KR101290063B1 - Platelet preserving composition, and kit for preserving platelet, and method for preserving platelet using the same - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: A platelet preserving composition, a platelet preserving kit, and a platelet preservation method are provided to store platelet for four or more months and to continuously maintain activated state of platelet. CONSTITUTION: A platelet preserving composition contains adenosine triphosphate (ATP), bivalent cation, chloride, vitamin B, insulin, granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), erythropoietin, and a solvent. A platelet preserving kit has a sealed sterilized container containing the composition, of which internal pressure is regulated to be identical with the external pressure. A platelet preservation method comprises the steps of: mixing blood and an anticoagulant, and centrifuging to obtain buffy coat and plasma; injecting the buffy coat and the plasma to the container; and preserving the container at 35-37 deg. C.

Description

혈소판 보존 조성물, 이를 포함하는 혈소판 보존 키트 및 이를 이용한 혈소판 보존 방법{Platelet preserving composition, and kit for preserving platelet, and method for preserving platelet using the same}TECHNICAL FIELD The present invention relates to a platelet preserving composition, a platelet preservation kit containing the same, and a method for preserving platelets using the same.

본 발명은 혈소판을 보존하기 위한 조성물, 이를 포함하는 혈소판 보존 키트 및 이를 이용하여 혈소판을 보존하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 혈소판을 활성화 상태로 유지하면서 혈소판을 장기간 보존할 수 있도록 하는 조성물, 이를 포함하는 혈소판 보존 키트 및 이를 이용하여 혈소판을 보존하는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a composition for preserving platelets, a platelet preservation kit containing the same and a method for preserving platelets using the same, and more particularly, to a composition for preserving platelets for a long time while maintaining platelets in an activated state, A platelet preservation kit containing the same, and a method of preserving platelets using the same.

세계적으로 혈액 공급에 대한 관심이 계속적으로 증가되어 왔다. 그러나, 혈액 산물의 보관 안정성이 비교적 짧기 때문에, 농축된 적혈구 및 수혈을 위한 혈액 산물 등은 현재 대부분 보관기간이 제한되고 있다. 상기 제한된 보관 기간이 지나면, 이들의 pH가 매우 낮아지며, 이와 함께 ATP의 수준도 급격히 낮아지고, 수혈 시 순환 수명이 매우 짧아지게 된다.
There has been a steady increase in interest in blood supply worldwide. However, since the storage stability of blood products is relatively short, most of the concentrated red blood cells and blood products for transfusion are currently limited in storage period. After the above-mentioned limited storage period, their pH is extremely low, and the level of ATP is also rapidly lowered, and the cycle life at the time of transfusion becomes very short.

특히 혈소판의 경우 골수에서 생성되어 생체 내에서 약 7일간 생존하나 채혈 후에는 일반적으로 보관이 가능한 기간이 다른 혈액 산물보다 더욱 짧아서, 현재 상온의 교반기(shaking machine) 내에서 5일 정도의 보관만이 가능한 것으로 알려져 있다.
In particular, platelets are produced in the bone marrow and survive for about 7 days in vivo, but after collection, the storage period is generally shorter than other blood products, and currently, only 5 days of storage in a shaking machine at room temperature It is known to be possible.

적혈구 등 다른 혈액 산물에 비해 혈소판의 보관 안정성이 더욱 저하되는 이유 중 하나는 혈소판에는 미토콘드리아가 존재하므로 미토콘드리아에 의한 대사 작용이 계속적으로 일어나기 때문이다. 따라서, 혈소판은 보존 시간이 경과함에 따라 pH 저하와 함께 ATP 감소를 보이고 이와 함께 젖산의 생성이 수반되지만, 미토콘드리아에 의한 해당 작용 때문에 이러한 문제가 더욱 악화되는 경향이 있다.
One of the reasons that the storage stability of platelets is further lowered compared to other blood products such as red blood cells is because the platelets contain mitochondria and the metabolism by the mitochondria continues to occur. Therefore, platelets show a decrease in ATP with a decrease in pH over time, accompanied by the production of lactic acid, but this problem tends to be further exacerbated by the corresponding action of mitochondria.

이러한 혈소판의 저장 또는 보존 기간을 늘리기 위한 많은 연구가 이루어지고 있으나 현재까지는 일주일이상의 보관은 불가능한 상태이다.
Many studies have been made to increase the storage or preservation period of such platelets, but until now it is impossible to store more than a week.

혈소판은 말초 혈액 내에 존재하는 성분인 혈구의 일종으로 부착과 응집 과정을 통해 일차 지혈 기전을 담당하는 물질이다. 또한 혈소판은 혈소판 유래 성장인자(PDF-platelet derived growth factor)를 비롯한 많은 성장인자들을 생성한다. 따라서, 장기간의 혈소판 보관이 가능하고 지속적으로 활성화 상태를 유지할 수 있다면, 이러한 관련 성장 인자에 대한 연구 및 다양한 관련 산업에서 상업적으로 이용이 가능할 것이다.
Platelets are a kind of blood cells that are present in the peripheral blood, and are substances responsible for primary hemostasis by adhesion and coagulation. Platelets also produce many growth factors, including platelet-derived growth factor (PDF). Thus, long-term platelet storage and sustained activation would be commercially available for research on these related growth factors and in various related industries.

이에 본 발명의 한 측면은 혈소판을 장기간 보존하기 위한 혈소판 보존 조성물을 제공하는 것이다.
Accordingly, one aspect of the present invention is to provide a platelet-preserving composition for prolonged storage of platelets.

본 발명의 다른 측면은 혈소판을 장기간 보존하기 위한 보존 키트를 제공하는 것이다.
Another aspect of the present invention is to provide a preservation kit for prolonged storage of platelets.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 보존 조성물 및 보존 키트를 이용하여 혈소판을 보존하는 방법을 제공하는 것이다.
Another aspect of the present invention is to provide a method for preserving platelets using the preservation composition and the preservation kit.

