KR101297886B1

KR101297886B1 - 자간전증의 조기 진단 및 예후 평가 방법

Info

Publication number: KR101297886B1
Application number: KR1020120109715A
Authority: KR
Inventors: 박원선; 김나리; 한진
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2012-10-02
Filing date: 2012-10-02
Publication date: 2013-08-19
Also published as: KR20120127364A

Abstract

본 발명은 자간전증 시에 특이적으로 발현되는 단백질의 스크리닝 방법 및 자간전증의 조기진단 및 예측을 위한 마커에 관한 것이다.
본 발명에 따른, 2차원 전기영동 분석을 이용하여 자간전증 시에 특이적으로 발현되는 태반 단백질의 스크리닝 방법은, ⅰ) 태반 조직에서 태반 단백질을 분리하는 단계, ⅱ) 상기 분리된 단백질을 2차원 전기영동을 통하여 2차원적으로 분리시키는 단계, 및 ⅲ) 상기 분리된 단백질을 겔의 스캔 및 이미지 차이를 통하여 정상 태반 단백질 또는 자간전증 태반 단백질과 비교 분석하는 단계를 포함하고, 상기 겔의 스캔 및 이미지 차이를 통한 태반 단백질의 비교 분석은, 두 태반에서 140% 이상의 차이를 보이는 단백질들을 선별하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른, 자간전증의 조기 진단 및 예측을 위한 마커는, 샤페로닌(chaperonin), ER-60 프로티아제(ER-60 protease), 이소시트레이트 디하이드로게나제 1(Isocitrate dehydrogenase 1), 알데히드 리덕타제 1(Aldehyde reductase), 인간 알도즈 리덕타제(human Aldose reductase)에 결합된 피다레스타트(Fidaresta) 체인 B, 전압-의존적 음이온 채널 1(Voltage-depentant anion channel 1), 핵염화 채널(Nuclear chloride channel), 카뎁신 D(Cathepsin D) 체인 H, 포스로글라이세레이트 뮤타제 1(Phosphoglycerate mutase 1), 소포체 단백질(Endoplasmic reticulum protein), PSMA2(proteasome_alpha_type_2) 단백질, 글루타티온 S-트랜스퍼레이제(Glutathione S-transferase), Ig 중사슬 v 부위(Ig heavy chain v region), 민무늬근 미오신 알칼리 경사슬(Smooth muscle myosin alkali light chain) 및 지방산 결합 단백질(Fatty acid binding protein)로 구성되는 단백질 군 중에서 선택된다.

Description

자간전증의 조기 진단 및 예후 평가 방법{METHOD FOR EARLY DIAGNOSIS AND ESTIMATION OF PATHOPHYSIOLOGY OF PREECLAMPSIA}

본 발명은 자간전증 시에 특이적으로 발현되는 단백질의 스크리닝을 통한 자간전증의 조기 진단 및 예후 평가 방법에 관한 것이다.

임신의 자간전증은 임신 기간 동안에 심각한 건강상의 문제가 될 수 있으며 태아 성장 발육 저하, 태아 사망 및 이환, 조산 및 산모 사망을 유발한다. 상기 질병의 병인은 거의 알려진 바 없으며 효율적인 치료법도 아직 없다. 임신 자간전증은 고혈압, 병리학적 부종 및 단백뇨의 동시 발생을 특징으로 한다. 이와 같이, 자간전증은 임신 중 발생한 고혈압, 단백뇨 및 전신장애를 특징으로 하는 임신 합병증으로서, 임신 중 발병 확률은 3-5%에 이르지만, 산모와 태아 및 신생아에게 미치는 영향은 지대하여, 주산기 사망률과 이환률을 상승시키는 주된 원인이다.

