KR101294808B1

KR101294808B1 - 휴믹산을 활성성분으로 포함하는 증균용 조성물을 이용한 증균 방법

Info

Publication number: KR101294808B1
Application number: KR1020110027117A
Authority: KR
Inventors: 허교; 손지영; 장경수; 나동희
Original assignee: 손지영; 허교
Priority date: 2011-03-25
Filing date: 2011-03-25
Publication date: 2013-08-08
Also published as: KR20120108795A

Abstract

본 발명은 천연 휴믹 물질(Natural Humic substances)에서 추출한 휴믹산의 증균 효과에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 천연 휴믹 물질(Natural Humic substances)에 추출한 휴믹산을 활성 성분으로 포함하는 증균용 조성물을 이용한 증균방법에 관한 것이다. 본 발명은 Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium 및 E. coli로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 균을 ml당 10⁵cell로 희석한 균액과 휴믹산을 1%, 0.1% 및 0.01% 농도로 포함하는 증균용 조성물을 1:99의 비율로 혼합하여 10시간 동안 반응시킨 후, 배지에 상기 반응액을 도말하여 배양하는 것을 특징으로 하는 증균 방법을 제공한다.본 발명에 의하면 휴믹산이 증균 및 세포배양에 효과가 있는 것으로 확인되어 백신 개발 등에 도움을 줄 수 있는 증균용 조성물을 증균 방법을 제공할 수 있는 장점이 있다.

Description

휴믹산을 활성성분으로 포함하는 증균용 조성물을 이용한 증균 방법{Bacterial Enrichment Method Of Using Bacterial Enrichment Composition Comprising Humic Acid}

본 발명은 천연 휴믹 물질(Natural Humic substances)에서 추출한 휴믹산의 증균 효과에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 천연 휴믹 물질(Natural Humic substances)에 추출한 휴믹산을 활성 성분으로 포함하는 증균용 조성물을 이용한 증균 방법에 관한 것이다.

1928년에 Fleming이 페니실린을 처음 발견하였을 때 페니실린은 거의 모든 박테리아를 죽일 수 있는 능력을 가지고 있었다. 하지만 1960년도에 들어서부터 전 세계적으로 내성균이 출현하기 시작하였다. 약의 오용, 감염 질병에 약한 고령인구와 어린이의 증가, AIDS와 암과 장기이식 등으로 면역력이 저하된 환자가 증가하고 있어 항생제 내성균 출현과 빠른 확산은 큰 문제가 되고 있다. 현재 중요한 사람 병원균들은 항생제 내성을 가지고 있으며 간혹 거의 모든 약에서 내성을 보이는 경우도 있다. 이러한 항생제 내성 세균의 확산과 항생제 사용 후 오랫동안 약의 활성이 남는 잔류 때문에 항생제 대체 물질에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다.

항생제 대체물질로는 생균제, 항산화제, 산성화제, 면역조절 및 증강물질, 기능성 천연추출물 등이 있다. 생균제는 세균억제화합물 생성과 숙주의 면역 반응을 강화, 소화효소 생성에 따른 숙주의 영양 강화를 통하여 병원성 세균을 경쟁적으로 억제한다.

항산화제는 산소의 작용에 의한 자동 산화를 방지하는 물질로 염증의 원인 물질을 억제하고 활성 산소로 인한 조직손상을 완화시킨다. 면역증강물질은 식균 작용과 면역정보 전달 기능이 있는 대식세포를 증식시키고 항체생성과 관련 있는 비장세포를 증식시켜 숙주를 강화시키는 작용을 한다.

이 중 천연물질은 인체에 적용했을 때 합성물질보다 부작용이 적고 독성이 적어 생체에 안정한 장점이 있으며 천연물질을 이용하면 항균제 개발비용과 기간이 단축되어 최근 새로운 내성이 발생하는 속도가 항생제 개발 속도를 앞지르게 되어 치료약이 없는 내성균이 발생되는 문제를 해결할 수 있다. 이러한 장점으로 최근 천연 항균물질에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

의약품뿐만 아니라 인체에 무해한 살충제, 살균제와 같은 생활용품과 화장품, 최근 소비자들의 생활수준의 향상과 건강에 대한 관심이 고조됨에 따라 식품에서의 천연 보존료를 선호하게 되어 천연항균성물질 연구와 개발이 급증하게 되었다.

