KR101279506B1 - Method of quantitative measurement of the total reactive oxygen species(ros) in the normal solution - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: A quantitative measurement method of total reactive oxygen species(ROS) in a normal solution is provided to accurately analyze the kinds and the quantitative relation of reactive oxygen species which are named as factors of an anti-bacteria effect, and to uniformly manage the quality of anti-bacterial products. CONSTITUTION: A quantitative measurement method of total ROS in a normal solution includes the following steps: writing a standard calibration curve by the content of H2O2 through adding an H2O2 standard solution and H2DCF-DA into a solvent in a Petri dish, and developing DCF fluorescence color(P100); measuring a developed fluorescence value by separately adding H2DCF-DA into a solution containing an ROS generating material in the Petri dish(P200); and calculating the content of H2O2 by comparing the measured DCF fluorescence value with the standard calibration curve(P300).

Description

일반기재에서 총활성산소종의 정량적 측정방법{Method of quantitative measurement of the total reactive oxygen species(ROS) in the normal solution} Method of quantitative measurement of the total reactive oxygen species (ROS) in the normal solution}

본 발명은 일반기재에서 총활성산소종의 정량적 측정방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 기재로부터 생산된 다양한 활성산소종들에 의해 나타나는 총 산화력과 동일한 산화력을 나타내는 과산화수소(H2O2)의 농도를 계산함으로써, 생체 내에서 발생하는 총활성산소종(ROS)을 측정하는 종래의 방법과는 달리 생체가 아닌 일반적인 기재가 생산하는 다양한 활성산소종들을 정량하는 방법이며 정량을 위해 비교적 반감기가 길어 안정성이 높은 활성산소종인 과산화수소(H2O2)로써 검량선을 작성하여 산화력을 기준으로 동일한 산화력을 나타내는 과산화수소(H2O2) 농도로 표시하여 정량적으로 측정하는 것을 특징으로 하는 총활성산소종의 정량적 측정방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for quantitatively measuring total free radical species in a general substrate, and more particularly, the concentration of hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) exhibiting the same oxidation power as the total oxidation power represented by various active oxygen species produced from the substrate Unlike the conventional method for measuring total free radical species (ROS) generated in vivo, the method of quantifying various active oxygen species produced by a general substrate, not a living body, and has a relatively long half-life for quantification. Quantitative quantitative measurement of the total active oxygen species, characterized in that the calibration curve is prepared from the hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), which is a high active oxygen species, and is expressed quantitatively by measuring the concentration of hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) which shows the same oxidizing power based on the oxidizing power. It relates to a measuring method.

활성산소종(reactive oxygen species)은 사람이 호흡 과정에서 몸속으로 들어간 산소가 산화 과정에 이용되면서 여러 대사 과정에서 생성된 화합물로서 산화력이 강하여 사람 몸속에서 산화작용으로 생체 조직을 공격하고 세포를 손상시키고, 몸속의 여러 아미노산을 산화시켜 단백질의 기능 저하도 가져온다. 그리고 핵산을 손상시켜 핵산 염기의 변형과 유리, 결합의 절단, 당의 산화분해 등을 일으켜 돌연변이나 암의 원인이 되기도 한다. 또한 생리적 기능이 저하되어 각종 질병과 노화의 원인이 되기도 한다.
Reactive oxygen species is a compound produced by various metabolic processes as oxygen enters the body during the breathing process and is used for oxidation process. It is strong in oxidizing power, attacking biological tissues and damaging cells by oxidation in the human body. It also oxidizes many of the amino acids in the body, leading to reduced protein function. In addition, the nucleic acid may be damaged, resulting in modification and release of nucleic acid bases, cleavage of bonds, and oxidative degradation of sugars, resulting in mutations and cancer. In addition, the physiological function is lowered, causing various diseases and aging.

일반적으로 활성산소종에는 여러 가지 종류가 있고, 그 중에서 대표적인 활성산소종으로는 과산화수소(H2O2), 슈퍼옥사이드(O2-), 하이드록시라디칼(·OH) 등이 있으며, 이 중에서 하이드록시라디칼이 가장 산화력이 강한 활성산소로 알려져 있다. 활성산소 종류 중 가장 산화력이 큰 하이드록시라디칼은 우리 몸의 세포벽을 산화시켜 세포활동에 장애를 일으키고 정상세포들을 공격해 세포를 망가뜨려 결과적으로 우리 몸에 악영향을 끼치게 되지만 반감기가 수억분의 일초로서 확산되지 못하고 발생부위에 공존하는 분자들과만 반응하여 신속하게 제거되어지므로 독성이 세포내에서조차 잘 전파되지 않는다.
In general, there are various kinds of active oxygen species, and typical active oxygen species include hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), superoxide (O 2- ), hydroxy radical (· OH), and the like. Roxy radicals are known to be the most oxidizing free radicals. Hydroxy radicals, the most oxidative of all kinds of free radicals, oxidize the cell wall of our body, which impedes cell activity, attacks normal cells and destroys the cells, which in turn adversely affects our body, but the half-life spreads as hundreds of millions of seconds. Toxicity does not propagate even well within cells because it is quickly removed by reacting only with molecules that coexist in the site of development.

그러나 생명체의 정상적인 대사과정 중에서 발생하는 활성산소종(ROS)은 생체에 나쁜 영향만 주는 것이 아니고, 체내에서 적정량만 생성될 경우에는 병원체나 이물질을 제거하기 위한 생체방어과정에서 슈퍼옥사이드·과산화수소와 같은 활성산소가 많이 발생하는데, 이들의 살균작용으로 대식세포의 살균작용, 오래된 단백질의 제거, 강한 살균작용으로 병원체로부터 인체를 보호하기는 등의 작용을 하지만 생체 내의 생성량이 그 방어기전을 벗어나게 되면 일시적 또는 영구적으로 생체에 손상을 주어 각종 질환을 일으키게 된다.
However, reactive oxygen species (ROS), which occur during normal metabolic processes in living organisms, do not only adversely affect the living body, but when only a proper amount is produced in the body, such as superoxide and hydrogen peroxide in bioprotective processes to remove pathogens or foreign substances. Many active oxygen are generated, and their sterilization action is the action of sterilization of macrophages, removal of old proteins, and strong sterilization action to protect the human body from pathogens. Or permanently damage the living body will cause various diseases.

이와 같이 생체 내에서 발생하는 활성산소종(ROS)을 측정하는 방법으로 특허문헌 1에 측정대상 생체의 조직을 소정의 크기로 추출하거나, 측정대상 생체의 조직에 소정 크기의 홀을 형성하여 생체 내의 활성산소 라디칼을 측정하는 방법이 알려져 있지만 상기와 같은 활성산소 측정법은 측정대상이 생체 조직에만 한정되는 문제점이 있었다.
As described above, a method of measuring active oxygen species (ROS) generated in a living body may be performed by extracting a tissue of a living body to be measured to a predetermined size in Patent Document 1, or forming a hole having a predetermined size in the tissue of the living body to be measured. Although a method of measuring active oxygen radicals is known, there is a problem in that the measurement of active oxygen as described above is limited to biological tissues.

상기와 같은 문제점을 개선하기 위하여 생체 조직 이외의 기재를 대상으로 한 총활성산소종을 측정하기 위한 방법으로, 특허문헌 2에 실리콘 기판 위에 광감응물질을 증착하고 상기 광감응물질 위에 유기물 박막이 코팅된 광감응물질 시편과 실리콘 기판 위에 피산화제 박막이 증착된 피산화제 박막 시편을 하나의 팩에 진공포장한 후 근적외선을 조사하여 활성산소를 발생시켜 X선 회절 분석에 의해 피산화제 박막인 철 박막에 형성된 Fe2O3 및 Fe3O4 피크의 강도 비로부터 철 박막의 두께를 구하고, 이로부터 활성산소를 정량적으로 측정하는 방법이 알려져 있지만, 상기 측정법의 경우에는 철 박막이 산화된 양으로부터 광감응물질이 생산한 활성산소의 양을 정량적으로 측정하는 방법에 관한 것으로, 광감응 반응을 나타내지 않는 일반기재에 대한 활성산소를 정량적으로 측정할 수 없는 문제점이 있다.
In order to improve the above problems, as a method for measuring total active oxygen species targeting substrates other than biological tissues, Patent Literature 2 deposits a photosensitive material on a silicon substrate and an organic thin film is coated on the photosensitive material. The photosensitive material specimen and the oxidized thin film specimen in which the oxidized thin film was deposited on the silicon substrate were vacuum packed in one pack, and then irradiated with near-infrared radiation to generate free radicals. It is known to obtain the thickness of the iron thin film from the intensity ratio of the formed Fe 2 O 3 and Fe 3 O 4 peaks and to quantitatively measure the active oxygen therefrom. A method for quantitatively measuring the amount of free radicals produced by a substance. There is a problem that can not be quantitatively measured in a castle oxygen.

