KR101286059B1 - Aqueous dispersion of organic nano-photosensitizer containing heavy-atomic dispersing agent, and preparation method and use thereof - Google Patents
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Abstract
빛의 조사에 의하여 단일항 산소를 발생시키는 유기 광감작제와 효율적인 광감작 작용을 가능하게 하는 무거운 원자가 고밀도로 집적된 코어와, 이 코어를 둘러싸고 있는 계면 활성제 및 물을 포함하는 수계 분산 근적외 광감작제 유기 나노 입자와 그 제조 방법 및 광역학 치료에의 용도가 기재되어 있으며, 상기 제조 방법은, (1) (a) 유기 광작제와 무거운 원자를 포함하는 유기분자 및 계면 활성제를 용매에 용해시켜 균일하게 혼합하고 용매를 제거하는 단계와, (b) 상기 단계 (a)의 생성물에 물을 가하여 나노 입자 수분산액을 제조하는 방법과, (2) (a) 광감작제, 분자 분산제를 유기 용매 내에서 생체 친화성 고분자에 공유결합으로 결합시키고 투석을 통하여 결합되지 않은 분자들을 제거한 다음, 동결 건조하는 단계와, (b) 상기 단계 (a)의 생성물을 음파처리 (sonication)로 물에 분산시키는 단계를 포함하는, 수계 분산 나노 광감작제의 제조 방법을 포함한다.An organic photosensitizer that generates singlet oxygen by irradiation of light, and a heavy atom dense core that enables efficient photosensitization, and an aqueous dispersion near-infrared light comprising a surfactant and water surrounding the core A sensitizer organic nanoparticle, its preparation method, and its use for photodynamic therapy are described, which method comprises (1) dissolving organic molecules and surfactants containing (a) an organic photochemical agent and heavy atoms in a solvent. To uniformly mix and remove the solvent, (b) adding water to the product of step (a) to prepare a nanoparticle aqueous dispersion, and (2) (a) a photosensitizer and a molecular dispersant. Covalently binding to the biocompatible polymer in a solvent and removing unbound molecules through dialysis, followed by freeze drying, (b) sonicating the product of step (a) A method of making an aqueous dispersed nanophotosensitizer, the method comprising dispersing in water by sonication.
Description
본 발명은 근적외(近赤外) 영역의 빛을 흡수하여 단일항 산소 (singlet oxygen)를 발생 시켜 세포의 사멸을 유도하는 유기 광감작제 (photosensitizer)와, 상기 광감작제의 단일항 산소 생성 효율을 증가시키는 역할을 하는 중원자 분산제, 생체 내/외에서 나노입자의 안정성 및 생체친화성을 부여할 수 있는 생체친화성 고분자로 이루어진 나노 입자를 암세포 내에 축적되게 하고 빛을 조사하여 암세포를 파괴하는 광역학 치료법 (photodynamic therapy)에 의하여 효율적인 암 치료를 가능하게 하는 수계 분산 유기 나노 광감작제와 이것의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.The present invention provides an organic photosensitizer that absorbs light in the near-infrared region to generate singlet oxygen and induces cell death, and a singlet oxygen generation of the photosensitizer. A heavy atom dispersant that increases efficiency, and a nanoparticle made of a biocompatible polymer that can impart the stability and biocompatibility of nanoparticles in vivo and externally to accumulate in cancer cells and irradiate light to destroy cancer cells. The present invention relates to an aqueous dispersion organic nanophotosensitizer, which enables efficient cancer treatment by photodynamic therapy, and a method and use of the same.
광역학 치료는 광감작제를 암세포 내에 축적시킨 후 빛을 조사하여 활성 산소종 중 하나인 단일항 산소를 발생시켜 암세포의 사멸을 유도하는 암치료법 중 하나로 빛의 접근이 용이한 피부암, 자궁암 등의 치료에 시술 및 임상 실험이 진행되고 있다 Photodynamic therapy is one of the cancer treatment methods that accumulate photo sensitizer in cancer cells and irradiate light to generate singlet oxygen, one of reactive oxygen species, and induce death of cancer cells. Treatment and clinical trials are underway
광역학 치료는 광감작제를 특정 암세포에만 선택적으로 축적시키게 되면 주변의 건강한 조직에 피해를 최소화 하면서 암조직 만을 제거할 수 있다는 장점이 있어 신체적, 정신적 요인으로 인하여 최소한의 절재가 요구되는 경우에 있어서 그 기대 효과가 매우 클 수 있다. 성공적인 광역학 치료를 위해서는 악성 종양 세포에 대한 광감작제의 선택적 함입과 선택적 레이저 조사가 이루어 졌을 때 이 두 가지 선택성이 교차하는 특정 부위의 특정 세포만이 제거 될 수 있다.Photodynamic therapy has the advantage that by selectively accumulating the sensitizer only to certain cancer cells, the cancer tissues can be removed with minimal damage to the healthy tissues around them. The expected effect can be very large. For successful photomechanical treatments, only selective cells of malignant tumor cells and selective laser irradiation can remove only certain cells at specific sites where these two selectivity intersect.
대부분의 광감작제는 방향족 고리로 이루어져 있고 소수성이어서 생리적 환경에서 쉽게 집합체를 이루어 활성산소를 생성하는 양자효율이 심각하게 줄어들 수 있다. 수용성 광감작제는 충분한 악성 종양에 대한 선택적 축적 충분히 이루어지지 않아 임상에 적용되기에 부족함이 있을 수 있다.Most photosensitisers are composed of aromatic rings and are hydrophobic, which can easily aggregate in a physiological environment to significantly reduce the quantum efficiency of generating free radicals. Water soluble photosensitizers may not be sufficient for selective accumulation of sufficient malignant tumors and may be insufficient for clinical application.
본 발명의 목적은 종래의 광감작제의 소수성에 기한 양자효율의 감소 및 수용성 광감작제의 임상 적용성의 한계등의 문제점 등을 해결하고자 하는 것으로서, 높은 단일항 산소 생성 효율, 높은 암조직 축적 효율 및 높은 암세포 사멸 효과가 달성된 광역학 치료용 소재를 제공하고자 하는 것이다. 구체적으로는, 생체 친화적 고분자 나노 입자의 내부에 근적외 영역의 빛을 흡수하여 단일항 산소를 생성하는 유기 광감작제와 이를 잘 분산시키고 단일항 산소 생성 효율을 높여줄 수 있는 유기 분자 분산제를 함께 도입하여 선택적이고 효과적인 광역학 치료용 나노 광감작제와 이것의 제조 방법 및 상기 나노 광감작제를 생체 또는 생체외의 암세포 소멸에 이용하는 방법을 제공하고자 하는 것이다. An object of the present invention is to solve problems such as the reduction of quantum efficiency due to the hydrophobicity of conventional photosensitizers and the limitations of clinical applicability of water-soluble photosensitizers, such as high singlet oxygen production efficiency and high cancer tissue accumulation efficiency. And it is to provide a material for photodynamic therapy in which a high cancer cell killing effect is achieved. Specifically, organic photo-sensitizers that absorb light in the near-infrared region to generate singlet oxygen and biomolecule dispersants that can disperse them well and increase the efficiency of singlet oxygen generation are included in the biocompatible polymer nanoparticles. It is intended to provide a selective and effective nanophotosensitizer for photodynamic therapy, a method for producing the same, and a method of using the nanophotosensitizer for attenuating cancer cells in vivo or in vitro.
상술한 과제를 실현하기 위한 본 명세서에 개시된 일 실시예에 따른 나노 광감작제는, 광감작제를 포함하는 코어; 상기 코어를 둘러싸고 있는 생체 친화성 고분자; 및 물을 포함하는 것을 특징으로 한다.Nanophotosensitizer according to an embodiment disclosed herein for realizing the above object, the core comprising a photosensitizer; A biocompatible polymer surrounding the core; And water.
일 실시예에 있어서, 상기 광감작제를 포함하는 코어는, 상기 광감작제에 대응하는 중원자 분산제를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.In one embodiment, the core including the photosensitizer, characterized in that it further comprises a heavy atom dispersant corresponding to the photosensitizer.
또한, 일 실시예에 있어서, 상기 중원자 분산제는, 요오드나 중금속류를 함유하는 소수성 분자로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 한다.In addition, in one embodiment, the heavy atom dispersant is characterized in that at least one selected from the group consisting of hydrophobic molecules containing iodine or heavy metals.
또한, 일 실시예에 있어서, 상기 중원자 분산제의 함량은 상기 수계 분산 나노 광감작제가 분산된 수계 분산액의 총중량에 대하여 0.0001 내지 5 중량%인 것을 특징으로 한다.In addition, in one embodiment, the content of the heavy atom dispersant is characterized in that 0.0001 to 5% by weight relative to the total weight of the aqueous dispersion in which the aqueous dispersion nano-photosensitive agent is dispersed.
또한, 일 실시예에 있어서, 상기 광감작제의 함량은 상기 수계 분산 나노 광감작제가 분산된 수계 분산액의 총중량에 대하여 0.0001 내지 0.01 중량%이고, 상기 생체 친화성 고분자의 함량은 상기 수계 분산 나노 광감작제가 분산된 수계 분산액의 총중량에 대하여 0.01 내지 50 중량%이고, 상기 물의 함량은 상기 수계 분산 나노 광감작제가 분산된 수계 분산액의 총중량에 대하여 45 내지 99.9899 중량%인 것을 특징으로 한다.In addition, in one embodiment, the content of the photosensitizer is 0.0001 to 0.01% by weight based on the total weight of the aqueous dispersion in which the aqueous dispersion nano-photosensitive agent is dispersed, the content of the bio-compatible polymer is the aqueous dispersion nano-light 0.01 to 50% by weight relative to the total weight of the aqueous dispersion in which the sensitizer is dispersed, and the water content is 45 to 99.9899% by weight relative to the total weight of the aqueous dispersion in which the aqueous dispersion nanophotosensitizer is dispersed.
또한, 일 실시예에 있어서, 상기 광감작제는, 흡광 파장이 500 내지 900 nm 범위인 것을 특징으로 한다.In addition, in one embodiment, the photosensitizer is characterized in that the absorption wavelength is in the range of 500 to 900 nm.
또한, 일 실시예에 있어서, 상기 광감작제는, 포피린계 (porphyrin family), 클로린계 (chlorin family) 및 프탈로시아닌계 (phthalocyanine family)로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 한다.In addition, in one embodiment, the photosensitizer is characterized in that at least one selected from the group consisting of porphyrin family (porphyrin family), chlorin family (chlorin family) and phthalocyanine family (phthalocyanine family).
