KR101297474B1 - Enzymatic Hydrolysis method of Law Starch Using Direct Pressure Pre-Treatment - Google Patents

Enzymatic Hydrolysis method of Law Starch Using Direct Pressure Pre-Treatment Download PDF

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Abstract

본 발명은 a) 전분에 압력을 직접적으로 처리하는 전처리 단계; 및 b) 상기 전처리된 전분에 효소를 가하는 단계를 포함하는 전분의 가수분해방법에 관한 것이다. 본 발명의 전분 가수분해방법은 압력 전처리 과정을 거침으로써 생전분의 표면구조가 변형되어 효소가 작용하기 좋은 기질이 외부로 많이 노출되어 효소의 작용을 받기 쉬운 상태가 되게 함으로써 효소에 의한 가수분해 반응속도가 월등히 증가되는 효과를 가지며, 이로 인해 호화되지 않은 생전분 입자를 직접 가수분해할 수 있으므로 에너지 효율성과 공정의 간편성 측면에서 이점을 가진다. 따라서 종래의 효소당화법과는 달리 고온에서 호화되는 공정 없이 올리고당 생산이 가능하고 낮은 온도에서 가수분해 반응을 진행시킴으로써 효소의 활성 유지를 위한 별도의 추가적인 공정도 요구되지 않는다. 이러한 본 발명의 전분 가수분해방법은 전분으로부터 올리고당을 효율적으로 생산할 수 있기 때문에 올리고당과 관련된 산업, 특히 식품원료인 전분당의 생산 및 바이오연료의 에너지원으로의 당 생산에 유용하게 사용될 수 있다.The present invention comprises a) a pretreatment step of treating pressure directly with starch; And b) adding an enzyme to the pretreated starch. In the starch hydrolysis method of the present invention, the surface structure of the raw starch is modified by the pressure pretreatment process so that the substrate that is easy to act on the enzyme is exposed to the outside so that the enzyme is easily susceptible to the action of the enzyme. It has the effect of significantly increasing the speed, which can directly hydrolyze the raw non-gelatinized particles, which has advantages in terms of energy efficiency and process simplicity. Therefore, unlike conventional enzyme glycosylation method, oligosaccharides can be produced without a process of gelatinization at a high temperature, and a separate additional process for maintaining enzyme activity is not required by proceeding a hydrolysis reaction at a low temperature. Since the starch hydrolysis method of the present invention can efficiently produce oligosaccharides from starch, it can be usefully used in the oligosaccharide-related industries, in particular, the production of starch sugar, a food material, and the production of sugar as an energy source of biofuels.

Description

압력을 직접 처리하는 전처리 공정을 포함하는 효소적 생전분 가수분해방법{Enzymatic Hydrolysis method of Law Starch Using Direct Pressure Pre-Treatment}Enzymatic Hydrolysis method of Law Starch Using Direct Pressure Pre-Treatment

본 발명은 전분의 가수분해 방법, 이를 통해 제조된 올리고당 및 올리고당을 이용한 바이오연료 생산방법에 관한 것이다.The present invention relates to a hydrolysis method of starch, a biofuel production method using oligosaccharides and oligosaccharides prepared therefrom.

전분은 포도당 분자가 α-1,4 및 α-1,6 글루코시드(glucoside) 결합으로 연결되어 있는 자연계에 존재하는 거대 생체 고분자로서, 인류가 섭취하는 열량의 70~80%를 공급한다. 전분의 가수분해산물을 생산하는 방법은 크게 산으로 가수분해하는 산당화법과 효소를 이용한 효소당화법으로 나눌 수 있다. 종래에는 산당화법이 많이 이용되었으나, 근래에는 효소로서 당화시켜 가수분해산물을 얻는 방법이 대부분 사용되고 있다.Starch is a large biopolymer that exists in nature in which glucose molecules are linked by α-1,4 and α-1,6 glucoside bonds, and supplies 70-80% of the calories consumed by humans. The method of producing starch hydrolyzate can be divided into acid glycosylation method which hydrolyzes into acid and enzyme glycosylation method which uses enzyme. Conventionally, the acid glycosylation method has been widely used, but in recent years, a method of obtaining a hydrolyzate by glycosylation as an enzyme is mostly used.

산으로 전분 분자를 가수분해하는 산당화법은 전분과 산 용액을 혼합하여 가열하는 방식으로 이루어진다. 전분분자의 α-1,4 및 α-1,6 글루코시드 결합은 저농도의 산과 함께 가열하면 쉽게 가수분해 된다. 이때, 산이 가지는 수소이온이 촉매작용을 하므로 전분의 농도는 물론 수소이온의 농도가 높거나 반응온도가 높을수록 가수분해가 빠르게 일어난다. 상기 산당화법에 있어서, 가수분해가 완전히 진행되려면 산의 수소이온이 전분분자와 작용할 때 반드시 물 분자가 같이 있어야 하지만 실제로 전분유의 농도가 낮아도 전분분자가 미셀을 이루고 있어 고르게 분산되지 못하므로 저항을 갖는 부분이 발생하는 문제점이 있다. 또한, 산당화법은 가수분해 시 전분의 농도와 비례해 역합성이 발생하여 부산물이 생성되는 문제점이 있다. 포도당과 역합성으로 생성된 당의 비율은 전분농도 및 온도조건에 따라 다르며 전분의 농도가 높을수록 역합성이 많이 일어나게 된다. 또한, 산당화법은 가열 및 냉각과정에서 에너지 비용이 소요되고 부산물로 생성된 당을 제거하는 데 많은 비용과 시간이 소요된다. The acid glycosylation method of hydrolyzing starch molecules with acid is performed by mixing and heating starch and acid solution. The α-1,4 and α-1,6 glucoside bonds of starch molecules readily hydrolyze when heated with low concentrations of acid. At this time, since the hydrogen ions of the acid catalyzes, hydrolysis occurs faster as the concentration of starch as well as the higher concentration of hydrogen ions or higher reaction temperature. In the acid glycosylation method, in order for the hydrolysis to proceed completely, water molecules must be present when the hydrogen ions of the acid interact with the starch molecules, but even though the starch milk concentration is low, the starch molecules form micelles and cannot be dispersed evenly. There is a problem that the part having. In addition, the acid glycosylation method has a problem in that byproducts are generated due to reverse synthesis in proportion to the concentration of starch during hydrolysis. The ratio of glucose and inverted sugar produced depends on the starch concentration and temperature conditions, and the higher the starch concentration, the more reverse synthesis occurs. In addition, acid glycosylation is an energy cost in the heating and cooling process, and a high cost and time to remove the sugar produced as a by-product.