특허문헌 1 : 대한민국 공개특허공보 특2002-0031673호(2002년 5월 3일 공개), 생체 내 활성산소 라디칼 생성량의 측정방법Patent Document 1: Republic of Korea Patent Application Publication No. 2002-0031673 (published May 3, 2002), a method for measuring the amount of active oxygen radical generation in vivo 특허문헌 2 : 대한민국 등록특허공보 제0844407호(2008년 7월 8일 공고), X선 회절 분석을 이용한 활성산소의 정량적 측정방법Patent Document 2: Republic of Korea Patent Publication No. 0444407 (July 8, 2008), quantitative measuring method of free radicals using X-ray diffraction analysis

본 발명은 생체 내에서 발생하는 총활성산소종(ROS)을 측정하는 종래의 방법과는 달리 증류수, 이온교환수 또는 일반 식용수를 사용하여 생체 세포 내가 아닌 일반 수용성 기재에서 발생하는 총활성산소종을 정량하기 위한 방법이며 기재가 생산하는 활성산소종의 종류에 상관없이 전체 활성산소종들이 나타내는 총 산화력을 측정하여 동일한 산화력을 나타내는 과산화수소의 농도(μM H2O2)로 표시하여 총활성산소종을 정량하는 것을 특징으로 하는 일반기재에서 총활성산소종의 정량적 측정방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
The present invention, unlike conventional methods for measuring total free radical species (ROS) occurring in vivo using distilled water, ion-exchanged water or general drinking water using the total active oxygen species generated in general water-soluble substrates, not in living cells Regardless of the type of active oxygen species produced by the substrate, the total oxidative power of all active oxygen species is measured and expressed as the concentration of hydrogen peroxide (μM H 2 O 2 ) showing the same oxidative power. An object of the present invention is to provide a quantitative measuring method of total active oxygen species in a general substrate, characterized in that for quantifying.

더욱 구체적으로 종래에는 총활성산소종을 정량함에 있어 기재가 생산하는 활성산소종이 다양하게 존재할 수 있어 개개의 활성산소종을 모두 특이적으로 측정하고 정량하는 것이 매우 어려울 뿐 아니라 그러한 값들이 가지는 의미도 복잡하여 생체의 독성 반응을 예측하기에 부족한 반면 본 발명은 합성수지 제품, 합성섬유, 합성피혁, 세라믹 제품, 도장 제품 등에 포함되어 항균 기능이 있는 활성산소종을 발생시킬 수 있는 기재로부터 생산된 총활성산소종을 정량하는 것을 특징으로 하는 일반기재에서 총활성산소종의 정량적 측정방법을 제공하는 것을 다른 과제로 한다.
More specifically, in the conventional quantification of total active oxygen species, there can be various active oxygen species produced by the substrate, so that it is very difficult to specifically measure and quantify all the individual active oxygen species as well as the meaning of those values. While the complex is insufficient to predict the toxic response of the living body, the present invention is included in synthetic resin products, synthetic fibers, synthetic leather, ceramic products, coating products, etc. Total activity produced from a substrate capable of generating active oxygen species with antibacterial function Another object of the present invention is to provide a method for quantitatively measuring total free radical species in a general substrate, characterized by quantifying oxygen species.

이에 본 발명에서 활성산소종의 생리 작용이 주로 산화력에 의한 것에 주목하여 기재가 생산하는 활성산소종의 종류에 상관없이 전체 활성산소종들이 나타내는 총 산화력을 측정하고 총 산화력을 수치화함에 있어서 생리작용과 밀접한 관계가 있으며 반감기가 수일로서 길어 측정기간 동안 특정 농도를 유지함으로써 농도 기준으로 사용하기에 적절한 과산화수소를 검량선 작성에 사용하여 총활성산소종의 농도를 동일한 산화력을 나타내는 과산화수소의 농도(μM H2O2)로서 표시하여 정량함으로써 다양한 활성산소종을 발생시키는 항균제품의 안전성과 균일한 품질관리가 가능하게 하고 환경과 인체에 미치는 영향의 분석이 가능하게 하는 것을 특징으로 하는 총활성산소종의 정량적 측정방법을 제공함을 또 다른 과제로 한다.
Therefore, the physiological action of the active oxygen species in the present invention is mainly due to the oxidative power, regardless of the type of active oxygen species produced by the substrate to measure the total oxidative power represented by all the active oxygen species and to quantify the total oxidative power It is closely related and has a long half-life of several days, so that the concentration of hydrogen peroxide (μM H 2 O) with the same oxidizing power as the concentration of total active oxygen species is determined by maintaining the specific concentration during the measurement period. 2 ) Quantitative measurement of total active oxygen species characterized by labeling and quantifying to enable the safety and uniform quality control of antimicrobial products that generate various active oxygen species and to analyze the effects on the environment and human body Providing a method is another challenge.

본 발명은 다양한 활성산소종에 비례적으로 산화 반응하는 형광 색소로서 H2DCF-DA(2’7'-dichlorodihydrofuorescein diacetate)를 사용하였다. H2DCF-DA는 일반적으로 세포 내 활성산소종의 측정에 사용되며 실제로 활성산소종에 대해 반응하는 형광 물질은 세포 내에서 에스테레이즈(esterase)에 의해 탈아세틸화된 H2DCF이다. H2DCF는 다양한 활성산소종에 의해 산화되어 형광을 나타내는 DCF로 변화하는데 이 DCF의 형광을 측정한다. 그러나 본 발명에서 아세틸화되지 않은 H2DCF-DA 자체로서 효과적으로 정량이 가능함을 확인하였고 이 물질이 안정성이 높고 재현성이 높아 본 발명에서 일반기재가 생산하는 총활성산소종에 반응하는 형광물질로 H2DCF-DA를 정량에 사용하였다.
In the present invention, H 2 DCF-DA (2'7'-dichlorodihydrofuorescein diacetate) was used as a fluorescent dye which is oxidized in proportion to various reactive oxygen species. H 2 DCF-DA is generally used for the measurement of free radicals in cells and the fluorescent substance that actually reacts to free radicals is H 2 DCF deacetylated by esterase in cells. H 2 DCF is oxidized by various reactive oxygen species to change into a fluorescent fluorescence, which measures the fluorescence of the DCF. However, it was confirmed that the present invention can effectively quantify the non-acetylated H 2 DCF-DA itself, and this material has high stability and high reproducibility, and is a fluorescent substance reacting to the total active oxygen species produced by the general substrate in the present invention. 2 DCF-DA was used for quantification.

따라서, 상기의 과제를 달성하기 위한 본 발명은 아래의 내용과 같이,Therefore, the present invention for achieving the above object is as described below,

페트리 접시 내에서 용매에 H2O2 표준액 및 H2DCF-DA를 첨가하여 교반한 다음 상온에서 일정시간 방치하여 DCF 형광 색상을 발색시킨 다음 H2O2 함량에 따른 표준 검량선을 작성하는 단계(P100)와;H 2 O 2 standard solution and H 2 DCF-DA were added to the solvent in a Petri dish, stirred, and allowed to stand at room temperature for a certain time to develop a DCF fluorescent color and to prepare a standard calibration curve according to the H 2 O 2 content ( P100);

별도로 페트리 접시 내에서 용매에 활성산소종 발생물질이 함유된 기재에 H2DCF-DA를 첨가하여 교반한 다음 상온에서 일정시간 방치하여 DCF 형광 색상을 발색시킨 다음 발색한 형광값을 측정하는 단계(P200) 및;In addition, H 2 DCF-DA was added to the substrate containing active oxygen species generating substance in a solvent in a Petri dish and stirred, and the mixture was left at room temperature for a certain time to develop a DCF fluorescent color and then measure the fluorescence value. P200);

상기 P200 단계에서 측정한 DCF 형광값을 상기 P100 단계에서 작성한 표준 검량선과 대조하여 H2O2 함량을 산출하는 단계(P300):Computing the H 2 O 2 content by comparing the DCF fluorescence value measured in step P200 with the standard calibration curve prepared in step P100 (P300):

로 이루어지는 것을 특징으로 하는 일반기재에서 총활성산소종의 정량적 측정방법을 과제 해결 수단으로 한다.
The method of quantitative measurement of total free radical species in the general substrate, characterized in that consisting of the problem solving means.

본 발명에서 상기 용매는 증류수, 이온교환수 또는 일반 식용수인 것을 특징으로 한다.
In the present invention, the solvent is characterized in that the distilled water, ion-exchanged water or general drinking water.