본 발명의 일 견지에 의하면, 아데노신 트리포스페이트(ATP), 2가 양이온, 염화물, 비타민 B, 인슐린, G-CSF(Granulocyte colony-stimulating factors), 에리스로포이에틴 및 용매를 포함하는, 혈소판 보존 조성물이 제공된다.
According to one aspect of the invention, there is provided a platelet preservation composition comprising adenosine triphosphate (ATP), divalent cation, chloride, vitamin B, insulin, Granulocyte colony-stimulating factors (G-CSF), erythropoietin and a solvent. .

상기 보존된 혈소판은 CD61 및 vWF(von Willebrand factor) 세포표시인자가 양성인 것이다.
The conserved platelets are positive for CD61 and von Willebrand factor (vWF) cell markers.

상기 2가 양이온은 Zn2 +, Cu2 +, Mg2 +, 및 Cr2 +로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 1종 이상인 것이 바람직하다. The divalent cations are preferably at least one selected from the group consisting of Zn 2 + , Cu 2 + , Mg 2 + , and Cr 2 + .

상기 염화물은 염화칼륨 및 염화 브롬(Bromine Chloride)으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 1종 이상인 것이 바람직하다.
The chloride is preferably at least one selected from the group consisting of potassium chloride and bromine chloride.

상기 비타민 B는 비타민 B6(피리독신)인 것이 바람직하다.
The vitamin B is preferably vitamin B6 (pyridoxine).

상기 용매는 증류수인 것이 바람직하다.The solvent is preferably distilled water.

상기 혈소판 보존 조성물은 아데노신 트리포스페이트(ATP) 15-25mg, 2가 양이온 4-6mg, 염화물 100-200mg 비타민 B 45-55mg, 인슐린 2.5-3.5 I.U, G-CSF(Granulocyte colony-stimulating factors) 10-15 μg, 에리스로포이에틴 350 -450 I.U 및 잔부의 용매를 전체 조성물의 최종 부피가 8cc가 되도록 포함하는 것이 바람직하다.
The platelet preservation composition comprises 15-25 mg of adenosine triphosphate (ATP), 4-6 mg divalent cation, 100-200 mg chloride B 45-55 mg vitamin B, insulin 2.5-3.5 IU, granulocyte colony-stimulating factors (G-CSF) 10- It is preferred to include 15 μg, erythropoietin 350-450 IU and the balance of solvent so that the final volume of the total composition is 8 cc.

본 발명의 다른 견지에 의하면, 상기와 같은 보존 조성물을 함유하며, 내부 압력이 외부 압력과 동일하게 조절된 밀폐 멸균 용기를 포함하는, 혈소판 보존 키트가 제공된다.
According to another aspect of the present invention, there is provided a platelet preservation kit, which contains a preservation composition as described above and includes a closed sterile container in which the internal pressure is controlled to be equal to the external pressure.

본 발명의 또 다른 견지에 의하면, 혈액을 항응고제와 혼합한 후 원심분리하여 버피코트(Buffy coat) 및 혈장을 획득하는 단계; 상기의 보존 조성물을 함유하며, 내부 압력이 외부 압력과 동일하게 조절된 밀폐 멸균 용기에, 상기에서 획득된 버피코트(Buffy coat) 및 혈장을 주입하는 단계; 및 상기 버피코트(Buffy coat) 및 혈장이 주입된 용기를 35 내지 37℃의 온도에서 보존하는 단계를 포함하는, 혈소판 보존 방법이 제공된다.
According to another aspect of the invention, the step of mixing the blood with the anticoagulant and centrifuged to obtain a buffy coat (Buffy coat) and plasma; Injecting a buffy coat and plasma obtained above into a closed sterile container containing the preservative composition, wherein the internal pressure is controlled to be equal to the external pressure; And preserving the buffy coat and the container infused with plasma at a temperature of 35 to 37 ° C.

상기 보존은 28일이상 유지될 수 있다.
The retention can be maintained for at least 28 days.

상기 보존된 혈소판은 CD61 및 vWF(von Willebrand factor) 세포표시인자가 양성인 것이 바람직하다.
Preferably, the preserved platelets are positive for CD61 and vWF (von Willebrand factor) cell markers.

본 발명의 혈소판 보존 조성물, 보존 키트 및 혈소판 보존 방법을 이용하는 경우에는 적어도 4주 이상 장기간의 보존이 가능하고, 이러한 보존 기간 동안 지속적으로 혈소판의 활성화 상태를 유지할 수 있다. 따라서, 혈소판과 관련한 성장 인자의 연구 등과 관련한 다양한 분야에서 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
In the case of using the platelet preserving composition, preservation kit and platelet preservation method of the present invention, it is possible to preserve the platelet for a long period of time for at least 4 weeks, and the platelet activation state can be maintained continuously during the preservation period. Therefore, it may be usefully used in various fields related to the study of growth factors related to platelets.

도 1 내지 도 3은 동일한 조건에서 상이한 대상으로부터 유래된 3군의 말초 혈액 시료를 각각 주입한 본 발명의 보존 키트를 이용하여 28일간 혈소판을 보존한 후 면역조직화학(immunohistochemistry) 염색을 진행하여 현미경 하에서 관찰한 결과이다(X400).
상기 도 1 내지 도 3 각각에서 (a)는 CD61의 면역조직화학 염색에 대한 결과를 나타낸 것이며, (b)는 vWF의 면역조직화학 염색에 대한 결과를 나타낸 것이다.1 to 3 is a preservation of platelets for 28 days using the preservation kit of the present invention each injected with three groups of peripheral blood samples derived from different subjects under the same conditions, followed by immunohistochemistry staining microscope The results were observed under (X400).
In each of Figures 1 to 3 (a) shows the results for immunohistochemical staining of CD61, (b) shows the results for immunohistochemical staining of vWF.

본 발명에 의하면 혈소판을 장기간 보존하기 위한 보존 조성물이 제공된다. 본 발명의 보존 조성물에 의하면 특히 혈소판을 활성화 상태로 유지하면서 장기간의 보존이 가능하다.
According to the present invention, a preservation composition for prolonged storage of platelets is provided. According to the preservation composition of the present invention, it is possible to preserve the platelets for a long period of time while keeping the platelets in an activated state.