자간전증은 연간 전 세계적으로 적어도 200,000명의 임신부 사망의 원인이 되고 있다. 자간전증의 증상은 전형적으로 임신 20주 이후에 나타나고 보통 산모의 혈압 또는 요(urine) 검사에 의해 검출된다. 조기 진단이 가능할 경우 적절한 치료만 행해진다면 대상체나 태어날 태아의 위험을 획기적으로 줄일 수 있는데, 이러한 모니터링(monitoring) 방법은 이러한 증상을 초기 단계에서 진단하는데 효과적이지 않다. 현재 자간전증에 대한 치료 방법으로 알려져 있는 것은 없다. 자간전증은 가벼운 증상에서부터 생명을 위협하는 정도까지 질병의 경중도(severity)에 있어서 매우 다양하다. 하지만, 이러한 임상적 위험에도 불구하고, 자간전증의 발병 원인, 발병 기전을 알아내거나, 조기 진단 및 예측을 하기가 불가능한 실정이다.

따라서, 자간전증의 발병 기전에 대한 제시와 이를 토대로 한 조기 진단 및 예측을 할 수 있다면, 자간전증이 발생한 산모와 태아의 상태의 개선을 기대할 수 있을 것이며, 사망률을 감소시킬 수 있을 것으로 기대한다. 자간전증의 발병과 예측을 위하여 많은 연구들이 이루어지고 있으나, 이는 특정 단백질 또는 물질에 국한되어 있어, 자간전증 발병에 대한 전체적인 현상과 기전을 설명해 줄 수 없었다.

이에, 본 발명자들은 자간전증 발병 기전을 밝히고자 노력하던 중, 자간전증의 발병에 주된 역할을 하는 태반을 이용하여 태반 전체 단백질에 대한 발현을 확인하고, 상기 단백질들의 자간전증 태반에서의 발현 변화를 분석함으로써 자간전증 시에 특이적으로 발현되는 단백질의 스크리닝 방법 및 자간전증의 조기 진단 및 예측을 위한 마커를 창안하였고, 아울러 자간전증 발병 기전에 대한 포괄적인 가설을 제시함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 자간전증 시에 특이적으로 발현되는 단백질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 자간전증의 조기 진단 및 예측을 위한 마커 단백질을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기와 같은 특징적인 구성을 제시한다.

본 발명의 일 태양에 따르면, 2차원 전기영동 분석을 이용하여 자간전증 시에 특이적으로 발현되는 태반 단백질의 스크리닝 방법은, ⅰ) 태반 조직에서 태반 단백질을 분리하는 단계, ⅱ) 상기 분리된 단백질을 2차원 전기영동을 통하여 2차원적으로 분리시키는 단계, 및 ⅲ) 상기 분리된 단백질을 겔의 스캔 및 이미지 차이를 통하여 정상 태반 단백질 또는 자간전증 태반 단백질과 비교 분석하는 단계를 포함하고, 상기 겔의 스캔 및 이미지 차이를 통한 태반 단백질의 비교 분석은, 두 태반에서 140% 이상의 차이를 보이는 단백질들을 선별하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 다른 태양에 따르면, 자간전증의 조기 진단 및 예측을 위한 마커는, 샤페로닌(chaperonin), ER-60 프로티아제(ER-60 protease), 이소시트레이트 디하이드로게나제 1(Isocitrate dehydrogenase 1), 알데히드 리덕타제 1(Aldehyde reductase), 인간 알도즈 리덕타제(human Aldose reductase)에 결합된 피다레스타트(Fidaresta) 체인 B, 전압-의존적 음이온 채널 1(Voltage-depentant anion channel 1), 핵염화 채널(Nuclear chloride channel), 카뎁신 D(Cathepsin D) 체인 H, 포스로글라이세레이트 뮤타제 1(Phosphoglycerate mutase 1), 소포체 단백질(Endoplasmic reticulum protein), PSMA2(proteasome_alpha_type_2) 단백질, 글루타티온 S-트랜스퍼레이제(Glutathione S-transferase), Ig 중사슬 v 부위(Ig heavy chain v region), 민무늬근 미오신 알칼리 경사슬(Smooth muscle myosin alkali light chain) 및 지방산 결합 단백질(Fatty acid binding protein)로 구성되는 단백질 군 중에서 선택된다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 자간전증의 태반 단백질 발현 분석에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 정상 태반에서보다 자간전증 태반에서 보다 많은 발현 변화를 보이는 단백질을 분석함으로써, 자간전증의 발병 기전에 관여하는 단백질을 제시하는 것에 관한 것이다.