그리고 상기 P100 단계에서는 시료의 총활성산소종을 정량함에 있어 안정성이 높은 활성산소종인 과산화수소(H2O2)를 사용하여 4 ~ 80 μM H2O2 표준액들(4, 10, 20, 30, 40, 60, 80 uM)의 검량선을 작성함으로써 시료의 총활성산소종과 동일한 총산화력을 나타내는 과산화수소(H2O2) 농도로 표시하며, In the step P100, 4 to 80 μM H 2 O 2 standard solutions (4, 10, 20, 30, using hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), which is a highly stable active oxygen species, in quantifying total active oxygen species of the sample. 40, 60, 80 uM) and the calibration curve is expressed by the concentration of hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) showing the same total oxidation power as the total active oxygen species of the sample,

상기 P200 단계에서는 용매 내에 첨가하는 기재의 양은 고체 기재의 경우 용매에 대한 함량을 1~100 W/V %(g/ml) 기준으로 첨가하고 수면에 충분히 담기도록 하여 액체 또는 액체에 분산된 형태인 경우 1~100 V/V % (ml/ml)를 기준으로 첨가하며 측정하기 전 3000 rpm에서 원심분리하여 상등액을 사용하고, In the step P200, the amount of the substrate added in the solvent is in the form of dispersed in a liquid or a liquid by adding a content of the solvent based on 1 ~ 100 W / V% (g / ml) in the case of a solid substrate so as to be sufficiently immersed in the water surface In the case of adding 1 ~ 100 V / V% (ml / ml) as a reference, before using the supernatant by centrifugation at 3000 rpm,

상기 P100 단계 및 P200 단계에서 용매 내에 각각 첨가하는 H2DCF-DA는 최종 농도가 1 mM이 되도록 첨가하며,H 2 DCF-DA added in the solvent in the P100 step and P200 step is added so that the final concentration is 1 mM,

상기 P200 단계에서 활성산소종 발생물질은 은(Au), 금(Au), 망간(Mn), 아연(Zn), 백금(Pt), 팔라듐(Pd), 구리(Cu)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
The active oxygen species generating material in step P200 is selected from the group consisting of silver (Au), gold (Au), manganese (Mn), zinc (Zn), platinum (Pt), palladium (Pd), and copper (Cu). It is characterized by.

본 발명은 종래에는 인체 내에서 발생하는 활성산소종(ROS)이 측정대상인 것과는 달리 인체 외의 기재에서 발생하는 총활성산소종을 정량하는 방법이며 다양한 활성산소종의 구성비율을 알 수 없는 활성산소종 혼합시료를 정량하기 위해서 활성산소종의 종류에 상관없이 총활성산소종의 산화력에 의해 생성되는 DCF 생성량을 형광 측정하여 이것을 활성산소종 중에서 비교적 안정적이고 반감기가 길어 정확한 농도를 측정할 수 있는 과산화수소(H2O2)를 사용하여 시험 시료와 동일한 산화력을 나타내는 과산화수소(H2O2)의 농도로 표시하였으므로 증류수, 이온교환수 또는 일반 식용수 등을 사용하여 생체의 세포 내가 아닌 기재서 발생하는 활성산소종을 정량적으로 측정할 수 있게 되어 활성산소종을 발생하는 항균제품의 안전성과 균일한 품질관리가 가능하다.
The present invention is a method for quantifying total active oxygen species generated in a substrate other than the human body, unlike conventional reactive oxygen species (ROS) that occur in the human body in the prior art and active oxygen species unknown composition ratio of various active oxygen species In order to quantify the mixed samples, the hydrogen peroxide can be measured by fluorescence measurement of the amount of DCF produced by the oxidizing power of the total active oxygen species, regardless of the type of active oxygen species. H 2 O 2 ) was used as the concentration of hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), which shows the same oxidizing power as the test sample. Therefore, the activity generated on the substrate, not in the cells of the living body, using distilled water, ion exchange water, or general drinking water. Oxygen species can be measured quantitatively for safety and uniform quality of antibacterial products that generate reactive oxygen species It is possible.

따라서, 본 발명은 합성수지 제품, 합성섬유, 합성피혁, 세라믹 제품, 도장 제품 등과 같은 기재에 항균력의 기능이 있는 활성산소종을 발생하는 물질이 함유된 기재로부터 총활성산소종을 정량적으로 측정함으로써, 항균작용의 원인 물질로 지목되는 활성산소종의 종류와 정량적 관계를 정확히 분석하여 환경과 인체에 대한 영향을 파악할 수 있고 항균효과 외에 좀 더 다양한 응용분야를 개척할 수 있을 것으로 기대된다.
Accordingly, the present invention by quantitatively measuring the total active oxygen species from a substrate containing a substance that generates active oxygen species having the function of antibacterial activity on the substrate, such as synthetic resin products, synthetic fibers, synthetic leather, ceramic products, coating products, By accurately analyzing the types and quantitative relationships of reactive oxygen species, which are considered as the cause of antimicrobial activity, it is possible to grasp the effects on the environment and the human body and to explore more applications in addition to the antibacterial effect.

도 1은 종래의 방법에 의해 NIR 빛에 노출되는 동안의 PSi 또는 CNT 에 의해 생성된 활성산소의 양을 X선 회절 분석을 이용하여 활성산소를 정량적으로 측정하는 방법은 나타낸 모식도.
도 2는 H2DCF-DA의 세포 내 활성산소종을 측정하는 원리를 나타낸 화학반응식 모식도.
도 3은 DCF의 여기(여기(excitation)) 파장과 방출(방출(emission)) 파장을 나타낸 그래프.
도 4는 Crude H2DCF가 H2O2에 의해 발색한 형광 발색 반응을 나타낸 그래프.
도 5는 H2DCF-DA가 H2O2에 의해 발색한 형광 발색 반응을 나타낸 그래프.
도 6은 실시 예 1 내지 2의 제품 함량에 따른 총활성산소종 발생량을 H2O2 농도로 환산하여 나타낸 그래프.
도 7은 실시 예 3 내지 4의 담수시간에 따른 총활성산소종 발생량을 H2O2 농도로 환산하여 나타낸 그래프.
도 8은 실시 예 5 내지 6의 담수용액에 따른 총활성산소종 발생량을 H2O2 농도로 환산하여 나타낸 그래프1 is a schematic diagram showing a method for quantitatively measuring free radicals using X-ray diffraction analysis of the amount of free radicals generated by PSi or CNT during exposure to NIR light by a conventional method.
Figure 2 is a schematic diagram showing the principle of measuring the active oxygen species in H 2 DCF-DA cells.
3 is a graph showing the excitation (excitation) wavelength and emission (emission) wavelength of DCF.
4 is a graph showing the fluorescence color development of Crude H 2 DCF by H 2 O 2 .
5 is a graph showing a fluorescence color reaction in which H 2 DCF-DA is colored by H 2 O 2 .
Figure 6 is a graph showing the total amount of free radical generation according to the product content of Examples 1 to 2 converted into H 2 O 2 concentration.
7 is a graph showing the total amount of free radical generation according to the fresh water time of Examples 3 to 4 in terms of H 2 O 2 concentration.
8 is a graph showing the total amount of reactive oxygen species generated according to the freshwater solutions of Examples 5 to 6 in terms of H 2 O 2 concentration;

이하, 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 일반기재에서 총활성산소종의 정량적 측정방법을 상세히 설명하며, 상세한 설명에서 이 기술의 분야의 종사자들이 용이하게 알 수 있는 구성 및 작용에 대한 도시 및 언급은 간략히 하거나 생략하였다.
Hereinafter, a method for quantitatively measuring total free radical species in a general substrate according to a preferred embodiment of the present invention will be described in detail, and the description and reference to the construction and operation that can be easily understood by those skilled in the art in the detailed description Briefly or omitted.

본 발명에 따른 일반기재에서 총활성산소종의 정량적 측정방법은 아래의 내용과 같이,The quantitative measuring method of total reactive oxygen species in the general substrate according to the present invention as follows,

페트리 접시 내에서 용매에 H2O2 표준액 및 H2DCF-DA를 첨가하여 교반한 다음 상온에서 일정시간 방치하여 DCF 형광 색상을 발색시킨 다음 H2O2 함량에 따른 표준 검량선을 작성하는 단계(P100)와;H 2 O 2 standard solution and H 2 DCF-DA were added to the solvent in a Petri dish, stirred, and allowed to stand at room temperature for a certain time to develop a DCF fluorescent color and to prepare a standard calibration curve according to the H 2 O 2 content ( P100);

별도로 페트리 접시 내에서 용매에 활성산소종 발생물질이 함유된 기재에 H2DCF-DA를 첨가하여 교반한 다음 상온에서 일정시간 방치하여 DCF 형광 색상을 발색시킨 다음 발색한 형광값을 측정하는 단계(P200) 및;In addition, H 2 DCF-DA was added to the substrate containing active oxygen species generating substance in a solvent in a Petri dish and stirred, and the mixture was left at room temperature for a certain time to develop a DCF fluorescent color and then measure the fluorescence value. P200);

상기 P200 단계에서 측정한 DCF 형광값을 상기 P100 단계에서 작성한 표준 검량선과 대조하여 H2O2 농도를 산출하는 단계(P300):Computing the H 2 O 2 concentration by comparing the DCF fluorescence value measured in step P200 with the standard calibration curve prepared in step P100 (P300):

로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
.