본 발명에 의하면 CD61 및 vWF(von Willebrand factor) 세포표시인자가 양성인 혈소판의 상태를 유지하면서 장기간의 보존이 가능하며, 상기 CD61 및 vWF(von Willebrand factor) 세포표시인자는 활성화 혈소판에서 특이적으로 확인될 수 있는 것이다.
According to the present invention, CD61 and vWF (von Willebrand factor) cell markers can be preserved for a long period of time while maintaining the state of platelets positive, and the CD61 and vWF (von Willebrand factor) cell markers are specifically identified in activated platelets It can be.

상기 CD61은 혈소판 표면의 글리코프로테인(glycoprotein) IIIa와 관련이 있는 세포표시인자로서 혈소판의 표준(standard) 표시인자이며, 상기 vWF는 혈장 내 응고인자에 대한 수용체로써 혈소판이 활성화 상태를 유지하며 응집 기능을 수행할 있음을 나타내는 세포표시인자이다. 혈소판 보관에 있어서 가장 중요한 문제로서 혈소판의 보관 온도가 맞지 않으면 혈소판의 세포막 구조에 이상이 발생하여 응집 기능을 상실하게 되는데, 이러한 경우에는 vWF가 활성화되지 않는다.
The CD61 is a standard marker for platelets as a cell marking factor associated with glycoprotein IIIa on platelet surface. The vWF is a receptor for plasma coagulation factor, Is a cell-marking factor that indicates that it is to be performed. The most important problem in platelet storage is that if the storage temperature of the platelets is not right, the cell membrane structure of the platelets is abnormally generated and the coagulation function is lost. In this case, vWF is not activated.

본 발명에 있어서, “혈소판의 보존“이란 혈소판을 보관 및/또는 유지하는 것을 의미하며, 이들과 상호교환적으로 사용될 수 있는 것으로, 특히 혈소판을 활성화 상태로 보존하는 것을 의미하는 것이다.
In the present invention, "preservation of platelets" means the storage and / or maintenance of platelets, which can be used interchangeably with them, in particular means to preserve the platelets in an activated state.

본 발명의 보존 조성물은 아데노신 트리포스페이트(ATP), 2가 양이온, 염화물, 비타민 B, 인슐린, G-CSF(Granulocyte colony-stimulating factors), 에리스로포이에틴 및 용매를 포함한다.
Preservation compositions of the present invention include adenosine triphosphate (ATP), divalent cations, chlorides, vitamin B, insulin, Granulocyte colony-stimulating factors (G-CSF), erythropoietin and solvents.

본 발명에 있어서 사용될 수 있는 용매는 물이며, 바람직하게는 증류수이다.
The solvent which can be used in the present invention is water, preferably distilled water.

상기 아데노신 트리포스페이트는 ATP라고도 불리며, 보존 조성물에 있어서 혈소판의 기능을 유지하고 보존할 수 있도록 에너지원 역할을 하는 것이다.
The adenosine triphosphate, also called ATP, serves as an energy source to maintain and preserve the function of platelets in a preservation composition.

상기 ATP는 본 발명의 보존 조성물의 최종 부피 8cc를 기준으로 하여, 15 내지 25mg 의 양으로 포함되는 것이 바람직하며, 18 내지 22mg 의 양으로 포함되는 것이 보다 바람직하다. 상기 ATP가 15mg 미만의 양으로 포함되는 경우에는 혈소판 유지에 필요한 에너지원 공급이 저하되는 문제가 있으며, 25mg 를 초과하여 포함되는 경우에는 세포독성이 발생할 우려가 있다.
The ATP is preferably included in an amount of 15 to 25 mg, more preferably in an amount of 18 to 22 mg, based on 8 cc of the final volume of the preservation composition of the present invention. When the ATP is included in an amount of less than 15mg, there is a problem that the supply of energy source required for platelet maintenance is lowered, and when it is included in excess of 25mg, there is a risk of cytotoxicity.

상기 2가 양이온은 본 발명의 보존 조성물에 있어서 세포막을 안정시키고 전해질 균형을 맞추기 위해 고안된 성분으로서, Zn2 +, Cu2 +, Mg2 +, 및 Cr2+로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 1종 이상인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 Zn2 +인 것이다. 상기 2가 양이온은 황산구리, 황산마그네슘 황산아연 등과 같이 황산염, 구연산염 등 당해 기술 분야에 알려진 적절한 염의 형태로 포함될 수 있다.
Wherein the divalent cation is a component that is designed to match the stability of the cell membrane and electrolyte balance in the preservation compositions of the present invention, Zn + 2, at least one member selected from the group consisting of Cu 2 +, Mg 2 +, and Cr 2+ It is preferred, and more preferably is a Zn + 2. The divalent cations can be included in the form of salts such as sulfate, citrate, and the like, which are known in the art, such as copper sulfate, magnesium sulfate, zinc sulfate, and the like.

본 발명에 있어서, '1종 이상'이란 용어는 각 성분이 단독으로 사용되거나, 2종 이상의 성분이 조합으로 사용될 수 있음을 의미하는 것이다.
In the present invention, the term 'one or more kinds' means that each component may be used alone, or two or more kinds of components may be used in combination.

상기 2가 양이온은 본 발명의 보존 조성물의 최종 부피 8cc를 기준으로 하여, 본 발명의 보존 조성물에 4 내지 6mg의 양으로 포함되는 것이 바람직하며, 4.2 내지 5.6 mg의 양으로 포함되는 것이 보다 바람직하다.The divalent cation is preferably contained in an amount of 4 to 6 mg, more preferably in an amount of 4.2 to 5.6 mg, based on 8 cc of the final volume of the storage composition of the present invention. .

상기 2가 양이온이 4mg 미만의 양으로 포함되는 경우에는 삼투압이 낮아짐으로 인해 세포막 안정성에 문제가 발생할 수 있으며, 6mg 를 초과하여 포함되는 경우에는 보존 조성물 내 높은 삼투압으로 인해 세포가 사멸할 수 있는 우려가 있다.
When the divalent cation is included in an amount of less than 4mg may cause a problem in cell membrane stability due to the low osmotic pressure, if contained in excess of 6mg concerns the cell death due to high osmotic pressure in the preservation composition There is.