또한, 일 실시예에 있어서, 상기 광감작제는, 클로린 e6 (Chlorin e6), 포토포피린 IX (photoporphyrin IX), 파이로피오포바이드-a (Pyropheophorbide-a (Ppa))로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 한다.In addition, in one embodiment, the photosensitizer is one type from the group consisting of Chlorin e6, photoporphyrin IX, Pyropheophorbide-a (Ppa) It is characterized in that the above selection.
또한, 일 실시예에 있어서, 상기 생체 친화성 고분자는, 폴록사머(poloxamer), 폴리락트글리콜산 (PLGA), 폴리락트산 (PLA), 폴리글리콜산 (PGA), 폴리카프로락톤, 폴리발레로락톤, 폴리히드록시부틸레이트, 폴리히드록시발러레이트 및 상기 고분자 중 적어도 하나가 함유된 공중합체로 이루어진 군에서 1종 이상 선택되는 것인 수계 분산 나노 광감작제인 것을 특징으로 한다.In addition, in one embodiment, the biocompatible polymer, poloxamer, polylactic glycol acid (PLGA), polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (PGA), polycaprolactone, polyvalerolactone , Polyhydroxybutylate, polyhydroxy valerate, and at least one selected from the group consisting of copolymers containing at least one of the above polymers.
또한, 일 실시예에 있어서, 상기 폴록사머는, 플루로닉
또한, 일 실시예에 있어서, 상기 생체 친화성 고분자는, 키토산, 키토산의 유도체, 헤파린, 헤파린의 유도체, 히아루론산, 히아루론의 유도체로 이루어진 군에서 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 한다.In one embodiment, the biocompatible polymer is characterized in that at least one selected from the group consisting of chitosan, chitosan derivatives, heparin, heparin derivatives, hyaluronic acid, hyaluronic derivatives.
또한, 일 실시예에 있어서, 수계 분산 나노 광감작제는 직경이 10 내지 300 nm인 것을 특징으로 한다.Further, in one embodiment, the aqueous dispersion nanophotosensitizer is characterized in that the diameter of 10 to 300 nm.
한편 상술한 과제를 실현하기 위한 본 명세서에 개시된 일 실시예에 따른 광역학 치료제는 상기 어느 하나의 수계 분산 나노 광감작제를 포함하는 것을 특징으로 한다. On the other hand, the photodynamic therapeutic agent according to an embodiment disclosed in the present specification for realizing the above-mentioned object is characterized in that it comprises any one of the aqueous dispersion nano-photosensitizer.
일 실시예에 있어서, 상기 광역학 치료제는, 생체내 암조직에 대하여 반응하고, 상기 반응 결과를 근거로 상기 생체내 암조직을 제거하는 것을 특징으로 한다. In one embodiment, the photodynamic therapeutic agent, in response to the cancer tissue in vivo, characterized in that to remove the cancer tissue in vivo based on the result of the reaction.
한편 상술한 과제를 실현하기 위한 본 명세서에 개시된 일 실시예에 따른 수계 분산 나노 광감작제의 제조 방법은, (a) 광감작제, 분자 분산제 및 생체 친화성 고분자를 유기 용매에 균일하게 용해시키는 단계; (b) 상기 유기 용매를 제거하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계의 생성물을 물에 분산시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.On the other hand, the method for producing a water-based dispersed nano-photosensitizer according to an embodiment disclosed in the present specification for realizing the above object, (a) to dissolve the photosensitizer, molecular dispersant and biocompatible polymer uniformly in an organic solvent. step; (b) removing the organic solvent; And (c) dispersing the product of step (b) in water.
한편 상술한 과제를 실현하기 위한 본 명세서에 개시된 일 실시예에 따른 수계 분산 나노 광감작제의 제조 방법은, (a) 광감작제 및 분자 분산제를 유기 용매 내에서 생체 친화성 고분자에 공유결합으로 결합시켜 혼합 용액을 생성하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 생성된 혼합용액의 투석을 통하여 공유결합되지 않고 남은 분자들을 제거하는 단계; (c)상기 (b)단계의 생성물을 동결 건조하는 단계; 및 (d) 상기 (c)단계의 생성물을 음파처리(sonication)로 물에 분산시키는 단계를 포함하는 특징으로 한다.Meanwhile, the method for preparing the aqueous dispersion nanophotosensitizer according to the embodiment disclosed in the present specification for realizing the above-mentioned object is (a) covalently bonding a photosensitizer and a molecular dispersant to a biocompatible polymer in an organic solvent. Combining to produce a mixed solution; (b) removing molecules remaining without covalent bonding through dialysis of the mixed solution generated in step (a); (c) freeze drying the product of step (b); And (d) dispersing the product of step (c) in water by sonication.
일 실시예에 따른 상기 수계 분산 나노 광감작제의 제조 방법에 있어서, 상기 수계 분산 나노 광감작제는, 광감작제; 상기 광감작제 및 분자 분산제를 포함하는 코어; 상기 코어를 둘러싸고 있는 생체 친화성 고분자; 및 물을 포함하는 것을 특징으로 한다.In the manufacturing method of the aqueous dispersion nano-photosensitizer according to an embodiment, the aqueous dispersion nano-photosensitizer, a photo-sensitizer; A core comprising the photosensitizer and a molecular dispersant; A biocompatible polymer surrounding the core; And water.
또한, 일 실시예에 있어서, 상기 광감작제는, 흡광 파장이 500 내지 900 nm 범위인 것을 특징으로 한다.In addition, in one embodiment, the photosensitizer is characterized in that the absorption wavelength is in the range of 500 to 900 nm.
또한, 일 실시예에 있어서, 상기 광감작제는, 포피린계 (porphyrin family), 클로린계 (chlorin family) 및 프탈로시아닌계 (phthalocyanine family)로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 한다.In addition, in one embodiment, the photosensitizer is characterized in that at least one selected from the group consisting of porphyrin family (porphyrin family), chlorin family (chlorin family) and phthalocyanine family (phthalocyanine family).
또한, 일 실시예에 있어서, 상기 광감작제는, 클로린 e6 (Chlorin e6), 포토포피린 IX (photoporphyrin IX), Pyropheophorbide-a (Ppa)로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 한다.In addition, in one embodiment, the photosensitizer is characterized in that at least one selected from the group consisting of chlorine e6 (Chlorin e6), photoporphyrin IX (Pyropheophorbide-a (Ppa)).
또한, 일 실시예에 있어서, 상기 중원자 분산제는, 요오드나 중금속류를 함유하는 소수성 분자로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 한다.In addition, in one embodiment, the heavy atom dispersant is characterized in that at least one selected from the group consisting of hydrophobic molecules containing iodine or heavy metals.
또한, 일 실시예에 있어서, 상기 생체 친화성 고분자는, 폴록사머(poloxamer), 폴리락트글리콜산 (PLGA), 폴리락트산 (PLA), 폴리글리콜산 (PGA), 폴리카프로락톤, 폴리발레로락톤, 폴리히드록시부틸레이트, 폴리히드록시발러레이트 및 이들이 함유된 공중합체로 이루어진 군에서 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 한다.In addition, in one embodiment, the biocompatible polymer, poloxamer, polylactic glycol acid (PLGA), polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (PGA), polycaprolactone, polyvalerolactone , Polyhydroxybutylate, polyhydroxy valerate, and at least one member selected from the group consisting of copolymers containing them.
또한, 일 실시예에 있어서, 상기 생체 친화성 고분자는, 키토산, 키토산의 유도체, 헤파린, 헤파린의 유도체, 히아루론산, 히아루론의 유도체로 이루어진 군에서 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 한다.In one embodiment, the biocompatible polymer is characterized in that at least one selected from the group consisting of chitosan, chitosan derivatives, heparin, heparin derivatives, hyaluronic acid, hyaluronic derivatives.
또한, 일 실시예에 있어서, 상기 수계 분산 나노 광감작제는, 직경이 10 내지 300 nm인 것을 특징으로 한다.In addition, in one embodiment, the aqueous dispersion nanophotosensitizer is characterized in that the diameter of 10 to 300 nm.
본 발명에 따르면, 광감작 효과가 향상되고 생체 친화성 고분자에 의해 생체 내에서 낮은 독성을 보이며 암 조직에 축적이 용이한 고효율의 나노 광감작제를 제조하여 생체 내 또는 생체 외 암세포의 사멸에 이용할 수 있다. According to the present invention, a high-efficiency nano-photosensitizer with improved photosensitization effect, low toxicity in vivo and easy to accumulate in cancer tissues by biocompatible polymers can be used to kill cancer cells in vivo or ex vivo. Can be.
본 명세서에 개시된 수계 분산 나노 광감작제의 구성요소 중 하나인 중원자 분산제는 중원자인 요오드나 중금속을 함유한 분자로서, 서로 가까운 거리에 있을 때 그 광감작 효과가 감소하는 광감작제를 분자 단위로 분산하고 광감작제가 여기 되었을 때 중원자 효과에 의해 중항으로의 계간 교차를 활성화하여 단일항 산소의 생성 효율을 증가 시키는 효과가 있다.The heavy atom dispersing agent, which is one of the components of the water-dispersed nanophotosensitizer disclosed herein, is a molecule containing heavy atoms of iodine or heavy metals. When the sensitizer is dispersed and the photosensitizer is excited, it increases the efficiency of generating singlet oxygen by activating the cross-over to the middle term by the heavy atom effect.
본 명세서에 개시된 수계 분산 나노 광감작제의 구성요소 중 하나인 생체 친화성 고분자는 생리적 환경에서 나노 광감작제의 분산 안정성 및 생체 친화성을 증가 시키고, 생체 친화성 고분자의 선택에 따라 암세포 침투성 및 생체 내에서 암 조직에 대한 광감작제 축적을 향상 시킬 수 있으며, 표면 개질을 통하여 다양한 기능성을 부여 할 수 있어 광역학 치료의 특정 조직에 대한 선택적 치료 기능을 향상시키는 효과가 있다. The biocompatible polymer, which is one of the components of the aqueous dispersion nanophotosensitizers disclosed herein, increases the dispersion stability and biocompatibility of the nanophotosensitizer in a physiological environment, and increases the cancer cell permeability and the bioavailability according to the selection of the biocompatible polymer. Accumulation of photosensitizers in cancer tissues can be improved in vivo, and various functionalities can be given through surface modification, thereby improving the selective therapeutic function of specific tissues of photodynamic therapy.