본 발명에서 용매는 증류수, 이온교환수 또는 일반 식용수를 사용한다. 그리고 상기 P200 단계에서 활성산소종 발생물질은 은(Au), 금(Au), 망간(Mn), 아연(Zn), 백금(Pt), 팔라듐(Pd), 구리(Cu)로 이루어지는 군으로부터 선택되어지며, 이와 같은 활성산소종 발생물질은 합성수지 제품, 합성섬유, 합성피혁, 도장제품, 세라믹 제품 등 다양한 종류의 기재에 첨가되어 질 수 있다.
In the present invention, the solvent is distilled water, ion-exchanged water or Use regular drinking water. The active oxygen species generating material in step P200 is selected from the group consisting of silver (Au), gold (Au), manganese (Mn), zinc (Zn), platinum (Pt), palladium (Pd), and copper (Cu). The active oxygen species generating material may be added to various kinds of substrates such as synthetic resin products, synthetic fibers, synthetic leather, coating products, ceramic products, and the like.

따라서, 본 발명은 상기 용매 내에 활성산소종 발생물질이 함유된 기재를 담지시키면, 이때 기재로부터 발생하는 다양한 종류의 활성산소종이 모두 측정대상이 된다.
Therefore, in the present invention, when a substrate containing an active oxygen species generating material is supported in the solvent, all kinds of active oxygen species generated from the substrate are measured.

본 발명의 표준 검량선을 작성하는 단계(P100)에서는 페트리 접시 내에서 용매에 과산화수소(H2O2) 표준액을 농도별로 준비하고 H2DCF-DA를 첨가하여 교반한 다음 상온에서 일정시간 방치하여 DCF 형광 색상을 발색시킨 다음 형광값을 측정하여 과산화수소 농도와의 관계식인 직선 일차함수식을 구함으로써 H2O2 함량에 따른 형광 강도의 표준 검량선을 작성하는 단계이다.
In the step (P100) of preparing a standard calibration curve of the present invention, a hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) standard solution is prepared for each concentration in a solvent in a petri dish, stirred by addition of H 2 DCF-DA, and left at room temperature for a predetermined time. It is a step of preparing a standard calibration curve of the fluorescence intensity according to the H 2 O 2 content by developing a fluorescent color and then measuring the fluorescence value to obtain a linear linear function, which is a relation with the hydrogen peroxide concentration.

표준액의 농도는 4 ~ 80 μM H2O2 (4, 10, 20, 30, 40, 60, 80 uM)가 되도록 하는 것이 바람직하며, 시료의 총활성산소종의 H2O2 농도가 최소 검량선 표준액 농도인 4 uM 미만이 될 경우에는 최소 검량한계인 1 uM 이상까지 가능하고 최대 표준액 농도인 80 μM H2O2 을 초과하는 경우 검량선 범위를 새로 작성하여 다시 시험하는 것이 바람직하다.
The concentration of the standard solution is preferably 4 to 80 μM H 2 O 2 (4, 10, 20, 30, 40, 60, 80 uM), and the H 2 O 2 concentration of the total active oxygen species in the sample is the minimum calibration curve. If the concentration of the standard solution is less than 4 uM, a minimum calibration limit of 1 uM or more is allowed. If the concentration of the standard solution exceeds 80 μM H 2 O 2 , it is recommended that a new calibration range be prepared and tested again.

그리고 형광값을 측정하는 단계(P200)에서 용매 내에 첨가하는 기재의 양은 고체 기재의 경우 용매에 대한 함량을 1~100 W/V %(g/ml) 기준으로 첨가하고 수면에 충분히 담기도록 하여 액체 또는 액체에 분산된 형태인 경우 1~100 V/V % (ml/ml)를 기준으로 첨가하며 측정하기 전 3000 rpm에서 원심분리하여 상등액을 사용하는 것이 바람직하다.
And the amount of the substrate added in the solvent in the step of measuring the fluorescence value (P200) in the case of a solid substrate is added to the content of the solvent on the basis of 1 ~ 100 W / V% (g / ml) so that the liquid sufficiently so that the water Or in the case of dispersed in liquid form is added based on 1 ~ 100 V / V% (ml / ml) is preferred to use a supernatant by centrifugation at 3000 rpm before measurement.

상기에서 기재의 첨가량이 상기에서 한정한 범위 미만으로 첨가될 경우에는 활성산소 발생량이 측정한계 미만이고, 상기에서 한정한 범위를 초과하여 첨가될 경우에는 상한치 이상의 활성산소가 측정되지 아니한다.
When the added amount of the substrate is added below the range defined above, the amount of active oxygen generation is less than the measurement limit, and when added over the range defined above, active oxygen above the upper limit is not measured.

또한 H2DCF-DA의 첨가량은 기존 생체내 분석에서 일반적으로 사용하는 경우와 같이 최종 농도가 1 mM H2DCF-DA이 되도록 첨가한다.Also the amount of H 2 DCF-DA is added such that the final concentration of 1 mM H 2 DCF-DA, such as by commonly used in conventional in vivo assays.

본 발명에서 DCF의 형광 값을 분광측정기(spectrometry) 등을 비롯한 다양한 측정기기에 의해 측정할 수 있다
In the present invention, the fluorescence value of DCF can be measured by various measuring instruments including spectrometry.

한편, 본 발명에서 사용하는 시약인 H2DCF-DA(2’7'-dichlorodihydrofuorescein diacetate)는 세포 내 산화적 스트레스 측정을 위해 널리 사용되고 있다. H2DCF-DA는 지용성으로 세포막을 통해 세포 내로 쉽게 확산되어 들어가고 세포 안에 일반적으로 존재하는 에스테라아제(esterase)에 의해 탈아세틸화(deacetylation)가 되면 H2DCF(dihydrodichlorofluorescein)가 되는데 이 물질은 수용성으로 세포막을 빠져나오지 못하고 세포 내에 잔류하게 된다. 도 2에 도시된 바와 같이 이후에 세포내 산화적 스트레스가 발생하면 형광성이 없던 H2DCF는 형광을 나타내는 DCF(2',7'-Dichlorofluorescin)가 되므로 이 형광을 측정하여 세포내 ROS 생성 정도를 평가할 수 있다. DCF의 흡광스펙트럼과 방출(방출(emission)) 스펙트럼은 도 3에서와 같이 최적의 여기(excitation) 파장은 504 nm이고 방출(emission) 파장은 529 nm이다. 본 발명에서는 여기(excitation) 파장 490nm, 방출(emission) 파장 535nm을 사용하였다.
Meanwhile, H 2 DCF-DA (2'7'-dichlorodihydrofuorescein diacetate), a reagent used in the present invention, is widely used for measuring oxidative stress in cells. H 2 DCF-DA is fat-soluble and easily diffuses into the cell through the cell membrane, and when deacetylated by esterase which is generally present in the cell, it becomes H 2 DCF (dihydrodichlorofluorescein). It does not exit the cell membrane and remains in the cell. As shown in FIG. 2, when intracellular oxidative stress occurs, H 2 DCF, which is not fluorescent, becomes DCF (2 ', 7'-Dichlorofluorescin) which exhibits fluorescence. Can be evaluated The absorption spectrum and emission (emission) spectrum of the DCF is 504 nm and the emission wavelength is 529 nm, respectively, as shown in FIG. 3. In the present invention, an excitation wavelength of 490 nm and an emission wavelength of 535 nm were used.

그리고 본 발명은 용매에 H2O2 표준액 및 H2DCF-DA(2’7'-dichlorodihydrofuorescein diacetate)를 첨가하여 교반한 다음 상온에서 90~100 분간 방치하면 H2DCF-DA는 H2O2의 산화력에 의해 형광 빛을 발하는 DCF(2',7'-dichlorofuorescein)로 산화반응이 일어나며, 이 DCF가 측정대상이 되며, 형광 색상을 발색시킨 다음 H2O2 함량에 따른 표준 검량선을 작성한다.
And the present invention is stirred by adding H 2 O 2 standard solution and H 2 DCF-DA (2'7'-dichlorodihydrofuorescein diacetate) to the solvent and left at room temperature for 90-100 minutes H 2 DCF-DA is H 2 O 2 Oxidation reaction occurs with DCF (2 ', 7'-dichlorofuorescein) which emits fluorescence by oxidizing power, and this DCF is measured, develops fluorescent color and prepares standard calibration curve according to H 2 O 2 content. .

