3')로 PCR 증폭하여 증폭된 PCR 산물(1,081 bp)을 pENTR vector(Invitrogen 사 구입)에 directional PCR 클로닝한 후 염기서열을 확인하였다. 염기서열이 확인된 pENTR-SaRBP1 plasmid와 GFP 타겟팅용 gateway 벡터인 pK7FWG2(Plant Systems Biology 사 구입) 플라스미드와 LR Recombinase(Invitrogen 사 구입)와 반응하여 SaRBP1 coding region이 GFP의 N-terminal 부분과 in-frame으로 융합하였다. SaRBP1-GFP 융합 단백질 발현을 담배 식물에서 실시하였다(도 5). 인터넷 단백질 위치 분석 프로그램인 TargetP (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)를 이용하여 나문재의 SaRBP1 단백질을 분석한 결과 SaRBP1 단백질은 주로 핵으로 타겟팅된다고 예측하였다(0.76). SaRBP1-GFP 융합단백질의 세포내 위치를 담배 표피세포와 원형질체에서 발현시켜 분석한 결과 핵 주변과 세포질에 발현되는 것을 알 수 있었다(도 5). In order to determine whether the GFP fusion protein expressed in plants was analyzed in cells, GFP was used in the plant expression binary vector. PCR amplified by PCR amplification with CACC-SaRBP1 primer (5'-CACCATGGCATCCACTAACCC-3 ') and 3NS-SaRBP1 primer (5'-GTTGGCACCCAAGGATGGG-3') using the entire SaRBP1 gene cDNA isolated in Example 1 as a template The product (1,081 bp) was directional PCR cloned into the pENTR vector (Invitrogen, Inc.) and the nucleotide sequence was confirmed. The nucleotide sequence identified pENTR-SaRBP1 plasmid and the gateway vector for GFP targeting pK7FWG2 (purchased by Plant Systems Biology) and LR Recombinase (purchased by Invitrogen) reacted with the N-terminal portion of the GFP and in-frame. Fused. SaRBP1-GFP fusion protein expression was carried out in tobacco plants (FIG. 5). The analysis of SaRBP1 protein from Namunjae using TargetP ( http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/ ), an internet protein location analysis program, predicted that SaRBP1 protein is mainly targeted to the nucleus (0.76). The intracellular location of SaRBP1-GFP fusion protein was expressed in tobacco epidermal cells and protoplasts. As a result, it was found that it was expressed in the nucleus and cytoplasm (Fig. 5).

실시예Example 4. 4. SaRBP1SaRBP1 유전자의 효모 발현 벡터 제작Construction of yeast expression vector of gene