또한, 본 명세서에 개시된 수계 분산 나노 광감작제는 그 구성 요소 중 하나인 광감작제의 선택에 있어서 소수성 분자를 사용할 수 있어 기존 광감작제 개발에 있어서 중요한 과제 중 하나인 물에 대한 용해성을 높이기 위한 노력을 배제할 수 있어 광역학 치료에 적용 가능한 광감작제의 범위를 넓히는 효과가 있다. In addition, the water-dispersible nanophotosensitizer disclosed herein can use hydrophobic molecules in the selection of a photosensitizer, one of its components, thereby improving the solubility in water, which is one of the important challenges in the development of existing photosensitizers. Efforts can be excluded to broaden the range of photosensitizers applicable to photodynamic therapy.
도 1a 및 도 1b는 상기 BASF사의 플루로닉 제품들의 사양을 나타내는 도표이다.
도 2은 본 명세서에 개시된 실시예 1에 기재된 방법으로 제조되는 중원자 분산제를 함유한 광역학 치료용 수계 분산 나노 광감작제의 구조 및 상기 나노 광감작제의 중원자 분산제에 의한 광감작 효과 증진의 모식도이다.
도 3의 (a)는 본 명세서에 개시된 실시예 1의 (1)에서 제조한 FIC NP의 투과 전자 현미경 (TEM) 사진이고, 도 3의 (b)는 본 명세서에 개시된 실시예 1의 (2)에서 제조한 GC-I-Ce6 NP의 투과 전자 현미경 (TEM) 사진이다.
도 4의 (a)는 본 명세서에 개시된 실시예 2의 (1)에 의해 측정된 Ce6, FMC NP, FIC NP의 레이저 조사 시간에 따른 단일항 산소 생성량을 도시한 그래프이고, 도 4의 (b)는 본 명세서에 개시된 실시예 2의 (1)에 의해 측정된 Ce6, Gc-Me-Ce6 NP, GC-I-Ce6 NP의 레이저 조사 시간에 따른 단일항 산소 생성에 의한 RNO 흡수의 감소를 도시한 그래프이다.
도 5는 본 명세서에 개시된 실시예 2의 (2)에 의해 측정된 FIC NP와 Ce6가 축적된 세포의 광학 영상 (DIC) 및 근적외 형광 영상 (NIRFL) 이다.
도 6는 세포 생존율을 도시한 그래프이며, 도 6의 (a)는 본 명세서에 개시된 실시예 3의 (1)의 MTT 방법으로 측정된 광감작제가 축적되지 않은 세포 (Control), FIC NP가 5 시간 동안 축적된 세포 (FIC), Ce6가 5시간 동안 축적된 세포 (Ce6)를 어둠속에서 15 시간 배양하였을 때의 생존율을 도시한 그래프이고, 도 6의 (b)는 671 nm 레이저 조사 후 15 시간 배양하였을 때의 세포 생존율을 도시한 그래프이다.
도 7은 본 명세서에 개시된 실시예 3의 (1)에 의해 측정된 FIC NP 가 축적된 세포와 Ce6가 축적된 세포에 671 nm 레이저를 조사 하거나 (Laser +) 조사하지 않은 (Laser -) 후에 아넥신 5-FITC를 첨가한 세포들의 광학 영상 (왼쪽), FITC 형광 영상 (가운데), 광학과 형광의 중첩 영상 (오른쪽) 이다.
도 8은 본 명세서에 개시된 실시예 3의 (1)에 의해 측정된 FIC NP 가 축적된 세포와 Ce6가 축적된 세포에 0.1 mm 가량의 좁은 틈을 통해 671 nm 레이저를 조사한 후 트리판 블루로 염색한 세포들의 광학 영상들이다.
도 9은 본 명세서에 개시된 실시예 3의 (2)에 의해 동물용 형광 영상 장비로 측정된 GC-I-Ce6 NP가 꼬리 정맥에 주사된 암 모델 수컷 쥐의 시간에 따른 형광 영상들이다.
도 10는 본 명세서에 개시된 실시예 3의 (2)에 의해 동물용 형광 영상 장비로 측정된 FIC NP와 Ce6가 암 조직에 국소 주사된 수컷 쥐의 시간에 따른 형광 영상 (a) 및 GC-I-Ce6 NP와 Ce6가 암 조직에 국소 주사된 수컷 쥐의 시간에 따른 형광 영상 (b) 이다.1A and 1B are diagrams showing specifications of Pluronic products of BASF.
2 is a view illustrating a structure of an aqueous dispersion nanophotosensitizer for treating photodynamics containing a heavy atom dispersant prepared by the method described in Example 1 disclosed herein, and enhancement of the photosensitization effect by the heavy atom dispersant of the nanophotosensitizer. It is a schematic diagram of.
(A) of FIG. 3 is a transmission electron microscope (TEM) photograph of the FIC NP prepared in (1) of Example 1 disclosed herein, and (b) of FIG. 3 is (2) of Example 1 disclosed herein Transmission electron microscopy (TEM) of GC-I-Ce6 NP prepared in
Figure 4 (a) is a graph showing the amount of singlet oxygen generation according to the laser irradiation time of Ce6, FMC NP, FIC NP measured by (1) of Example 2 disclosed herein, Figure 4 (b) ) Shows the decrease in RNO absorption by singlet oxygen production with laser irradiation time of Ce6, Gc-Me-Ce6 NP, GC-I-Ce6 NP measured by (1) of Example 2 disclosed herein One graph.
5 is an optical image (DIC) and near-infrared fluorescence image (NIRFL) of cells in which FIC NP and Ce6 are accumulated, measured by (2) of Example 2 disclosed herein.
Figure 6 is a graph showing the cell viability, Figure 6 (a) is a cell that does not accumulate the photosensitizer measured by the MTT method of Example 3 (1) disclosed in the present disclosure (Control), FIC NP is 5 It is a graph showing the survival rate when the cells accumulated for time (FIC), Ce6 accumulated cells for 5 hours (Ce6) incubated for 15 hours in the dark, Figure 6 (b) is 15 after 671 nm laser irradiation It is a graph which shows the cell survival rate in time culture.
Figure 7 shows the cells after FIC NP accumulation and Ce6 accumulation cells measured by (1) of Example 3 disclosed herein after irradiation with a 671 nm laser (Laser +) or not (Laser-). Optical images (left), FITC fluorescence images (center), and overlapping images of optics and fluorescence (right) of cells with Nexin 5-FITC.
FIG. 8 is a dye stained with trypan blue after irradiation with a 671 nm laser through a small gap of about 0.1 mm in FIC NP-accumulated cells and Ce6-accumulated cells measured by Example (1) disclosed herein. Optical images of one cell.
9 are fluorescence images over time of a cancer model male rat injected with a tail vein of GC-I-Ce6 NP measured by an animal fluorescence imaging apparatus according to Example 2 (2) disclosed herein.
FIG. 10 shows fluorescence images (a) and GC-I over time of male rats in which FIC NP and Ce6 were locally injected into cancer tissues measured by animal fluorescence imaging apparatus (2) of Example 3 disclosed herein. (B) Time-dependent fluorescence imaging of male rats in which Ce6 NP and Ce6 were topically injected into cancer tissue.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 명세서에 개시된 실시형태를 설명한다. 그러나 본 명세서에 개시된 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 명세서에 개시된 범위가 이하 설명하는 실시형태로 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에 개시된 실시형태는 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.Hereinafter, exemplary embodiments disclosed herein will be described with reference to the accompanying drawings. However, the embodiments disclosed herein may be modified in many different forms, and the scope disclosed herein is not limited to the embodiments described below. Embodiments disclosed herein are provided to more fully explain the present invention to those skilled in the art.
본 명세서에서 사용되는 용어는 본 명세서에 개시된 실시 예들의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어를 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 관례 또는 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 명세서에서 사용되는 용어는, 단순한 용어의 명칭이 아닌 그 용어가 가지는 실질적인 의미와 본 명세서의 전반에 걸친 내용을 토대로 해석되어야 함을 밝혀두고자 한다.The terminology used herein is a general term that is currently widely used, while taking into consideration the functions of the embodiments disclosed herein, but may vary according to the intention or custom of a person skilled in the art or the emergence of a new technology. . In addition, in certain cases, there may be a term arbitrarily selected by the applicant, in which case the meaning thereof will be described in the description of the corresponding invention. Therefore, it is intended that the terminology used herein should be interpreted based on the meaning of the term rather than on the name of the term, and on the entire contents of the specification.
또한, 본 명세서에 첨부된 도면의 구성요소들은 설명의 편의를 위하여 확대 또는 축소되어 도시되어 있을 수 있음이 고려되어야 한다.In addition, it should be considered that the constituent elements of the drawings attached hereto can be enlarged or reduced for convenience of explanation.
종래의 광감작제의 소수성에 기한 양자효율의 감소 및 수용성 광감작제의 임상 적용성의 한계등의 문제점들은 종양 표적화 및 세포내 전달을 용이하게 하는 수분산 고분자 나노입자에 광감작제를 봉입함으로써 해결할 수 있다. 10 내지 200 nm 크기의 나노입자는 세포내에 침투가 용이하고 배출이 어려워 세포내에 잘 축적되는 특성을 가질 수 있다. 전형적인 약물 전달 시스템과 달리 광역학 치료용 나노 전달체는 광감작제의 방출을 필요로 하지 않는 대신 실제 치료의 주체인 산소종이 나노 입자 메트릭스 내 외로 확산 될 수 있도록 하는 것이 중요할 수 있다. 또한, 이러한 나노입자 광감작제는 그 내부 혹은 외부에 분자 영상이나 능동적 암 표적을 위한 다양한 기능성을 부여하는 물질을 함유 할 수 있는 장점이 있을 수 있다.Problems such as the reduction of quantum efficiency due to the hydrophobicity of conventional photosensitizers and the limitation of clinical applicability of water-soluble photosensitizers are solved by encapsulating the photosensitizer in water-dispersible polymer nanoparticles that facilitate tumor targeting and intracellular delivery. Can be. The nanoparticles having a size of 10 to 200 nm may be easily penetrated into cells and difficult to be discharged, and thus may accumulate well in the cells. Unlike typical drug delivery systems, photodynamic therapy nanocarriers do not require the release of photosensitizers, but it may be important to allow oxygen species, which are the subject of actual therapy, to diffuse into and out of the nanoparticle matrix. In addition, such nanoparticle photosensitizer may have an advantage that may contain a material that imparts a variety of functionalities for molecular imaging or active cancer targets inside or outside.