본 발명의 P100 단계에서 상온에서의 방치시간은 90분 미만이 될 경우에는 H2DCF-DA가 형광을 나타내는 DCF(2',7'-Dichlorofluorescin)로 충분하게 전환되지 않을 우려가있고, 100분을 초과할 경우에는 자가 산화(auto-oxidation)에 의한 배경 형광이 너무 높아 분석 감도가 낮아질 수 있다.
In the P100 step of the present invention, if the standing time at room temperature is less than 90 minutes, there is a fear that H 2 DCF-DA may not be sufficiently converted to DCF (2 ', 7'-Dichlorofluorescin) exhibiting fluorescence, and 100 minutes If it exceeds the background fluorescence due to auto-oxidation (auto-oxidation) is too high can reduce the assay sensitivity.

상기 표준 검량선을 작성하는 단계(P100)에서 작성되는 표준 검량선은 H2O2 표준액의 농도 및 사용량에 따라 변화되므로 아래 후술되는 실시 예의 설명에서 그 예를 들기로 한다.
Since the standard calibration curve created in the step (P100) of preparing the standard calibration curve changes according to the concentration and the usage amount of the H 2 O 2 standard solution, the example will be given in the following description of the embodiments.

검량선의 작성시에는 상기 표준 검량선을 작성하는 단계(P100)에서 수일 동안 일정한 농도를 유지할 수 있는 20 mM H2O2 원액을 용매로 희석하여 4 ~ 80 μM H2O2 표준액들(4, 10, 20, 30, 40, 60, 80 uM)을 제조하여 검량선 작성에 사용하고, 상기 P200 단계에서 용매 내에 첨가하는 기재의 양은 고체 기재의 경우 용매에 대한 함량을 W/V %(g/ml) 기준으로 실험하고 액체 또는 액체에 분산된 형태인 경우 V/V % (ml/ml)를 기준으로 첨가하여 실험하고, 상기 P100 단계의 각 농도의 표준액 및 P200 단계에서 시료액을 각각 50 ㎕씩 취하여 블랙 96-웰 플레이트(black 96-well plate)의 3개의 웰에 동일시료를 분주하였다. 여기에 2 mM H2DCF-DA(또는 2 mM crude H2DCF) 실험용액(working solution) 50 ㎕를 혼합하여 상온에서 반응시켰다. 혼합 후 90분, 95분, 100분 방치하였을 때 각각 여기(excitation) 파장 490nm, 방출(emission) 파장 535nm에서 VICTOR3TM로 형광을 측정하고 3개 값의 평균값을 사용하여 검량선을 작성하였다. 음성반응 대조군(negative control)로서 기재를 넣지 않은 증류수를 사용하였다.
When preparing the calibration curve, in the step of preparing the standard calibration curve (P100), dilute 20 mM H 2 O 2 stock solution, which can maintain a constant concentration for several days, with a solvent to prepare 4 to 80 μM H 2 O 2 standards (4, 10). , 20, 30, 40, 60, 80 uM) is used to prepare a calibration curve, the amount of the substrate added in the solvent in the P200 step is the content of the solvent in the case of a solid substrate W / V% (g / ml) Experiment by reference and in the case of liquid or dispersed in liquid form by adding V / V% (ml / ml) as the standard, and 50 μl of the sample solution at each concentration of the P100 step and P200 step The same sample was dispensed into three wells of a black 96-well plate. 50 μl of a 2 mM H 2 DCF-DA (or 2 mM crude H 2 DCF) working solution was mixed and reacted at room temperature. When left for 90 minutes, 95 minutes, and 100 minutes after mixing, fluorescence was measured at an excitation wavelength of 490 nm and an emission wavelength of 535 nm by VICTOR3 ™ , and a calibration curve was prepared using an average value of three values. Distilled water without a substrate was used as a negative control.

그리고 H2O2 농도를 산출하는 단계(P300)에서는 상기 P200 단계에서 측정한 DCF 형광값을 상기 P100 단계에서 작성한 표준 검량선 식과 대조하여 H2O2 농도를 산출한다.
In the step (P300) of calculating the H 2 O 2 concentration, the DCF fluorescence value measured in step P200 is compared with the standard calibration curve formula prepared in step P100 to calculate the H 2 O 2 concentration.

한편, H2DCF와 H2DCF-DA는 아래 [표 1]의 내용과 같이 H2DCF-DA에 반응하는 다양한 ROS들의 반응강도를 나타낸 것으로, 다양한 ROS와 반응하여 형광을 나타내므로 비특이적인 ROS 측정도구이다. 따라서 일반적으로 ROS에 대한 절대적인 정량은 이루어 지지 않고 있으며 연구자들은 시료의 DCF 형광강도 측정치를 사용하여 시료들에 발생한 총활성산소치를 상대적으로 비교한 결과를 보고하였다. 본 시험에서는 비교적 반감기가 길어 안정적인 과산화수소를 이용하여 환산 H2O2 정량값(μM H2O2)을 구하여 결과를 제시하였다. 활성산소종 중에 과산화수소는 비교적 반감기가 길어 농도별로 제조하였을 때 시간이 지나도 비교적 일정한 농도를 유지하므로 이것을 검량선 표준품으로 사용하여 과산화수소농도별 DCF 형광을 측정하였을 때 비교적 직선성과 재현성이 있는 결과를 나타내었다. 아래 [표 1]에서 H2DCFDA값은 H2DCFDA의 산화에 의해 발생하는 활성산소의 상대적인 형광값이다.On the other hand, H 2 DCF and H 2 DCF-DA as shown in the following [Table 1] shows the reaction intensity of various ROS in response to H 2 DCF-DA, because it reacts with various ROS fluorescence non-specific ROS It is a measuring tool. Therefore, in general, absolute quantification of ROS is not achieved, and the researchers reported a comparison of total free radicals generated in the samples using DCF fluorescence intensity measurements of the samples. The relatively long half-life in this test in terms of using a stable hydrogen peroxide to obtain H 2 O 2 quantification value (μM H 2 O 2) presents the results. Hydrogen peroxide in reactive oxygen species has a relatively long half-life, so that the concentration is relatively constant over time when prepared by concentration. Thus, when it was used as a calibration curve standard, DCF fluorescence by hydrogen peroxide concentration was relatively linear and reproducible. In Table 1 below, the H 2 DCFDA value is a relative fluorescence value of active oxygen generated by oxidation of H 2 DCFDA.

ROSROS ROS Generation MethodROS Generation Method H2DCFDA*H 2 DCFDA * *OH* OH 100μM of ferrous perchlorate(ll) and 1 mM of H2O2 100 μM of ferrous perchlorate (ll) and 1 mM of H 2 O 2 74007400 ONOO- ONOO - 3μM (final) of ONOO- 3μM (final) of ONOO - 66006600 -OCl - OCl 3μM (final) of -OCl3 μM (final) of - OCl 8686 1O2 1 O 2 100μM of 3-(1,4-dihydro-1,4-epidioxy-1-naphthyl)propionic acid100 μM of 3- (1,4-dihydro-1,4-epidioxy-1-naphthyl) propionic acid 2626 *O2 - * O 2 - 100μM of KO2 100 μM of KO 2 6767 H2O2 H 2 O 2 100μM of H2O2 100 μM of H 2 O 2 190190 NONO 100μM of 1-hydroxy-2-oxo-3-(3-aminopropyl)-3
-methyl-1-triazene100 μM of 1-hydroxy-2-oxo-3- (3-aminopropyl) -3
-methyl-1-triazene 150150 ROO*ROO * 100μM of 2,2'-azobis(2-amidinopropane), dihydrochioride(AAPH)100 μM of 2,2'-azobis (2-amidinopropane), dihydrochioride (AAPH) 710710 Auto-OxidationAuto-Oxidation 2.5 hours exposure to fluorescent light source2.5 hours exposure to fluorescent light source 20002000

이하, 본 발명에 따른 실시 예를 아래에서 상세히 설명하되, 본 발명의 기술적 구성이 아래의 실시 예에 의해서만 반드시 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail below, but the technical configuration of the present invention is not necessarily limited only to the following embodiments.

1. 시료의 제조
1. Preparation of Sample

(실시 예 1)(Example 1)

60pi petri dish들에 볼(Ball) 형태인 항균제 A를 0.05, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5g을 각각 넣고, 3차 증류수를 합성수지 볼이 3차 증류수 내에 잠기도록 5 ml를 가하여 용매 중 함량이 각각 1, 5, 10, 20, 50, 100 %(W/V%) 범위가 되게 제조하였으며, 뚜껑을 연 상태에서 3D 진탕기(shaker)를 이용하여 상온에서 진탕(shaking)시키면서 담수하고 3시간 후에 수용액 400 ㎕를 취하여 분석 시료로 사용하였다.
Add 0.05, 0.25, 0.5, 1, 2.5, and 5 g of antimicrobial agent A in the form of ball to 60pi petri dishes, and add 5 ml of tertiary distilled water to submerge the resin ball in the tertiary distilled water. 1, 5, 10, 20, 50, 100% (W / V%) was prepared in the range, with the lid open and fresh water shaking at room temperature using a 3D shaker (shaking) for 3 hours After that, 400 µl of an aqueous solution was taken and used as an analytical sample.

