KR101294742B1 - Method for producing aloe adventitious root with increased medical active material - Google Patents
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Abstract
본 발명은 알로에 식물 절편을 살균한 후 식물성장 호르몬을 포함하는 배지에 치상하여 부정근을 유도하고 고체 또는 액체 배지에서 증식시키는 단계를 포함하는 알로에 부정근의 제조 방법 및 약리활성물질이 증가된 알로에 부정근의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 알로에 에모딘 또는 알로에신이 증가된 알로에 부정근을 제공한다.The present invention provides a method for preparing aloe vera roots and the pharmacologically active substance of the aloe roots, which comprises a step of sterilizing the aloe plant sections and inducing the root muscles to grow on a medium containing plant growth hormone and propagating in a solid or liquid medium. The method of preparation and the aloe eminine or aloesin produced by the method provide increased aloe roots.
Description
본 발명은 약리활성물질이 증가된 알로에 부정근의 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 알로에 식물 절편을 살균한 후 식물성장 호르몬을 포함하는 배지에 치상하여 부정근을 유도하고 고체 또는 액체 배지에서 증식시키는 단계를 포함하는 알로에 부정근의 제조 방법 및 약리활성물질이 증가된 알로에 부정근의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 알로에 에모딘 또는 알로에신이 증가된 알로에 부정근에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing aloe agonist with increased pharmacologically active substance, and more particularly, to sterilize aloe plant sections and instill it in a medium containing plant growth hormone to induce the root muscle and proliferate in a solid or liquid medium. The present invention relates to a method for preparing aloe vera roots and a method for producing aloe vera roots with increased pharmacologically active substances, and to aloe endosperm roots with aloe emodin or aloesin produced by the method.
알로에 베라(Aloe vera)는 다년생 초본으로 백합과에 속한다. 약 500여종의 알로에 종이 존재하지만 약성으로 쓰이는 알로에는 약 5종으로 알로에 베라(Aloe vera), 알로에 아보레센스(Aloe arborescens), 알로에 사포나리아(Aloe saponaria), 알로에 페리(Aloe perryi), 알로에 페록스(Aloe ferox) 만이 약용으로서 사용되고 있다(Park YI, Lee SK (2006) New perspectives on aloe. Springer Verlag). 그 중 알로에 베라(Aloe vera)는 상업적이나 약용으로서 사용되는 대표적인 알로에 종으로 여러 약리활성물질이 있다고 알려져 있는데 특히 안트라퀴논(anthraquinone) 계통 물질의 알로에 에모딘(Aloe emodin)은 항암, 항염, 항균 효과가 뛰어나다고 알려져 있다(He et al. (2005) Food control 16: 95-104).Aloe vera (Aloe vera ) is a perennial herb and belongs to the family Liliaceae. There are about 500 kinds of aloe species, but about 5 kinds of aloe are used as medicinal aloe vera ( Aloe) vera), aloe ahbore sense (Aloe arborescens ), Aloe saponaria saponaria ), Aloe ferry ( Aloe perryi), aloe Tenerife Rocks (Aloe ferox ) is used as a medicinal agent (Park YI, Lee SK (2006) New perspectives on aloe.Springer Verlag). Those of Aloe vera (Aloe vera) is known that a number of pharmacologically active substances in a typical Aloe species is used as a commercial or medicinal especially anthraquinone (anthraquinone) emodine (Aloe emodin) in aloe of the grid material is anti-cancer, anti-inflammatory, antibacterial effect Is known to be excellent (He et al. (2005) Food control 16: 95-104).
하지만 알로에 베라는 재배한 지 3년 이상이 되어야 약성이 뛰어나며 주로 사용되는 알로에 잎 부분은 98% 이상이 물로 이루어져 있고 나머지 2%에서도 아주 적은 양의 부분만이 알로에가 가지는 약리활성물질을 포함하고 있다(Femenia et al. (1999) Carbohydrate polymers 39: 109-117). 게다가 노지 재배의 특성상 알로에가 가지는 약리활성물질 함량은 얼마든지 외부 환경에 의해 변화할 수 있다(Beppu et al. (2004) Biochemical systematics and ecology 32: 783-795). 따라서 알로에 베라의 약리성분을 안정적으로 꾸준히 얻기 위해서는 알로에 세포 배양을 통한 기내 배양이 필요하다.However, aloe vera has excellent medicinal properties after at least 3 years of cultivation, and the aloe leaf part, which is mainly used, is made up of more than 98% of water, and only 2% contains the pharmacologically active substance of aloe. (Femenia et al. (1999) Carbohydrate polymers 39: 109-117). In addition, due to the nature of cultivation of the open field, the content of aloe pharmacologically active substance can be changed by the external environment (Beppu et al. (2004) Biochemical systematics and ecology 32: 783-795). Therefore, in order to steadily obtain pharmacological components of aloe vera, in-flight culture through aloe cell culture is required.
최근 파낙스 진생(Panax ginseng), 히페리쿰 펄포라툼(Hypericum perforatum)과 같은 약용작물에서 세포 배양을 통해 약리활성물질을 안정적으로 공급하는 사례가 보고되고 있다(Ferrie AMR (2010) Annals of Botany 105: vii). 알로에의 여러 종에서 캘러스 유기에는 성공한 사례가 몇 차례 보고가 있었으나(Kawai et al. (1993) Phytotherapy Research 7: S5-S10), 액체 현탁 배양을 통해 약리활성물질을 안정적으로 생산하였다는 사례가 보고되지 않았으며, 더욱이 알로에 종에서 부정근 배양을 통해 약리활성물질을 생산한 사례는 알려진 바가 없다. Recently Panax Ginseng (Panax ginseng ) and medicinal crops such as Hypericum perforatum have been reported to stably supply pharmacologically active substances through cell culture (Ferrie AMR (2010) Annals of Botany 105: vii). There have been several reports of successful callus induction in several species of aloe (Kawai et al. (1993) Phytotherapy Research 7: S5-S10), but there have been reports of stable production of pharmacologically active substances through liquid suspension culture. In addition, there is no known case of pharmacologically active substance produced by culturing in the roots of aloe species.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 알로에 베라 어린 생주에서 부정근을 유기하였고 유기된 부정근의 고체 배지 배양 및 액체 현탁 배양에 성공하였으며 이를 이용하여 알로에 약리활성물질 중 알로에 에모딘(Aloe emodin)과 알로에신(Aloesin)을 안정적으로 공급받을 수 있는 방법을 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present invention was derived from the above requirements, and the present inventors have abolished the roots of young roots in aloe vera, and succeeded in solid medium culture and liquid suspension culture of the abandoned roots. The present invention was completed by developing a method for stably supplying Aloe emodin and Aloesin.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 알로에 식물 절편을 살균한 후 식물성장 호르몬을 포함하는 배지에 치상하여 부정근을 유도하고 고체 또는 액체 배지에서 증식시키는 단계를 포함하는 알로에 부정근의 제조 방법을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a method for producing aloe root muscles comprising sterilizing the aloe plant slices and inoculated into a medium containing plant growth hormone to induce the root muscles and to grow in a solid or liquid medium. .