효모 발현 벡터인 pYES-DEST52(Invitrogen 사 구입)를 이용하여 효모에서 발현시키는데 이용하였다(도 6). 상기 실시예 3에서 클로닝된 pENTR-SaRBP1 plasmid와 효모 발현용 pYES-DEST52 vector(Invitrogen 사 구입) gateway와 반응하여 클로닝한 후 염기서열을 확인하였다. 대조 실험으로 이용하기 위하여 pYES-GFP인 경우 GFP(pK7FWG2; Plant Systems Biology) 플라즈미드를 template으로 이용하여 CACC-5GFP 프라이머(5'-CACCATGAGTAAAGGAGAAGAACT-3')와 3-GFP 프라이머(5'-TTATTTGTATAGTTCATCCATGTG-3')로 증폭된 PCR 산물(1,081 bp)을 pENTR vector (Invitrogen 사 구입)에 directional PCR 클로닝한 후 염기서열을 확인하였다. 염기서열이 확인된 pENTR-SaRBP1과 pENTR-GFP 각각plasmid와 효모 발현용 gateway 벡터인 pYES-DEST52(Invitrogen 사 구입) 플라스미드와 LR Recombinase(Invitrogen 사 구입)와 반응하여 GAL 프로모터 뒤에 SaRBP1 그리고 GFP coding region을 클로닝하고 DNA sequencing을 통하여 염기서열을 확인하였다. pYES-GFP와 pYES-SaRBP1 각각의 플라즈미드를 LiAc 방법으로 EGY48 cell에 형질전환하여 SD(Ura 결핍) 선택배지에 도말한 후 30℃에 2일 배양하였으며, 배양결과로 확보된 콜로니를 template로, SaRBP1 유전자 프라이머를 이용하여 콜로니 PCR을 수행하여 형질전환을 확인하였다.
PYES-DEST52 (purchased by Invitrogen), a yeast expression vector, was used to express in yeast (FIG. 6). The cloned pENTR-SaRBP1 plasmid cloned in Example 3 was reacted with a pYES-DEST52 vector (purchased by Invitrogen) gateway for yeast expression, and the base sequence was confirmed. In the case of pYES-GFP, CACC-5GFP primer (5'-CACCATGAGTAAAGGAGAAGAACT-3 ') and 3-GFP primer (5'-TTATTTGTATAGTTCATCCATGTG-3) were used as a template for pYES-GFP. The PCR product (1,081 bp) amplified with ') was subjected to directional PCR cloning into the pENTR vector (Invitrogen) and the nucleotide sequence was confirmed. The nucleotide sequences identified pENTR-SaRBP1 and pENTR-GFP, respectively, were reacted with the plasmid and yeast expression vector pYES-DEST52 (purchased by Invitrogen) and LR Recombinase (purchased by Invitrogen), followed by SaRBP1 and GFP coding regions. Cloning and DNA sequencing confirmed the sequence. pYES-GFP and pYES-SaRBP1 by transforming each of the plasmids in EGY48 cell with LiAc method SD (Ura-deficient) were cultured for 2 days in 30 ℃ then plated on selective medium, the colonies obtained by the culture results as template, SaRBP1 Transformation was confirmed by colony PCR using gene primers.

실시예Example 5. 5. SaRBP1SaRBP1 유전자의 효모 발현 벡터를 이용하여 삼투 스트레스 저항성 검정 Osmotic stress resistance assay using yeast expression vector of gene

정상 조건으로 WT(pYES-GFP) 효모와 SaRBP1을 발현하는 효모를(pYES-SaRBP1) SD(Ura-, Raff 2%) 액체배지에서 overnight 배양 후 새로운 SD(Ura-, Raff 2%) 또는 SD(Ura-, Gal 2%) 액체배지에 현탁해서 OD를 측정해 0.2로 맞추고(3반복) 난 후 28℃에서 배양하면서 3시간마다 15시간까지 OD를 측정하였다(도 7 A). 삼투 스트레스 저항성을 분석하기 위해서 액체배지에 NaCl(1 M), KCl(1 M), sorbitol(1.5 M)를 첨가하여 위의 방법으로 WT 효모와 SaRBP1을 발현하는 효모를 접종하여 3시간 마다 OD를 측정하여 생장을 비교하였다(도 7 B-D).Under normal conditions, yeast expressing WT (pYES-GFP) and SaRBP1 (pYES-SaRBP1) were cultured overnight in SD (Ura-, Raff 2%) liquid medium and then replaced with new SD (Ura-, Raff 2%) or SD ( Ura-, Gal 2%) suspended in a liquid medium to measure the OD was adjusted to 0.2 (3 repetition) and then OD was measured every 3 hours for 15 hours while incubating at 28 ℃ (Fig. 7A). In order to analyze the osmotic stress resistance, NaCl (1 M), KCl (1 M), and sorbitol (1.5 M) were added to the liquid medium, and OD was inoculated every 3 hours by inoculating WT yeast and SaRBP1 expressing yeast by the above method. The growth was measured and compared (FIG. 7 BD).