천연 휴믹 물질(Natural Humic substances)은 토양에서 유기물질의 침식 생성물로 형성되며, 보통 자연환경의 토양, 물, 퇴적물, 석탄, 이탄 등에서 발견된다. 천연 휴믹 물질은 진한 색을 가진 3차원 구조의 무정형 복합물로, 금속과 무기물질을 킬레이트 할 수 있는 중합 페놀 물질을 포함한다. 천연 휴믹 물질은 자연환경에서 무기, 유기 화합물을 연결하는 중요한 역할을 한다. 천연 휴믹 물질의 흡착능력은 주변 사슬에 방향족, 하이드록실기, 카르보닐기, 카르복실기, 아민기, 설프히드릴기 등이 포함되어 있어 다양한 성질과 다양한 구조를 갖기 때문이라고 추측되어진다. 알칼리 수용액인 천연 휴믹 물질은 산에서의 용해성 차이에 의해서 Fulvic acid(풀빅산)와 Humic acid(휴믹산)로 분리할 수 있다. Fulvic acid(풀빅산)는 산에서 녹으나 Humic acid(휴믹산)는 산에서 녹지 않는다.

Humic acid(휴믹산)는 식물의 잔재물이 퇴적되어 수천만년 동안 미생물이나 효소, 곰팡이류나 원충 등에 의하여 발효, 유기촉매, 물질 전환 작용을 반복하는 과정을 거친 퇴적층에서 캐내며 다기능, 다관능의 작용을 갖는 소재로서 축산. 수산동물의 생산성 향상뿐만 아니라 농업, 원예식물의 생육개선, 나아가서는 인간의 건강증진에까지 폭넓게 유효기능을 갖는 뛰어난 화학적 합성제의 대체물이다.

Fulvic acid(풀빅산)는 토양에 많이 축적되어 있는 부식물질의 일부로 유용미생물의 작용에 의하여 만들어진 저분자량의 산이다. 생물활성이 높고 분자구조 중에 미네랄과 요소와 쉽게 결합하는 능력을 가진다. Fulvic acid는 표면장력이 낮아 침투력이 있어 소화흡수력을 높여 영양흡수를 개선하여 혈액 순환을 조장하고 심장에 부담을 주지 않고 정신을 안정시켜 스트레스를 적게 하며, 세포내의 독소배출을 촉진한다. 또한 병원성 세균, 바이러스, 독성물질의 구성분자 단백질, 탄수화물의 성분을 분해, 키레이트 결합하여 체외로 배출하는 기능이 있다.

풀빅산은 일반적으로 휴믹산보다 물에서 더 풍부하고 산소를 포함하는 기를 더 많이 가진다. 또한 휴믹산보다 분자량이 작고, 총 산도와 carboxyl value가 더 높다. 풀빅산은 병원성 세균, 바이러스, 독성물질의 구성분자 단백질, 탄수화물의 성분을 분해하는 기능이 있다. 풀빅산은 세균과 진균의 발육 체계에서 세균과 진균의 수는 감소하는 경향이 있지만, 휴믹산은 진균의 균사체의 집락화와 생산 경로에 자극을 준다.

이러한 물질의 특성을 고려하여 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 휴믹산의 증균효과를 실험하여 세포배양에 효과가 있는지 확인하여 백신 개발 등에 도움을 줄 수 있는 증균용 조성물을 이용한 증균방법을 제공하는 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은
Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecium 및 E. coli로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 균을 ml당 10⁵cell로 희석한 균액과
휴믹산을 1%, 0.1% 및 0.01% 농도로 포함하는 증균용 조성물을
1:99의 비율로 혼합하여 10시간 동안 반응시킨 후, 배지에 상기 반응액을 도말하여 배양하는 것을 특징으로 하는 증균 방법을 제공하다.

본 발명에 의하면 휴믹산이 증균 및 세포배양에 효과가 있는 것으로 확인되어 백신 개발 등에 도움을 줄 수 있는 증균용 조성물을 이용한 증균 방법을 제공할 수 있는 장점이 있다.