본 발명에 포함된 상기 염화물은, 보존 조성물에 있어서 양이온을 안정화시키고 보존 조성물의 농도를 적절히 유지시키는 역할을 하는 것으로, 염화칼륨 및 염화 브롬(Bromine Chloride)으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 1종 이상인 것이 바람직하며, 염화칼륨인 것이 보다 바람직하다.
The chloride contained in the present invention serves to stabilize the cation in the preservation composition and to properly maintain the concentration of the preservation composition, and preferably at least one selected from the group consisting of potassium chloride and bromine chloride. It is more preferable that it is potassium chloride.

상기 염화물은 본 발명의 보존 조성물의 최종 부피 8cc를 기준으로 하여, 본 발명의 보존 조성물에 100-200mg 양으로 포함되는 것이 바람직하며, 130-180mg 의 양으로 포함되는 것이 보다 바람직하다.The chloride is preferably contained in an amount of 100-200 mg, more preferably in an amount of 130-180 mg, based on 8 cc of the final volume of the preservation composition of the present invention.

상기 염화물이 100mg 미만의 양으로 포함되는 경우에는 삼투압이 과도하게 낮아지는 문제가 있으며, 200mg 를 초과하여 포함되는 경우에는 삼투압이 과도하게 높아지는 문제가 있다. 삼투압이 상기와 같이 과도하게 낮아지거나 높아지는 경우에는 혈소판의 보존에 있어서 부적정인 영향을 미치며, 활성화 상태의 혈소판의 보존이 원활하게 이루어지지 않을 수 있다.
If the chloride is contained in an amount of less than 100mg, there is a problem that the osmotic pressure is excessively low, and if it contains more than 200mg there is a problem that the osmotic pressure is excessively high. When the osmotic pressure is excessively lowered or increased as described above, it has an inadequate effect on the preservation of platelets, and the preservation of activated platelets may not be performed smoothly.

상기 비타민 B는 특히 비타민 B6(피리독신)인 것이 바람직하며, 상기 비타민 B는 보존 조성물에 있어서 항산화작용을 통해 혈소판 보존 조성물을 안정적으로 유지시키는 역할을 하는 것이다.
The vitamin B is particularly preferably vitamin B6 (pyridoxine), and the vitamin B serves to stably maintain the platelet preservation composition through antioxidant activity in the preservation composition.

상기 비타민 B는 본 발명의 보존 조성물의 최종 부피 8cc를 기준으로 하여, 본 발명의 보존 조성물에 45-55mg의 양으로 포함되는 것이 바람직하며, 48-52mg의 양으로 포함되는 것이 보다 바람직하다.The vitamin B is preferably contained in an amount of 45-55 mg, more preferably in an amount of 48-52 mg, based on 8 cc of the final volume of the preservation composition of the present invention.

상기 비타민 B6가 45mg 미만의 양으로 포함되는 경우에는 보존 조성물의 안정성 유지에 문제가 있으며, 55mg를 초과하여 포함되는 경우에는 세포독성이 발생할 우려가 있다.
When the vitamin B6 is included in an amount of less than 45mg, there is a problem in maintaining the stability of the preservation composition, and when included in excess of 55mg there is a fear that cytotoxicity occurs.

상기 인슐린은 혈소판 보존 조성물에 있어서 혈소판전구세포의 세포 분열과 관련한 신호를 전달하는 역할을 하는 것으로, R(Regular) 인슐린을 사용하는 것이 바람직하다.
The insulin plays a role in delivering a signal related to cell division of platelet progenitor cells in the platelet preservation composition, and it is preferable to use R (Regular) insulin.

상기 인슐린은 본 발명의 보존 조성물의 최종 부피 8cc를 기준으로 하여, 본 발명의 보존 조성물에 2.5-3.5 I.U의 양으로 포함되는 것이 바람직하며, 2.8-3.2 I.U의 양으로 포함되는 것이 보다 바람직하다.The insulin is preferably included in an amount of 2.5-3.5 I.U, more preferably in an amount of 2.8-3.2 I.U, based on 8 cc of the final volume of the preservative composition of the present invention.

상기 인슐린이 2.5 I.U 미만의 양으로 포함되는 경우에는 혈소판전구세포의 세포 분열과 관련한 신호 전달이 저하되는 문제가 있으며, 3.5 I.U 를 초과하여 포함되는 경우에는 세포사멸이 발생할 가능성이 있다.
When the insulin is contained in an amount of less than 2.5 IU, there is a problem in that signal transduction related to cell division of platelet precursor cells is reduced, and when it is included in more than 3.5 IU, cell death may occur.

상기 G-CSF(Granulocyte colony-stimulating factors)는 필그라스팀(Filgrastim)이라고도 불리며, 혈소판전구세포의 세포 분열과 관련한 신호를 전달하는 역할을 하는 것으로, 바람직하게는 유전자 재조합 G-CSF를 사용할 수 있다.
Granulocyte colony-stimulating factors (G-CSF), also called filgrastim, serve to transmit signals related to cell division of platelet progenitor cells, and preferably, recombinant G-CSF may be used. .

상기 G-CSF는 본 발명의 보존 조성물의 최종 부피 8cc를 기준으로 하여, 본 발명의 보존 조성물에 10-15 μg의 양으로 포함되는 것이 바람직하며, 13-15μg의 양으로 포함되는 것이 보다 바람직하다.The G-CSF is preferably contained in an amount of 10-15 μg, more preferably in an amount of 13-15 μg, based on 8 cc of the final volume of the preservative composition of the present invention. .

상기 G-CSF가 10μg 미만의 양으로 포함되는 경우에는 혈소판전구세포의 세포 분열과 관련한 신호 전달이 저하되는 문제가 있으며, 15μg를 초과하여 포함되는 경우에는 세포사멸이 발생할 우려가 있다.
When the G-CSF is included in an amount of less than 10μg, there is a problem in that signal transduction related to cell division of platelet precursor cells is reduced, and when it is included in excess of 15μg, cell death may occur.