(실시 예 2) (Example 2)

용매에 분산된 형태인 항균제 B는 3차 증류수를 혼합하여 5 ml이 되도록 시료를 제조하되 B를 60pi petri dish들에 0.05, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5 ml을 각각 넣고, 3차 증류수를 순서대로 4.95, 4.75, 4.5, 4, 2.5, 0 ml를 혼합하여 B의 용매 중 함량이 각각 1, 5, 10, 20, 50, 100 %(V/V%) 범위로 제조하였으며, 이것들을 뚜껑을 연 상태에서 3D 진탕기(shaker)를 이용하여 상온에서 진탕(shaking)시키면서 담수하고 3시간 후에 3000 rpm에서 3분간 원심분리한 후 상층액 400 ㎕를 취하여 분석 시료로 사용하였다.
The antimicrobial agent B, which is dispersed in a solvent, prepares a sample so that 5 ml of tertiary distilled water is mixed, but adds 0.05, 0.25, 0.5, 1, 2.5, and 5 ml of B to 60pi petri dishes, respectively. 4.95, 4.75, 4.5, 4, 2.5, and 0 ml were mixed in order to prepare the content of B in the solvent in the range of 1, 5, 10, 20, 50, and 100% (V / V%), respectively. In the open state, fresh water was shaken at room temperature using a 3D shaker, and after 3 hours, centrifuged at 3000 rpm for 3 minutes, 400 μl of the supernatant was used as an analytical sample.

(실시 예 3)(Example 3)

60pi petri dish에 볼(Ball) 형태인 항균제 A를 5 g을 넣고, 3차 증류수 5 ml를 가하여 합성수지 볼이 3차 증류수 내에 잠기도록 하였고 용매 중 함량은 20%(W/V %)였으며, 뚜껑을 연 상태에서 3D 진탕기(shaker)를 이용하여 진탕(shaking)시키면서 상온에서 일정 시간 담수 방치하였다. 시료는 담수시간이 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간 및 24시간씩 각각 경과한 것의 수용액 400 ㎕를 취하여 분석 시료로 사용하였다.
5 g of antimicrobial agent A in the form of a ball was added to a 60pi petri dish, and 5 ml of tertiary distilled water was added to soak the synthetic resin ball in the tertiary distilled water. The content of the solvent was 20% (W / V%). Fresh water was allowed to stand at room temperature for a period of time while shaking with a 3D shaker. Samples were taken as analytical samples by taking 400 µl of an aqueous solution whose freshwater time had elapsed for 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours, 5 hours, 6 hours and 24 hours, respectively.

(실시 예 4) (Example 4)

용매에 분산된 형태인 항균제 B는 3차 증류수 2.5 ml 에 B 2.5 ml을 넣어 용매 중 함량이 50%(V/V)가 되도록 시료를 제조하였으며, 뚜껑을 연 상태에서 3D 진탕기(shaker)를 이용하여 진탕(shaking)시키면서 상온에서 일정 시간 담수 방치하였다. 시료는 담수시간이 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간 및 24시간씩 각각 경과된 것을 3000 rpm에서 3분간 원심분리한 후 상층액 400 ㎕를 취하여 분석 시료로 사용하였다.
The antimicrobial agent B in the form of dispersion in the solvent was prepared by adding 2.5 ml of B to 2.5 ml of tertiary distilled water so that the content of the solvent was 50% (V / V), and the 3D shaker was opened with the lid open. Fresh water was left at room temperature for a while while shaking. The sample was centrifuged at 3000 rpm for 3 minutes, and the freshwater time was passed for 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours, 5 hours, 6 hours and 24 hours, respectively. .

(실시 예 5) (Example 5)

실시 예 3과 동일한 방법에 의해 시료를 제조하되, 플라스틱 펠릿(LDPE) 형태인 항균제는 C(20%)를 사용하여 용매 중 함량이 100%(W/V%)가 되도록 제조하되, 시료는 담수 방치 시간은 담수시간이 1시간, 2시간, 3시간 및 4시간 경과된 것을 각각 사용하였다.
A sample was prepared by the same method as Example 3, except that the antimicrobial agent in the form of plastic pellets (LDPE) was prepared to have a content of 100% (W / V%) in a solvent using C (20%). As the leaving time, freshwater time of 1 hour, 2 hours, 3 hours and 4 hours was used, respectively.

(실시 예 6) (Example 6)

실시 예 3과 동일한 방법에 의해 시료를 제조하되, 플라스틱 펠릿(LDPE) 형태인 항균제는 D(20%)를 사용하여 용매 중 함량이 100%(W/V%)가 되도록 제조하되, 시료는 담수 방치 시간은 담수시간이 1시간, 2시간, 3시간 및 4시간 경과된 것을 각각 사용하였다.
A sample was prepared by the same method as Example 3, except that the antimicrobial agent in the form of plastic pellets (LDPE) was prepared to have a content of 100% (W / V%) in a solvent using D (20%), but the sample was fresh water. As the leaving time, freshwater time of 1 hour, 2 hours, 3 hours and 4 hours was used, respectively.

상기 실시 예 1 내지 6에서 제조한 시료들은 즉시 각각 50 ㎕씩 분취하여 바로 측정하였다.
Samples prepared in Examples 1 to 6 were immediately measured by separating 50 μl each.

그리고 상기 실시 예 1 내지 6에서 사용한 항균제의 제원은 아래 [표 2]의 내용과 같다.
And the specifications of the antimicrobial agent used in Examples 1 to 6 are as described in the following [Table 2].

(단위 : w/w%)                                                              (Unit: w / w%) 구분division 실시 예 1, 3Example 1, 3 실시 예 2, 4Example 2, 4 실시 예 5Example 5 실시 예 6
Example 6
AA BB C(20%)C (20%) D(20%)D (20%) 항균제Antimicrobial agent SiO2 SiO 2 99 1818 -- 1818 Sodium Alumino SilcateSodium Alumino Silcate -- -- 16.9416.94 -- AgAg 1One 22 0.060.06 22 ZnZn -- -- 33 -- DI.WaterDI.Water -- 1010 -- -- EtOHEtOH -- 7070 -- -- LDPELDPE -- -- 8080 8080 ZeoliteZeolite 9090 -- -- -- 합계Sum 100100 100100 100100 100100 은(Ag) 입자의 크기는 1~100nm임 Silver (Ag) particles range in size from 1 to 100 nm

2. 측정 시약 및 기구2. Measuring reagents and instruments

본 실시 예에서 총 활선산소종 정량을 위해 사용한 측정시약은 H2DCF-DA(D6883), DCF(0521012210), 포르신 에스테라아제(Pocrine esterase)는 Sigma사 (st. Louis, MO, USA)로부터 구매하여 사용하였으며 측정기구는 반응시약들의 형광(fluorescence)은 VICTOR3™ 멀티-레벨 플레이트 리더(Multi-label Plate Reader, PerkinElmer)를 사용하여 측정하였다. 1회 총 반응 용량은 100 ㎕로써 SPL 라이프 사이언스(Life Science, South Korea)사의 블랙 96-웰 플레이트(Black 96-wells plate, 30196; flat)에서 수행하였다. 담수에 사용된 60pi petri dish 는 SPL 사의 것을 사용하였고 SLB co.의 3D 진탕기(shaker)를 이용하여 분석하였다.
In this example, the measurement reagent used for quantifying total live oxygen species was H 2 DCF-DA (D6883), DCF (0521012210), and forcin esterase (Pocrine esterase) was purchased from Sigma (st. Louis, MO, USA). The fluorescence of the reaction reagents was measured using a VICTOR3 ™ Multi-label Plate Reader (PerkinElmer). One total reaction dose was 100 μl in a Black 96-wells plate (30196; flat) from SPL Life Science, South Korea. The 60pi petri dish used for fresh water was manufactured by SPL and analyzed by 3D shaker of SLB co.