도 1: 저농도 humic acid (휴믹산)에서 Salmonella typhimurium의 시간별 증균효과에 대한 도면.
도 2: Gram 양성균과 그람음성균에 대한 휴믹산의 증균효과에 대한 도면.
E: Gram-positive bacteria,
F: Gram-positive antibiotics-resistant bacteria,
G: Gram-negative bacteria,
H: Gram-negative antibiotics-resistant bacteria

1. 물질 및 방법

(1) 천연 휴믹 물질로부터 풀빅산과 휴믹산의 추출 및 정제

천연 휴믹 물질로부터 fulvic acid (풀빅산)와 humic acid (휴믹산)의 추출은 국제적인 학회인 International Humic Substances Society (I천연 휴믹 물질)에서 정한 추출법에 따라 실시하였다. 휴믹산와 풀빅산의 추출은 강염기(NaOH, pH 10)로 처리후 강산 (HCl, pH 1)에서 humic acid를 침전시켜 용존하고 있는 풀빅산을 분리하며 분리된 풀빅산은 흡착크로마토그래피와 양이온교환수지 크로마토그래피 및 투석을 이용하여 정제 추출하였다. 그리고 HNC로부터 풀빅산와 휴믹산의 최적의 추출조건은 I천연 휴믹 물질법을 기반으로 ion-pairing 방법(Fukushima et al., 2006)을 적용하여 확립하였으며, 물성에 따른 각 분획을 효율적으로 분리 정제할 수 있는 양이온교환수지 및 흡착 크로마토그래피 시스템을 이용하여 추출된 풀빅산와 휴믹산을 분석한 후 본 연구에 공시하였다.

(2) 박테리아 배양 및 균주( Bacterial culture and strains )

본 실험의 대표적인 병원성 세균으로는 식중독 및 설사증을 유발하는 Salmonella typhimurium (Sal. typhimurium)을 공시하였으며 증균배지 및 선택배지로는 brain heart infusion (BHI) broth와 XLD agar, MacConkey agar를 이용하였으며 그람양성균으로는 Staphylococcus aureus와 Enterococcus faecium을 공시하였으며 Staphylococcus aurues (SA)의 증균배지 및 선택배지로는 BHI broth와 5% sheep blood가 함유된 blood agar, mannitol salt agar (MSA) 를 Enterococcus faecium의 증균배지로는 blood agar와 BHI broth를 사용하였다. 그람양성 항생제 내성균으로는 methicillin-resistant SA (MRSA)와 vancomycin-resistant Enterococcus faecium (VRE)를 공시하였다. 다른 그람음성균으로는 E. coli를 그람음성 항생제 내성균으로는 imipenem-resistant Acinetobacter baumannii (IRA)를 공시하였다.

(3) 저농도 humic acid ( 휴믹산 )에서 Salmonella typhimurium 의 시간별 증균효과

BHI broth에서 Salmonella typhimurium를 24시간 배양한 후 배양액을 10⁴배 희석한 균희석액(10⁴개/100μL)을 만든다. 추출된 Humic acid powder를 1%, 0.1%, 0.01% 농도로 saline에 녹인다. 균 희석액 10μL와 Humic acid 990μL를 99:1의 비율로 반응시켜 시간대 별로 1시간 후, 3시간 후, 5시간 후, 10시간 후, 24 시간 후에 XLD배지에 각각의 반응액을 100μL 분주 후 유리봉을 이용하여 도말한다. 35℃에서 24시간 배양 후 colony count를 한다.

(4) 그람양성, 음성 세균 및 항생제 내성세균에 대한 휴믹산의 증균효과

BHI broth에서 배양된 공시된 그람양성세균, 그람음성세균, MRSA, VRE, IRA를 ml당 10⁵cell로 희석한 균액과 1%, 0.1%, 0.01% 농도로 희석된 풀빅산와 휴믹산을 1:99의 비율로 첨가하여 10시간 동안 반응시킨 후, 각각의 선택배지에 각각의 반응액을 100μL 분주 후 유리봉을 이용하여 도말한 후 35℃에서 24시간 배양 후 colony count하여 균수를 측정하였다.

2. Results

(1) Fulvic acid 와 humic acid 의 추출 및 정제법

천연 휴믹 물질법으로 추출정제된 풀빅산와 휴믹산을 HPLC로 분석한 바, 휴믹산은 공시된 Sigma사의 휴믹산와 일치하는 pattern을 보여 HNC에서 추출된 휴믹산만 순수하게 분리되었음이 확인되었으며 휴믹산을 정량하기 위해 표준 휴믹산을 농도별로 분획하여 peak값을 계산한 바, 추출정제된 휴믹산의 함량을 정량할 수 있게 되었다. 또한 추출정제된 풀빅산은 두 개의 peak를 나타내는 물질로 휴믹산의 다일 pattern과는 다른 양상을 보였다. 본 연구에서는 HNC로부터 추출정제된 휴믹산와 풀빅산을 동결건조한 후 이를 농도별로 다시 용해하여 항균효과 및 증균효과를 알아보았다.