상기 에리스로포이에틴은 혈소판전구세포의 세포 분열과 관련한 신호를 전달하는 역할을 하는 것으로, 바람직하게는 유전자 재조합 에리스로포이에틴을 사용할 수 있다.
The erythropoietin serves to transmit signals related to cell division of platelet progenitor cells, and preferably, recombinant erythropoietin may be used.

상기 에리스로포이에틴은 본 발명의 보존 조성물의 최종 부피 8cc를 기준으로 하여, 본 발명의 보존 조성물에 350 -450 I.U의 양으로 포함되는 것이 바람직하며, 380 -420 I.U 의 양으로 포함되는 것이 보다 바람직하다.The erythropoietin is preferably included in the preservation composition of the present invention in an amount of 350 -450 I.U, more preferably in the amount of 380 -420 I.U, based on a final volume of 8 cc of the preservation composition of the present invention.

상기 에리스로포이에틴이 350 I.U 미만의 양으로 포함되는 경우에는 혈소판전구세포의 세포 분열과 관련한 신호 전달이 저하되는 문제가 있으며, 450 I.U를 초과하여 포함되는 경우에는 세포사멸이 발생할 우려가 있다.
When the erythropoietin is contained in an amount of less than 350 IU, there is a problem in that signal transduction associated with cell division of platelet precursor cells is reduced, and in the case where the erythropoietin is included in an amount greater than 450 IU, cell death may occur.

본 발명의 보존 조성물은 가장 바람직하게는, 아데노신 트리포스페이트(ATP) 15-25mg, 2가 양이온 4-6mg, 염화물 100-200mg, 비타민 B 45-55mg, 인슐린 2.5-3.5 I.U, G-CSF(Granulocyte colony-stimulating factors) 10-15 μg, 에리스로포이에틴 350 -450 I.U 및 잔부의 용매를 전체 조성물의 최종 부피가 8cc가 되도록 포함한다.
The preservation composition of the present invention is most preferably, 15-25mg adenosine triphosphate (ATP), 4-6mg divalent cation, 100-200mg chloride, vitamin B 45-55mg, insulin 2.5-3.5 IU, G-CSF (Granulocyte colony-stimulating factors) 10-15 μg, erythropoietin 350-450 IU, and the balance of solvent are included so that the final volume of the total composition is 8 cc.

한편, 본 발명에 의하면, 혈소판을 보존하기 위한 보존 키트가 제공된다. 본 발명의 보존 키트는 상술한 본 발명의 보존 조성물이 함유된 밀폐 용기를 포함한다.
On the other hand, according to the present invention, a preservation kit for preserving platelets is provided. The preservation kit of the present invention includes a closed container containing the above-mentioned preservation composition of the present invention.

나아가, 상기 보존 키트는 내부 압력과 외부 압력이 동일하게 조절된 밀폐 멸균 용기를 포함하는 것이 바람직하다.
Furthermore, it is preferable that the preservation kit includes a sealed sterilization container in which the internal pressure and the external pressure are controlled to be the same.

본 발명의 보존 키트에 이용될 수 있는 용기는 멸균 처리된 밀폐 용기인 것이 바람직하고, 상기 용기의 재질은 특히 제한되는 것은 아니며, 혈소판의 보존에 적절한 어떠한 용기도 사용할 수 있으나, 유리인 것이 바람직하다. 다만, 보존 조성물을 안전하게 함유할 수 있는 당업계에 알려진 적절한 어떠한 다른 용기도 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 바이알(vial)을 이용한다.
The container that can be used in the preservation kit of the present invention is preferably a sterilized closed container. The material of the container is not particularly limited, and any container suitable for the preservation of platelets may be used, . However, any other container known in the art which can safely contain the preservative composition can be used. Most preferably a vial is used.

상기 용기는 상기 본 발명의 보존 조성물을 전체 부피의 약 7/50 내지 9/50의 양으로 함유하는 것이 바람직하다.
The container preferably contains the preservative composition of the present invention in an amount of about 7/50 to 9/50 of the total volume.

나아가, 본 발명에 의하면 혈소판을 장기간 보존하는 방법이 제공된다
Further, according to the present invention, there is provided a method of preserving platelets for a long time

본 발명의 방법은 상기 본 발명의 보존 조성물 및 보존 키트를 이용하며, 보다 상세하게는 혈액을 항응고제와 혼합한 후 원심분리하여 버피코트(Buffy coat) 및 혈장을 획득하는 단계;The method of the present invention uses the preservation composition and preservation kit of the present invention, and more specifically, mixing blood with an anticoagulant and centrifuging to obtain a buffy coat and plasma;

상기 보존 조성물을 함유하며, 내부 압력이 외부 압력과 동일하게 조절된 밀폐 멸균 용기에, 상기에서 획득된 버피코트(Buffy coat) 및 혈장을 주입하는 단계; 및 상기 버피코트(Buffy coat) 및 혈장이 주입된 용기를 35 내지 37℃의 온도에서 보존하는 단계를 포함한다.
Injecting the buffy coat and plasma obtained above into a closed sterile container containing the preservative composition, wherein the internal pressure is controlled to be equal to the external pressure; And preserving the buffy coat and the plasma-infused container at a temperature of 35 to 37 ° C.

혈소판의 보존을 위해 본 발명의 방법에 사용되는 보존 조성물 및 이를 포함하는 보존 키트는 상술한 바와 같다.
The preservation composition used in the method of the present invention for the preservation of platelets and the preservation kit containing the same are as described above.

본 발명의 혈소판 보존 방법은, 보다 상세하게는, 먼저 인체로부터 획득한 혈액의 응고를 방지하기 위해 항응고제와 혼합한 후, 이를 원심분리하여 혈소판이 포함되어 있는 버피코트(Buffy coat) 및 혈장을 획득한다.
The platelet preservation method of the present invention, more specifically, first mixed with an anticoagulant to prevent blood coagulation obtained from the human body, and then centrifuged to obtain a buffy coat (Buffy coat) and plasma containing platelets do.