또한, 전분분자의 글루코시드(glucoside) 결합은 가수분해효소의 작용으로도 쉽게 분해되므로 전분분해효소를 이용하는 효소당화법이 있다. 산으로 가수분해하는 방법과 달리 당화 후 전분 가수분해산물을 중화시킬 필요가 없어서 중화 시 생성되는 염류를 제거할 필요가 없으며, 당화액 중의 포도당의 순도가 높고, 생산비가 적은 장점을 가지고 있기 때문에 현재 전분 가수분해에 있어 주로 사용되는 방법이지만, 공정 초기에 전분을 호화시킬 때 고온으로 가열하기 때문에 많은 에너지가 소요되는 단점이 있다.In addition, since glucoside binding of starch molecules is easily degraded by the action of hydrolase, there is an enzymatic glycosylation method using starchase. Unlike the method of hydrolysis with acid, there is no need to neutralize the starch hydrolyzate after saccharification, so there is no need to remove salts generated during neutralization, and it has the advantages of high purity of glucose in saccharification solution and low production cost. Although it is a method mainly used for starch hydrolysis, there is a disadvantage in that a lot of energy is consumed because it is heated to a high temperature when starch is gelatinized at the beginning of the process.

한편 초고압이 생체고분자에 미치는 효과는 분자간의 공간을 줄이고 사슬간의반응을 촉진시키는데 있다. 이러한 초고압 기술은 설비비용이 고가이고 한 번에 처리할 수 있는 시료의 양이 제한되어 있다는 단점 때문에 아직까지는 식품산업에 널리 이용되어지지 못하고 있는 실정이나, 최근 설비비용이 점차 저렴해지고 한 번에 처리할 수 있는 시료의 양을 증가시키는 등 초고압처리 관련기술의 발달과 기존의 가열가공방식과는 달리 초고압처리 시 식품의 영양소 파괴를 최소화하고 풍미를 유지할 수 있다는 장점이 부각되면서 일본 등 일부 국가에서 시판되는 과일쥬스나 젤리 등 제한된 식품분야에서 사용되어지고 있다. 또한, 가열처리 없이 식품 중 유해미생물의 살균이 가능하여 식품의 향미를 보존하면서 저장성을 증진시킬 수 있다는 장점으로 인하여 미국, 유럽 등 선진국에서 새로운 비가열 가공방법의 일환으로 이와 관련된 다양한 연구들이 진행 중에 있다. On the other hand, the effect of ultra high pressure on biopolymers is to reduce the space between molecules and promote the reaction between chains. These ultra-high pressure technologies have not been widely used in the food industry because of the high cost of equipment and the limited amount of samples that can be processed at one time. It is marketed in some countries, such as Japan, due to the development of technology related to ultra high pressure treatment, such as increasing the amount of samples that can be made, and the fact that it can minimize the destruction of nutrients and maintain the flavor of the food during ultra high pressure processing, unlike the existing heating processing method. It is used in limited food fields such as fruit juice and jelly. In addition, due to the advantage of sterilizing harmful microorganisms in foods without heat treatment, preserving the flavor of foods and improving shelf life, various studies related to this as part of a new non-heating processing method in advanced countries such as the United States and Europe are in progress. have.

전분 가수분해방법에 있어서, 초고압 기술을 접목시킨 특허문헌으로는 한국등록특허 제10-0540607호가 있으며, 본 문헌에서는 전분에 산 용액을 가하여 제조한 전분현탁액에 소정의 시간 동안 초고압을 가하는 단계를 통하여 전분의 가수분해 효과를 증진시키는 내용을 개시하고 있다.In the starch hydrolysis method, a patent document incorporating ultra-high pressure technology is Korean Patent No. 10-0540607. In this document, an ultrahigh pressure is applied to a starch suspension prepared by adding an acid solution to starch for a predetermined time. Disclosed is a content that enhances the hydrolysis effect of starch.

그러나 상기 특허문헌에 의하면, 초고압을 가하는 단계는 전분에 산 용액을 처리한 후 전분 내에서 산의 균일한 침투 및 사슬간의 반응을 촉진시키기 위하여 존재하는 것이다. 즉 초고압 처리는 전분과 산의 반응을 보다 효과적으로 매개하는 역할을 하는 것으로 초고압 자체가 전분에 독립적인 영향을 미치는 것을 개시한 것은 아니다. 또한 이러한 과정을 통하더라도 산을 부가하는 공정 및 산을 알칼리 용액으로 중화시키는 공정이 별도로 필요하여 공정이 번거로운 문제점이 여전히 존재하게 된다. However, according to the patent document, the step of applying ultra-high pressure exists after treating the acid solution to the starch to promote uniform penetration of the acid and the chain-to-chain reaction in the starch. In other words, the ultrahigh pressure treatment mediates the reaction between the starch and the acid more effectively, and does not disclose that the ultrahigh pressure itself has an independent effect on the starch. In addition, even through this process, a process of adding an acid and a process of neutralizing an acid with an alkaline solution are required separately, so that the process is cumbersome.

이에 본 발명자들은 초고압 처리가 전분의 가수분해에 미치는 영향을 연구하던 중, 생전분 입자(raw starch granule)에 일정 기압 이상의 압력을 직접적으로 처리한 후 효소를 이용하여 가수분해를 하는 경우, 압력을 처리를 하지 않은 무처리군과 비교하여 효소반응속도가 1.3 내지 9.5배로 증가함을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.The inventors of the present invention studied the effects of ultrahigh pressure treatment on the starch hydrolysis, and when hydrolyzing by using enzyme after directly processing a pressure above a certain atmospheric pressure on raw starch granules (raw starch granule), The present invention was completed by confirming that the enzyme reaction rate was increased by 1.3 to 9.5 times compared with the untreated group.

따라서 본 발명의 목적은 열처리 공정을 생략하여 효과적으로 에너지를 절감하면서 올리고당을 대량 생산할 수 있는 전분의 가수분해방법을 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for hydrolyzing starch which can omit the heat treatment step and efficiently produce oligosaccharides while saving energy.

본 발명의 다른 목적은 이러한 전분의 가수분해방법으로 제조된 올리고당을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide an oligosaccharide prepared by the hydrolysis method of such starch.

본 발명의 또 다른 목적은 이러한 전분의 가수분해방법을 이용하여 바이오연료를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a method of preparing biofuel using the hydrolysis method of starch.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 a) 전분에 압력을 직접적으로 처리하는 전처리 단계; 및 b) 상기 전처리된 전분에 효소를 가하는 단계를 포함하는 전분 가수분해방법을 제공한다.In order to achieve the object of the present invention as described above, the present invention comprises a) a pretreatment step of directly treating the pressure in the starch; And b) provides a starch hydrolysis method comprising the step of adding an enzyme to the pretreated starch.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 전분은 물을 첨가하지 않은 생전분으로서 쌀전분, 밀전분, 보리전분, 옥수수전분, 감자전분, 고구마전분, 카사바전분 및 타피오카전분으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the starch is a raw starch without water, one star selected from the group consisting of rice starch, wheat starch, barley starch, corn starch, potato starch, sweet potato starch, cassava starch and tapioca starch Can be.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 압력은 1기압 이상일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the pressure may be 1 atm or more.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 효소는 알파-아밀라아제, 베타-아밀라아제, 글루코아밀라아제 및 탈분지효소 단독 또는 이들의 혼합물일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the enzyme may be alpha-amylase, beta-amylase, glucoamylase and debranching enzyme alone or a mixture thereof.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 탈분지효소는 풀룰라나아제(pullulanase)일 수 있다.In one embodiment of the invention, the debranching enzyme may be pullulanase (pullulanase).