이러한 장점들에도 불구하고 나노 전달체 접근법은 봉입된 광감작제 분자들의 국소적 농도가 증가하였을 때 조사된 빛에 의해 여기된 전자가 빠르게 비복사 감쇄 과정을 거쳐 바닥상태로 되돌아오는 농도 소광 효과를 보여 산소 분자를 활성 산소종인 단일항 산소로 만드는 광물리 과정이 차단되기 때문에 전달체 내의 광감작제 분자의 농도는 상당히 낮은 농도로 제한될 수 있다.Despite these advantages, the nanocarrier approach shows a concentration quenching effect in which electrons excited by irradiated light rapidly return to the ground state through nonradiative attenuation when the local concentration of encapsulated photosensitizer molecules increases. The concentration of photosensitizer molecules in the carrier can be limited to considerably lower concentrations because the photophysical process of converting oxygen molecules into active oxygen species, singlet oxygen, is blocked.
나노 광감작제 시스템에서 광감작 효과를 높일 수 있는 하나의 방법은 분자간 상호작용을 이용하여 봉입된 광감작제의 광물리 성질을 변화시키는 것일 수 있다. 예를 들어, 원자량이 큰 원소인 요오드가 다량 도입된 실리카 나노 입자에 광감작제를 봉입하여 ‘입자내 무거운 원자 효과 (intraparticle heavy-atom effect)'라는 새로운 개념을 도입하여 광감작 효과를 높인 결과가 발표되었다. 세포독성을 가진 활성산소 중 하나인 단일항 산소의 생성은 광감작제의 삼중항 상태와 주위의 산소 분자 간의 반응에 의해 생성되므로, 광감작제의 여기상태가 단일항 상태에서 삼중항 상태로 전이되는 계간 교차 (intersystem crossing(ISC))의 효율에 직접적으로 관계되는데, 계간교차는 무거운 원자가 매우 가까이 근접한 계에서 스핀-궤도 결합 (spin-orbit coupling)이 강화됨에 따라 그 효율이 증가할 수 있다. 따라서 요오드가 도입된 실리카 나노 입자에 봉입된 광감작제는 주변의 요오드에 의해 계간 교차가 더욱 활성화 되어 단일항 산소의 생성을 증가시킬 수 있다.One way to increase the photosensitization effect in the nanophotosensitizer system may be to change the photophysical properties of the encapsulated photosensitizer using intermolecular interactions. For example, a photosensitizer was encapsulated in silica nanoparticles containing a large amount of iodine, an element having a large atomic weight, and a new concept called 'intraparticle heavy-atom effect' was introduced to increase the photosensitization effect. Was released. The production of singlet oxygen, one of cytotoxic active oxygen, is produced by the reaction between the triplet state of the photosensitizer and the surrounding oxygen molecules, so that the excited state of the photosensitizer transitions from the singlet state to the triplet state. This is directly related to the efficiency of intersystem crossing (ISC), which can increase as spin-orbit coupling is enhanced in systems where heavy atoms are very close. Therefore, the photosensitizer encapsulated in the iodine-incorporated silica nanoparticles may further increase the generation of singlet oxygen by the cross-linking between the iodine surroundings is further activated.
효과적인 광역학 치료를 위한 광감작제의 개발은 암 세포 표적성 및 다양한 기능성을 부여할 수 있는 생체 친화성 나노 전달체와 내부에 도입된 광감작제를 분자 단위로 잘 분산 시키고 단일항 산소 생성 효율을 높여줄 수 있는 효과적인 분자분산제를 도입함 으로써 달성될 수 있다.The development of a photosensitizer for effective photodynamic therapy is to disperse biocompatible nanocarriers that can impart cancer cell targeting and various functionalities and the photosensitizer introduced into the molecule, and to increase the efficiency of singlet oxygen production. This can be achieved by introducing an effective molecular dispersant that can be enhanced.
본 명세서에 개시된 일 실시예에 따른 수계 분산 나노 광감작제는,The aqueous dispersion nanophotosensitizer according to one embodiment disclosed herein,
(A) 광감작제와 중원자 분산제가 축적된 나노 입자 코어와, (A) a nanoparticle core in which a photosensitizer and a heavy atom dispersant are accumulated,
(B) 상기 코어를 둘러싸고 있는 생체 친화성 고분자와, (B) a biocompatible polymer surrounding the core,
(C) 물 (C) Water
로 구성되는 것을 특징으로 한다.. ≪ / RTI >
바람직하게는, 나노 광감작제가 분산된 수계 분산액의 총중량에 대하여 상기 광감작제의 함량은 0.0001 내지 0.01 중량%, 상기 중원자 분산제의 함량은 0 내지 5 중량%, 상기 생체 친화성 고분자의 함량은 0.01 내지 50 중량%, 물의 함량은 45 내지 99.9899 중량%이다.Preferably, the content of the photosensitizer is 0.0001 to 0.01% by weight, the content of the heavy atom dispersant is 0 to 5% by weight, and the content of the biocompatible polymer is based on the total weight of the aqueous dispersion in which the nanophotosensitizer is dispersed. 0.01 to 50% by weight, the water content is 45 to 99.9899% by weight.
상기 광감작제는 레이저 조사 시 단일항 산소를 발생시킬 수 있는 물질 중 나노 입자의 내부에 봉입될 수 있는 물질로 500 내지 900 nm 범위의 흡광 파장을 가진다. 흡광 파장이 650 nm 미만이면 레이저 파장이 짧아서 생체 조직에 깊이 침투하지 못하므로 표피 근처에서의 광역학 치료에 활용이 가능하고, 650 nm 이상의 흡광 파장을 가지면 좀 더 깊은 조직에 대한 치료에 활용이 가능하지만, 흡광 파장이 900 nm보다 길면 생체 내에 과량으로 존재하는 물의 흡수에 의한 간섭이 증가하므로 바람직하지 못하다. 바람직하게는, 상기 광감작제는 포피린계 (porphyrin family), 클로린계 (chlorin family) 및 프탈로시아닌계 (phthalocyanine family)로 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택된다.The photosensitizer is a material that can be enclosed inside the nanoparticles of the material capable of generating singlet oxygen during laser irradiation and has an absorption wavelength in the range of 500 to 900 nm. If the absorption wavelength is less than 650 nm, the laser wavelength is too short to penetrate deep into the tissue, so it can be used for photodynamic therapy near the epidermis, and if the absorption wavelength is over 650 nm, it can be used for the treatment of deeper tissue. However, if the absorption wavelength is longer than 900 nm, it is not preferable because the interference by absorption of excess water in the living body increases. Preferably, the photosensitizer is selected from the group consisting of porphyrin family, chlorin family and phthalocyanine family.
상기 중원자 분산제는 요오드나 중금속류를 함유하는 소수성 분자로 광감작제를 분자 단위로 분산시켜 상기 광감작제가 수용액에서 서로 집합체를 이루어 단일항 산소를 생성하는 효율이 감소하는 현상을 방해하고, 중원자 효과에 의해 상기 광감작제가 레이저에 의해 여기되었을 때 그 여기된 전자가 삼중항으로 이동하는 계간 교차를 활성화 하여 광감작제의 여기된 삼중항 전자가 삼중항 산소 분자와 반응하여 단일항 산소를 생성하는 효율을 높이는 역할을 한다. The heavy atom dispersant is a hydrophobic molecule containing iodine or heavy metals to disperse the photosensitizer in molecular units, thereby preventing the efficiency of generating singlet oxygen by forming the aggregates in the aqueous solution, By virtue of this effect, when the photosensitizer is excited by a laser, the excited electrons are moved to the triplet, and the excited triplet electrons of the photosensitizer react with the triplet oxygen molecules to generate singlet oxygen. To increase efficiency.
상기 생체 친화성 고분자는 광감작제와 중원자 분산제를 포함하는 코어의 구조를 유지하는 지지체 역할과 상기 나노 광감작제가 혈액 내에서 안정적으로 순환할 수 있도록 하는 역할을 하여 상기 나노 광감작제가 생체 내의 암조직에 축적되기 쉽도록 하는 것으로서, 생리 환경에서의 분산 안정성 및 적합성을 위하여 생체 적합성 계면 활성제와 생체 고분자, 생분해성 고분자로 이루어진 군 중에서 선택하여 사용하는 것이 바람직하다.The biocompatible polymer serves as a support for maintaining a structure of a core including a photosensitizer and a heavy atom dispersant and enables the nanophotosensitizer to stably circulate in blood, thereby allowing the nanophotosensitizer to be in vivo. As it is easy to accumulate in cancer tissue, it is preferable to select from the group consisting of a biocompatible surfactant, a biopolymer, and a biodegradable polymer for dispersion stability and suitability in a physiological environment.
상기 생체 적합성 계면 활성제는 약물 전달 시스템 및 수화젤에 널리 사용되고 있는 폴록사머 (poloxamer) 계열의 계면 활성제인 것이 바람직하다. 구체적으로는, 플루로닉
도 1a 및 도 1b는 상기 BASF사의 플루로닉 제품들의 사양을 나타내는 도표이다.1A and 1B are diagrams showing specifications of Pluronic products of BASF.
상기 도 1a 및 도 1b를 참조하면, 순차적으로 각각 플루로닉
상기 폴록사머, 특히 플루로닉
상기 생체 고분자는 약물 전달 시스템에서 널리 사용되고 있는 키토산 및 그 유도체, 헤파린 및 그 유도체, 히아루로닉산 및 그 유도체 중 하나 이상 선택되는 것이 바람직하다. 상기 생체 고분자는 생체 적합성이 매우 뛰어나며 암 조직에 축적이 용이하여 나노 구조체의 구성 요소로 사용 될 경우 암 표적성이 현저히 증가하는 효과를 가진다. The biopolymer is preferably selected from one or more of chitosan and its derivatives, heparin and its derivatives, hyaluronic acid and its derivatives which are widely used in drug delivery systems. The biopolymer has excellent biocompatibility and has an effect of significantly increasing cancer targetability when used as a component of a nanostructure because it is easily accumulated in cancer tissue.