(2) 저농도 Humic acid 에서 Salmonella typhimurium 의 시간별 증균효과

Humic acid와 Salmonella typhimurium을 반응 후 즉시 도말 하였을 때와 1시간 반응 후 도말 하였을 때는 0.01%, 0.1%, 1% 휴믹산에서 거의 10%의 증가율을 보였고, 3시간 반응에서는 0.01% 휴믹산은 3%, 0.1% 휴믹산은 70%, 1% 휴믹산에서는 133%가 증가 하였다. 5시간 반응에서는 0.01% 휴믹산은 91%, 0.1% 휴믹산은 116%, 1% 휴믹산에서는 164%의 증가율을 보였고 10시간 반응에서는 0.01% 휴믹산은 795%, 0.1% 휴믹산은 1419%, 1% 휴믹산에서는 2720% 증가하여 100%가 훨씬 넘는 증가를 보였다. 24시간 반응에서는 0.01% 휴믹산은 437%, 0.1% 휴믹산은 816%, 1% 휴믹산에서는 1573%의 증가율을 보여 Humic acid의 증균효과에서는 10시간 반응을 하였을 때가 가장 효과가 좋은 것으로 나타났다(도 1 참조).

(3) Gram 양성균과 그람음성균에 대한 휴믹산의 증균효과

휴믹산의 농도별 세균의 증균효과를 알아보기 위해 농도별로 공시한 그람양성세균과 그람음성세균을 혼합하여 10시간 반응 후 도말하여 증균효과를 관찰한 바, 그람 양성균인 S. aureus는 0.01% 휴믹산 농도에서 18%의 증가를 보였으나 0.1%와 1%에서는 250% 이상의 증균효과를 나타내었다. E. faecium은 0.01% 휴믹산 농도에서 약간의 감소를 보였으나 0.1%와 1%에서 63%와 98%의 증균효과를 보였다. 그리고 항생제 내성균인 MRSA에서는 0.01%, 0.1% 그리고 1% 휴믹산 농도에서 81%, 162%, 그리고 131%의 증가율을 보여 항생제 내성균인 MSSA보다는 낮은 증균효과를 나타내었다. 그리고 VRE에서도 모든 농도에서 20%~30%의 증균효과를 나타내어 항생제 감수성인 세균보다는 증균율이 다소 낮게 나타났다. 그람 음성균인 E.coli는 휴믹산 0.01%에서 9%, 0.1%에서 20% 그리고 1% 휴믹산에서 104%가 증가하였고, A. baumannii는 휴믹산 0.01%에서 95%, 0.1%와 1% 휴믹산에서 300%이상의 증가를 보여 가장 높은 증균효과를 보였다(도 2 참조)

3. Discussion

항생제 내성균의 빠른 확산은 어느 나라에서나 큰 문제가 되고 있다. 약의 오용, 감염질병에 약한 고령인구와 어린이의 증가, AIDS와 암과 장기이식 등으로 면역력이 저하된 환자가 증가하고 있어 이 문제는 더욱 심각해지고 있다. 현재 중요한 사람 병원균들은 항생제 내성을 가지고 있으며 간혹 거의 모든 약에서 내성을 보이고 있는 경우도 있다.

항생제 내성균이 늘어갈수록 항생제의 개발 및 연구도 활발하게 이루어지고 있으나 합성물질은 항생제 개발에 많은 비용이 들고 시간도 오래 걸려 빠르게 내성균으로 변화하고 있는 병원균을 치료하기에 어려움이 있다. 또한 합성물질은 인체에 사용했을 때 안정성을 확보할 수 없으며 부작용이 많다는 단점이 있다.

그리하여 본 연구는 인체에 무해하고 부작용이 적은 천연물질인 Humic acid(휴믹산)를 사용하여 실험을 진행하였다.

Humic Acid는 다기능, 다관능의 작용을 갖는 소재로서 축산. 수산동물의 생산성 향상뿐만 아니라 농업, 원예식물의 생육개선, 나아가서는 인간의 건강증진에 까지 폭넓게 유효기능을 갖는 뛰어난 화학적 합성제의 대체물로서 이번 연구에서 Humic Acid는 증균효과를 가지고 있는 것이 확인되어 앞으로 백신개발 등에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Claims

Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus 및 Enterococcus faecium로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 균을 ml당 10⁵cell로 희석한 균액과
휴믹산을 1% 또는 0.1% 또는 0.01% 농도로 포함하는 증균용 조성물을
1:99의 비율로 혼합하여 10시간 동안 반응시켜 반응액을 제조한 후,
배지에 상기 반응액을 도말하여 배양하는 것을 특징으로 하는 증균 방법.