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 b) 단계는 효소로 알파-아밀라아제, 베타-아밀라아제, 글루코아밀라아제 및 탈분지효소로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 동시에 또는 순차적으로 가하는 단계일 수 있다.In one embodiment of the present invention, step b) may be the step of simultaneously or sequentially adding one or more selected from the group consisting of alpha-amylase, beta-amylase, glucoamylase and debranching enzyme as an enzyme.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 b) 단계는 20℃ 이상의 온도조건에서 가수분해가 이루어질 수 있다.In one embodiment of the present invention, the step b) may be hydrolyzed at a temperature condition of 20 ℃ or more.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 올리고당을 제공한다.The present invention also provides oligosaccharides prepared by the above method.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 올리고당은 글루코오스, 말토오스, 말토트리오즈, 말토테트라오스 등의 말토올리고당 및 판노오스로 이루어진 군으로부터 선택된 단독 또는 이들의 혼합물일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the oligosaccharide may be alone or a mixture thereof selected from the group consisting of maltooligosaccharides such as glucose, maltose, maltotriose, maltotetraose and pannoose.

또한, 본 발명은 a) 전분에 압력을 직접적으로 처리하는 전처리 단계; b) 상기 전처리된 전분에 효소를 가하여 올리고당을 생산하는 단계; 및 c) 상기 올리고당을 발효시켜 에틸알코올을 생성하는 단계를 포함하는 바이오연료 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention includes a) a pretreatment step of directly treating the pressure in the starch; b) adding an enzyme to the pretreated starch to produce oligosaccharides; And c) fermenting the oligosaccharides to produce ethyl alcohol.

본 발명의 전분 가수분해방법은 압력 전처리 과정을 거침으로써 생전분의 표면구조가 변형되어 효소가 작용하기 좋은 기질이 외부로 많이 노출되어 효소의 작용을 받기 쉬운 상태가 되게 함으로써 효소에 의한 가수분해 반응속도가 월등히 증가되는 효과를 가지며, 이로 인해 호화되지 않은 생전분 입자를 직접 가수분해할 수 있으므로 에너지 효율성과 공정의 간편성 측면에서 이점을 가진다. 따라서 종래의 효소당화법과는 달리 고온에서 호화되는 공정 없이 올리고당 생산이 가능하고 낮은 온도에서 가수분해 반응을 진행시킴으로써 효소의 활성 유지를 위한 별도의 추가적인 공정도 요구되지 않는다. 이러한 본 발명의 전분 가수분해방법은 전분으로부터 올리고당을 효율적으로 생산할 수 있기 때문에 올리고당과 관련된 산업, 특히 식품원료인 전분당의 생산 및 바이오연료의 에너지원으로의 당 생산에 유용하게 사용될 수 있다.In the starch hydrolysis method of the present invention, the surface structure of the raw starch is modified by the pressure pretreatment process so that the substrate that is easy to act on the enzyme is exposed to the outside so that the enzyme is easily susceptible to the action of the enzyme. It has the effect of significantly increasing the speed, which can directly hydrolyze the raw non-gelatinized particles, which has advantages in terms of energy efficiency and process simplicity. Therefore, unlike conventional enzyme glycosylation method, oligosaccharides can be produced without a process of gelatinization at a high temperature, and a separate additional process for maintaining enzyme activity is not required by proceeding a hydrolysis reaction at a low temperature. Since the starch hydrolysis method of the present invention can efficiently produce oligosaccharides from starch, it can be usefully used in the oligosaccharide-related industries, in particular, the production of starch sugar, a food material, and the production of sugar as an energy source of biofuels.

도 1은 생전분에 초고압(4000기압) 처리를 한 경우, 전분 입자의 표면구조를 나타낸 전자현미경 사진이다(A: 쌀전분, B: 옥수수전분, C: 감자전분).
도 2는 생전분에 초고압(2000기압, 4000기압, 5000기압)을 처리한 경우, 알파-아밀라아제의 상대 가수분해 속도를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 생전분에 초고압(2000기압, 4000기압, 5000기압)을 처리한 경우, 알파-아밀라아제의 가수분해 반응에 대한 double reciprocal plots을 나타낸 것이다(A: 감자전분, B: 옥수수전분, C: 쌀전분).
도 4는 초고압(5000기압) 전처리과정을 거친 전분에 알파-아밀라아제를 처리한 경우, 전분 입자의 표면구조를 나타낸 사진이다(A: 쌀전분, B: 옥수수전분, C: 감자전분).
도 5는 생전분에 초고압(2000기압, 4000기압, 5000기압)을 처리한 경우, 풀룰라나아제의 상대 가수분해 속도를 그래프로 나타낸 것이다.1 is an electron micrograph showing the surface structure of starch particles when ultra-high pressure (4000 atm) is applied to raw starch (A: rice starch, B: corn starch, C: potato starch).
2 is a graph showing the relative hydrolysis rate of alpha-amylase when raw starch is treated with ultra high pressure (2000 atm, 4000 atm, 5000 atm).
Figure 3 shows the double reciprocal plots for the hydrolysis of alpha-amylase when the raw starch was treated with ultra high pressure (2000 atm, 4000 atm, 5000 atm) (A: potato starch, B: corn starch, C: Rice starch).
4 is a photograph showing the surface structure of starch particles when alpha-amylase is treated in starch that has undergone ultra high pressure (5000 atm) pretreatment (A: rice starch, B: corn starch, C: potato starch).
5 is a graph showing the relative hydrolysis rate of pullulanase when the raw starch is treated with ultra high pressure (2000 atm, 4000 atm, 5000 atm).

본 발명은 a) 전분에 압력을 직접적으로 처리하는 전처리 단계; 및 b) 상기 전처리된 전분에 효소를 가하는 단계를 포함하는 전분의 가수분해방법을 제공한다.The present invention comprises a) a pretreatment step of treating pressure directly with starch; And b) adding an enzyme to the pretreated starch.

먼저 본 발명의 a) 단계는 생전분에 압력을 직접적으로 처리하는 전처리 단계이다.First, step a) of the present invention is a pretreatment step of directly processing pressure on raw starch.