이 때 상기 혈액은 바람직하게는 인체의 말단으로부터 획득되는 말초 혈액인 것이 바람직하다. 상기 말초 혈액은 정맥으로부터 획득하는 것이 보다 바람직하며, 예를 들어 팔, 다리 등의 정맥으로부터 획득할 수 있다.
In this case, the blood is preferably peripheral blood obtained from the distal end of the human body. The peripheral blood is more preferably obtained from the vein, and can be obtained from, for example, veins such as arms, legs and the like.

이 때 사용될 수 있는 항응고제는 소듐 시트레이트 및 헤파린으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
The anticoagulant that may be used herein may be at least one selected from the group consisting of sodium citrate and heparin, but is not limited thereto.

항응고제는 말초 혈액 100 중량부 당 6 내지 7 중량부의 비율로 혼합하고, 바람직하게는 약 6.6 중량부의 비율로 혼합하며, 말초 혈액 100 중량부 당 6 중량부 미만의 항응고제가 혼합되는 경우 항응고 효과가 충분하지 않을 수 있으며, 7 중량부를 초과하는 양의 항응고제가 혼합되는 경우 시트레이드 독성이 발생할 수 있는 문제가 있다.
The anticoagulant is mixed at a ratio of 6 to 7 parts by weight per 100 parts by weight of peripheral blood, preferably at a ratio of about 6.6 parts by weight, and has an anticoagulant effect when less than 6 parts by weight of anticoagulant is mixed per 100 parts by weight of peripheral blood. It may not be sufficient, and there is a problem that may cause citrate toxicity if the anticoagulant is mixed in excess of 7 parts by weight.

혈액의 분리를 위한 상기 원심분리는 1500 내지 1700 rpm의 범위에서 20 내지 25 분 동안 수행되며, 1600 내지 1700 rpm의 범위에서 22 내지 24 분 동안 수행되는 것이 보다 바람직하다.
The centrifugation for the separation of blood is carried out for 20 to 25 minutes in the range of 1500 to 1700 rpm and more preferably for 22 to 24 minutes in the range of 1600 to 1700 rpm.

원심분리가 1500 rpm 미만에서 수행되거나 20 분 미만으로 수행되는 경우 원심분리가 불충분하게 수행되는 문제가 있으며, 1700 rpm을 초과하여 수행되거나 25 분을 초과하여 수행되는 경우에는 세포가 손상될 우려가 있다.
Centrifugation is insufficiently performed when the centrifugation is performed at less than 1500 rpm or when the centrifugation is performed at less than 1500 rpm or when the centrifugation is performed at more than 1700 rpm or more than 25 minutes, .

원심분리가 완료되면 혈액은 세 층으로 분리가 된다. 가장 아래층은 약 45%를 차지하며, 적혈구(Red blood cells)로 이루어진 층이며, 중간층은 약 1%를 차지하며, 백혈구(White blood cells) 및 혈소판 (platelets) 으로 이루어진 층으로서 '버피 코트(Buffy coat)'라고 불리는 층이고, 가장 윗층은 약 54%를 차지하며　혈장(Plasma)으로 이루어진 층이다.
When centrifugation is complete, blood is separated into three layers. The bottom layer is about 45% and consists of red blood cells, the middle layer is about 1% and consists of white blood cells and platelets. a layer called 'coat', the top layer is about 54% and consists of plasma.

상술한 본 발명의 보존 조성물을 함유하고 내부 압력이 외부압력과 동일하게 조절된 밀폐 멸균 용기에, 상기에서 분리된 버피코트층 및 혈장층을 주입한다. 상기 외부 압력은 상압을 의미하며, 압력의 조절 방법은 예를 들어 주사기 바늘을 패킹된 고무 마개에 투과시킨 후 압력이 평형을 이루면 주사바늘을 제거하는 방식으로 이루어질 수 있으나 이러한 방법에 특히 제한되는 것은 아니다.
The buffy coat layer and the plasma layer separated above are injected into a closed sterile container containing the above-described storage composition of the present invention and having an internal pressure controlled to be equal to the external pressure. The external pressure means the atmospheric pressure. The method of controlling the pressure may be, for example, a method of passing a needle of a syringe through a packed rubber stopper and then removing the needle when the pressure is balanced. However, no.

후속적으로 버피코트층 및 혈장층을 주입한 상기 용기를 35 내지 37℃의 온도에서 보존하며, 보다 바람직하게는 약 36℃의 온도에서 보존한다. 35℃ 미만에서 보존되는 경우에는 혈소판 전구세포의 분열이 저하되고 보존 조성물 내 혈소판 보존 효율이 저하되는 문제가 있고, 37℃를 초과하여 수행되는 경우에는 세포 열손상이 발생할 우려가 있다.
Subsequently, the vessel into which the buffy coat layer and the plasma layer are injected is stored at a temperature of 35 to 37 ° C, more preferably at a temperature of about 36 ° C. When stored below 35 ° C., there is a problem that platelet progenitor cell division is lowered and platelet storage efficiency in the storage composition is decreased.

본 발명에 따른 혈소판 보존 방법에 의하면, 적어도 28일까지, 즉 4주 이상의 기간 동안 혈소판을 활성화 상태로 보존할 수 있다.
According to the platelet preservation method of the present invention, platelets can be kept in an activated state for at least 28 days, that is, for a period of 4 weeks or more.

이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically by way of specific examples. The following examples are merely examples to help understanding of the present invention, but the scope of the present invention is not limited thereto.

실시예Example

<< 실시예Example >>

1. 혈소판 보존 조성물을 포함하는 보존 1. Preservation comprising platelet-preserving composition 키트의Of kit 제조 Produce

정맥으로부터 추출한 혈액 30cc를 응고 방지를 위해 2cc의 시트레이트 완충제(100cc 시트레이트 완충제 내에는 2.45g 덱스트로즈, 2.2g 소듐 시트레이트, 730mg 시트르산을 포함)(Fenwal)와 혼합하여 혼합액을 제조하였다.
30 cc of blood extracted from the vein was mixed with 2 cc of citrate buffer (including 2.45 g dextrose, 2.2 g sodium citrate, 730 mg citric acid in 100 cc citrate buffer) (Fenwal) to prevent coagulation.