3. 시험 방법3. Test method

3.1 Crude H2DCF의 제조 방법3.1 Preparation of Crude H 2 DCF

H2DCF-DA는 분자량이 487.29g/mol으로써 100% MeOH 2 ml에 H2DCF-DA 0.0195g을 넣어 녹임으로써 20 mM H2DCF-DA 모액(stock solution)(20x)을 제조하였다. 빛을 차단하기 위해 갈색 e-tube에 1 ml씩 분취(aliquot)하여 -20 ℃에 보관하여 필요할 때 사용하였다. 포르신 에스테라아제(Porcine esterase)(17 U/mg)는 3.7 mg을 0.1M PBS 12.5 ml에 녹여 5 U/ml 모액(stock solution)(100x)를 제조한 후 1 ml씩 분취(aliquot)하여 -70 ℃에 보관하고 필요할 때 상온 해동하여 사용하였다.H 2 DCF-DA having a molecular weight of 487.29 g / mol was dissolved in 2 ml of 100% MeOH H 2 DCF-DA 0.0195g to prepare a 20 mM H 2 DCF-DA stock solution (20x). Aliquot 1 ml each in a brown e-tube to block light and store at -20 ℃ to use when necessary. Forcine esterase (17 U / mg) was dissolved in 12.5 ml of 0.1 M PBS to prepare 5 U / ml stock solution (100x). It was stored at ℃ and thawed at room temperature when needed.

갈색 e-tube에 PBS(pH=7.4) 445 ㎕를 넣고 20 mM H2DCF-DA 50 ㎕와 5 U/ml 포르신 에스테라아제(porcine esterase)(100 x) 5 ㎕를 혼합한 후 37 ℃에서 한 시간 동안 반응시켰다.
445 μl of PBS (pH = 7.4) was added to the brown e-tube, and 50 μl of 20 mM H 2 DCF-DA and 5 μl of 5 U / ml forcine esterase (100 ×) were mixed. The reaction was carried out for a time.

3.2 과산화수소 검량선 표준액의 제조(H2DCF-DA 법)3.2 Preparation of hydrogen peroxide calibration curve standard solution (H 2 DCF-DA method)

아래 [표 3]의 내용과 같이 20 mM H2O2 원액을 연속하여 3차 증류수로 희석하여 4 ~ 80 μM H2O2 표준액들(4, 10, 20, 30, 40, 60, 80 uM)을 제조하여 검량선 작성에 사용하였다.
As shown in Table 3 below, the 20 mM H 2 O 2 stock solution was continuously diluted with distilled water and then 4 to 80 μM H 2 O 2 standard solutions (4, 10, 20, 30, 40, 60, 80 uM). ) Was used to prepare a calibration curve.

과산화수소량(㎕)Hydrogen peroxide amount (µl) 증류수량(㎕)Distilled water (μl) 과산화수소표준액 농도(μM)Hydrogen peroxide standard concentration (μM) 3 % H2O2 22.7 3% H 2 O 2 22.7 + 977+ 977 2000020000 20mM H2O2 50 20 mM H 2 O 2 50 + 950+ 950 10001000 1000μM H2O2 80 1000 μM H 2 O 2 80 + 920+ 920 8080 80μM H2O2 75080 μM H 2 O 2 750 + 250+ 250 6060 80μM H2O2 50080 μM H 2 O 2 500 + 500+ 500 4040 60μM H2O2 500 60 μM H 2 O 2 500 + 500+ 500 3030 40μM H2O2 50040 μM H 2 O 2 500 + 500+ 500 2020 20μM H2O2 50020 μM H 2 O 2 500 + 500+ 500 1010 20μM H2O2 100 20 μM H 2 O 2 100 + 400+ 400 44

3.3 형광 반응 측정3.3 Fluorescence Response Measurement

2 mM H2DCF-DA(2x) 실험용액(working solution)을 만들기 위하여 20 mM H2DCF-DA 모액(stock solution)(20x) 100 ㎕와 3차 증류수 900 ㎕를 혼합 제조하여 사용하였으며 crude H2DCF의 경우 3.1에서 제조한 시약을 그대로 사용하였다. 음성대조군(Negative control)으로서 기재를 넣지 않은 증류수 50 ㎕를 각각 블랙 96-웰 플레이트(black 96-well plate)의 웰(well)에 동일한 3개의 웰(triple tests)에 각각 분주하였다.To prepare a 2 mM H 2 DCF-DA (2x) working solution, 100 µl of 20 mM H 2 DCF-DA stock solution (20x) and 900 µl of distilled water were used. 2 For DCF, the reagent prepared in 3.1 was used as it is. 50 μl of undistilled water as a negative control was dispensed into the same three wells in each well of a black 96-well plate.

음성대조군(Negative control), H2O2 표준액, 측정할 시료 각 50 ㎕에 2 mM H2DCF-DA(또는 2 mM crude H2DCF) 실험용액(working solution) 50 ㎕를 혼합하여 상온에서 반응시켰다. 혼합 후 90분, 95분, 100분 방치하였을 때 각각 여기(excitation) 파장 490nm, 방출(emission) 파장 535nm에서 램프 에너지(lamp energy)를 500으로 하고 VICTOR3TM 멀티-레벨 플레이트 리더(Multi-label Plate Reader, PerkinElmer)로 형광(fluorescence)을 측정하고 평균값을 사용하여 검량선을 작성하였다. 최종 반응조건은 증류수 속에 1 mM H2DCF-DA의 시약이 포함되어 시료 중의 ROS와 반응하는 조건이었다.
50 μl of 2 mM H 2 DCF-DA (or 2 mM crude H 2 DCF) working solution was mixed with 50 μl of negative control, H 2 O 2 standard solution, and the sample to be measured. I was. 90 minutes, 95 minutes, and 100 minutes after mixing, the lamp energy is 500 at the excitation wavelength of 490 nm and the emission wavelength of 535 nm, respectively, and the VICTOR3 ™ Multi-label Plate Reader (Multi-label Plate) Fluorescence was measured with Reader, PerkinElmer) and a calibration curve was prepared using the average value. The final reaction condition was a condition in which 1 mM H 2 DCF-DA reagent was included in distilled water and reacted with ROS in the sample.

시료의 총활성산소가 나타내는 산화력과 동일한 산화력을 나타내는 H2O2 농도의 계산은 표준액 H2O2 농도들과 형광값들로부터 선형회귀(linear regression) (r 2 > 0.9) 방법을 사용하여 아래와 같은 표준 검량선식을 구한 다음 그 식에 시료의 형광값을 대입하여 μM H2O2 농도를 구하였다. The calculation of H 2 O 2 concentrations showing the same oxidative power as that of the total active oxygen of the sample was calculated using the linear regression method ( r 2 > 0.9) from the standard H 2 O 2 concentrations and the fluorescence values. After obtaining the same standard calibration curve, the fluorescence value of the sample was substituted for the concentration of μM H 2 O 2 .

y = a x - b, R2 = 상관계수y = ax-b, R 2 = correlation coefficient

상기 표준 검량선식에서 y는 표준액 또는 시료가 나타내는 DCF 형광값이며 x는 H2O2 (μM)농도이고, a, b는 H2DCF-DA 첨가 후 방치시간에 따라 변화하는 상수(도면 4 및 도면 5에 도시된 표준 검량선 참조), R2는 상관계수이다. x를 구하는 관계식은 x = (y + b)/a이며 y에 DCF 형광값을 대입하여 x를 구한다.
In the standard calibration curve, y is the DCF fluorescence value represented by the standard solution or the sample, x is the H 2 O 2 (μM) concentration, and a and b are constants that change with the standing time after H 2 DCF-DA addition (Fig. 4 and Fig. R 2 is the correlation coefficient. The relation to find x is x = (y + b) / a and substitutes DCF fluorescence for y to find x.

4. 총활성산소종의 측정 결과4. Measurement result of total reactive oxygen species

먼저 세포 내가 아니라 일반 기제 속에서 활성산소종을 측정하기 위해서 H2DCF-DA가 탈아세틸화 없이도 활성산소종에 반응하고 과산화수소 농도에 비례하여 형광강도가 직선적으로 증가하는지 관찰하기 위하여 탈 아세틸화된 crude H2DCF를 만들어 다양한 과산화수소 농도 표준액들과 혼합 반응시킨 후 검량선을 도 5와 같이 작성하였으며 동일한 조건에서 H2DCF-DA를 이용하여 같은 방법으로 도 6에 도시된 내용과 같이 다양한 검량선식을 구하였다. 혼합 후 60분 이상을 방치하였을 때 검량선의 r 2 (상관계수)가 0.9 이상으로 양호한 직선성을 나타내기 시작하였으며 60분 반응에서 crude H2DCF는 검량선 수식에서 기울기가 135.6으로 H2DCF-DA의 89.3 보다 높았다.
First, dehydrogenated H 2 DCF-DA reacts with reactive oxygen species without deacetylation to measure reactive oxygen species in the general substrate but not in the cell, and linearly increases the fluorescence intensity in proportion to the hydrogen peroxide concentration. After preparing and reacting crude H 2 DCF with various hydrogen peroxide concentration standards, the calibration curve was prepared as shown in FIG. 5, and various calibration curves were prepared as shown in FIG. 6 using H 2 DCF-DA under the same conditions. Obtained. When left for more than 60 minutes after mixing, the calibration curve showed good linearity with r 2 (correlation coefficient) of 0.9 or more. In the 60-minute reaction, crude H 2 DCF showed 135.6 in the calibration curve with H 2 DCF-DA. Was higher than 89.3.