상기 생분해성 고분자는 약물 전달 시스템에서 널리 사용되고 있는 폴리락트글리콜산 (PLGA), 폴리락트산 (PLA), 폴리글리콜산 (PGA), 폴리카프로락톤, 폴리발레로락톤, 폴리히드록시부틸레이트, 폴리히드록시발러레이트 및 이들의 공중합체를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 생분해성 고분자는 생체 내에서 분해되므로 나노 입자가 장기간 생체 내에 축적되었을 때 나타날 수 있는 잠재적 독성 문제를 해결 할 수 있다.The biodegradable polymers are polylactic glycolic acid (PLGA), polylactic acid (PLA), polyglycolic acid (PGA), polycaprolactone, polyvalerolactone, polyhydroxybutylate, polyhydride, which are widely used in drug delivery systems. Preference is given to using oxyvalorate and copolymers thereof. Since the biodegradable polymer is decomposed in vivo, it may solve the potential toxicity problem that may occur when nanoparticles accumulate in vivo for a long time.
본 발명에 따른 수계 분산 나노 광 감작제의 직경은 5 내지 500 nm, 바람직하게는 10 내지 200 nm이다. 이것은 상기 나노 입자가 이러한 직경 범위 내에 있을 경우에 임상 및 진단용으로 적합하기 때문이다.The diameter of the aqueous dispersion nanophotosensitizer according to the invention is 5 to 500 nm, preferably 10 to 200 nm. This is because the nanoparticles are suitable for clinical and diagnostic purposes when they are within this diameter range.
또한, 본 발명은 상기 수계 분산 나노 광감작제를 포함하는 광역학 치료 용도에 관한 것이다. The present invention also relates to a photodynamic therapeutic use comprising the aqueous dispersion nanophotosensitizer.
본 발명에 따른 수계 분산 나노 광감작제는 아래 실시예에서 확인되는 바와 같이 향상된 단일항 산소 생성 효율을 보여주고 암세포에 대한 세포 침투성이 뛰어나 레이저 조사를 통해 정상 세포에 대한 피해를 최소화 하면서 암세포의 사멸을 유도 할 수 있다. The aqueous dispersion nanophotosensitizer according to the present invention shows improved singlet oxygen production efficiency and excellent cell permeability to cancer cells as confirmed in the following examples, while killing cancer cells while minimizing damage to normal cells through laser irradiation. Can induce
또한, 본 발명은 상기 수계 분산 나노 광감작제의 제조 방법에 관한 것으로서, 이 방법은, In addition, the present invention relates to a method for producing the aqueous dispersion nanophotosensitizer, the method,
(1) (a) 광감작제, 분자 분산제 및 생체 친화성 고분자를 유기 용매에 균일하게 용해시킨 다음, 상기 유기 용매를 제거하는 단계와, (1) uniformly dissolving a photosensitizer, a molecular dispersant, and a biocompatible polymer in an organic solvent, and then removing the organic solvent,
(b) 상기 단계 (a)의 생성물을 물에 분산시키는 단계(b) dispersing the product of step (a) in water
를 포함하는, 수계 분산 나노 광감작제의 제조 방법.A method of producing a water-based dispersed nano-photosensitive agent comprising a.
(2) (a) 광감작제, 분자 분산제를 유기 용매 내에서 생체 친화성 고분자에 공유결합으로 결합시키고 투석을 통하여 결합되지 않은 분자들을 제거한 다음, 동결 건조하는 단계와, (2) (a) covalently binding the photosensitizer and the molecular dispersant to the biocompatible polymer in an organic solvent, removing unbound molecules through dialysis, and then freeze drying;
(b) 상기 단계 (a)의 생성물을 음파처리 (sonication)로 물에 분산시키는 단계(b) dispersing the product of step (a) in water by sonication;
를 포함하는, 수계 분산 나노 광감작제의 제조 방법.A method of producing a water-based dispersed nano-photosensitive agent comprising a.
을 포함한다..
실시예Example
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명하겠다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 명세서에 개시된 범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, these examples are intended to illustrate the invention, and the scope disclosed herein is not limited to these examples.
실시예 1: 나노 광감작제의 제조Example 1 Preparation of Nanophotosensitizers
(1) 생체 적합성 계면활성제를 포함하는 나노 광감작제의 제조(1) Preparation of Nanophotosensitizers Containing Biocompatible Surfactants
생체 적합성 계면활성제인 플루로닉
그 다음, 증류수 1 mL를 첨가하고, 균일하게 혼합하여 중심부, 즉 코어에 디아트리조산이 축적된 수계 분산 나노 입자 (FIC NP), 또는 트리메틸벤조산이 축적된 수계 분산 나노 입자 (FMC NP)를 얻었다. Then, 1 mL of distilled water was added and uniformly mixed to obtain aqueous dispersion nanoparticles (FIC NP) in which ditrizoic acid was accumulated in the center, ie, core, or aqueous dispersion nanoparticles (FMC NP), in which trimethylbenzoic acid was accumulated. .
도 2은 본 명세서에 개시된 실시예 1에 기재된 방법으로 제조되는 중원자 분산제를 함유한 광역학 치료용 수계 분산 나노 광감작제의 구조 및 상기 나노 광감작제의 중원자 분산제에 의한 광감작 효과 증진의 모식도이다.2 is a view illustrating a structure of an aqueous dispersion nanophotosensitizer for treating photodynamics containing a heavy atom dispersant prepared by the method described in Example 1 disclosed herein, and enhancement of the photosensitization effect by the heavy atom dispersant of the nanophotosensitizer. It is a schematic diagram of.
도 2을 참조하면, 상기 중원자 분산제는 요오드(I)를 함유하는 소수성 분자인 경우를 나타내며, 상기 중원자 분산제는 상기 광감작제(PS)를 분자 단위로 분산시켜 상기 광감작제(PS)가 수용액에서 서로 집합체를 이루어 단일항 산소(1O2)를 생성하는 효율이 감소하는 현상을 방해하고, 상기 중원자 효과에 의해 상기 광감작제(PS)가 레이저에 의해 여기되었을 때 그 여기된 전자가 삼중항으로 이동하는 계간 교차를 활성화 하여 광감작제의 여기된 삼중항 전자가 삼중항 산소 분자(3O2)와 반응하여 단일항 산소(1O2)를 생성하는 효율이 증가 있고, 이로 인해 향상된 감작(enhanced sensitization) 특성 및 세포 독성(cytotoxicity) 특성을 보일 수 있다.Referring to FIG. 2, the heavy atom dispersing agent is a hydrophobic molecule containing iodine (I), and the heavy atom dispersing agent disperses the photosensitizer (PS) in a molecular unit to form the photosensitive agent (PS). When the photosensitive agent (PS) is excited by a laser due to the heavy atom effect, it hinders the phenomenon that the efficiency of generating singlet oxygen ( 1 O 2 ) by aggregating with each other in an aqueous solution decreases. The efficiency of generating singlet oxygen ( 1 O 2 ) is increased by activating the intersecting cross where electrons move to triplet, and the excited triplet electrons of the photosensitizer react with triplet oxygen molecules ( 3 O 2 ), This may result in enhanced sensitization and cytotoxicity.
도 3의 (a)는 본 명세서에 개시된 실시예 1의 (1)에서 제조한 FIC NP의 투과 전자 현미경 (TEM) 사진이다.Figure 3 (a) is a transmission electron microscope (TEM) photograph of the FIC NP prepared in Example 1 (1) disclosed herein.
도 3의 (a)를 참조하면, 상기 TEM으로 측정된 결과에 의해 10 nm가량의 균일한 구형 나노 입자를 형성함을 확인할 수 있다.Referring to Figure 3 (a), it can be seen that by forming a uniform spherical nanoparticles of about 10 nm by the result measured by the TEM.
(2) 생체 고분자에 나노 광감작제의 제조 (2) Preparation of Nanophotosensitizer in Biopolymer
디아트리조산 170 mg 또는 트리메틸벤조산 45.5 mg 과, EDC (ethyl-N',N'-dimethylamino)propylcarbodiimide, Aldrich에서 구입 가능) 74 mg, NHS (N-hydroxysuccinimide, Aldrich에서 구입 가능) 45 mg 을 10 mL 의 DMSO (dimethyl sulfoxide) 에 녹이고 교반하였다.10 mL of 170 mg of ditrizoic acid or 45.5 mg of trimethylbenzoic acid, 74 mg of EDC (ethyl-N ', N'-dimethylamino) propylcarbodiimide, available from Aldrich), 45 mg of NHS (N-hydroxysuccinimide, available from Aldrich) And dissolved in DMSO (dimethyl sulfoxide).
글리콜키토산 113.5 mg 을 2 mL 의 물에 녹인 후 상기 DMSO 용액에 서서히 적가하고, 혼합 용액을 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 교반 후 상기 혼합 용액을 Cellu.Sep 분리막 (Membrane Filteration Products 에서 구입가능, molecular cutoff = 50 kDa) 에 담은 후 DMSO에서 이틀간 투석한 후, 증류수에서 이틀간 투석하였다. 투석이 끝난 혼합물은 동결건조 하여 디아트리조산이 도입된 GC-I-Ce6 나노입자 (GC-I-Ce6 NP)와 트리메틸벤조산이 도입된 GC-Me-Ce6 나노입자 (GC-Me-Ce6 NP)를 얻었다. 113.5 mg of glycolchitosan was dissolved in 2 mL of water, and then slowly added dropwise to the DMSO solution, and the mixed solution was stirred at room temperature for 24 hours. After stirring, the mixed solution was placed in Cellu.Sep membrane (available from Membrane Filteration Products, molecular cutoff = 50 kDa), dialyzed in DMSO for 2 days, and then dialyzed in distilled water for 2 days. After the dialysis mixture was lyophilized, GC-I-Ce6 nanoparticles (GC-I-Ce6 NP) with ditrizoic acid and GC-Me-Ce6 nanoparticles (GC-Me-Ce6 NP) with trimethylbenzoic acid were introduced. Got.
도 3의 (b)는 본 명세서에 개시된 실시예 1의 (2)에서 제조한 GC-I-Ce6 NP의 투과 전자 현미경 (TEM) 사진이다. Figure 3 (b) is a transmission electron microscope (TEM) photograph of GC-I-Ce6 NP prepared in Example (2) of the present disclosure.