또한, 본 발명은 알로에 식물 절편을 살균한 후 식물성장 호르몬을 포함하는 배지에 치상하여 부정근을 유도하고 고체 또는 액체 배지에서 증식시키는 단계를 포함하는 약리활성물질이 증가된 알로에 부정근의 제조 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for producing aloe vera roots with increased pharmacologically active substances, including sterilizing aloe plant sections and inducing the root muscles to grow on a medium containing plant growth hormone and propagating in a solid or liquid medium. do.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 알로에 에모딘 또는 알로에신이 증가된 알로에 부정근을 제공한다.In addition, the present invention provides aloe agonist with increased aloe emodine or aloesin prepared by the above method.
본 발명의 알로에 부정근의 제조법으로부터 부정근을 유도하고 고체 또는 액체 증식배지에서 증식시켜 최적의 기내배양 조건을 규명함으로써 알로에 대량생산 체계의 기초를 확립하였다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 알로에 부정근은 유용성분을 생산하는 알로에 식물 조직 배양 전략으로 그 이용가치가 높을 것이다.The basis of the aloe mass production system was established by deriving the root of the aloe from the aloe root of the present invention and growing in a solid or liquid growth medium to identify the optimal incubation conditions. The aloe abs roots prepared by the method of the present invention will be of high value for use as an aloe plant tissue culture strategy for producing useful ingredients.
도 1은 본 발명에 사용한 알로에의 부위를 나타낸다(F, 폭 1cm 미만의 어린 잎; Y, 노란색 잎 조직; G, 초록색 잎 조직; S, 잎 절편을 반으로 절개; W, 잎 절편을 그대로 이용).
도 2는 다양한 호르몬 조건에서 유기된 알로에 베라 부정근의 중량 변화를 나타낸다.
도 3은 0.5mg/L NAA 및 0.2mg/L BA가 포함된 B5, SH, 2MS, MS, 1/2MS 배지에서 알로에 베라 부정근의 중량 변화를 나타낸다.
도 4는 PVP 용액의 전처리를 통한 부정근 절편의 생존률을 나타낸다.
도 5는 알로에 베라에서 얻어진 부정근을 나타낸다 (A, 5주 후 0.5 mg/L NAA에서 유도된 부정근; B, 5주 후 1 mg/L NAA에서 유도된 캘러스 형태의 부정근; C, 6주 후 0.5mg/L NAA 및 0.2mg/L BA가 첨가된 MS배지에서 증식된 부정근; D, 6주 후 0.5mg/L NAA 및 0.2mg/L BA가 첨가된 SH배지에서 증식된 부정근).
도 6은 액체 현탁 배양에서 다양한 배지 조건에 따른 알로에 베라 부정근의 생체 무게를 나타낸다.
도 7은 액체 현탁 배양에서 다양한 호르몬 조건에 따른 알로에 베라 부정근의 생체 무게 변화를 나타낸다.
도 8은 알로에 부정근 배지에서 수크로스, NO3 및 PO4의 함량 패턴을 나타낸다.
도 9는 알로에 베라 부정근의 30 ml(A), 200 ml(B), 500 ml(C) 액체 현탁 배양을 나타낸다.Figure 1 shows the site of aloe used in the present invention (F, young leaves less than 1 cm in width; Y, yellow leaf tissue; G, green leaf tissue; S, cut in half the leaf slice; W, using the leaf slice as it is ).
2 shows the weight change of the aloe vera intestinal muscles that were induced under various hormonal conditions.
Figure 3 shows the weight change of Aloe Vera root muscle in B5, SH, 2MS, MS, 1 / 2MS medium containing 0.5 mg / L NAA and 0.2 mg / L BA.
Figure 4 shows the survival rate of the root muscle section through pretreatment of PVP solution.
FIG. 5 shows the abscess obtained from Aloe vera (A, inferior root induced at 0.5 mg / L NAA after 5 weeks; B, callus-formed atypical root induced at 1 mg / L NAA after 5 weeks; C, 0.5 after 6 weeks Nerve roots grown in MS medium with mg / L NAA and 0.2 mg / L BA; D, Nerve roots grown in SH medium with 0.5 mg / L NAA and 0.2 mg / L BA after 6 weeks.
6 shows the bio weight of aloe vera involuntary muscles according to various media conditions in liquid suspension culture.
Figure 7 shows the change in bio weight of Aloe Vera root muscle in accordance with various hormonal conditions in liquid suspension culture.
FIG. 8 shows sucrose, NO 3 in aloe malaria media And the content pattern of PO 4 .
Figure 9 shows 30 ml (A), 200 ml (B), 500 ml (C) liquid suspension cultures of Aloe Vera root muscle.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알로에 식물 절편을 살균한 후 식물성장 호르몬을 포함하는 배지에 치상하여 부정근을 유도하고 고체 배지 또는 액체 배지에서 증식시키는 단계를 포함하는 알로에 부정근의 제조 방법을 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention is a method for producing aloe root muscle comprising the step of sterilizing the aloe plant slices and injured in a medium containing plant growth hormone to induce the root muscle and proliferate in a solid medium or a liquid medium To provide.
본 발명의 알로에 식물은 알로에 베라(Aloe vera), 알로에 아보레센스(Aloe arborescens), 알로에 사포나리아(Aloe saponaria), 알로에 페리(Aloe perryi), 알로에 페록스(Aloe ferox) 일 수 있으며, 바람직하게는 알로에 베라(Aloe vera)이나, 이에 제한되지 않는다.Aloe plant of the present invention is aloe vera ( Aloe vera , Aloe arborescens , Aloe saponaria saponaria ), Aloe ferry ( Aloe perryi), aloe Tenerife Rocks (Aloe ferox ), preferably Aloe vera, but is not limited thereto.