또한, 고체배지에서 삼투 스트레스 저항성을 확인하기 위해 정상조건으로 WT(pYES-GFP) 효모와 SaRBP1을 발현하는 효모를(pYES-SaRBP1), SD(Ura-, Raff 2%) 액체배지에서 overnight 배양 후 새로운 SD(Ura-, Raff 2%) 액체배지에 OD를 측정해 0.7로 맞추고 난 후 멸균된 증류수로 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4로 희석한 후 고체배지에 10μl씩 분주한 후 말려서 30℃에서 3일간 암배양하였다. In addition, in order to check the osmotic stress resistance in the solid medium, after overnight culture in the yeast (pYES-SaRBP1), SD (Ura-, Raff 2%) liquid medium expressing WT (pYES-GFP) yeast and SaRBP1 under normal conditions Measure the OD in a new SD (Ura-, Raff 2%) liquid medium, set it to 0.7, dilute to 10 ^-1 , 10 ^-2 , 10 ^-3 , 10 ^-4 with sterile distilled water and 10 μl in a solid medium. After dispensing and drying, the cells were cultured at 30 ° C. for 3 days.

실험 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 WT(pYES-GFP) 효모보다 SaRBP1을 발현하는 효모(pYES-SaRBP1) 균주가 삼투 스트레스에서 생장이 훨씬 더 좋은 것을 확인할 수 있었다.
As a result, as shown in FIG. 8, it was confirmed that the yeast (pYES-SaRBP1) strain expressing SaRBP1 was much better in osmotic stress than the WT (pYES-GFP) yeast.

실시예Example 6. 6. SaRBP1SaRBP1 유전자의 효모 발현 벡터를 이용하여 냉동 스트레스 저항성 검정 Frozen Stress Resistance Assay Using Yeast Expression Vectors of Genes

냉동 스트레스 저항성을 분석하기 위해 다음처럼 실험을 수행하였다. Experiments were performed as follows to analyze frozen stress resistance.

냉동 스트레스 주기 전 생장을 조사하기 위해서, WT(pYES-GFP) 효모와 SaRBP1을 발현하는 효모를(pYES-SaRBP1) SD(Ura-, Raff 2%) 액체배지에서 overnight 배양 후 새로운 SD(Ura-, Raff 2%) 액체배지에 현탁해 OD를 측정해 0.7로 맞추고 난 후 멸균된 증류수로 10^-4로 희석한 후 SD(Ura-, Glc 2%) 고체배지에 50μl씩 분주한 후 도말하고 30℃에서 3일간 암배양한 후 콜로니 수를 세었다(3반복). 또한 냉동 스트레스 처리 후 생장을 조사하기 위해서, WT(pYES-GFP) 효모와 SaRBP1을 발현하는 효모를(pYES-SaRBP1) SD(Ura-, Raff 2%) 액체배지에서 overnight 배양 후 새로운 SD(Ura-, Raff 2%) 액체배지에 현탁해 OD를 측정해 0.7로 맞추고 난 후 효모세포가 담긴 에펜도르프 튜브를 에탄올(100%)에 잠기게 한 뒤 -20°C 냉동실에 24시간 냉동시킨 후 30°C waterbath에 10분간 해동시킨 후 다시 -20°C 냉동실에 24시간 냉동시킨 후 30°C waterbath에 10분간 해동시켜, 증류수로 10^-4로 희석한 후 SD(Ura-, Glc 2%) 고체배지에 200μl 씩 분주한 후 도말하고 30℃에서 3일간 암배양한 후 콜로니 수를 세었다(3반복). 생존율은 냉동 스트레스 전 콜로니수에 대한 냉동 스트레스 후 콜로니수의 백분율을 계산하였으며 3반복 실험한 값의 평균값을 계산하였다. To investigate growth prior to the freezing stress cycle, WT (pYES-GFP) yeast and SaRBP1 expressing yeast (pYES-SaRBP1) SD (Ura-, Raff 2%) incubated overnight in a new SD (Ura-, Raff 2%) suspended in a liquid medium to measure OD, adjusted to 0.7, diluted to 10 ^-4 with sterile distilled water, 50μl aliquots were added to SD (Ura-, Glc 2%) solid medium, and plated at 30 ℃. Colonies were counted after 3 days of cancer culture (3 repetitions). In addition, in order to investigate the growth after freezing stress treatment, WT (pYES-GFP) yeast and saRBP1 expressing yeast (pYES-SaRBP1) SD (Ura-, Raff 2%) incubated overnight in a new SD (Ura-) , Raff 2%), suspended in liquid medium, OD is measured to 0.7, and then the Eppendorf tube containing yeast is immersed in ethanol (100%) and frozen in -20 ° C freezer for 24 hours and then 30 ° After thawing in C waterbath for 10 minutes, frozen again at -20 ° C freezer for 24 hours, then thawing in 30 ° C waterbath for 10 minutes, diluted with distilled water to 10 ^-4 and then SD (Ura-, Glc 2%) solid medium After 200μl aliquots were smeared and smeared and cultured at 30 ° C. for 3 days, the colonies were counted (3 repetitions). The survival rate was calculated as the percentage of colony number after freezing stress to the number of colony numbers before freezing stress, and the average value of three repeated experiments was calculated.