자간전증 발병 기전에 관련된 단백질을 제시하기 위하여, 본 발명에서는 2차원 전기영동 분석(2D E-proteomics analysis)을 이용하여 태반 내 단백질의 발현을 분석하고, 자간전증 태반의 단백질 발현 차이를 확인하기 위하여 정상 태반과 자간전증 태반 단백질 발현을 비교한다. "2차원 전기영동 분석"은 세포나 조직의 단백질을 전체적인 묶음으로 인지하여 단백질을 개체가 아닌 총체적 변화에 대하여 단백질의 전기적, 물리적 성상을 이용하여 전기영동 방법으로 확인하는 학문으로서, 최근 전세계에서 활발히 이용되고 있는 연구 기법이며, 이 기법은 크게 1차원 등전점 분리와 2차원 단백질 질량 겔 분리를 통해 이루어진다. 두 단계의 단백질 분리를 통해 겔 상에 넓게 분포된 단백질의 이미지는 영상 분석 장치를 통하여 양적인 발현을 비교하고 그 중 큰 차이를 보이는 단백질을 채취하여 MALDI-TOF MS라는 분자 질량 측정 방법을 통하여 단백질의 작은 절편 단위인 펩티드의 질량을 측정한다. 측정된 펩티드의 질량은 다시 펩티드를 구성하는 아미노산의 질량으로 계산되어 최종적으로 이미 공지된 펩티드의 질량 데이터베이스와 비교하여 원래 단백질의 성상을 밝혀낸다.

본 발명은 이러한 2차원 전기영동 분석을 이용하여 자간전증 태반에서 발현에 차이를 보이는 21개의 단백질을 제시한다. 상기 단백질들은 자간전증 태반 내 대사 이상 및 발병 기전에 대하여 제시될 수 있으며, 또한 향후 자간전증이 발병된 임신부의 조기 진단 및 예측에 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명자들은 정상 태반과 자간전증 태반조직을 준비하고, 상기 태반에서 단백질 분석을 위한 준비 과정을 거친 후, 1차 단백질 등점전 분리(isoelectric point) 및 분자량에 따른 2차 단백질 전기영동을 수행함으로써 2차원 전기영동을 수행하였다. 전기영동을 마친 겔을 질산은을 이용하여 염색하고, 염색된 겔을 평판 스캐너로 스캐닝하고 이를 이미지 분석 프로그램을 통해 분석하였다. 여기서 두 시료의 태반에서 140% 이상의 차이를 보이는 단백질들을 선별하여 최종 단백질 동정을 수행하여 21개의 단백질을 채취하고, 단백질 질량 피크를 MASCOT PMF에서 NCBI 데이터베이스를 기준으로 검색하였다(표 1 참조). 아울러, 상기 21개의 단백질 중 17개의 단백질에 대하여 분석을 하고, 그 결과 대부분의 단백질들이 태반 대사에 관여하는 단백질임을 확인하였으며(표 2 참조), 상기 단백질들은 항산화 작용, 스트레스와 관련된 재조합, 세포자멸사, 당분해, 면역 조절, 감소된 NADP 재형성에 관여하는 단백질 등으로 분류를 할 수 있어, 이들 단백질에 의한 자간전증의 발병 기전을 제시할 수 있다(도 3 참조).

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 2차원 전기영동 분석을 이용하여 자간전증 태반에서 발현 변화를 보이는 단백질들을 확인할 수 있으며, 이를 통해 자간전증의 발병 기전에 대한 가설을 제시할 수 있고, 또한 본 발명의 스크리닝 방법 및 마커는 자간전증 임신부 태반에서 발현에 차이를 보이는 단백질을 스크리닝할 수 있고, 상기 단백질을 마커로 이용함으로써 자간전증의 예방 및 초기 치료에 이용될 수 있다.