상기 알로에 식물 절편은 어린 잎, 노란색 잎 또는 초록색 잎의 절편 또는 반으로 절개한 절편이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 20cm 이하의 어린 생주의 잎 중 빛을 받지 않은 노란색의 단단한 부분을 반으로 절개한 절편이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The aloe plant slices may be slices of young leaves, yellow leaves, or green leaves, or slices cut in half, and preferably cut in half of a hard, yellow part of the leaves of the young stem of 20 cm or less. One segment may be used, but is not limited thereto.
본 발명의 일 구현 예에 따른 부정근 유도 배지는 MS(Murashige & Skoog) 고체 배지이나, 이에 제한되지 않는다.Abdominal muscle-inducing medium according to an embodiment of the present invention is MS (Murashige & Skoog) solid medium, but is not limited thereto.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물성장 호르몬은 바람직하게는 NAA(1-naphthalene acetic acid) 및 BA(6-benzylaminopurine)의 조합일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.4 ~ 0.6mg/L NAA 및 0.1 ~ 0.3mg/L BA이며, 가장 바람직하게는 0.5mg/L NAA 및 0.2mg/L BA이다.Plant growth hormone according to an embodiment of the present invention may be preferably a combination of NAA (1-naphthalene acetic acid) and BA (6-benzylaminopurine), more preferably 0.4 ~ 0.6mg / L NAA and 0.1 ~ 0.3 mg / L BA, most preferably 0.5 mg / L NAA and 0.2 mg / L BA.
본 발명의 일 구현 예에 따른 부정근의 유도는 0.4 ~ 0.6mg/L NAA 및 0.1 ~ 0.3mg/L BA가 첨가된 완전히 굳히지 않은 MS 고체 배지에서 18~24일 동안 배양시킴으로써 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 0.5mg/L NAA 및 0.2mg/L BA가 첨가된 완전히 굳히지 않은 MS 고체 배지에서 21일 동안 배양시킴으로써 이루어질 수 있다.Induction of inferior root muscle according to an embodiment of the present invention may be made by incubating for 18 to 24 days in completely unsolidified MS solid medium to which 0.4 to 0.6 mg / L NAA and 0.1 to 0.3 mg / L BA are added. Preferably by incubating for 21 days in completely unsolidified MS solid medium with 0.5 mg / L NAA and 0.2 mg / L BA added.
본 발명의 일 구현 예에 따른 알로에 부정근의 증식을 위한 고체 배지는 B5 고체 배지이나, 이에 제한되지 않는다.Solid medium for propagation of aloe involuntary muscle according to an embodiment of the present invention is a B5 solid medium, but is not limited thereto.
본 발명의 일 구현 예에 따른 액체 배지에서 증식은 바람직하게는 0.2 ~ 0.4mg/L IBA(indole-3-butyric acid)가 첨가된 MS 액체 배지에서 현탁 배양하여 수행할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.3mg/L IBA가 첨가된 MS 액체 배지에서 현탁 배양하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Proliferation in the liquid medium according to an embodiment of the present invention is preferably carried out by suspension culture in MS liquid medium to which 0.2 ~ 0.4mg / L IBA (indole-3-butyric acid) is added, more preferably It may be carried out by suspension culture in MS liquid medium added with 0.3mg / L IBA, but is not limited thereto.
상기 현탁 배양은 상기 유도된 부정근을 PVP(polyvinylpyrrolidone)로 세척 후 40 ~ 60rpm에서 교반하여 배양시킬 수 있으며, 바람직하게는 50rpm에서 교반하여 배양시킬 수 있다. 본 발명의 PVP는 PVP10, PVP40 또는 PVP58이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The suspension culture can be cultured by stirring the induced root muscle with polyvinylpyrrolidone (PVP) at 40 ~ 60rpm, preferably by stirring at 50rpm. PVP10, PVP40 or PVP58 of the present invention may be used, but is not limited thereto.
본 발명의 현탁 배양을 위한 액체 배지는 2주 간격으로 교환해 주는데, 초기 배양 약 7일 후 수크로스 함량이 가장 많이 감소하여 약 14일 이후엔 단당류인 글루코스 및 프락토스로 변화되기 때문이다.The liquid medium for suspension culture of the present invention is exchanged every two weeks, since the sucrose content is most reduced after about 7 days of initial culture, and is changed to glucose and fructose, which are monosaccharides after about 14 days.
또한, 본 발명은In addition,
a) 알로에 식물 절편을 살균한 후 식물성장 호르몬을 포함하는 배지에 치상하여 부정근을 유도하는 단계; 및a) sterilizing the slices of aloe plants and instilling a root of root in a medium containing plant growth hormone to induce the root muscle; And
b) 상기 유도된 알로에 부정근을 고체 또는 액체 배지에서 증식시키는 단계를 포함하는 약리활성물질이 증가된 알로에 부정근의 제조 방법을 제공한다.b) provides a method for producing aloe vera roots with increased pharmacologically active substance comprising the step of propagating the induced aloe roots in solid or liquid medium.
또한, 본 발명은In addition,
a) 알로에 식물 절편을 살균한 후 식물성장 호르몬을 포함하는 배지에 치상하여 부정근을 유도하는 단계;a) sterilizing the slices of aloe plants and instilling a root of root in a medium containing plant growth hormone to induce the root muscle;
b) 상기 유도된 알로에 부정근을 고체 또는 액체 배지에서 증식시키는 단계;b) propagating the induced aloe root in solid or liquid medium;
c) 상기 증식된 알로에 부정근에 전구물질을 처리하는 단계; 및 c) treating the proliferated aloe root with precursors; And
d) 상기 전구물질을 처리한 부정근에 SA(salicylic acid)를 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 약리활성물질이 증가된 알로에 부정근의 제조 방법을 제공한다.d) providing a method for preparing aloe vera roots with increased pharmacologically active substance, comprising the step of treating salicylic acid with SA.
상기 알로에 식물 절편은 어린 잎, 노란색 잎 또는 초록색 잎의 절편 또는 반으로 절개한 절편이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 20cm 이하의 어린 생주의 잎 중 빛을 받지 않은 노란색의 단단한 부분을 반으로 절개한 절편이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The aloe plant slices may be slices of young leaves, yellow leaves, or green leaves, or slices cut in half, and preferably cut in half of a hard, yellow part of the leaves of the young stem of 20 cm or less. One segment may be used, but is not limited thereto.