실험 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이 WT(pYES-GFP) 효모보다 SaRBP1을 발현하는 효모(pYES-SaRBP1) 균주가 냉동 스트레스에서 생장이 훨씬 더 좋은 것을 확인할 수 있었다.
As a result, as shown in FIG. 9, it was confirmed that the yeast (pYES-SaRBP1) strain expressing SaRBP1 was much better than the free-grown strain than the WT (pYES-GFP) yeast.

실시예Example 7. 7. SaRBP1SaRBP1 유전자의 효모 발현 벡터를 이용하여 고온 스트레스 저항성 검정 High Temperature Stress Resistance Assays Using Gene Yeast Expression Vectors

고온 스트레스 저항성을 분석하기 위해 다음처럼 실험을 수행하였다. Experiments were performed as follows to analyze the high temperature stress resistance.

고온 스트레스 주기 전 생장을 조사하기 위해서, WT(pYES-GFP) 효모와 SaRBP1을 발현하는 효모를(pYES-SaRBP1) SD(Ura-, Raff 2%) 액체배지에서 overnight 배양 후 새로운 SD(Ura-, Raff 2%) 액체배지에 현탁해 OD를 측정해 0.7로 맞추고 난 후 멸균된 증류수로 10^-4로 희석한 후 SD(Ura-, Glc 2%) 고체배지에 50μl 씩 분주한 후 도말하고 30℃에서 3일간 암배양한 후 콜로니 수를 세었다(3반복) (Zhang et al., 2001). 또한 고온 스트레스 처리 후 생장을 조사하기 위해서, WT(pYES-GFP) 효모와 SaRBP1을 발현하는 효모를(pYES-SaRBP1) SD(Ura-, Raff 2%) 액체배지에서 overnight 배양 후 새로운 SD(Ura-, Raff 2%) 액체배지에 현탁해 OD를 측정해 0.7로 맞추고 난 후 효모세포가 담긴 에펜도르프 튜브를 50°C에 5, 10, 15, 20분간 처리한 후 증류수로 10^-4로 희석한 후 SD(Ura-, Glc 2%) 고체배지에 200μl 씩 분주한 후 도말하고 30℃에서 3일간 암배양한 후 콜로니 수를 세었다(3반복). 생존율은 고온 스트레스 전 콜로니수에 대한 고온 스트레스 후 콜로니수의 백분율을 계산하였으며 3반복 실험한 값의 평균값을 계산하였다.To investigate growth prior to the high temperature stress cycle, WT (pYES-GFP) yeast and saRBP1 expressing yeast (pYES-SaRBP1) SD (Ura-, Raff 2%) liquid cultures were added after overnight incubation in new SD (Ura-, Raff 2%) suspended in a liquid medium to measure OD, adjusted to 0.7, diluted to 10 ^-4 with sterile distilled water, 50μl aliquots were added to SD (Ura-, Glc 2%) solid medium, and plated at 30 ℃. Colonies were counted after 3 days of cancer culture (3 repetitions) (Zhang et al., 2001). In addition, in order to investigate growth after high temperature stress treatment, WT (pYES-GFP) yeast and saRBP1 expressing yeast (pYES-SaRBP1) SD (Ura-, Raff 2%) liquid culture medium after overnight incubation in new SD (Ura-) , Raff 2%), suspended in a liquid medium, OD was measured to 0.7, and then treated with Eppendorf tubes containing yeast at 50 ° C for 5, 10, 15, 20 minutes, and diluted with distilled water to 10 ^-4 . After 200 μl aliquots were added to the SD (Ura-, Glc 2%) solid medium and plated, the cells were cultured at 30 ° C. for 3 days, and the number of colonies was counted (3 repetitions). The survival rate was calculated as the percentage of colony number after high temperature stress to colony number before high temperature stress, and the average value of three repeated experiments was calculated.