상기 혼합액을 1670 rpm에서 24분 동안 원심분리하여 분리된 혈액으로부터 버피코트(Buffy coat) 및 혈장(Plasma)을 피펫으로 채취하여 50cc 용량의 밀폐 유리병인 보존 키트에 주입하였다.
The mixed solution was centrifuged at 1670 rpm for 24 minutes, and the buffy coat and plasma were collected from the separated blood by pipette and injected into a preservation kit, which is a 50 cc sealed glass bottle.

혈액 30cc를 원심분리하여 얻은 버피코트(Buffy coat) 및 혈장(Plasma)에 대하여 상기 배양 키트에는 하기 표 1과 같은 성분을 포함하는 배양 조성물이 함유되어 있고, 여기에 용매로서 증류수(Distiled water)를 전체 조성물의 최종 부피가 8cc가 되도록 추가하였다.
Buffy coat and plasma obtained by centrifuging blood 30cc The culture kit contains a culture composition comprising the components shown in Table 1 below, Distilled water (Distiled water) as a solvent The final volume of the total composition was added to 8 cc.

실시예 1Example 1 ATP(Adenosin tri-phosphate)Adenosin tri-phosphate (ATP) 20mg20 mg 염화칼륨Potassium chloride 150mg150mg 피리독신Pyridoxine 50mg50 mg 아연zinc 4mg4 mg 구리Copper 0.6 mg0.6 mg 마그네슘magnesium 0.3 mg0.3 mg 크롬chrome 0.004 mg0.004 mg h-에리스로포이에틴h-erythropoietin 400 I.U400 I.U hG-CSF(Filgrastim)hG-CSF (Filgrastim) 15μg15 μg R(Regular) 인슐린R (Regular) Insulin 3 I.U3 I.U

상기 밀폐 유리병으로부터 27 게이지 주사기를 이용하여 패킹된 고무마개에 투과시킨 후 압력이 평형을 이루면 주사기를 제거하여 유리병 내외의 압력이 동일하도록 하였다.
After passing through the sealed rubber bottle from a sealed glass bottle using a 27 gauge syringe, if the pressure was balanced, the syringe was removed to make the pressure inside and outside the glass bottle the same.

2. 혈소판의 보존 과정2. Preservation of Platelets

3명의 지원자로부터 혈액을 채취하여 1.에서 제조된 바와 같은 보존 키트 3군을 구성하여 28일 동안 같은 조건에서 각각 보관하였으며, 보관 온도는 섭씨 36℃로 하였다.
Blood was collected from three volunteers to construct three groups of preservation kits as prepared in 1. were stored under the same conditions for 28 days, the storage temperature was 36 ℃.

3. 혈소판의 보존 결과 확인3. Confirmation of platelet preservation result

(1) 면역조직화학(immunohistochemistry) 염색(1) Immunohistochemistry Dyeing

28일간의 보존 후 각각의 보존 키트 내에 포함된 각 시료를 시린지에 의해 흡입하여 10mL의 시험 튜브에 배치하고, 그 후 각각의 튜브를 3000rpm으로 10분간 실온에서 원심분리한 후 밑에 가라앉아 분리된 세포 성분(pellet)을 채취하여 파라핀에 넣어 10% 포르말린 용액에서 고정시켰다. 파라핀-포매 세포 블록을 형성한 후, 헤마톡실린-에오진 염색의 수행을 위해 각 시료의 박편을 만들고 면역조직화학 염색처리를 하였다.
After 28 days of preservation, each sample contained in each preservation kit was aspirated by syringe and placed in a 10 mL test tube, after which each tube was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes at room temperature and then settled down. The pellets were taken and placed in paraffin and fixed in 10% formalin solution. After forming paraffin-embedded cell blocks, flakes of each sample were prepared and immunohistochemically stained for hematoxylin-eosin staining.

CD61 및 vWF(von Willebrand factor)에 대한 면역 염색은 수동적으로 수행하였고, Dako Catalyzed Signal Amplification System (Dako)를 적용하였다. 탈파라핀화(deparaffinization) 및 내인성 퍼옥시다제 활성의 차단(blocking) 후 박편을 단백질 차단 용액(protein block solution)으로 5분 동안 처리하고, 항체(CD61 및 vWF(von Willebrand factor))로 20분간 처리하였다.
Immunostaining for CD61 and vWF (von Willebrand factor) was performed passively and Dako Catalyzed Signal Amplification System (Dako) was applied. After deparaffinization and blocking of endogenous peroxidase activity, the flakes were treated with protein block solution for 5 minutes and treated with antibodies (CD61 and vWF (von Willebrand factor)) for 20 minutes Respectively.

상기와 같이 면역조직화학(immunohistochemistry) 염색을 진행한 후 현미경 하에서 관찰하였고(X400), 이에 따른 제1군의 결과를 도 1에 나타내었고, 제2군의 결과를 도 2에 나타내었으며, 제3군의 결과를 도 3에 각각 나타내었다.
Immunohistochemistry staining as described above was observed under a microscope (X400), the results of the first group according to this is shown in Figure 1, the results of the second group is shown in Figure 2, the third The results of the group are shown in FIG. 3, respectively.

혈소판의 존재를 확인하기 위한 면역형광검사의 항체목록은 CD61 및 vWF(von Willebrand factor)으로서, CD61 및 vWF을 이용하는 경우 활성화 상태의 혈소판을 확인할 수 있다.
The antibody list of immunofluorescence for confirming the presence of platelets is CD61 and vWF (von Willebrand factor), and the activated platelets can be identified using CD61 and vWF.

본 실험에 사용된 면역조직화학 염색의 마커는 하기 표 2와 같다.
The markers of immunohistochemical staining used in this experiment are shown in Table 2 below.

항체Antibody 제조사manufacturer 희석 비율Dilution ratio 전처리Pretreatment CD61CD61 DAKODAKO 1:7501: 750 오토프로테이제(Autoprotease)Autoprotease vWFvWF DAKODAKO 1:101:10 오토프로테이제(Autoprotease)Autoprotease

상기 도1 내지 도3에서 (a)는 CD61에 대한 면역조직화학 염색 결과를 나타낸 것이며, (b)는 vWF에 대한 면역조직화학 염색 결과를 나타낸 것이다.
1 to 3, (a) shows the immunohistochemical staining results for CD61, and (b) shows the immunohistochemical staining results for vWF.