도 3의 (b)를 참조하면, 실시예 1의 (2)에서 개시된 제조방법에 의해 얻어진 나노입자는 냉동 보관한 후 필요시에 물에 넣고 초음파 처리하여 재분산 시켜 100 nm 이하의 구형 나노입자를 얻어질 수 있다.Referring to (b) of Figure 3, the nanoparticles obtained by the manufacturing method disclosed in Example 1 (2) is frozen and stored in water if necessary, sonicated and re-dispersed, spherical nanoparticles of 100 nm or less Can be obtained.
실시예 2: 나노 광감작제의 단일항 산소 생성 특성 및 암세포 침투성 분석Example 2: Singlet Oxygen Production Characteristics and Cancer Cell Permeability Analysis of Nanophotosensitizers
(1) 나노 광감작제의 단일항 산소 생성 특성 분석(1) Analysis of Singlet Oxygen Generation Characteristics of Nanophotosensitizers
단일항 산소의 생성은 N-니트로소디메틸아닐린 (N-nirosodimethylanilin (RNO))의 단일항 산소에 의한 표백을 440 nm에서의 흡광도 감소로 관찰하는 RNO 테스트로 분석하였다.The production of singlet oxygen was analyzed by RNO test, which observed the bleaching of N-nirosodimethylanilin (RNO) by singlet oxygen with reduced absorbance at 440 nm.
0.21 mL 나노 광감작제 수계분산 혹은 Ce6 수용액과, 0.11 mL의 RNO 표준 용액 (0.12 mM 수용액), 0.7 mL의 히스티딘 (histidine) 용액 (0.03 M 수용액), 0.18 mL의 증류수를 혼합하고 그 혼합 용액에 671 nm의 레이저를 조사하며 시간에 따른 440 nm의 흡광도를 측정하였다.0.21 mL nanophotosensitizer aqueous dispersion or Ce6 aqueous solution, 0.11 mL RNO standard solution (0.12 mM aqueous solution), 0.7 mL histidine solution (0.03 M aqueous solution), and 0.18 mL distilled water are mixed and mixed into the mixed solution. A 671 nm laser was irradiated and the absorbance at 440 nm was measured over time.
도 4의 (a)는 본 명세서에 개시된 실시예 2의 (1)에 의해 측정된 Ce6, FMC NP, FIC NP의 레이저 조사 시간에 따른 단일항 산소 생성량을 도시한 그래프이고, 도 4의 (b)는 본 명세서에 개시된 실시예 2의 (1)에 의해 측정된 Ce6, Gc-Me-Ce6 NP, GC-I-Ce6 NP의 레이저 조사 시간에 따른 단일항 산소 생성량을 도시한 그래프이다.Figure 4 (a) is a graph showing the amount of singlet oxygen generation according to the laser irradiation time of Ce6, FMC NP, FIC NP measured by (1) of Example 2 disclosed herein, Figure 4 (b) ) Is a graph showing the amount of singlet oxygen production according to the laser irradiation time of Ce6, Gc-Me-Ce6 NP, GC-I-Ce6 NP measured by Example (1) of the present disclosure.
도 4의 (a) 및 도 4의 (b)를 참조하면, 측정된 440 nm의 흡광도 값을 레이저 조사 전의 흡광도 값을 1로 하여 그에 대한 흡광도 감소율을 계산하고, 계산된 값을 음의 자연로그 (-ln(y))로 취한 후, 그 계산 결과에 100을 곱하여 활성산소의 생성량으로 정의하고, 이를 시간에 따라 도시하였다.Referring to FIGS. 4A and 4B, the absorbance value of 440 nm is measured as the absorbance value before laser irradiation, and the absorbance reduction rate is calculated. The calculated value is a negative natural log. After taking as (-ln (y)), multiplying the result of the calculation by 100, it was defined as the amount of active oxygen produced, and it was shown with time.
또한, 상기 나노 광감작제 각각의 레이저 조사 시간에 따른 단일항 산소의 생성 효율을 각각의 기울기로 나타낼 수 있고, 이를 Ce6의 단일항 산소 생성 양자 효율인 0.64를 기준으로 서로 비교하여 상대적인 단일항 생성 양자 효율을 계산할 수 있다.In addition, the generation efficiency of singlet oxygen according to the laser irradiation time of each of the nanophotosensitizers can be represented by the respective slopes, and the relative singlet generation is compared with each other based on 0.64 which is the singlet oxygen generation quantum efficiency of Ce6. Quantum efficiency can be calculated.
상기 계산된 단일항 산소 생성 효율은 FIC NP, FMC NP, GC-I-Ce6 NP, GC-Me-Ce6 NP 각각에 대하여 1.13, 0.45, 0.59, 0.45의 값으로 나타나, 중원자 분산제의 사용에 의한 효율 증가를 확인할 수 있다.The calculated singlet oxygen production efficiency is represented by the values of 1.13, 0.45, 0.59, and 0.45 for FIC NP, FMC NP, GC-I-Ce6 NP, and GC-Me-Ce6 NP, respectively. The increase in efficiency can be seen.
(2) 나노 광감작제의 암세포 침투 특성 분석(2) Analysis of Cancer Cell Penetration Characteristics of Nanophotosensitizers
인간의 유방암 세포 중 하나인 MDA-MB-231 세포가 배양된 배양액에 FIC NP와 Ce6를 첨가하여 세포내에 광감작제가 침투 할 수 있도록 하고 형광 이미징을 통하여 세포 내에 축적된 광감작제의 양을 비교하여 나노 광감작제의 세포 침투 특성을 분석 하였다.FIC NP and Ce6 were added to the culture medium in which MDA-MB-231 cells, one of human breast cancer cells, were cultured so that the photosensitiser could penetrate into the cells and compared with the amount of the photosensitizer accumulated in the cells through fluorescence imaging. The cell penetration characteristics of nanophotosensitizers were analyzed.
MDA-MB-231 세포들을 35 mm 디쉬에서 배양하고 PBS (pH 7.4)로 두 번 씻어준 후 혈청이 함유되지 않은 세포 배양액 2 mL를 첨가하고, 2.6 mg의 FIC NP (Ce6 함량: 0.001 mg) 또는 0.001 mg Ce6를 첨가한 후 5% 이산화탄소, 37 °C의 환경 하에서 3시간 동안 배양 하였다. 배양된 세포들은 차가운 PBS (pH 7.4)로 두 번 씻어준 후 혈청이 함유되지 않은 세포 배양액을 2 mL 첨가하고, 형광 현미경 (Olympus BX21; Olympus 사 제품)으로 관찰 하였다.Incubate the MDA-MB-231 cells in a 35 mm dish, wash twice with PBS (pH 7.4), add 2 mL of serum-free cell culture, add 2.6 mg of FIC NP (Ce6 content: 0.001 mg) or After adding 0.001 mg Ce6 and incubated for 3 hours under the environment of 5% carbon dioxide, 37 ° C. The cultured cells were washed twice with cold PBS (pH 7.4), and then 2 mL of cell culture solution containing no serum was added and observed by fluorescence microscopy (Olympus BX21; manufactured by Olympus).
도 5는 본 명세서에 개시된 실시예 2의 (2)에 의해 측정된 FIC NP와 Ce6가 축적된 세포의 광학 영상 (DIC) 및 근적외 형광 영상 (NIRFL) 이다.5 is an optical image (DIC) and near-infrared fluorescence image (NIRFL) of cells in which FIC NP and Ce6 are accumulated, measured by (2) of Example 2 disclosed herein.
도 5를 참조하면, 상기 관찰된 형광 영상을 분석 하였을 때, FIC NP를 첨가한 세포의 형광 세기가 Ce6를 첨가한 세포의 형광 세기에 비하여 3 배 가량 강하여 FIC NP의 세포 침투성이 단분자인 Ce6에 비해 우수함을 확인할 수 있었다.Referring to FIG. 5, when the observed fluorescence images were analyzed, the fluorescence intensity of the cells added with FIC NP was about three times stronger than the fluorescence intensity of cells added with Ce6. It was confirmed that the superior to.
실시예 3: 나노 광감작제의 암세포에 대한 세포 독성 및 생체내 분포 특성 분석 Example 3 Analysis of Cytotoxicity and In vivo Distribution of Nanophotosensitizer to Cancer Cells
(1) 나노 광감작제의 암세포에 대한 세포 독성 평가(1) Cytotoxicity Assessment of Cancer Cells by Nanophotosensitizers
MDA-MB-231 세포에 나노 광감작제 또는 Ce6를 축적 시키고 레이저 조사하거나 혹은 어둠속에 보관함에 따른 세포 생존율을 3-(4,5-디메틸티아졸-2- 일)-2,5-디페닐테트라조리움 브롬마이드 (MTT) 방법으로 분석하여 세포에 대한 독성을 평가 하였고, 아넥신 5-FITC (annexin V-FITC) 킷을 이용하여 세포 사멸 경로를 입증하였으며, 트리판 블루 (trypan blue) 염색으로 레이저를 조사한 위치에서만 세포 사멸이 일어남을 입증하였다.3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl cell survival rate by accumulating nanophotosensitizer or Ce6 in MDA-MB-231 cells and laser irradiation or storage in the dark Tetrazolium bromide (MTT) method was used to assess the toxicity to cells, and the cell death pathway was demonstrated using the Annexin 5-FITC kit, and trypan blue staining. The cell death was demonstrated only at the laser irradiation position.
MDA-MB-231 세포를 96-웰 배양판 용기들에 배양하고, 각 웰에 0.026 mg의 FIC NP (Ce6 함량: 0.00001 mg) 또는 0.00001 mg의 Ce6를 첨가하고 5시간 동안 배양한 후, 세포를 씻어 주었다. 세포를 배양한 배양판 중 일부는 어둠 속에서 15 시간 동안 배양하였고, 나머지 배양판에는 671 nm 레이저 1.3 J cm-2를 조사한 후 15시간 동안 어둠속에서 배양하였다. 각각의 배양판을 MTT 방법으로 분석하여 세포의 생존율을 측정하였다.MDA-MB-231 cells were cultured in 96-well culture vessels, and 0.026 mg of FIC NP (Ce6 content: 0.00001 mg) or 0.00001 mg of Ce6 was added to each well and incubated for 5 hours, after which the cells were cultured. Washed. Some of the cultured culture plates were incubated for 15 hours in the dark, and the rest of the culture plates were irradiated with a 671 nm laser 1.3 J cm-2 and then incubated in the dark for 15 hours. Each culture plate was analyzed by MTT method to determine the viability of the cells.