본 발명의 a) 단계에서 상기 전분은 식물에 존재하는 전분의 종류이면 특별히 종류를 한정하는 것은 아니나, 바람직하게는 쌀전분, 밀전분, 보리전분, 옥수수전분, 감자전분, 고구마전분, 카사바전분 및 타피오카전분으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 전분일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 쌀전분, 옥수수전분 또는 감자전분일 수 있다. 또한 본 발명에서 사용할 수 있는 전분은 시중에서 판매되는 상기 종류의 전분이거나 본 발명이 속하는 기술분야에서 일반적인 방법을 통해 직접 제조하여 사용할 수도 있다. 하기 실시예에서는 쌀전분, 옥수수전분 및 감자전분을 Sigma사(USA)에서 구입하여 사용하였다.In the step a) of the present invention, the starch is not particularly limited as long as it is a kind of starch present in the plant, preferably rice starch, wheat starch, barley starch, corn starch, potato starch, sweet potato starch, cassava starch and It may be one starch selected from the group consisting of tapioca starch, more preferably may be rice starch, corn starch or potato starch. In addition, the starch that can be used in the present invention may be commercially available starch of the above kind or may be prepared and used directly by a general method in the art to which the present invention belongs. In the following examples, rice starch, corn starch and potato starch were purchased from Sigma (USA) and used.

본 발명의 a) 단계에서 상기 압력은 1기압 이상일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 2000기압 내지 10000기압일 수 있다.In step a) of the present invention, the pressure may be 1 atm or more, and more preferably 2000 to 10000 atm.

따라서 본 발명의 a) 단계는 쌀전분, 밀전분, 보리전분, 옥수수전분, 감자전분, 고구마전분, 카사바전분 및 타피오카전분으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 생전분을 1기압 이상의 압력을 직접적으로 처리하는 단계이며, 하기 실시예에서는 물을 첨가하지 않은 종류별 생전분 입자(raw starch granule)들을 진공포장한 뒤 초고압처리기(35L-600 HPP System, Avure, Sweden)로 각각 2000기압, 4000기압, 5000기압으로 전처리하였다.Therefore, step a) of the present invention directly treats one or more pressures of one starch selected from the group consisting of rice starch, wheat starch, barley starch, corn starch, potato starch, sweet potato starch, cassava starch and tapioca starch. In the following example, the raw starch granules (raw starch granules) without water were vacuum-packed and then pressurized to 2000 atm, 4000 atm, and 5000 atm using an ultrahigh pressure processor (35L-600 HPP System, Avure, Sweden). Pretreated.

본 발명의 b) 단계는 상기 a) 단계를 통해 압력이 직접적으로 처리된 전분에 효소를 가하는 단계이다.Step b) of the present invention is a step of adding the enzyme to the starch, the pressure is directly processed through the step a).

본 발명의 b) 단계에서 효소는 아밀라아제와 탈분지효소(debranching enzyme) 단독 또는 이들의 혼합물일 수 있다.In step b) of the present invention, the enzyme may be amylase and debranching enzyme alone or a mixture thereof.

상기 아밀라아제는 α-1,4 글루코시드 및 α-1,6 글루코시드 결합을 분해하는 효소적 특성을 포함하는 것으로서 알파-아밀라아제, 베타-아밀라아제 및 글루코아밀라아제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 아밀라아제일 수 있다. 즉, 아밀라아제는 전분, 말토올리고당(maltooligosaccharides), 사이클로덱스트린(cyclodextrin) 및 플루란(pullulan)으로 이루어진 군으로부터 선택된 기질에 작용하여 α-1,4 글루코시드 및 α-1,6 글루코시드 결합을 분해하여, 글루코스, 말토오스, 말토트리오즈, 말토테트라오스 등의 말토올리고당, 판노오스 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고당을 생성시킨다. The amylase includes enzymatic properties that degrade α-1,4 glucoside and α-1,6 glucoside bonds, and may be at least one amylase selected from the group consisting of alpha-amylase, beta-amylase and glucoamylase. have. That is, amylase acts on a substrate selected from the group consisting of starch, maltooligosaccharides, cyclodextrin and pullulan to break down α-1,4 glucoside and α-1,6 glucoside bonds. Thus, oligosaccharides selected from the group consisting of maltooligosaccharides such as glucose, maltose, maltotriose and maltotetraose, pannose and mixtures thereof are produced.

상기 탈분지효소는 아밀로펙틴, 글리코겐과 풀룰란(pullulan) 등의 다당체 중 α-1,6 결합으로 이루어진 가지를 선택적으로 가수분해하여 직쇄를 생성하는 효소의 총칭으로, 본 발명에서 사용할 수 있는 탈분지효소의 종류로는 아이소아밀라아제(isoamylase), 풀룰라나아제(pullulanase), R-효소 등이 있으며, 바람직하게는 풀룰라나아제가 좋다.The debranching enzyme is a generic term for an enzyme that generates a straight chain by selectively hydrolyzing a branch consisting of α-1,6 bonds among polysaccharides such as amylopectin, glycogen and pullulan, and the like. Kinds of enzymes include isoamylase, pullulanase, R-enzyme, and the like, preferably pullulanase.

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 b) 단계는 상기 a) 단계의 전처리를 거친 생전분에 효소로 알파-아밀라아제를, 베타-아밀라아제, 글루코아밀라아제 및 탈분지효소로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 동시에 또는 순차적으로 가할 수 있다.According to an embodiment of the present invention, step b) of the present invention is selected from the group consisting of alpha-amylase as enzyme, beta-amylase, glucoamylase and debranching enzyme in the raw starch subjected to the pretreatment of step a). More than one species may be added simultaneously or sequentially.

본 발명의 b) 단계는 20℃ 이상의 온도조건에서 가수분해가 이루어질 수 있다.Step b) of the present invention may be hydrolyzed at a temperature of 20 ℃ or more.

본 발명의 일실시예에 따르면, 효소로 알파-아밀라아제를 사용하는 경우, 상기 a) 단계의 전처리 과정을 거친 생전분을 pH 6.5 내지 pH 7.5에서, 35℃ 내지 40℃의 반응조건으로 가수분해할 수 있으며, 또한 효소로 풀룰라나아제를 사용하는 경우에는, 상기 a) 단계의 전처리 과정을 거친 생전분을 pH 4.5 내지 pH 5.5에서, 40℃ 내지 50℃의 반응조건으로 가수분해할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, in the case of using alpha-amylase as an enzyme, the raw starch which has undergone the pretreatment of step a) may be hydrolyzed at a reaction condition of 35 ° C. to 40 ° C. at pH 6.5 to pH 7.5. In addition, in the case of using the pullulanase as an enzyme, the raw starch which has been subjected to the pretreatment of step a) may be hydrolyzed at a reaction condition of 40 ° C. to 50 ° C. at pH 4.5 to pH 5.5.