실험 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이 WT(pYES-GFP) 효모보다 SaRBP1을 발현하는 효모(pYES-SaRBP1) 균주가 고온 스트레스에서 생장이 훨씬 더 좋은 것을 확인할 수 있었다. As a result, as shown in FIG. 10, it was confirmed that the yeast (pYES-SaRBP1) strain expressing SaRBP1 was much better than the WT (pYES-GFP) yeast.

실시예Example 8. 8. SaRBP1SaRBP1 재조합 단백질 분리 및 Recombinant protein isolation and RNARNA 결합 활성 분석 Binding activity assay

GST(glutathione S-transferase) 재조합 발현 벡터인 pDEST15(Invitrogen 사 구입)를 이용하여 대장균에서 발현시키는데 이용하였다(도 11). 상기 실시예 1에서 분리된 SaRBP1 유전자 cDNA 전체를 template으로 이용하여 CACC-SaRBP1 primer(5'-CACCATGGCATCCACTAACCC-3')와 3-SaRBP1 primer(5'-TCAGTTGGCACCCAAGGATGGG-3')로 PCR 증폭하여 증폭된 PCR 산물(1,081 bp)을 pENTR vector(Invitrogen 사 구입)에 directional PCR 클로닝한 후 염기서열을 확인하였다. 염기서열이 확인된 pENTR-SaRBP(Stop)과 GST 재조합 단백질 발현용 gateway 벡터인 pDEST15(Invitrogen 사 구입) 플라스미드와 LR Recombinase(Invitrogen 사 구입)와 반응하여 GST 뒤에 SaRBP1 coding region을 클로닝하고 DNA sequencing을 통하여 염기서열을 확인하였다. 재조합 단백질 발현을 위하여 BL21-Al(Stratagene 사 구입) competent cell에 형질전환하여, LB (Ampicillin 100 μg/ml) 선택배지에 도말한 후 37℃에 밤새 배양하였으며, 배양결과로 확보된 콜로니를 template로, SaRBP1 유전자 프라이머를 이용하여 콜로니 PCR을 수행하여 형질전환을 확인하였다. 대조 실험으로 이용하기 위하여 GST 단백질 분리를 위하여 pGEX4T-1(Amersham 사 구입) BL21(DE3)pLysS(Stratagene 사 구입) competent cell에 형질전환하여 LB(Ampicillin 100 μg/ml) 선택배지에 도말한 후 37℃에 밤새 배양하였으며, 배양결과로 확보된 콜로니를 이용하였다. GD (glutathione S-transferase) recombinant expression vector pDEST15 (Invitrogen) was used to express in E. coli (Fig. 11). PCR amplified by PCR amplification with CACC-SaRBP1 primer (5'-CACCATGGCATCCACTAACCC-3 ') and 3-SaRBP1 primer (5'-TCAGTTGGCACCCAAGGATGGG-3') using the entire SaRBP1 gene cDNA isolated in Example 1 as a template The product (1,081 bp) was directional PCR cloned into the pENTR vector (Invitrogen, Inc.) and the nucleotide sequence was confirmed. The nucleotide sequence identified pENTR-SaRBP (Stop) and the gateway vector for expression of GST recombinant protein (pDEST15 (purchased by Invitrogen)) and LR Recombinase (purchased by Invitrogen) were reacted to clone the SaRBP1 coding region after GST and through DNA sequencing The base sequence was confirmed. In order to express the recombinant protein, BL21-Al (purchased by Stratagene) was transformed into competent cells, plated in LB (Ampicillin 100 μg / ml) selection medium, and then cultured overnight at 37 ° C. , Transformation was confirmed by performing colony PCR using SaRBP1 gene primer. PGEX4T-1 (purchased by Amersham) BL21 (DE3) pLysS (purchased by Stratagene) competent cells were transformed into LB (Ampicillin 100 μg / ml) selective medium to isolate GST protein for use as a control experiment 37 It was incubated overnight at ℃, it was used colonies secured as a result of the culture.