도 6는 세포 생존율을 도시한 그래프이며, 도 6의 (a)는 본 명세서에 개시된 실시예 3의 (1)의 MTT 방법으로 측정된 광감작제가 축적되지 않은 세포 (Control), FIC NP가 5 시간 동안 축적된 세포 (FIC), Ce6가 5시간 동안 축적된 세포 (Ce6)를 어둠속에서 15 시간 배양하였을 때의 생존율을 도시한 그래프이고, 도 6의 (b)는 671 nm 레이저 조사 후 15 시간 배양하였을 때의 세포 생존율을 도시한 그래프이다.Figure 6 is a graph showing the cell viability, Figure 6 (a) is a cell that does not accumulate the photosensitizer measured by the MTT method of Example 3 (1) disclosed in the present disclosure (Control), FIC NP is 5 It is a graph showing the survival rate when the cells accumulated for time (FIC), Ce6 accumulated cells for 5 hours (Ce6) incubated for 15 hours in the dark, Figure 6 (b) is 15 after 671 nm laser irradiation It is a graph which shows the cell survival rate in time culture.
도 6를 참조하면, 어둠속에서만 보관된 배양판에서는 광감작제가 첨가되지 않은 세포, FIC NP가 축적된 세포, Ce6가 축적된 세포에 대하여 각각, 100%, 95%, 99%의 높은 세포 생존율을 보여주었지만, 레이저를 조사한 배양판에서는 각각, 100%, 45%, 85%의 생존율을 보여주어, 광감작제는 빛의 조사에 의해 세포 독성이 발생 되고, 특히 FIC NP는 레이저 조사 하에서 높은 세포 사멸 효과가 있음을 확인하였다.Referring to FIG. 6, in the culture plate stored only in the dark, high cell viability of 100%, 95%, and 99% for cells without photosensitizer, cells with FIC NP, and cells with Ce6 were accumulated, respectively. In the cultured laser plate, the survival rate was 100%, 45% and 85%, respectively, and the photosensitizer caused cytotoxicity by irradiation of light, especially FIC NP was high under laser irradiation. It was confirmed that there is a cell death effect.
도 7은 본 명세서에 개시된 실시예 3의 (1)에 의해 측정된 FIC NP 가 축적된 세포와 Ce6가 축적된 세포에 671 nm 레이저를 조사 하거나 (Laser +) 조사하지 않은 (Laser -) 후에 아넥신 5-FITC를 첨가한 세포들의 광학 영상 (왼쪽), FITC 형광 영상 (가운데), 광학과 형광의 중첩 영상 (오른쪽) 이다. Figure 7 shows the cells after FIC NP accumulation and Ce6 accumulation cells measured by (1) of Example 3 disclosed herein after irradiation with a 671 nm laser (Laser +) or not (Laser-). Optical images (left), FITC fluorescence images (center), and overlapping images of optics and fluorescence (right) of cells with Nexin 5-FITC.
도 8은 본 명세서에 개시된 실시예 3의 (1)에 의해 측정된 FIC NP 가 축적된 세포와 Ce6가 축적된 세포에 0.1 mm 가량의 좁은 틈을 통해 671 nm 레이저를 조사한 후 트리판 블루로 염색한 세포들의 광학 영상들이다.FIG. 8 is a dye stained with trypan blue after irradiation with a 671 nm laser through a small gap of about 0.1 mm in FIC NP-accumulated cells and Ce6-accumulated cells measured by Example (1) disclosed herein. Optical images of one cell.
도 7 및 도 8를 참조하면, 상기 나노 광감작제에 의한 세포 사멸 과정의 경로 및 효율을 분석하기 위해 네 개의 35 mm 디쉬에 MDA-MB-231 세포를 배양하고, 두 개의 디쉬에 1.3 mg의 FIC NP (Ce6 함량: 0.0005 mg)를, 다른 두 개의 디쉬에는 0.0005 mg의 Ce6를 첨가하여 5시간 배양한 후, FIC NP 디쉬와 Ce6 디쉬 각각 하나에만 671 nm 레이저 6 J cm-2를 조사하고, 모든 디쉬에 아넥신 5-FITC를 가해준 후 형광 현미경으로 형광 이미지를 얻었다.7 and 8, MDA-MB-231 cells were incubated in four 35 mm dishes and 1.3 mg in two dishes to analyze the path and efficiency of the cell death process by the nanophotosensitizer. After incubating FIC NP (Ce6 content: 0.0005 mg) for 5 hours with 0.0005 mg of Ce6 added to the other two dishes, only one FIC NP dish and one Ce6 dish were irradiated with a 671 nm laser 6 J cm-2. Annexin 5-FITC was added to all dishes to obtain fluorescence images under a fluorescence microscope.
얻어진 형광 이미지로 분석한 결과, FIC NP가 축적된 세포에 레이저를 조사한 디쉬의 형광 이미지에서 강한 FITC의 형광이 나타나서 FIC NP와 레이저 조사에 의한 세포 사멸 경로가 아팝토시스 (apoptosis) 경로임을 확인하였고 Ce6에 레이저를 조사한 디쉬의 이미지에서 나타나는 FITC 형광에 비해 5배 가량 높은 형광으로 세포 사멸에 있어서 FIC NP의 우수성을 다시 한번 확인할 수 있었다.As a result of analysis with the obtained fluorescence image, strong FITC fluorescence appeared in the fluorescence image of the dish irradiated with FIC NP and confirmed that the cell death pathway by FIC NP and laser irradiation was an apoptosis pathway. The FIC NP superiority in cell death was confirmed once again with fluorescence about five times higher than the FITC fluorescence shown in the image of the laser irradiated with Ce6.
레이저 조사 위치에 따른 선택적 세포 사멸의 가능성을 확인하기 위해 MDA-MB-231 세포에 레이저 조사 시 0.1 mm 가량의 좁은 틈을 통하여 조사하고 죽은 세포를 염색하여 사멸된 세포의 영역을 확인할 수 있었다.In order to confirm the possibility of selective cell death according to the laser irradiation position, the area of the dead cells could be identified by irradiating MDA-MB-231 cells through a narrow gap of about 0.1 mm when laser irradiation and staining the dead cells.
35 mm 디쉬에 MDA-MB-231 세포를 배양하고, 1.3 mg의 FIC NP를 가해준 후 5시간 동안 배양하고 0.1 mm 가량의 좁은 틈을 통해 671 nm의 레이저를 조사하였다. 5 분 후에 트리판 블루를 가해주고, 5분 후에 세포를 씻어준 후 광학 현미경 (Axioskop 2 FS; Carl Zeiss 사 제품)으로 광학 이미지를 얻었다.MDA-MB-231 cells were cultured in a 35 mm dish, 1.3 mg of FIC NP was added, followed by incubation for 5 hours, and 671 nm laser was irradiated through a narrow gap of about 0.1 mm. After 5 minutes, trypan blue was added, and after 5 minutes, cells were washed and optical images were obtained by an optical microscope (
광학 이미지 분석 결과, 0.1 mm 지름의 원 안의 세포들만 트리판 블루에 의해 염색이 되어 레이저에 의해 매우 좁은 부분 까지 선택적으로 세포 사멸을 유도할 수 있음을 확인 하였다. As a result of optical image analysis, it was confirmed that only cells in 0.1 mm diameter circles could be stained by trypan blue to selectively induce cell death down to very narrow area by laser.
(2) 나노 광감작제의 생체내 분포 평가(2) In vivo distribution evaluation of nanophotosensitizers
나노 광감작제의 생체내 분포를 평가하여 생체 내 암 조직에 대한 선택적 축적을 통한 암 치료 가능성을 확인 하였다.In vivo distribution of the nanophotosensitizer was evaluated to confirm the possibility of cancer treatment through selective accumulation of cancer tissue in vivo.
동물 암치료 실험을 행하기 위하여 수컷 쥐 (BALB/c, 5주령, Institute of Medical Science, Tokyo)의 왼쪽 엉덩이 근육 부위에 1 × 106 개의 SCC7 (Squamous Cell Carcinoma) 세포를 피하 주사하였다. To conduct animal cancer therapy experiments, 1 × 10 6 SCC7 (Squamous Cell Carcinoma) cells were injected subcutaneously into the left hip muscle area of male rats (BALB / c, 5 weeks old, Institute of Medical Science, Tokyo).
도 9은 본 명세서에 개시된 실시예 3의 (2)에 의해 동물용 형광 영상 장비로 측정된 GC-I-Ce6 NP가 꼬리 정맥에 주사된 암 모델 수컷 쥐의 시간에 따른 형광 영상들이다.9 are fluorescence images over time of a cancer model male rat injected with a tail vein of GC-I-Ce6 NP measured by an animal fluorescence imaging apparatus according to Example 2 (2) disclosed herein.
도 10는 본 명세서에 개시된 실시예 3의 (2)에 의해 동물용 형광 영상 장비로 측정된 FIC NP와 Ce6가 암 조직에 국소 주사된 수컷 쥐의 시간에 따른 형광 영상 (a) 및 GC-I-Ce6 NP와 Ce6가 암 조직에 국소 주사된 수컷 쥐의 시간에 따른 형광 영상 (b) 이다.FIG. 10 shows fluorescence images (a) and GC-I over time of male rats in which FIC NP and Ce6 were locally injected into cancer tissues measured by animal fluorescence imaging apparatus (2) of Example 3 disclosed herein. (B) Time-dependent fluorescence imaging of male rats in which Ce6 NP and Ce6 were topically injected into cancer tissue.
도 9 및 도 10를 참조하면, 2주 후에 1 mg mL-1 수계 분산 GC-I-Ce6 NP 0.2 mL를 마취된 상기 수컷 쥐의 꼬리 정맥에 주사 하고 생체내 형광의 분포를 동물용 형광 영상 장비 (eXplore Optix; GE Medical Systems 사 제품)로 영상화 하였다.9 and 10, after 2 weeks, 0.2 mL of 1 mg mL-1 aqueous dispersion GC-I-Ce6 NP was injected into the tail vein of the anesthetized male rat, and the distribution of fluorescence in vivo was measured by the animal fluorescent imaging equipment. (eXplore Optix; manufactured by GE Medical Systems).