본 발명의 전분 가수분해방법에 따라 생전분에 압력을 직접적으로 처리한 후 알파-아밀라아제 또는 풀룰라나아제를 이용하여 가수분해를 하는 경우, 압력을 처리를 하지 않은 무처리군(대조군)과 비교하여 효소반응속도가 1.3 내지 9.5배로 증가함을 하기 <실시예 2> 및 <실시예 3>에서 증명하였다.According to the starch hydrolysis method of the present invention, when the raw starch is directly treated with pressure and hydrolyzed using alpha-amylase or pullulanase, the pressure is not treated compared with the untreated group (control). It was proved that the enzyme reaction rate increased by 1.3 to 9.5 times in <Example 2> and <Example 3>.

상기와 같은 실험 결과는 본 발명의 압력 전처리 과정을 통한 전분의 가수분해방법이 생전분의 가수분해를 효과적으로 증강시킬 수 있음을 증명하는 것이다.The experimental results as described above prove that the hydrolysis method of starch through the pressure pretreatment process of the present invention can effectively enhance the hydrolysis of raw starch.

따라서 본 발명의 전분 가수분해방법은 복잡한 기존의 공정(산당화법: 산부가 공정 및 산을 중화시키는 공정, 효소당화공정: 고온의 호화 공정 및 효소의 활성 유지를 위한 공정) 없이 호화되지 않은 생전분 입자를 직접 가수분해할 수 있으므로 올리고당의 대량생산에 유용하게 사용될 수 있다.Therefore, the starch hydrolysis method of the present invention is a raw starch that is not gelatinized without complex conventional processes (acid saccharification: acid neutralization and acid neutralization, enzyme saccharification: high temperature gelatinization and enzyme maintenance). Since the particles can be directly hydrolyzed, they can be usefully used for mass production of oligosaccharides.

본 발명은 또한, 상기 방법을 통해 제조된 올리고당을 제공한다.The present invention also provides oligosaccharides prepared through the above process.

상기 올리고당은 글루코오스, 말토오스, 말토트리오즈, 말토테트라오스 등의 말토올리고당 및 판노오스로 이루어진 군으로부터 선택된 단독 또는 이들의 혼합물일 수 있다.The oligosaccharide may be alone or a mixture thereof selected from the group consisting of malto oligosaccharides such as glucose, maltose, maltotriose and maltotetraose and pannose.

또한 본 발명은, 상기 제조된 올리고당을 이용하여 바이오연료를 제조할 수도 있다.In addition, the present invention, it is also possible to manufacture a biofuel using the prepared oligosaccharides.

“바이오연료”란 바이오매스(Biomass)에서 얻는 연료로 살아 있는 유기체뿐 아니라 동물의 배설물 등 대사활동에서 나오는 부산물을 모두 포함하며, 화석연료와는 다른 신재생에너지로 바이오에탄올과 바이오디젤 등이 포함되는 개념이다.“Biofuel” is a fuel obtained from biomass. It contains not only living organisms but also byproducts from metabolic activities such as animal excretion. Bioethanol and biodiesel are other renewable energy that are different from fossil fuels. It is a concept.

본 발명의 바이오연료 제조방법은 a) 전분에 압력을 직접적으로 처리하는 전처리 단계; 및 b) 상기 전처리된 전분에 효소를 가하여 올리고당을 생산하는 단계; 및 c) 상기 올리고당을 발효시켜 에틸알코올을 생성하는 단계를 포함한다.Biofuel production method of the present invention comprises a) a pretreatment step of directly processing the pressure in the starch; And b) adding an enzyme to the pretreated starch to produce oligosaccharides; And c) fermenting the oligosaccharide to produce ethyl alcohol.

먼저 본 발명의 a) 단계는 생전분에 압력을 직접적으로 처리하는 전처리 단계이다.First, step a) of the present invention is a pretreatment step of directly processing pressure on raw starch.

본 발명의 a) 단계에서 상기 전분은 식물에 존재하는 전분의 종류이면 특별히 종류를 한정하는 것은 아니나, 바람직하게는 쌀전분, 밀전분, 보리전분, 옥수수전분, 감자전분, 고구마전분, 카사바전분 및 타피오카전분으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 전분일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 쌀전분, 옥수수전분 또는 감자전분일 수 있다. 또한 본 발명의 a) 단계에서 상기 압력은 1기압 이상일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 2000기압 내지 10000기압인 것일 수 있다.In the step a) of the present invention, the starch is not particularly limited as long as it is a kind of starch present in the plant, preferably rice starch, wheat starch, barley starch, corn starch, potato starch, sweet potato starch, cassava starch and It may be one starch selected from the group consisting of tapioca starch, more preferably may be rice starch, corn starch or potato starch. In addition, in the step a) of the present invention, the pressure may be 1 atm or more, and more preferably 2000 to 10000 atm.

본 발명의 b) 단계는 상기 a) 단계를 통해 전처리된 전분에 효소를 가하여 올리고당을 생산하는 단계이다.Step b) of the present invention is a step of producing an oligosaccharide by adding an enzyme to the starch pretreated through the step a).

본 발명의 b) 단계에서 효소는 아밀라아제와 탈분지효소(debranching enzyme) 단독 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 b) 단계는 압력 전처리를 거친 생전분에 효소로 알파-아밀라아제, 베타-아밀라아제, 글루코아밀라아제 및 탈분지효소로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 동시에 또는 순차적으로 가할 수 있다.In step b) of the present invention, the enzyme may be amylase and debranching enzyme alone or a mixture thereof. According to one embodiment of the present invention, step b) of the present invention may be carried out on raw starch subjected to pressure pretreatment. The enzyme may be added simultaneously or sequentially with one or more selected from the group consisting of alpha-amylase, beta-amylase, glucoamylase and debranching enzyme.

본 발명의 b) 단계를 통해 생산되는 올리고당은 글루코오스, 말토오스, 말토트리오즈, 말토테트라오스 등의 말토올리고당 및 판노오스로 이루어진 군으로부터 선택된 단독 또는 이들의 혼합물일 수 있다.Oligosaccharides produced through step b) of the present invention may be alone or a mixture thereof selected from the group consisting of maltooligosaccharides such as glucose, maltose, maltotriose, maltotetraose and pannoose.

본 발명의 c) 단계는 상기 b) 단계를 통해 생산된 올리고당을 발효시켜 에틸알코올을 생성하는 단계이다.Step c) of the present invention is a step of producing ethyl alcohol by fermenting the oligosaccharides produced through step b).