본 발명의 일 구현 예에 따른 부정근 유도 배지는 MS(Murashige & Skoog) 고체 배지이나, 이에 제한되지 않는다.Abdominal muscle-inducing medium according to an embodiment of the present invention is MS (Murashige & Skoog) solid medium, but is not limited thereto.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물성장 호르몬은 바람직하게는 NAA(1-naphthalene acetic acid) 및 BA(6-benzylaminopurine)의 조합일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.4 ~ 0.6mg/L NAA 및 0.1 ~ 0.3mg/L BA이며, 가장 바람직하게는 0.5mg/L NAA 및 0.2mg/L BA이다.Plant growth hormone according to an embodiment of the present invention may be preferably a combination of NAA (1-naphthalene acetic acid) and BA (6-benzylaminopurine), more preferably 0.4 ~ 0.6mg / L NAA and 0.1 ~ 0.3 mg / L BA, most preferably 0.5 mg / L NAA and 0.2 mg / L BA.
본 발명의 일 구현 예에 따른 부정근의 유도는 0.4 ~ 0.6mg/L NAA 및 0.1 ~ 0.3mg/L BA가 첨가된 완전히 굳히지 않은 MS 고체 배지에서 18~24일 동안 배양시킴으로써 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 0.5mg/L NAA 및 0.2mg/L BA가 첨가된 완전히 굳히지 않은 MS 고체 배지에서 21일 동안 배양시킴으로써 이루어질 수 있다.Induction of inferior root muscle according to an embodiment of the present invention may be made by incubating for 18 to 24 days in completely unsolidified MS solid medium to which 0.4 to 0.6 mg / L NAA and 0.1 to 0.3 mg / L BA are added. Preferably by incubating for 21 days in completely unsolidified MS solid medium with 0.5 mg / L NAA and 0.2 mg / L BA added.
본 발명의 일 구현 예에 따른 알로에 부정근의 증식을 위한 고체 배지는 B5 고체 배지이나, 이에 제한되지 않는다.Solid medium for propagation of aloe involuntary muscle according to an embodiment of the present invention is a B5 solid medium, but is not limited thereto.
본 발명의 일 구현 예에 따른 액체 배지에서 증식은 바람직하게는 0.2 ~ 0.4mg/L IBA(indole-3-butyric acid)가 첨가된 MS 액체 배지에서 현탁 배양하여 수행할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.3mg/L IBA가 첨가된 MS 액체 배지에서 현탁 배양하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Proliferation in the liquid medium according to an embodiment of the present invention is preferably carried out by suspension culture in MS liquid medium to which 0.2 ~ 0.4mg / L IBA (indole-3-butyric acid) is added, more preferably It may be carried out by suspension culture in MS liquid medium added with 0.3mg / L IBA, but is not limited thereto.
상기 현탁 배양은 상기 유도된 부정근을 PVP(polyvinylpyrrolidone)로 세척 후 40 ~ 60rpm에서 교반하여 배양시킬 수 있으며, 바람직하게는 50rpm에서 교반하여 배양시킬 수 있다.The suspension culture can be cultured by stirring the induced root muscle with polyvinylpyrrolidone (PVP) at 40 ~ 60rpm, preferably by stirring at 50rpm.
본 발명의 현탁 배양을 위한 액체 배지는 2주 간격으로 교환해 주는데, 초기 배양 약 7일 후 수크로스 함량이 가장 많이 감소하여 약 14일 이후엔 단당류인 글루코스 및 프락토스로 변화되기 때문이다.The liquid medium for suspension culture of the present invention is exchanged every two weeks, since the sucrose content is most reduced after about 7 days of initial culture, and is changed to glucose and fructose, which are monosaccharides after about 14 days.
본 발명의 일 구현 예에 따른 전구물질은 말로닐-CoA(malonyl-CoA)이고, 바람직하게는 20㎎/L 말로닐-CoA일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.Precursor according to an embodiment of the present invention is malonyl-CoA (malonyl-CoA), preferably 20mg / L malonyl-CoA, but is not limited thereto.
본 발명의 일 구현 예에 따른 약리활성물질은 알로에 에모딘(Aloe emodin) 또는 알로에신(aloesin)이나, 이에 제한되지 않는다.The pharmacologically active substance according to one embodiment of the present invention is aloe emodin (Aloe emodin) or aloesin (aloesin), but is not limited thereto.
본 발명의 바람직한 SA 처리 농도는 40 ~ 60mg/L이고, 더욱 바람직하게는 50mg/L이다. 약리활성물질을 추출하는 것은 SA 처리 이후 20 ~ 28시간이 지나 수행하는 것이 바람직하다.The preferred SA treatment concentration of the present invention is 40 to 60 mg / L, more preferably 50 mg / L. Extracting the pharmacologically active substance is preferably performed 20 to 28 hours after SA treatment.
상기 배지는 바람직하게는 알로에 부정근의 유도 및 증식용으로 이용된다. 상기 배지에 첨가되는 성분의 함량은 본 발명의 효과를 달성할 수 있는 범위 내에서 변할 수 있다는 것은 당업자가 용이하게 인식할 수 있다.The medium is preferably used for the induction and proliferation of aloe malaria. It will be readily appreciated by those skilled in the art that the amount of ingredient added to the medium may vary within a range capable of achieving the effects of the present invention.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된, 알로에 에모딘 또는 알로에신이 증가된 알로에 부정근을 제공한다.
In addition, the present invention provides aloe agonist with increased aloe emodine or aloesin, prepared by the above method.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail through examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예Example 1. 알로에 베라( 1. Aloe vera ( AloeAloe veravera ) ) 부정근의Involuntary 고체 배지에서의 유도 및 증식 Induction and Propagation in Solid Medium
1) 조직 세척 및 배양 1) tissue washing and culture
어린 유묘의 잎을 흐르는 잎에 깨끗하게 세척하고 조직이 단단하고 옅은 노란색을 띄는 부분을 남기고 나머지 부분은 절단시킨 후 4% 락스에 담가 5분 동안 교반 없이 표면 살균을 하였다. 표면 살균이 끝난 후 멸균수로 여러번 표면 세척을 하였다. 세척된 조직은 28℃ 암 상태에서 배양되었다.
The leaves of young seedlings were washed clean with the flowing leaves, the tissues were left hard and pale yellow, and the remaining parts were cut and soaked in 4% Lax and sterilized without stirring for 5 minutes. After surface sterilization, the surface was washed several times with sterile water. The washed tissues were incubated at 28 ° C. in the dark.