도 1은 자간전증 임신부 태반의 단백질 변화를 확인하기 위해 실시한 2차원 전기영동의 겔 사진으로, 도 1a는 정상 임신부 태반의 단백질을 분석한 것이고, 도 1b는 자간전증 임신부 태반의 단백질을 분석한 겔 사진이며,
도 2는 도 1에 도시된 전기영동 결과 정상 태반과 자간전증 태반 간에 큰 차이를 보이는 단백질 상을 도시한 사진(좌측: 정상 세포, 우측: 위암 세포)으로서, 정상 태반과 비교하여 자간전증 태반에서 발현의 차이를 보이는 단백질은 21개 단백질임을 나타내는 사진이고,
도 3은 자간전증의 태반 내 발현 시에 변화를 보이는 단백질의 분석을 토대로 자간전증 발병 기전을 제시한 개념도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 단, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

< 실시예 1 > 태반 단백질의 분리

2차원 전기영동 분석을 위해 정상 태반과 자간전증 태반조직을 준비하였다. 태반 조직을 액체 질소를 이용하여 곱게 갈아주고, 완충액(조직0.2 g/10 ㎖)을 첨가하였다. 이 후 튜브에 분주하여 5분 끓인 후, 5분간 얼음에 방치하였고, 8,000 rpm, 10 min, 4℃에서 원심분리하였다. 상층액 800 ㎕씩 새로운 튜브에 분주한 후 효소(DNase/RNase) 처리하여, 10분간 얼음에 방치하였다. 10% TCA/acetone preparation-50% TCA/acetone 200 ㎕씩 첨가하여 얼음에서 1시간 방치한 후 12,000 rpm, 10 min, 4℃에서 원심분리하고, 펠렛을 아세톤으로 세척하였다. 건조시켜 남은 분말을 -20℃에 보관하였다.

< 실시예 2 > 2차원 전기영동 단백질 분리

< 2-1 > 1차 단백질 등전점 분리

단백질의 고유 성질인 전기적 등전점(isoelectric point)을 이용하여 단백질을 일차적으로 분리하는 방법이다. 13 ㎝의 건조 상태의 고정화 pH 구배(immobilized pH gradient, IPG) 스트립에 50 ㎍ 단백질을 함유하는 250 ㎕의 등전점 분리 용액을 더하여 10 시간 이상 재수화시켰다. 재수화된 IPG 스트립에 대해 IPG 포어(phore)(GE 헬쓰케어, 미국) 장치 상에서 등전점 분리를 수행하였다. 등전점 분리 시의 조건은 500 V 1시간, 1000 V 1시간, 최종적으로 8000 V로 최종 누적 볼트가 60000 V가 될 때까지 시행하였다. 이때, 최고 전류를 스트립당 50 ㎂로 조절하였다. 등전점 분리를 마친 스트립을 1차 상동화 용액(6M 우레아, 30% 글리세롤, 2% SDS, 브로모페놀 블루, 1% DTT를 함유하는 50 mM Tris-HCl, pH 8.8 용액)에서 15분간 천천히 교반시켰다. 1차 상동화를 마친 스트립을 2차 상동화 용액(6M 우레아, 30% 글리세롤, 2% SDS, 브로모페놀 블루, 2.5% 요오도아세트아미드를 함유하는 50 mM Tris-HCl, pH 8.8 용액)에 담가 다시 15분간 교반시켰다.

< 2-2 > 2차원 단백질 전기영동

폴리아크릴아미드 겔에서 단백질의 분자량에 따라 분리하는 단계이다. 12.5%의 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔을 13 ㎝ 크기에 맞추어 SE 600 루비(Ruby) 전기영동 세트(애머샴, 미국)를 통해 제작하였다. 상동화 과정을 마친 스트립을 겔 위에 올려 놓고 실링(sealing) 아가로 스트립과 겔 사이를 막아주었다. 구동 완충액(running buffer)(25 mM Tris, 192 mM 글리신, 2.5 mM SDS, pH 8.3)을 세트에 채우고 처음 20분간 80 V에서 스트립의 단백질이 겔로 옮겨가도록 하고 이후 5시간 가량 240 V에서 전기영동을 진행하였다. 전기영동을 마친 겔을 질산은을 이용하여 염색하였다. 그 결과, 정상 임신부 태반의 단백질을 분석한 2차원 전기영동의 겔 사진(도 1a)과 자간전증 임신부 태반의 단백질을 분석한 2차원 전기영동의 겔 사진(도 1b)을 비교함으로써 자간전증 임신부 태반의 단백질 변화를 확인하였다.