대장균에서 GST 융합단백질을 분리하기 위하여 상기 pGST-SaRBP1와 pGEX4T-1 형질전환 대장균을 100 ㎍/ml ampicillin(Duchefa, 미국)이 함유된 LB(Luria-Bertani, 미국) 액체 배지에서 1시간 배양한 후, LB-Ampicillin 고체배지에 도말하여 37℃에서 16시간 이상 배양하였다. 고체 배지에서 얻어진 대장균 콜로니를 LB-Amp 50 ml 액체배지에 접종하여, OD 0.6(1.0 × 10⁶ cell)까지 배양 후에 pGST-SaRBP1을 포함한 대장균은 0.2% arabinose와 1 mM IPTG를 첨가하고, pGEX4T-1를 포함한 대장균은 0.1 mM IPTG를 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 재배양하였다. 그리고 나서 배양물을 3,000 rpm에서 5분간 원심 분리하여 균체를 모은 후 50 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액을 1.7 ml 첨가하고 세포 파쇄기를 이용하여 세포를 파괴한 후 5,000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 원심분리 후 상층액만을 12,000 rpm에서 10분 동안 다시 원심분리하여 얻어진 상층액으로부터 GST column을 사용하여 GST 융합단백질을 분리하였다(도 12A). 융합단백질은 centricone(밀리포어, 미국)을 이용하여 농축하였으며, 12% SDS-단백질 전기영동(Laemmli, Nature, vol 227, p680-685, 1970)에 의해 BSA(0.1 mg/ml) 농도의 샘플과 비교하여 융합단백질 농도를 분석하였다. To isolate the GST fusion protein from Escherichia coli, the pGST-SaRBP1 and pGEX4T-1 transformant Escherichia coli were incubated for 1 hour in LB (Luria-Bertani, USA) liquid medium containing 100 ㎍ / ml ampicillin (Duchefa, USA). , LB-Ampicillin solid medium was incubated for 16 hours at 37 ℃. Escherichia coli colonies obtained in solid medium were inoculated into 50 ml liquid medium of LB-Amp. After incubation to OD 0.6 (1.0 × 10 ⁶ cells), E. coli containing pGST-SaRBP1 was added with 0.2% arabinose and 1 mM IPTG, and pGEX4T- Escherichia coli including 1 was cultured for 4 hours at 37 ℃ by adding 0.1 mM IPTG. The cells were then centrifuged at 3,000 rpm for 5 minutes to collect the cells, and 1.7 ml of 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) buffer was added and the cells were disrupted using a cell crusher, followed by centrifugation at 5,000 rpm for 5 minutes. It was. After centrifugation, only the supernatant was centrifuged again at 12,000 rpm for 10 minutes to separate the GST fusion protein using the GST column (FIG. 12A). The fusion protein was concentrated using centricone (Millipore, USA), and sampled at BSA (0.1 mg / ml) concentration by 12% SDS-protein electrophoresis (Laemmli, Nature, vol 227, p680-685, 1970). In comparison, the fusion protein concentration was analyzed.