2) 물질 분석 2) substance analysis
부정근이 가지고 있는 알로에 에모딘의 함량을 확인하기 위해 HPLC로 분석하였다. 분석하는 방법은 Park et al의 방법을 참조하였다(Park et al. (1998) Phytochem Analysis : PCA 9:186-191). 동결건조를 시킨 시료 0.5g을 10ml 에탄올을 첨가하여 50℃에서 1시간 동안 소니케이션을 하였다. 그리고 3000rpm에서 15분간 원심분리를 통해 상층액을 얻어 0.45μm 멤브레인에서 필터링을 한 후 HP-1100 HPLC (Hewlett Packard)를 이용하여 분석하였다. 분석용 컬럼으로는 Nova-Pak C18 (4 mm; Waters, Milford, MA, USA)이 사용되었고, 이동상 용매의 유속은 0.7ml/min, 상온을 유지시켰고 UV 293nm에서 감지하였다.
HPLC analysis was carried out to check the content of aloe emodine in the adventitious root. For analysis, see Park et al. (Park et al. (1998) Phytochem Analysis: PCA 9: 186-191). 0.5 g of the lyophilized sample was added to 10 ml ethanol and sonicated at 50 ° C for 1 hour. The supernatant was obtained by centrifugation at 3000 rpm for 15 minutes, and then filtered through a 0.45 μm membrane, and analyzed using HP-1100 HPLC (Hewlett Packard). Nova-Pak C18 (4 mm; Waters, Milford, Mass., USA) was used as the analytical column. The flow rate of the mobile phase solvent was 0.7 ml / min, maintained at room temperature, and detected at UV 293 nm.
3) 갈변 억제를 위한 PVP 전처리3) PVP pretreatment for browning inhibition
알로에 부정근 한 개의 절편을 갈변 억제제인 PVP(polyvinylpyrrolidone)를 이용하여 다양한 농도 (2, 4, 6, 8, 10, 12g/L), 시간 (10, 20, 40, 60, 120min), pH (2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0)에서 세척(전처리: pre-washing) 하였다. 그 후 호르몬이 들어가지 않은 MS 기본 배지에 치상하여 가장 갈변현상이 많이 억제되는 조건을 찾고자 하였다.
A single slice of aloe root was used for polyvinylpyrrolidone (PVP) as a browning inhibitor at various concentrations (2, 4, 6, 8, 10, 12g / L), time (10, 20, 40, 60, 120min), pH (2.0). , 2.5, 3.0, 3.5, 4.0) (pre-washing). Afterwards, we tried to find the condition that the most browning phenomenon was suppressed by placing on MS basic medium without hormone.
4) 건조 무게 측정4) dry weight measurement
-70℃ 초저온 냉동고(deepfreezer)에서 보관된 알로에 베라 부정근을 3일 동안 동결건조 시킨 후 건조 무게를 측정하였다. "(주)김정문 알로에" 제주도 농장에서 제공받은 3년동안 노지 재배된 알로에 베라 뿌리, 잎과 기내에서 배양된 부정근에서 알로에 에모딘과 알로인의 함량을 확인해 보았다. 추출방법은 Park 등의 방법을 인용하였다(Park et al. (1998) Phytochem Analysis : PCA 9:186-191). 알로에 에모딘의 경우 3년 노지 뿌리에서 574.8±92.4 ㎍/g이 추출되었다. 뿌리에 알로에 에모딘의 함량이 높은 점을 착안하여 알로에 베라에서 뿌리배양을 시도하였다(표 1).After freeze-drying the aloe vera involuntary muscle stored in a -70 ℃ deepfreezer for 3 days was measured the dry weight. "Kim Jung Moon Aloe" We checked the contents of aloe emodine and aloe in the roots of aloe vera, leaves, and root cultivated in the field for three years. The extraction method was cited by Park et al. (Park et al. (1998) Phytochem Analysis: PCA 9: 186-191). In the case of aloe emodine, 574.8 ± 92.4 μg / g was extracted from the root of three years. Focusing on the high content of aloe emodine in the root, the root culture was attempted in aloe vera (Table 1).
알로에 베라의 부정근 형성에 적합한 옥신의 종류와 농도를 조사하기 위하여 아가 0.7g/L 와 수크로스 30 g/L 을 첨가한 MS (Murashige & Skoog) 기본배지에 IAA (indole-3-acetic acid), 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid), NAA (1-naphthalene acetic acid), IBA (indole-3-butyric acid)을 각각 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 6.0mg/L 더하여 유묘의 어린 잎을 치상하였다. 각 조건별 생장정도는 5주간 암 상태에서 배양된 후 생체중을 측정하여 비교하였다(표 2). IAA (indole-3-acetic acid), MS (Murashige & Skoog) basal medium containing 0.7 g / L agar and 30 g / L sucrose, were investigated to investigate the types and concentrations of auxin suitable for the formation of aloe vera. 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid), NAA (1-naphthalene acetic acid) and IBA (indole-3-butyric acid) added 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0 and 6.0 mg / L, respectively The young leaves of were healed. Growth of each condition was compared by measuring the live weight after incubation in cancer for 5 weeks (Table 2).
약 5주간의 배양 결과 NAA가 부정근 유도에 효과적임을 확인할 수 있었고 (표 2), 특히 부정근은 NAA 0.5 mg/L에서 효과적으로 유도할 수 있다(표 3). 반면, 완전히 성숙한 개체의 잎을 치상하였을 경우 어떤 호르몬 조합에서도 반응이 없어 약 20 cm 이하이며 연초록에 하얀 점이 있는 잎 상태인 어린 묘 (이하 유묘라 함)의 잎을 치상하여야 함을 알 수 있다.After about 5 weeks of culture, it was confirmed that NAA was effective for inducing negative muscle (Table 2), and in particular, negative muscle could be effectively induced at NAA 0.5 mg / L (Table 3). On the other hand, when the leaves of completely mature individuals were healed, no hormonal combination responded and the leaves of young seedlings (hereinafter referred to as seedlings), which are about 20 cm or less and have white spots in light green, should be healed.
부정근을 쉽게 얻을 수 있는 부분을 찾기 위하여 NAA 0.5mg/L을 첨가한 MS (Murashige & Skoog) 기본배지에 유묘의 잎을 초록색 부분(G)과 노란색 부분(Y) 그리고 폭 1cm 이하인 어린 잎(F)으로 세분화하고, 잎을 치상할 경우 젤을 중심으로 반으로 절개한 것(S)과 절개하지 않은 것(W)으로 배양 조건을 비교해보았다(도 1). 치상한지 5주 후 잎의 노랑색 부분을 반으로 절개한 조직(도 1 Y,S)에서 부정근 효율이 가장 많은 것을 확인할 수 있었다(표 4).Seeds of seedlings in MS (Murashige & Skoog) basal medium supplemented with NAA 0.5mg / L to find the area where the root canal is easily obtained. ), And when the leaves were healed, the culture conditions were compared with the incisions in half (S) and the incisions (W) around the gel (FIG. 1). Five weeks after the tooth decay, the most inferior root muscle efficiency was observed in the tissue cut in half of the yellow part of the leaf (Fig. 1 Y, S) (Table 4).