< 실시예 3 > 겔의 스캔과 이미지 분석

염색된 겔을 평판 스캐너(UMAX 파워 룩 1100, 미국)를 통해 스캐닝하였다. 스캐닝시, 300 dpi, 투과형으로 옵션을 조절하였다. 스캐닝된 겔의 이미지를 이미지 분석 프로그램(이미지 매스터 2D 플래티늄, GE 헬쓰케어, 미국)을 통해 분석하였다. 본 발명에서는 이미지 분석 결과를 통해 두 태반에서 140% 이상의 차이를 보이는 단백질들을 선별하여 최종 단백질 동정을 수행하였다. 그 결과, 도 1에 도시된 전기영동의 정상 태반과 자간전증 태반간에 큰 차이를 보이는 단백질을 확인하였고(도 2; 좌측: 정상 세포, 우측: 위암 세포), 정상 태반과 비교하여 자간전증 태반에서 발현의 차이를 보이는 단백질은 21개임을 확인하였다.

< 실시예 4 > 단백질 동정

사용된 태반 간의 차이를 보이는 21개의 단백질을 채취 후에 (주)인투젠(IN2GEN)에 MALDI-TOF MS 기법을 이용한 단백질 질량 분석을 의뢰하였다. 분석된 단백질 질량 피크를 MASCOT PMF(http://www.matrixscience.com)에서 NCBI 데이터베이스를 기준으로 검색한 결과를 진뱅크 ID와 함께 하기 표 1에 나열하였다.

상기 표 1은 상기 21개의 단백질을 MALDI-TOF MS 분석법을 통하여 분석한 결과이며, 상기 21개의 단백질들 중 1개를 제외하고는 정상 태반에서보다 자간전증 태반에서 과발현을 나타내었다.

< 실시예 5 > 단백질 분석 및 발병기전 제시

상기 21개의 단백질 중 17개의 단백질에 대하여 분석을 하였고, 결과로 대부분의 단백질들이 태반 대사에 관여하는 단백질임을 확인하였다. 구체적으로, 상기 21개의 단백질의 기능과 정상 태반과 비교한 단백질 발현 변화에 대한 분석을 수행하였고, 이를 하기 표 2에 나타내었다.

그 결과, 상기 단백질들은 항산화작용, 스트레스와 관련된 재조합, 세포자멸사, 당분해, 면역조절, 감소된 NADP 재형성에 관여하는 단백질 등으로 분류를 할 수 있었고, 이들 단백질으로 도 3에 기술한 것과 같이 발병 기전을 제시할 수 있다.

없음.

Claims

태반 조직 시료에서 태반 단백질을 분리하는 단계;
상기 태반 단백질로부터 인간 알도즈 리덕타제(human Aldose reductase)에 결합된 피다레스타트(Fidaresta) 체인 B(NCBI 검색(access) 번호 493797), 포스로글라이세레이트 뮤타제 1(Phosphoglycerate mutase 1)(NCBI 검색(access) 번호 56081766), 소포체 단백질(Endoplasmic eticulum protein)(NCBI 검색(access) 번호 5803013), PSMA2(proteasome_alpha_type_2) 단백질(NCBI 검색(access) 번호 50881968), 글루타티온 S-트랜스퍼레이제(Glutathione S-transferase)(NCBI 검색(access) 번호 2204207), Ig 중사슬 v 부위(Ig heavy chain v region)(NCBI 검색(access) 번호 8249777), 민무늬근 미오신 알칼리 경사슬(Smooth muscle myosin alkali light chain)(NCBI 검색(access) 번호 16924329) 및 지방산 결합 단백질(Fatty acid binding protein)(NCBI 검색(access) 번호 4557581)로 구성되는 단백질 군 중에서 선택되는 1종 이상의 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;
상기 측정된 단백질의 발현 수준을 정상 대조구 시료와 비교하는 단계; 및
상기 태반 조직 시료의 측정된 단백질의 발현 수준이 정상 대조구 시료보다 높을 경우 자간전증이라고 판단하는 단계를 포함하는 자간전증 예측 및 조기 진단용 마커 검출 방법.