본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 c) 단계는 상기 b) 단계를 통해 생산된 올리고당(당질원료)에 에탄올 생산효모를 첨가한 후 30℃~32℃의 온도에서 60~80시간 발효시켜 에틸알코올을 생성시킬 수 있으며, 이때 발효를 촉진시키기 위해 원적외선을 방사할 수도 있다.
According to one embodiment of the present invention, step c) of the present invention is added to the oligosaccharides (sugar raw material) produced through the step b) fermentation at 60 ℃ to 80 hours at a temperature of 30 ℃ ~ 32 ℃ To produce ethyl alcohol, in which case far infrared rays may be emitted to promote fermentation.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Advantages and features of the present invention and methods of achieving them will become apparent with reference to the embodiments described in detail below. Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, these examples are for illustrating the present invention specifically, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

<< 실시예Example >>

실험재료Experimental material

본 실험에서 사용한 생전분은 감자(S4251), 옥수수(S4126), 쌀전분(S7260)을 Sigma社에서 구입하였으며, 정제된 porcine pancreatic α-amylase(PPA, Type I-A, A4268), 말토오스(4-O-α-D-glucopyranosyl-D-glucose)는 Sigma社(USA)에서 구입하여 사용하였다. 풀룰라나아제는 Novozyme社에서 구입하여 사용하였다
Raw starch used in this experiment was purchased from Sigma, potato (S4251), corn (S4126), rice starch (S7260), purified porcine pancreatic α-amylase (PPA, Type IA, A4268), maltose (4-O -α-D-glucopyranosyl-D-glucose) was purchased from Sigma (USA). Pullulanase was purchased from Novozyme.

<< 실시예Example 1> 1>

생전분Live meal 입자의 초고압 전처리 Ultra high pressure pretreatment of particles

생전분을 초고압으로 전처리하기 위하여 물을 첨가하지 않은 생전분 입자(raw starch granule)들을 진공포장한 뒤 초고압처리기(35L-600 HPP System, Avure, Sweden)로 각각 2000기압, 4000기압, 5000기압에서 5분간 처리하였다. 초고압 전처리된 생전분 입자의 표면구조는 전자현미경을 사용하여 확인하였다. 각각의 전분 시료는 금막을 입히는 과정을 거친 뒤 주사전자현미경(FM-SEM, S-4300SE, Hitachi Ltd., Japan)으로부터 사진을 얻었으며, 그 결과는 도 1에서 나타내었다.In order to pretreat raw starch to ultra high pressure, raw starch granules without water were vacuum-packed and ultra high pressure processor (35L-600 HPP System, Avure, Sweden) was used at 2000, 4000 and 5000 atmospheres, respectively. 5 minutes treatment. The surface structure of the ultrahigh pressure pretreated raw starch particles was confirmed using an electron microscope. Each starch sample was obtained from a scanning electron microscope (FM-SEM, S-4300SE, Hitachi Ltd., Japan) after the gold coating process, the results are shown in FIG.

도 1A에서 나타낸 바와 같이, 쌀전분의 경우 전체적인 전분 입자의 모양이 초고압을 처리하였을 때 쭈그러진 모양을 하고 있었으며 처리한 압력이 증가할수록 그 정도가 심하였다. 옥수수전분(도 1B)과 감자전분(도 1C)의 경우 초고압을 처리하였을 때 전분 입자의 표면이 주위의 다른 입자에 의하여 압착되어 눌린 모습을 확인할 수가 있었으며 전체적인 모습은 구가 아닌 다면체의 형태를 가지고 있었다.As shown in FIG. 1A, the rice starch had a crushed shape when the whole starch particle was treated at an ultrahigh pressure, and the degree was increased as the pressure was increased. In case of corn starch (FIG. 1B) and potato starch (FIG. 1C), the surface of the starch particles was pressed and pressed by the surrounding particles when the ultrahigh pressure was treated. The overall appearance was a polyhedron rather than a sphere. there was.

결론적으로 물을 첨가하지 않고 초고압을 처리한 전분의 입체구조가 압력에 따라 많이 변형되었음을 확인하였고 이에 따라 전분입자 표면이 물리적인 충격에 의하여 보다 효소의 작용을 받기 쉬운 상태인 것으로 예상되었다. 따라서 하기 실험에서는 초고압 처리한 전분을 기질로 하여 알파-아밀라아제와 풀룰라나아제의 가수분해 속도를 측정하였으며 이로부터 초고압이 동력학적 매개변수(kinetic parameters)에 어떠한 영향을 미치는지 조사하였다.
In conclusion, it was confirmed that the three-dimensional structure of the starch treated with ultra high pressure without adding water was deformed much according to the pressure. Therefore, in the following experiments, the hydrolysis rates of alpha-amylase and pullulanase were measured using ultra-high pressure starch as a substrate, and the effects of ultra high pressure on kinetic parameters were investigated.

<< 실시예Example 2> 2>

초고압 전처리에 따른 According to ultra high pressure pretreatment 생전분에In raw starch 대한 알파- For alpha- 아밀라아제의Amylase 가수분해 특성 Hydrolysis characteristics

초고압 전처리가 생전분에 대한 알파-아밀라아제(porcine pancreatic α-amylase: PPA)의 가수분해 반응에 미치는 영향을 규명하기 위하여, 생전분을 <실시예 1>에서와 같이 초고압 처리한 후, 이를 기질로 사용하여 알파-아밀라아제의 반응 속도를 다음과 같은 방법으로 구하였다.In order to investigate the effect of ultra high pressure pretreatment on the hydrolysis of alpha-amylase (PPA) on raw starch, raw starch was treated as ultra high pressure as in <Example 1> The reaction rate of alpha-amylase was determined by the following method.

먼저 초고압 전처리한 생전분(감자, 옥수수, 쌀 전분)의 입자표면에 존재하는 잔여물질을 제거하기 위하여 생전분을 증류수로 세척하여 필터(#40, Whatman)로 여과한 후 100mL 삼각 플라스크에 세척한 생전분을 건량 기준으로 각각 0.5, 1, 2, 5g씩 넣고, 6mM NaCl을 포함한 0.1M 인산완충용액(pH 6.9) 45mL과 혼합한 후 shaking water bath(TS 1400, 태성과학)에서 각 온도에서 100rpm에서 먼저 5분간 가온하였다. 가온 후 일정량의 효소액(알파-아밀라아제)을 투여하고 미생물의 증식을 막기 위해서 Thymerosal (T5125, Sigma)을 1:10,000(w/v)비율로 첨가하여 최종 부피를 50mL로 맞추었다. 반응온도는 37℃를 유지하였으며 반응을 시작한 후 시간별(0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6min)로 200μL씩 샘플링을 하였다. 50% 에탄올을 800μL 첨가하여 효소 반응을 정지시킨 후 10,000rpm에서 3분간 원심분리 시켜 얻은 상등액의 환원당 양을 측정하였다. 환원당 정량은 Copper bicinchoninate 방법을 이용해 측정하였다. 즉, 증류수에 15배 희석한 상등액과 Copper bicinchoninate 시약 A와 B를 1:1 비율로 혼합한 발색액을 혼합한 후 80℃ 35분간 반응시켜 ELISA Reader(Microplate reader-MQX200R, BioTeck, USA)를 이용하여 565nm의 파장에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과로부터 말토오스를 표준물질로 환원당을 정량하였다. 효소의 반응속도는 단위시간 동안 생성된 환원당의 양으로부터 SigmaPlot을 사용하여 계산하였다. First, raw starch was washed with distilled water, filtered through a filter (# 40, Whatman), and then washed in a 100 mL Erlenmeyer flask in order to remove residual substances on the surface of raw starch (potato, corn, rice starch) that was ultra-high pressure pretreated. Add 0.5, 1, 2, and 5 g of raw starch, respectively, and mix with 45 mL of 0.1 M phosphate buffer solution (pH 6.9) containing 6 mM NaCl, and then 100 rpm at each temperature in shaking water bath (TS 1400, Taesung Science). First warmed for 5 minutes. After warming, a certain amount of enzyme solution (alpha-amylase) was administered and Thymerosal (T5125, Sigma) was added at a ratio of 1: 10,000 (w / v) to prevent the growth of microorganisms, thereby adjusting the final volume to 50 mL. The reaction temperature was maintained at 37 ℃ and after the start of the reaction was sampled by 200μL hourly (0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6min). 800 μL of 50% ethanol was added to stop the enzyme reaction, and then the amount of reducing sugar in the supernatant obtained by centrifugation at 10,000 rpm for 3 minutes was measured. Reducing sugar quantification was measured using the Copper bicinchoninate method. In other words, the supernatant diluted 15-fold in distilled water and the coloring solution mixed with copper bicinchoninate reagents A and B in a 1: 1 ratio were mixed and reacted at 80 ° C for 35 minutes using an ELISA Reader (Microplate reader-MQX200R, BioTeck, USA). The absorbance was measured at a wavelength of 565 nm, and the reducing sugar was quantified using maltose as a standard from the result. The reaction rate of the enzyme was calculated using SigmaPlot from the amount of reducing sugar produced during the unit time.