알로에 부정근의 증식조건을 얻기 위하여 배양기간에 따른 건조 무게의 변화를 측정하였다. 그 결과 1 mg/L NAA에서 유도된 부정근의 건조 무게가 0.1333±0.001g으로 0.5 mg/L NAA에서 유도된 부정근 0.078±0.002g 보다 더 많이 증가하였다. 하지만 1 mg/L NAA에서 얻은 부정근은 비정상적인 조직을 더 많이 함유하고 있어 생체무게가 0.5 mg/L NAA 보다 많이 나가는 것을 확인하였다(도 2, 도 5A, 5B). 0.5 mg/L NAA을 첨가한 MS배지에 다양한 농도의 BA을 첨가한 결과 0.5mg/L NAA 및 0.2mg/L BA에서 약 6주 후 건조 중량이 0.1232±0.001 g으로 다른 호르몬 조합에 비해 증식이 가장 잘 되는 것을 확인하였다(도 5C). 그리고 증식에 적합한 배지를 찾고자 0.5mg/L NAA 및 0.2mg/L BA의 호르몬을 넣고 다양한 배지 (B5, SH, MS, 2MS, 1/2MS)를 첨가하여 증식 증가율을 시간대 별로 확인해 본 결과 MS 배지가 다른 배지에 비해 부정근의 증식 효율이 효과적인 것을 확인할 수 있다(도 3, 도 5C,5D).The change of dry weight according to incubation period was measured to obtain the growth condition of aloe root. As a result, the dry weight of the root muscle derived from 1 mg / L NAA increased to 0.1333 ± 0.001 g, which was more than 0.078 ± 0.002g from the root muscle derived from 0.5 mg / L NAA. However, the negative root obtained at 1 mg / L NAA contained more abnormal tissue, it was confirmed that the bioweight is more than 0.5 mg / L NAA (Fig. 2, Fig. 5A, 5B). Various concentrations of BA were added to MS medium supplemented with 0.5 mg / L NAA, resulting in a dry weight of 0.1232 ± 0.001 g after about 6 weeks at 0.5 mg / L NAA and 0.2 mg / L BA. It was confirmed that the best (Fig. 5C). And in order to find a suitable medium for growth, the hormones of 0.5mg / L NAA and 0.2mg / L BA were added and various mediums (B5, SH, MS, 2MS, 1 / 2MS) were added to confirm the growth rate by time period. It can be confirmed that the growth efficiency of the root muscle is more effective than other media (Fig. 3, Fig. 5C, 5D).
알로에 베라 부정근은 뿌리를 하나씩 절개하여 배양하면 갈변화 현상이 심하게 일어나 조직이 사멸하게 된다. 따라서 대량 증식을 위해서는 조직의 갈변화 현상을 억제할 수 있는 방법을 찾는 것이 필요하다. 갈변화를 막기 위하여 부정근 조직을 하나씩 분리해 갈변억제제인 PVP(Polyvinylpyrrolidone) 3 종류(PVP10, PVP40, PVP58)를 이용하여 여러 조건에서 전처리(pre-washing) 하였다. 그 결과 전처리를 해주지 않으면 갈변현상으로 뿌리의 생육이 억제되지만 pH, 전처리(prewashing) 시간과는 상관없이 짧은 시간이라도 2 g/L 이상의 용액에서 전처리(prewashing)를 해주면 뿌리의 갈변현상을 줄일 수 있었다(도 4).Aloe Vera root muscles are severely browned when the roots are cut and cultured to cause tissue death. Therefore, for mass proliferation, it is necessary to find a way to suppress the browning of tissues. In order to prevent browning, the root muscles were separated and pre-washed under various conditions using three types of polyvinylpyrrolidone (PVP10, PVP40, PVP58) inhibitors. As a result, if the pretreatment is not performed, the growth of the roots is suppressed due to browning. Irrespective of pH and prewashing time, browning of roots could be reduced by prewashing in a solution of 2 g / L or more even for a short time (FIG. 4).
또한 기본 배지 차이에 따른 알로에 부정근 내 알로에 에모딘의 함량 변화를 확인하였다. 0.5mg/L NAA 및 0.2mg/L BA가 포함되어 있는 MS, 1/2 MS, B5, SH 배지에 알로에 베라 부정근을 유도하였고, 7주 후 HPLC 을 이용해 알로에 에모딘 함량을 측정하였다. 알로에 에모딘 성분 분석 방법은 Park 등(1998)의 방법을 인용하였다. 그 결과 B5 배지에서 알로에 에모딘 함량이 133.1±0.1 ㎍/g으로 월등히 높은 것을 확인하였다(표 5). In addition, the changes in the content of aloe emodine in the aloe mala muscle according to the basal medium difference was confirmed. Aloe Vera roots were induced in MS, 1/2 MS, B5, SH medium containing 0.5 mg / L NAA and 0.2 mg / L BA, and the aloe emodine content was measured after 7 weeks using HPLC. Aloe emodine component analysis method was quoted by Park et al. (1998). As a result, it was confirmed that the aloe emodine content in the B5 medium was much higher at 133.1 ± 0.1 μg / g (Table 5).
실시예Example 2. 알로에 베라 2. Aloe Vera 부정근의Involuntary 액체 배지에서의 증식 Proliferation in Liquid Medium
1) 알로에 부정근의 생육 비율 1) Growth rate of aloe root
액체 현탁 배양 후 알로에 베라 부정근의 생육 비율을 다음과 같은 계산법으로 측정하였다.After the liquid suspension culture, the growth rate of Aloe Vera root muscle was measured by the following calculation method.
생육 비율 =(시기별 부정근의 생체 무게 - 처음 배양한 부정근의 생체 무게)÷(처음 배양한 부정근의 생체 무게)
Growth rate = (bio weight of intestinal root muscle at each time period-bio weight of first incubated root muscle) ÷ (bio weight of first cultured root muscle)
2) 알로에 부정근 현탁 배양 2) Aloe susceptible suspension culture
처음 액체 현탁 배양을 실시할 때 27±1℃ 진탕배양기(shaking incubator)에서 50 rpm으로 천천히 교반을 시켜 부정근을 배양하였다.
When the liquid suspension culture was first performed, the root muscle was incubated by slowly stirring at 50 rpm in a 27 ± 1 ° C shaking incubator.