정맥 주사 이후 암에서의 형광은 48 시간까지 꾸준히 증가하지만, 다른 장기의 형광은 서서히 증가하다가 48시간에 이르러서는 감소하는 것으로 보아 나노 광감작제가 암에 선택적으로 축적되는 것을 확인할 수 있었고, 이러한 결과는 본 특허의 나노 광감작제를 이용한 암 치료의 가능성을 높여준다.After intravenous injection, the fluorescence in cancer increased steadily up to 48 hours, but the fluorescence in other organs gradually increased and then decreased down to 48 hours, suggesting that nanophotosensitizers accumulate selectively in cancer. It increases the possibility of cancer treatment using the nanophotosensitizer of the patent.
암을 치료하는 데에 있어서 국소 주사를 통해 광감작제를 주입하고 레이저를 조사하여 광역학 치료를 시행할 수 있는데 이를 위해서는 광감작제가 주입된 조직에 오래 머물러서 선택된 조직의 세포에 침투하는 것이 유리하기에 나노 광감작제와 분자 광감작제를 암 조직에 주사하고 머무르는 시간을 측정하는 실시예를 시행하였다.In the treatment of cancer, photodynamic therapy can be performed by injecting a photosensitizer via topical injection and irradiating a laser, which is advantageous to stay long in the tissue where the photosensitizer is injected and to infiltrate cells of the selected tissue. In Example, the nano-sensitizer and the molecular photo-sensitizer was injected into the cancer tissue and the time for measuring the retention time was implemented.
같은 양의 Ce6를 함유한 Ce6 용액, FIC NP, GC-I-Ce6 NP를 0.03 mL 씩 상기 수컷 쥐의 암 조직에 주사하고 시간에 따른 형광의 변화를 동물용 형광 영상 장비 (eXplore Optix)로 관찰하였다.0.03 mL of Ce6 solution containing the same amount of Ce6, FIC NP, and GC-I-Ce6 NP were injected into the cancer tissue of the male rats, and the change in fluorescence over time was observed with an animal fluorescent imaging device (eXplore Optix). It was.
FIC NP와 Ce6를 비교하였을 때 주입 후 시간의 경과에 따라 암 조직에서의 형광이 점차 약해지는 것을 확인할 수 있었으나, GC-I-Ce6 NP와 Ce6를 비교하였을 때는 Ce6는 시간에 따라 점차 감소하지만 GC-I-Ce6 NP는 5 시간 동안 그 형광 신호가 암 조직에서만 강하게 나타나서 암 조직에 오래 머무르고 있어, 이와 같은 국소 주사를 통한 광역학 치료에 있어서는 GC-I-Ce6 NP가 유리함을 확인할 수 있었다.When the FIC NP and Ce6 were compared, the fluorescence in the cancer tissue gradually decreased as the time passed after the injection.However, when the GC-I-Ce6 NP and Ce6 were compared, Ce6 gradually decreased with time, but GC -I-Ce6 NP showed strong fluorescence signal only in cancer tissue for 5 hours and stayed in cancer tissue for a long time, and it was confirmed that GC-I-Ce6 NP is advantageous in photodynamic therapy through such local injection.
이상에서는, 본 명세서에 개시된 다양한 실시 예들에 대하여 도시하고 설명하였지만, 본 발명은 상술한 특정의 실시 예에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 명세서에 개시된 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변형실시가 가능한 것은 물론이고, 이러한 변형실시들은 본 명세서에 개시된 기술적 사상이나 전망으로부터 개별적으로 이해되어져서는 안 될 것이다. In the foregoing description, various embodiments disclosed herein have been shown and described, but the present invention is not limited to the above-described specific embodiments, and the technology to which the present invention pertains without departing from the gist disclosed herein is claimed in the claims. Various modifications may be made by those skilled in the art, and these modifications should not be individually understood from the technical spirit or the prospects disclosed herein.
Claims (24)
상기 코어를 둘러싸고 있는 생체 친화성 고분자; 및
물을 포함하고,
상기 광감작제는 클로린 e6이고, 상기 생체 친화성 고분자는 플루로닉 또는 글리콜키토산이며, 상기 분산제는 디아트리조산 또는 트리메틸벤조산이되,
상기 분산제는 상기 광감작제를 분자단위로 분산시켜 수용액 내에서 상기 광감작제가 서로 집합체를 이루도록 하는 것을 특징으로 하는 수계 분산 나노 광감작제.A core comprising a photosensitizer and a dispersant corresponding to the photosensitizer;
A biocompatible polymer surrounding the core; And
Contains water,
The photosensitizer is chlorine e6, the biocompatible polymer is pluronic or glycolchitosan, and the dispersant is ditrizoic acid or trimethylbenzoic acid,
The dispersing agent is a water-disperse nano-photosensitizer, characterized in that to disperse the optical sensitizer in molecular units so that the optical sensitizer is aggregated in an aqueous solution.
상기 분산제의 함량은 상기 수계 분산 나노 광감작제가 분산된 수계 분산액의 총중량에 대하여 0.0001 내지 5 중량%인 것인 수계 분산 나노 광감작제.The method of claim 1,
The amount of the dispersant is 0.0001 to 5% by weight based on the total weight of the aqueous dispersion of the aqueous dispersion nano-photosensitive agent dispersed aqueous dispersion nano-photosensitizer.
상기 광감작제의 함량은 상기 수계 분산 나노 광감작제가 분산된 수계 분산액의 총중량에 대하여 0.0001 내지 0.01 중량%이고,
상기 생체 친화성 고분자의 함량은 상기 수계 분산 나노 광감작제가 분산된 수계 분산액의 총중량에 대하여 0.01 내지 50 중량%이고,
상기 물의 함량은 상기 수계 분산 나노 광감작제가 분산된 수계 분산액의 총중량에 대하여 45 내지 99.9899 중량%인 것인 수계 분산 나노 광감작제.The method of claim 1,
The amount of the photosensitizer is 0.0001 to 0.01% by weight relative to the total weight of the aqueous dispersion in which the aqueous dispersion nanophotosensitizer is dispersed,
The content of the biocompatible polymer is 0.01 to 50% by weight relative to the total weight of the aqueous dispersion in which the aqueous dispersion nanophotosensitizer is dispersed,
The amount of the water is 45 to 99.9899% by weight relative to the total weight of the aqueous dispersion in which the aqueous dispersion nano-photosensitive agent is dispersed, the aqueous dispersion nano-photosensitive agent.
흡광 파장이 500 내지 900 nm 범위인 것인 수계 분산 나노 광감작제. The method of claim 1, wherein the photosensitizer,
An aqueous dispersion nanophotosensitizer having an absorption wavelength in the range of 500 to 900 nm.
플루로닉
Pluronic
직경이 10 내지 300 nm인 것인 수계 분산 나노 광감작제.The method of claim 1, wherein the aqueous dispersion nano photosensitizer,
An aqueous dispersion nanophotosensitizer having a diameter of 10 to 300 nm.
생체내 암조직에 대하여 반응하고,
상기 반응 결과를 근거로 상기 생체내 암조직을 제거하는 것인 광역학 치료제.The method of claim 13, wherein the photodynamic therapeutic agent,
Respond to cancerous tissues in vivo,
A photodynamic therapeutic agent for removing cancer tissue in vivo based on the result of the reaction.
(b) 상기 유기 용매를 제거하는 단계; 및
(c) 상기 (b)단계의 생성물을 물에 분산시키는 단계를 포함하고,
상기 광감작제는 클로린 e6이고, 상기 생체 친화성 고분자는 플루로닉 또는 글리콜키토산이며, 상기 분산제는 디아트리조산 또는 트리메틸벤조산이되,
상기 분산제는 상기 광감작제를 분자단위로 분산시켜 수용액 내에서 상기 광감작제가 서로 집합체를 이루도록 하는 것을 특징으로 하는 수계 분산 나노 광감작제의 제조 방법.(a) uniformly dissolving a photosensitizer, a dispersant and a biocompatible polymer in an organic solvent;
(b) removing the organic solvent; And
(c) dispersing the product of step (b) in water,
The photosensitizer is chlorine e6, the biocompatible polymer is pluronic or glycolchitosan, and the dispersant is ditrizoic acid or trimethylbenzoic acid,
The dispersing agent is a method for producing an aqueous dispersion nano-photosensitizer, characterized in that to disperse the photosensitizer in molecular units so that the photosensitizers are aggregated together in an aqueous solution.
(b) 상기 (a)단계에서 생성된 혼합용액의 투석을 통하여 공유결합되지 않고 남은 분자들을 제거하는 단계;
(c)상기 (b)단계의 생성물을 동결 건조하는 단계; 및
(d) 상기 (c)단계의 생성물을 음파처리(sonication)로 물에 분산시키는 단계를 포함하고,
상기 광감작제는 클로린 e6이고, 상기 생체 친화성 고분자는 플루로닉 또는 글리콜키토산이며, 상기 분산제는 디아트리조산 또는 트리메틸벤조산이되,
상기 분산제는 상기 광감작제를 분자단위로 분산시켜 수용액 내에서 상기 광감작제가 서로 집합체를 이루도록 하는 특징으로 하는 수계 분산 나노 광감작제의 제조 방법.(a) covalently bonding the photosensitiser and dispersant to the biocompatible polymer in an organic solvent to produce a mixed solution;
(b) removing molecules remaining without covalent bonding through dialysis of the mixed solution generated in step (a);
(c) freeze drying the product of step (b); And
(d) dispersing the product of step (c) in water by sonication,
The photosensitizer is chlorine e6, the biocompatible polymer is pluronic or glycolchitosan, and the dispersant is ditrizoic acid or trimethylbenzoic acid,
The dispersing agent is a method of producing a water-disperse nano-photosensitizer, characterized in that the optical sensitizer is dispersed in a molecular unit so that the optical sensitizer is aggregated together in an aqueous solution.
광감작제;
상기 광감작제 및 분자 분산제를 포함하는 코어;
상기 코어를 둘러싸고 있는 생체 친화성 고분자; 및
물을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법. The method according to any one of claims 15 and 16, wherein the aqueous dispersion nanophotosensitizer,
Photosensitizers;
A core comprising the photosensitizer and a molecular dispersant;
A biocompatible polymer surrounding the core; And
A production method comprising water.
흡광 파장이 500 내지 900 nm 범위인 것인 제조 방법. The method of claim 17, wherein the photosensitizer,
Wherein the absorption wavelength is in the range of 500 to 900 nm.
직경이 10 내지 300 nm인 것인 수계 분산 나노 광감작제 제조방법.The method according to any one of claims 15 and 16, wherein the aqueous dispersion nanophotosensitizer,
10 to 300 nm in diameter of the aqueous dispersion nanophotosensit manufacturing method.
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