그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, 생전분의 초고압 전처리가 효소반응속도의 증가에 매우 중대한 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 즉 초고압 처리한 생전분의 반응속도가 초고압 처리하지 않은 대조군에 비하여 2.1배 내지 9.5배 정도 증가하였으며, 따라서 도 3의 double reciprocal plots에서 기울기가 많이 감소한 것으로 나타났다. 도 3의 결과로부터 동력학적 매개변수 중 효소반응 최대속도(Vm, y-절편의 역수)는 초고압 처리한 생전분과 대조군의 차이가 없으나 Michaelis 상수(Km, x-절편의 역수× -1)는 초고압 처리한 생전분의 경우 대조군에 비하여 급격히 감소하는 것을 확인하였으며 이는 효소와 용이하게 결합할 수 있는 기질의 농도가 증가하였음을 의미한다. 처리한 압력에 따라 반응속도가 약간씩 증가하였으나 그 차이가 크지 않아 2000기압에서도 충분한 효과가 있는 것으로 확인되었다.As a result, as shown in Figure 2, it was confirmed that ultra-high pressure pretreatment of raw starch has a very significant effect on the increase of the enzyme reaction rate. That is, the reaction rate of the ultra high pressure treated starch was increased by 2.1 times to 9.5 times compared to the control that was not subjected to the ultra high pressure, and therefore, the slope was greatly reduced in the double reciprocal plots of FIG. 3. From the results of FIG. 3, the maximum rate of enzymatic reaction (Vm, reciprocal of y-section) of the kinetic parameters was not different between the ultrahigh pressure treated starch and the control group, but the Michaelis constant (Km, reciprocal of x-section × 1) was very high pressure. The treated raw starch was found to decrease rapidly compared to the control group, which means that the concentration of the substrate that can easily bind to the enzyme was increased. The reaction rate slightly increased with the pressure, but the difference was not significant.

또한 초고압 전처리과정을 거친 전분에 알파-아밀라아제를 처리한 후 전분의 표면구조를 분석하기 위하여 주사전자현미경으로 가수분해된 전분입자의 표면구조를 관찰하였다. 효소 반응이 종료된 전분을 여과한 뒤 증류수로 수차례 세척하여 잔존 효소 및 이온물질들을 충분히 제거한 후 동결 건조하여 시료로 사용하였다. 각각의 전분 시료는 금막을 입히는 전처리과정을 거친 뒤 주사전자현미경(FM-SEM, S-4300SE, Hitachi Ltd., Japan)으로부터 사진을 얻었다.In addition, the surface structure of the starch particles hydrolyzed by scanning electron microscope was examined to analyze the surface structure of the starch after alpha-amylase treatment. After the enzyme reaction was completed, the starch was filtered and washed several times with distilled water to sufficiently remove residual enzymes and ionic substances, and then lyophilized to use as a sample. Each starch sample was taken from a scanning electron microscope (FM-SEM, S-4300SE, Hitachi Ltd., Japan) after pretreatment with gold film.

그 결과 도 4에서 나타낸 바와 같이, 세 가지 전분 모두 초고압 처리한 전분에서 표면의 침식이 많이 진행되었음을 확인할 수 있었으며 특히 옥수수전분의 경우 침식과 더불어 입자에 균열이 생겨 전체적인 구조가 많이 변형된 것으로 나타났다. 쌀전분(도 4A)의 경우 초고압을 처리한 경우 입자의 전체구조가 많이 쭈그러진 상태로 되며 효소를 처리하였을 때 표면이 다소 거칠어지는데 초고압을 처리하지 않은 대조군의 경우보다 그 정도가 심한 것으로 나타났다. 옥수수전분(도 4B)의 경우 초고압 처리된 전분의 표면구조가 효소의 반응에 의하여 가장 심하게 변형된 것으로 확인되었으며 표면의 구멍이 넓어지고 균열이 생기며 일부분이 부스러지는 모습이 전반적으로 관찰되어 일부 부분적인 침식이 일어난 대조군의 경우보다 변형정도가 매우 심하였다. 감자전분(도 4C)은 세 전분 중에서 그 크기가 가장 큰 전분으로 옥수수전분보다 침식의 정도는 약하였으나 대조군에 비하여 표면이 좀 더 거칠어진 것을 확인할 수 있었다.
As a result, as shown in Figure 4, all three starch was confirmed that the surface erosion proceeded much in the ultra-high pressure starch, especially in the case of corn starch appeared to be a lot of deformation due to the cracks in the particles along with the erosion. In the case of rice starch (Fig. 4A), when the ultrahigh pressure was treated, the entire structure of the particles became crushed, and when the enzyme was treated, the surface became somewhat rough, which was more severe than that of the control without the ultrahigh pressure. In the case of corn starch (FIG. 4B), the surface structure of the ultra-high pressure starch was confirmed to be the most severely deformed by the reaction of the enzyme, and the pores of the surface were widened, cracked, and fragmented. The degree of deformation was more severe than that of the eroded control group. Potato starch (FIG. 4C) was the largest starch among the three starches. The degree of erosion was weaker than that of corn starch, but the surface was more rough than the control starch.