3) 당, 인산염, 질산염 분석3) sugar, phosphate, nitrate analysis
배지안의 당(Sucrose), 질산염(nitrate), 인산염(phosphate)의 측정은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 배지를 3000 rpm에서 15분간 원심분리를 통해 상층액을 얻어 0.45μm 멤브레인에서 필터링을 한 후 Ion Chromatograph 1 ICS3000 (Dionex,USA) 을 이용하여 분석하였다. 수크로스 분석은 CarboPac PA1 Guard Column (4*250mm) 칼럼을 이용하였으며 이동상 용매의 유속은 1 mL/min이고 용매는 150 mM 수산화나트륨(Sodium hydroxide)을 사용하였다. 시료는 50㎕씩 사용하였으며 Puled amperometry을 이용해 감지하였다. 표준폼의 retention time과 일치시켜 확인하였고 spike test를 통해서 확인하였다. 질산염(nitrate) 및 인산염(phosphate)은 Ion Chromatograph 1 ICS3000 (Dionex, USA) 기기를 이용하였으며 Ionpac AS20 (4*250mm) 컬럼을 이용하였다. 이동상 용매의 유속은 1 mL/min이고 용매는 30mM KOH를 이용하였다. 시료는 25㎕씩 사용하였으며 conductivity detector을 이용해 감지하였다. 표준폼의 retention time과 일치시켜 확인하였고 spike test를 통해서 확인하였다.
The measurement of sugar, nitrate and phosphate in the medium was performed as follows. The medium was centrifuged at 3000 rpm for 15 min to obtain supernatant, filtered on 0.45 μm membrane and analyzed using
4) 알로에 에모딘과 알로에신 물질의 정량4) Determination of aloe emodine and aloesin substance
① 부정근 내 알로에 에모딘과 알로에신 물질 확인① Identification of aloe emodine and aloesin substances in the root
부정근에서 물질 분석하는 방법은 상기 실시예 1의 고체 배지에서 증식된 부정근의 물질 분석과 동일한 방법을 사용하였다.As a method of analyzing the substance in the root muscle, the same method as that of the material analysis of the root muscle propagated in the solid medium of Example 1 was used.
② 배지 내 알로에 에모딘과 알로에신 물질 확인② Identification of aloe emodine and aloesin substances in the medium
배지에 빠져 나오는 알로에 에모딘과 알로에신 물질을 확인하기 사용한 방법은 Chiang and Abdulah 2007의 방법을 변형하였다(Chiang and Abdulah (2007) Process Biochemistry 42 : 757 - 763). The method used to identify aloe emodine and aloesin material in the medium was modified from the method of Chiang and Abdulah 2007 (Chiang and Abdulah (2007) Process Biochemistry 42: 757-763).
XAD-4를 0.1M 아세트산에 넣고 100 rpm에서 24시간 동안 침지시킨다. 침지된 XAD-4를 진공 여과를 시켜준 후 70℃ 건조기에서 24시간 건조를 하였다. 그 후 121℃에서 15분 동안 고압 멸균을 시킨다. 멸균된 XAD-4는 부정근을 수거한 배지 100ml 당 0.5g씩 첨가하여 1주일간 상온에서 100rpm으로 교반하였다. 다시 수거한 XAD-4를 진공여과한 후 70℃ 건조기에서 24시간을 건조하였다. 수거한 XAD-4를 모아 0.5g 당 100% 에탄올을 5ml을 첨가하여 이틀간 상온에서 100rpm으로 교반하였다. 교반이 끝난 후 에탄올만 수거하여 -80℃ 진공 또는 원심 농축기로 100㎕ 까지 농축하였다. 농축된 에탄올을 Park 등(1998)의 방법으로 HPLC를 통해 분석하였다(Park et al. (1998) Phytochem Analysis : PCA 9:186-191). XAD-4 is poured into 0.1 M acetic acid and soaked for 24 hours at 100 rpm. The immersed XAD-4 was vacuum filtered and then dried in a 70 ° C. dryer for 24 hours. Then autoclave at 121 ° C. for 15 minutes. Sterilized XAD-4 was added 0.5g per 100ml of the medium from which the root muscle was collected and stirred at 100 rpm for 1 week at room temperature. The collected XAD-4 was again vacuum filtered and then dried in a 70 ° C. dryer for 24 hours. The collected XAD-4 was collected and 5 ml of 100% ethanol per 0.5 g was added and stirred at 100 rpm at room temperature for two days. After stirring, only ethanol was collected and concentrated to 100 μl using a -80 ° C vacuum or centrifugal concentrator. The concentrated ethanol was analyzed by HPLC using the method of Park et al. (1998) (Park et al. (1998) Phytochem Analysis: PCA 9: 186-191).
알로에 베라 부정근을 100ml 플라스크에서 액체 현탁 배양을 실시할 때 보통 식물들을 배양하는 조건인 100~120rpm으로 교반하면 쉽게 갈변되어 조직이 사멸하게 된다. 하지만 부정근의 대량배양을 성공하기 위해선 이 갈변현상을 해결해야 하기 때문에 갈변현상을 막는 여러 물질을 처리하여 갈변억제를 시도하였으나 특정 물질을 처리하여 갈변을 억제하기엔 쉽지 않았다. 하지만 이런 알로에 베라 부정근을 50 rpm으로 천천히 교반하면 알로에 베라 부정근의 갈변 없이 부정근을 생육할 수 있었다. When liquid suspension culture of aloe vera root roots is carried out in a 100 ml flask, the mixture is easily browned and killed by agitation at 100 to 120 rpm, which is a condition for culturing plants. However, in order to succeed in mass cultivation of the roots of the roots, it is necessary to solve the browning phenomena. Therefore, browning was suppressed by treating various substances that prevent browning. However, a slow stirring of the aloe vera involuntary muscle at 50 rpm allowed the growth of the root of aloe vera without browning.
3주 동안 고체에서 유도된 알로에 베라 부정근을 사용하여 액체 현탁 배양을 실시하였다. 액체 현탁 배양에서 가장 효과적인 배지 종류를 확인하기 위하여 0.5 mg/L IAA이 포함된 다양한 종류의 배지(MS, 1/2 MS, SH, B5)를 처리하여 30일간 5일 간격으로 성장률을 확인하였다(도 6). 그 결과 IAA 0.5 mg/L 가 포함된 MS 배지에서 알로에 베라 부정근 생육이 가장 좋은 것으로 나타났는데, 이것은 SH 배지에 비하여 생장률이 약 3배 정도 높은 것이다.Liquid suspension cultures were performed using aloe vera abscesses derived from solids for 3 weeks. In order to identify the most effective medium type in the liquid suspension culture, various kinds of medium (MS, 1/2 MS, SH, B5) containing 0.5 mg / L IAA were treated to check the growth rate at 5 days intervals for 30 days ( 6). As a result, aloe vera root muscle growth was the best in MS medium containing 0.5 mg / L of IAA, which is about 3 times higher than that of SH medium.