(2) 소결 (2) Sintering

도 1 내지 3을 참고하면, 본 발명을 이용하여 28일간 혈소판을 보관한 결과 활성 상태의 혈소판이 다량 유지되고 있음이 확인되었고, 이들은 CD61 및 vWF(von Willebrand factor)에 대해 모두 강한 면역 반응성을 나타내었다.
1 to 3, the platelet was stored for 28 days using the present invention, it was confirmed that a large amount of active platelets are maintained, they show a strong immune response to both CD61 and vWF (von Willebrand factor) It was.

상기 실험 결과에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 혈소판 보존 조성물, 보존 키트 및 방법을 이용하여 혈소판을 보존하는 경우에는 28일까지 활성 혈소판을 보존할 수 있으며, 나아가 3군의 실험이 모두 동일한 결과를 나타낸 것을 확인할 수 있었다.
As shown in the above experimental results, in the case of preserving platelets using the platelet preservation composition, preservation kit and method of the present invention, active platelets can be preserved for up to 28 days, and all three experiments showed the same result. I could confirm that.

이러한 결과는 본 발명의 보존 조성물, 키트 및 방법을 이용하는 경우 4주 이상의 장기간 동안 혈소판을 활성 상태로 보존할 수 있는 것을 입증하는 것이다. These results demonstrate that platelets can be preserved in an active state over a period of 4 weeks or longer using the preservation compositions, kits and methods of the present invention.

Claims (11)

아데노신 트리포스페이트(ATP), 2가 양이온, 염화물, 비타민 B, 인슐린, G-CSF(Granulocyte colony-stimulating factors), 에리스로포이에틴 및 용매를 포함하는, 혈소판 보존 조성물.
A platelet preservation composition comprising adenosine triphosphate (ATP), divalent cation, chloride, vitamin B, insulin, Granulocyte colony-stimulating factors (G-CSF), erythropoietin and a solvent.
제1항에 있어서, 상기 보존된 혈소판은 CD61 및 vWF(von Willebrand factor) 세포표시인자가 양성인, 혈소판 보존 조성물.
The platelet preservation composition according to claim 1, wherein the preserved platelets are positive for CD61 and vWF (von Willebrand factor) cell markers.
제1항에 있어서, 상기 2가 양이온은 Zn2 +, Cu2 +, Mg2 +, 및 Cr2 +로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 1종 이상인, 혈소판 보존 조성물.
The method of claim 1, wherein the divalent cation is Zn 2 +, Cu 2 +, Mg 2 +, Cr, and one member selected from the group consisting of 2 + or higher, platelet preservation composition.
제1항에 있어서, 상기 염화물은 염화칼륨 및 염화 브롬(Bromine Chloride)으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 1종 이상인, 혈소판 보존 조성물.
The platelet preservation composition of claim 1, wherein the chloride is at least one selected from the group consisting of potassium chloride and bromine chloride.
제1항에 있어서, 상기 비타민 B는 비타민 B6(피리독신)인, 혈소판 보존 조성물.
The platelet preservation composition of claim 1, wherein the vitamin B is vitamin B6 (pyridoxine).
제1항에 있어서, 상기 용매는 증류수인, 혈소판 보존 조성물.
The platelet preservation composition of claim 1, wherein the solvent is distilled water.
제1항에 있어서, 상기 보존 조성물은 아데노신 트리포스페이트(ATP) 15-25mg 2가 양이온 4-6mg, 염화물 100-200mg 비타민 B 45-55mg, 인슐린 2.5-3.5 I.U, G-CSF(Granulocyte colony-stimulating factors) 10-15 μg, 에리스로포이에틴 350 -450 I.U 및 잔부의 용매를 전체 조성물의 최종 부피가 8cc가 되도록 포함하는, 혈소판 보존 조성물.
The composition of claim 1, wherein the preservative composition comprises adenosine triphosphate (ATP) 15-25 mg divalent cation 4-6 mg, chloride 100-200 mg vitamin B 45-55 mg, insulin 2.5-3.5 IU, granulocyte colony-stimulating factors) 10-15 μg, erythropoietin 350-450 IU and the balance of solvent, so that the final volume of the total composition is 8 cc.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 보존 조성물을 함유하며, 내부 압력이 외부 압력과 동일하게 조절된 밀폐 멸균 용기를 포함하는, 혈소판 보존 키트.
A platelet preservation kit, comprising the hermetically sealed container containing the preservation composition of claim 1, wherein the internal pressure is controlled to be equal to the external pressure.
혈액을 항응고제와 혼합한 후 원심분리하여 버피코트(Buffy coat) 및 혈장을 획득하는 단계;
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 보존 조성물을 함유하며, 내부 압력이 외부 압력과 동일하게 조절된 밀폐 멸균 용기에, 상기에서 획득된 버피코트(Buffy coat) 및 혈장을 주입하는 단계; 및
상기 버피코트(Buffy coat) 및 혈장이 주입된 용기를 35 내지 37℃의 온도에서 보존하는 단계
를 포함하는, 혈소판 보존 방법.
Mixing blood with anticoagulant and centrifuging to obtain a buffy coat and plasma;
Injecting the buffy coat and plasma obtained above into a closed sterile container containing the preservative composition of any one of claims 1 to 7, wherein the internal pressure is controlled to be equal to the external pressure; And
Preserving the buffy coat and the plasma-infused container at a temperature of 35 to 37 ° C.
&Lt; / RTI &gt;
제9항에 있어서, 상기 보존은 28일이상 유지되는, 혈소판 보존 방법.
10. The platelet preservation method according to claim 9, wherein the preservation is maintained for more than 28 days.
제9항에 있어서, 상기 보존된 혈소판은 CD61 및 vWF(von Willebrand factor) 세포표시인자가 양성인, 혈소판 보존 방법.10. The platelet preservation method according to claim 9, wherein the preserved platelets are positive for CD61 and vWF (von Willebrand factor) cell markers.
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