<< 실시예Example 3> 3>

초고압 전처리에 따른 According to ultra high pressure pretreatment 생전분에In raw starch 대한  About 풀룰라나아제의Pullulanase 가수분해 특성 Hydrolysis characteristics

초고압 전처리가 생전분에 대한 풀룰라나아제(pullulanase)의 가수분해 반응에 미치는 영향을 규명하기 위하여, 생전분을 <실시예 1>에서와 같이 초고압 처리한 후, 이를 기질로 사용하여 풀룰라나아제의 반응 속도를 다음과 같은 방법으로 구하였다.In order to investigate the effect of ultra high pressure pretreatment on the hydrolysis reaction of pullulanase on raw starch, the raw starch was subjected to ultra high pressure treatment as in <Example 1>, and then used as a substrate. The reaction rate of the agent was determined by the following method.

효소 반응액은 50mM 소듐 아세테이트 버퍼(pH 4.7)에 25mg/mL의 기질을 첨가하여 제조하였으며 이 용액을 45℃, 110rpm 으로 맞춰진 shaking water bath(JSSB-30T, JSR)에서 먼저 5분간 가온 한 후 반응용액 1mL당 1U의 풀룰라나아제를 첨가하여 반응을 시작하고 각 시간별로 샘플링을 하였다. 반응정지는 반응액과 동량의 100mM 염화나트륨을 사용하였으며, 이 후 10,000rpm에서 3분간 원심분리 시켜 상등액의 환원당 양을 측정하였다. 환원당의 측정은 Copper bicinchoninate 방법을 이용해 측정하였으며, 80℃, 35분간 반응시켜 ELISA Reader를 이용해 540nm에서 흡광도를 측정하였으며, 환원당의 함량은 말토오스를 기준물질로 사용하여 환산하였다. 측정된 데이터는 SigmaPlot Ver 11.2를 이용하여 분석하였다.The enzyme reaction solution was prepared by adding 25 mg / mL of substrate to 50 mM sodium acetate buffer (pH 4.7), and the solution was first warmed for 5 minutes in a shaking water bath (JSSB-30T, JSR) at 45 ° C and 110 rpm. Reactions were started by adding 1 U pullulase per mL of solution and sampled for each hour. The reaction was stopped using the same amount of 100mM sodium chloride and then centrifuged for 3 minutes at 10,000rpm to measure the amount of reducing sugar in the supernatant. Reducing sugar was measured using a copper bicinchoninate method, and absorbance was measured at 540 nm using an ELISA Reader at 80 ° C. for 35 minutes. The content of reducing sugar was converted using maltose as a reference. The measured data were analyzed using SigmaPlot Ver 11.2.

그 결과 도 5에서 나타낸 바와 같이, 초고압을 처리함에 따라 풀룰라나아제의 반응속도는 초고압처리 조건이 높아짐에 따라 전반적으로 증가하는 경향을 나타내었다. 즉 초고압 처리한 생전분의 반응속도가 초고압 처리하지 않은 대조군에 비하여 1.3배 내지 6.4배 정도 증가하였으며 처리한 압력에 따라 반응속도가 약간씩 증가하였으나 그 차이가 크지 않아 2,000기압에서도 충분한 효과가 있는 것으로 확인되었다.
As a result, as shown in FIG. 5, as the ultrahigh pressure was treated, the reaction rate of the pullulanase showed a general tendency to increase as the ultrahigh pressure treatment conditions were increased. In other words, the reaction rate of raw starch treated with ultra high pressure was increased by 1.3 times to 6.4 times compared to the control without ultra high pressure, and the reaction rate increased slightly depending on the treated pressure, but the difference was not so large that there was sufficient effect even at 2,000 atmosphere Confirmed.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.So far I looked at the center of the preferred embodiment for the present invention. It will be understood by those skilled in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. Therefore, the disclosed embodiments should be considered in an illustrative rather than a restrictive sense. The scope of the present invention is defined by the appended claims rather than by the foregoing description, and all differences within the scope of equivalents thereof should be construed as being included in the present invention.

Claims (10)

a) 전분에 압력을 처리하는 전처리 단계; 및
b) 상기 전처리된 전분에 효소를 가하는 단계를 포함하는 전분 가수분해방법.a) pretreatment step of subjecting the starch to pressure; And
b) a starch hydrolysis method comprising adding an enzyme to the pretreated starch. 제1항에 있어서,
상기 전분은 물을 첨가하지 않은 생전분으로서 쌀전분, 밀전분, 보리전분, 옥수수전분, 감자전분, 고구마전분, 카사바전분 및 타피오카전분으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 전분 가수분해방법.The method of claim 1,
The starch is a starch hydrolysis method, characterized in that one kind selected from the group consisting of rice starch, wheat starch, barley starch, corn starch, potato starch, sweet potato starch, cassava starch and tapioca starch as no water added. 제1항에 있어서,
상기 압력은 1기압 이상인 것을 특징으로 하는 전분 가수분해방법.The method of claim 1,
The pressure is starch hydrolysis method, characterized in that more than 1 atmosphere. 제1항에 있어서,
상기 효소는 알파-아밀라아제, 베타-아밀라아제, 글루코아밀라아제 및 탈분지효소로 이루어진 군으로부터 선택된 단독 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 전분 가수분해방법.The method of claim 1,
The enzyme is a starch hydrolysis method, characterized in that the single or mixture thereof selected from the group consisting of alpha-amylase, beta-amylase, glucoamylase and debranching enzyme. 제4항에 있어서,
상기 탈분지효소는 풀루라나아제(pullulanase)인 것을 특징으로 하는 전분 가수분해방법.5. The method of claim 4,
The debranching enzyme is a starch hydrolysis method, characterized in that pullulanase (pullulanase). 제1항에 있어서,
상기 b) 단계는 효소로 알파-아밀라아제, 베타-아밀라아제, 글루코아밀라아제 및 탈분지효소로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 동시에 또는 순차적으로 가하는 단계인 것을 특징으로 하는 전분 가수분해방법.The method of claim 1,
The step b) is a starch hydrolysis method, characterized in that the step of simultaneously or sequentially adding one or more selected from the group consisting of alpha-amylase, beta-amylase, glucoamylase and debranching enzyme as an enzyme. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 b) 단계는 20℃ 이상의 온도조건에서 가수분해가 이루어지는 것을 특징으로 하는 전분 가수분해방법.7. The method according to any one of claims 1 to 6,
The step b) is a starch hydrolysis method characterized in that the hydrolysis is carried out at a temperature condition of 20 ℃ or more. 삭제delete 삭제delete a) 전분에 압력을 처리하는 전처리 단계;
b) 상기 전처리된 전분에 효소를 가하여 올리고당을 생산하는 단계; 및
c) 상기 올리고당을 발효시켜 에틸알코올을 생성하는 단계를 포함하는 바이오연료 제조방법.a) pretreatment step of subjecting the starch to pressure;
b) adding an enzyme to the pretreated starch to produce oligosaccharides; And
c) fermenting the oligosaccharides to produce ethyl alcohol.
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