상기 GST와 GST-SaRBP1 단백질을 Hybond ECL nitrocellulose membrane(GE Healthcare Life Sciences 사 구입)에 전이시켜, GST antibodies로 웨스턴 블롯팅을 수행하여 단백질을 확인하고(도 12A), 또 다른 멤브레인은 융합단백질 GST-SaRBP1의 RNA 결합 활성을 확인하기 위해 Northwestern blot을 수행하였다(도 12B). Northwestern blot 분석을 위해 RNA 기질을 다음과 같이 준비하였다. pGEMT-Easy 벡터에 SaDhn 유전자(Genbank accession number, JF512469) cDNA 전체를 template으로 이용하여 F-SaDhn primer(5'-ATGGCAGATGAAAGGATTAGTG-3')와 R-SaDhn primer(5'- TTAATATCCTTCCTTTTTCTCCT-3')로 PCR 증폭하여 증폭된 PCR 산물(741 bp)을 pGEMT-Easy vector(Promega 사 구입)에 PCR 클로닝한 후 염기서열을 확인하였다. SalI 제한효소 처리된 pGEMT-SaDhn벡터를 주형으로 T7 RNA polymerase(Promega 사 구입)와 ³²P-CTP, GTP, UTP, ATP 를 사용하여 in vitro에서 sense SaDhn RNA를 합성하여 radioisotope-labeling된 RNA 기질을 각각 준비하였다. 준비된 단백질 블랏과 [α-³²P] CTP로 표식된 방사성을 띈 SaDhn RNA 기질을 반응시켰다(Fernandez et al., Nucleic Acids Res. 23:1327-1332, 1995). RNA 결합 및 세척 용액은 10 mM Tris-HCl(pH 7.5), 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 1x-Denhardt's reagent로 구성되었다(Fernandez et al., 1995). The GST and GST-SaRBP1 proteins were transferred to a Hybond ECL nitrocellulose membrane (purchased by GE Healthcare Life Sciences), followed by Western blotting with GST antibodies to confirm the protein (FIG. 12A), and another membrane was a fusion protein GST- Northwestern blot was performed to confirm the RNA binding activity of SaRBP1 (FIG. 12B). RNA substrates were prepared as follows for Northwestern blot analysis. PCR using F-SaDhn primer (5'-ATGGCAGATGAAAGGATTAGTG-3 ') and R-SaDhn primer (5'- TTAATATCCTTCCTTTTTCTCCT-3') using the entire SaDhn gene (Genbank accession number, JF512469) cDNA as a template in pGEMT-Easy vector The amplified PCR product (741 bp) was PCR cloned into the pGEMT-Easy vector (promega company) and the nucleotide sequence was confirmed. Using a Sal I restriction enzyme-treated pGEMT-SaDhn vector as a template, T7 RNA polymerase (promega) and ³² P-CTP, GTP, UTP and ATP were used in Sense SaDhn RNA was synthesized in vitro to prepare radioisotope- labeled RNA substrates, respectively. The prepared protein blot and the radioactive SaDhn RNA substrate labeled with [α- ³² P] CTP were reacted (Fernandez et al., Nucleic Acids Res. 23: 1327-1332, 1995). RNA binding and washing solution consisted of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 1x-Denhardt's reagent (Fernandez et al., 1995).

그 결과, GST-SaRBP1 융합단백질 농도가 증가할수록 SaDhn 전사체와 많이 결합하는 것을 확인할 수 있었으며, GST 단독 단백질은 RNA 결합 능력이 없는 것을 알 수 있었다(도 12B).
As a result, as the concentration of GST-SaRBP1 fusion protein increases, it was confirmed that the binding to SaDhn transcript was increased, and the GST-only protein was found to have no RNA binding ability (FIG. 12B).

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Claims

RNA binding protein SaRBP1 ( Suaeda from Namunjae) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID 2 asparagoides RNA binding protein).

The gene encoding the SaRBP1 protein of claim 1.

Recombinant vector comprising the gene of claim 2.

Composition for enhancing resistance to stress of the plant comprising the gene of claim 2.

The composition of claim 4, wherein the stress is osmotic stress, freezing stress or high temperature stress.

A method of enhancing resistance to stress in a plant, comprising the step of transforming the plant with the recombinant vector of claim 3 to express the SaRBP1 gene.

7. The method of claim 6, wherein the stress is osmotic stress, freezing stress or high temperature stress.

Method for analyzing the RNA binding activity comprising transforming the recombinant vector of claim 3 to E. coli.