그리고 액체 현탁 배양에서 알로에 베라 부정근의 성장을 더욱 촉진하기 위하여 도 6에서 확인한 IAA와 IBA 호르몬을 농도별로 (0.1, 0.3, 0.5, 1.0 mg/L) 처리한 후 49일간 7일 간격으로 부정근 성장비율을 확인하였다(도 7). 그 결과 다른 호르몬 조건에서는 성장률이 3 배 정도 되는 것에 비하여 0.5 mg/L IBA에서는 4 배 정도였으며 특히 0.3 mg/L IBA를 처리하였을 때 다른 호르몬 농도에 비하여 성장률이 약 7배 정도 증가하는 것으로 나타났다. 알로에 베라 부정근은 21일부터 42일간 길이 생장이 촉진되고 약 42일이 지난 후에는 부정근의 생육이 더 이상 증가하지 않았다. In order to further promote the growth of Aloe Vera root muscle in liquid suspension culture, the ratio of the root growth of the root muscle at 49
알로에 베라 부정근의 생육에 가장 필요한 배지 성분이 무엇인지 확인하고, 간접적으로 이차 대사산물의 합성 시기와 합성이 끝나는 시기를 추정하여 이차 대사산물의 전구물질을 외부에서 처리하여 물질 합성을 촉진하고 합성이 끝나는 시기에 elicitor을 처리하여 물질 합성을 더욱 증진시키는 것을 목적으로, 7일 간격으로 배지의 성분을 분석하여 가장 대표적인 주요성분인 당(Sucrose), 질산염(nitrate), 인산염(phosphate)의 함량을 측정하였다(도 8).Identify the media components most necessary for the growth of Aloe Vera root muscles, and indirectly estimate the synthesis time and the end of synthesis of secondary metabolites to promote the synthesis of materials by processing the precursors of secondary metabolites externally. In order to further enhance substance synthesis by treating elicitor at the end of time, the contents of medium, such as sucrose, nitrate and phosphate, which are the most representative major ingredients, are analyzed by analyzing the components of the medium every 7 days. (FIG. 8).
그 결과 약 7일 이후 다당류인 수크로스의 함량이 가장 많이 감소하여 14일 이후엔 단당류인 글루코스(glucose)와 프락토스(fructose)로 변화하는 것을 확인할 수 있었다. 질산염(nitrate), 인산염(phosphate) 그리고 단당류인 글루코스와 프락토스는 모두 35일 이후 감소하는 경향을 보였다. 이를 통해 알로에 액체 현탁 배양 시 계대 배양을 적어도 2주 간격으로 실시해야 함을 알 수 있다. 도 7에서 약 42일 이후 성장률이 더 이상 크게 증가하지 않은 것과 도 8의 결과를 토대로 약 35일에서 42일 이후 이차 대사산물이 합성된다는 것을 간접적으로 알 수 있었다. As a result, after about 7 days, the content of polysaccharide sucrose was decreased the most, and after 14 days, the sucrose content was changed to glucose and fructose. Nitrate, phosphate and the monosaccharides glucose and fructose all tended to decrease after 35 days. This suggests that subculture should be performed at least two weeks apart during aloe liquid suspension culture. It can be seen indirectly that secondary metabolites are synthesized after about 42 to 42 days after the growth rate no longer increases significantly after about 42 days in FIG. 7 and the results of FIG. 8.
또한 도 8의 결과를 토대로 알로에 베라 부정근을 액체 현탁 배양한지 14일 후 알로에 에모딘과 알로에신의 전구물질인 20 mg/L 말로닐-CoA(malonyl-CoA)를 처리하여 물질 합성을 촉진시켰다. In addition, 14 days after the liquid suspension culture of aloe vera insufficiency based on the results of FIG. 8, 20 mg / L malonyl-CoA (malonyl-CoA), a precursor of aloe emodine and aloesin, was treated to promote material synthesis.
또한 49일간 알로에 부정근을 배양한 후 50 mg/L 살리실산(salicylic acid, SA)을 처리한 후 알로에 베라 부정근과 부정근을 키운 배지 안에 있는 알로에 에모딘과 알로에신의 성분을 확인했다. 알로에 에모딘은 부정근 내에서 240 μg/g이 확인되었고, 부정근을 키운 배지에서 900 μg/ml가 확인되었다. 알로에신은 부정근 내에서 31 μg/g 이 확인되었으며 배지에선 확인되지 않았다. In addition, aloe vera root was incubated for 49 days, treated with 50 mg / L salicylic acid (SA), and then aloe emodin and aloesin were identified in the medium in which aloe vera was grown. Aloe emodine was found to be 240 μg / g in the root of the root and 900 μg / ml in the medium in which the root of root was grown. Aloesin was found to be 31 μg / g in the root muscle and not in the medium.
MS 기본 배지에 0.3 mg/L IBA이 포함된 배지를 100ml 플라스크에 30ml을 담아 알로에 베라를 50 rpm 으로 교반하며 액체 현탁 배양을 하였고, 같은 조건으로200ml, 500ml 액체 현탁 배양하는데 성공하였다(도 9). The medium containing 0.3 mg / L IBA in MS basal medium was added to 30 ml in a 100 ml flask, and the aloe vera was agitated at 50 rpm for liquid suspension culture, and 200 ml and 500 ml liquid suspension culture under the same conditions were successful (FIG. 9). .
Claims (14)
b) 상기 유도된 알로에 부정근을 고체 또는 액체 배지에서 증식시키는 단계;
c) 상기 증식된 알로에 부정근에 말로닐-CoA(malonyl-CoA)를 처리하는 단계; 및
d) 상기 말로닐-CoA(malonyl-CoA)를 처리한 부정근에 SA(salicylic acid)를 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 약리활성물질이 증가된 알로에 부정근의 제조 방법.a) sterilizing the slices of aloe plants and instilling a root of root in a medium containing plant growth hormone to induce the root muscle;
b) propagating the induced aloe root in solid or liquid medium;
c) treating malonyl-CoA (malonyl-CoA) to the propagated aloe root; And
and d) treating salinic acid (SA) to the malonyl-CoA treated malonyl-CoA.
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