감도(Sensitivity)를 나타내는 LOQ(limit of quantification)는 crude H2DCF가 0.63 μg/ml H2O2로써 H2DCF-DA의 1.3 μg/ml H2O2 보다 감도가 더 좋았다.
Sensitivity of LOQ (limit of quantification) was 0.63 μg / ml H 2 O 2 for crude H 2 DCF, which was more sensitive than 1.3 μg / ml H 2 O 2 for H 2 DCF-DA.

결과적으로 H2DCF-DA와 crude H2DCF가 모두 일정 시간(60분) 이상 반응시킬 때 과산화수소의 농도와 비례하여 DCF 형광이 증가하였으므로 H2DCF-DA를 측정에 사용할 때 디아세틸화 과정이 필요 없어 사용이 간편하고 자가산화(auto-oxidation) 정도가 약하여 안정적이므로 H2DCF-DA를 총활성산소종에 의해 산화되어 형광을 나타내는 물질로서 정량에 사용하였다.
As a result, the de-acetylation process when DCF fluorescence in proportion to the concentration of hydrogen peroxide when H 2 DCF-DA and the crude H 2 DCF all be reacted over a period of time (60 minutes) is increased hayeoteumeuro use H 2 DCF-DA in the measurement H 2 DCF-DA was oxidized by total reactive oxygen species and used as a fluorescence material because it was easy to use because it was simple to use and was weak due to its low degree of auto-oxidation.

A와 B를 3차 증류수를 사용하여 다양한 함량에 따라 발생하는 총활성산소종을 μM H2O2으로 정량하였다. 실시 예 1에서 A를 0.05, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5g을 각각 넣고, 3차 증류수를 5 ml 씩 가하여 용매 중 함량이 1, 5, 10, 20, 50, 100 %가 되도록 제조한 후, 3시간 담수한 후 측정한 총활성산소량은 아래 [표 4]의 내용과 같았다. 3차 증류수 내 A함량에 따른 발생량의 경향은 도 6과 같이 U 자 모양을 나타내어 1 %에서 7.8 μM H2O2를 나타낸 후 감소하다가 10 %에서 가장 작은 5.1 μM H2O2를 보이며 이후 함량이 증가함에 따라 증가하여 100 %에서 가장 많은 8.4 μM H2O2를 나타내었다.
The total active oxygen species generated according to various contents of A and B using tertiary distilled water were quantified by μM H 2 O 2 . In Example 1, A, 0.05, 0.25, 0.5, 1, 2.5, and 5 g were added, respectively, and 5 ml of tertiary distilled water was added to prepare 1, 5, 10, 20, 50, and 100% of the solvent. The total free radicals measured after 3 hours of fresh water were as shown in Table 4 below. The trend of the generation amount according to the A content in the tertiary distilled water showed a U-shape as shown in FIG. 6, showing 7.8 μM H 2 O 2 at 1% and then decreasing to 5.1 μM H 2 O 2 , the smallest at 10%. This increased with increasing number, showing the highest amount of 8.4 μM H 2 O 2 at 100%.

실시 예 2에서 용매에 분산된 형태인 B는 3차 증류수를 혼합하여 5 ml이 되도록 시료를 제조하여 용매 중 함량이 1, 5, 10, 20, 50, 100 %로 하여 제조한 후, 3시간 담수한 후 측정한 총활성산소량은 아래 [표 4]의 내용과 같았다. 3차 증류수 내 A함량에 따른 발생량의 경향은 도 6과 같이 전체적으로 역 U 자 모양을 나타내어 50 %에서 가장 많은 35.9 μM H2O2를 나타내고 5 %에서 가장 작은 7.8 μM H2O2를 보이며 함량 100 %에서 23.7 μM H2O2를 나타내었다.
B in the form dispersed in Example 2 was prepared by mixing tertiary distilled water to make a sample to 5 ml, and then prepared in 1, 5, 10, 20, 50, 100% of the solvent, 3 hours The total free radicals measured after fresh water were as shown in Table 4 below. The trend of the generation amount according to the A content in the tertiary distilled water showed an inverted U-shape as a whole as shown in FIG. 6, showing the highest 35.9 μM H 2 O 2 at 50% and the lowest 7.8 μM H 2 O 2 at 5%. 23.7 μM H 2 O 2 was shown at 100%.

[단위 : H2O2 값(μM)][Unit: H 2 O 2 value (μM)] 함 량 %content % 실시 예 1 (A)Example 1 (A) 실시 예 2 (B)Example 2 (B) 1One 7.8 7.8 16.5 16.5 55 6.6 6.6 7.8 7.8 1010 5.1 5.1 13.7 13.7 2020 6.5 6.5 22.9 22.9 5050 6.1 6.1 35.9 35.9 100100 8.4 8.4 23.7 23.7

실시 예 3에서 A를 증류수 5ml에 5g 을 담수하여 함량을 100%(W/V)로 하였고, 실시 예 4에서 B는 증류수 2.5 ml에 B액 2.5 ml을 혼합함으로써 함량을 50%로 한 후 시간별로 측정한 총 활성산소종의 측정 결과는 아래 [표 5]의 내용과 같았다. 1시간부터 6시간까지 측정 하였을 때 거의 직선적으로 증가하여 실시 예 3(A)의 경우 20.8 μM H2O2 , 실시 예 4(B)의 경우 99.6 μM H2O2 까지 증가하였다. 24시간 이후에 측정하였을 때 실시 예 3의 경우 17.5 μM H2O2 , 실시 예 4의 경우 94.6 μM H2O2 까지 감소하였다. 도 7를 통해 실시 예 3, 4 제품들이 생산하는 총활성산소종의 추세를 보았을 때 8 ~ 10 시간까지 증가하였을 것으로 추정되며 이후에 정상기를 유지하다가 후에 감소할 것으로 생각된다.
In Example 3, 5g of A was distilled into 5ml of distilled water, and the content was 100% (W / V). The measurement results of the total active oxygen species measured as shown in Table 5 below. When measured from 1 hour to 6 hours, almost linearly increased to 20.8 μM H 2 O 2 in Example 3 (A) and 99.6 μM H 2 O 2 in Example 4 (B). When measured after 24 hours, it decreased to 17.5 μM H 2 O 2 for Example 3 and 94.6 μM H 2 O 2 for Example 4. Referring to the trend of the total active oxygen species produced by Examples 3 and 4 through Figure 7 is estimated to have increased by 8 to 10 hours, after which it is believed to decrease after maintaining the normal phase.

[단위 : H2O2 값(μM)][Unit: H 2 O 2 value (μM)] 담수 시간Freshwater time 실시 예 3(A)Example 3 (A) 실시 예 4(B)Example 4 (B) 1One 12.112.1 16.516.5 22 11.6 11.6 31.031.0 33 12.6 12.6 48.248.2 44 13.5 13.5 54.2 54.2 55 18.3 18.3 76.3 76.3 66 20.8 20.8 99.699.6 2424 17.517.5 94.694.6

실시 예 5[C(20%)]과 실시 예 6[D(20%)]에 대해 함량을 100 % (w/v)로 하여 본 발명방법에 따라 총활성산소량을 정량한 결과를 아래 [표 6] 및 도 8과 같이 담수 시간에 따라 나타내었다. 측정결과 실시 예 3의 경우 담수 4시간까지 총활성산소량이 9.1 μM H2O2 증까지 지속적으로 증가하였으며 실시 예 6의 경우는 일정한 경향을 나타내지 않았으므로 실시 예 3, 4에 비해 총활성산소 발생량이 적음을 알 수 있었다.
In Example 5 [C (20%)] and Example 6 [D (20%)] the content of 100% (w / v) of the total amount of free oxygen according to the method of the present invention was quantified according to the following table 6] and as shown in FIG. 8 according to freshwater time. As a result, in case of Example 3, the total amount of free radical oxygen was continuously increased to 9.1 μM H 2 O 2 increase until 4 hours of fresh water, and in case of Example 6, the total amount of free oxygen was generated compared to Examples 3 and 4 I could see this less.

[단위 : H2O2 값(μM)][Unit: H 2 O 2 value (μM)] 담수 시간Freshwater time 실시 예 5(C)Example 5 (C) 실시 예 6(D)Example 6 (D) 1One 4.04.0 5.6 5.6 22 6.8 6.8 3.9 3.9 33 6.26.2 3.8 3.8 44 9.19.1 5.65.6

상술한 바와 같은, 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 일반기재에서 총활성산소종의 정량적 측정방법을 설명한 것은 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변화 및 변경이 가능하다는 것을 이 분야의 통상적인 기술자들은 잘 이해할 수 있을 것이다.As described above, the method of quantitatively measuring the total active oxygen species in the general substrate according to the preferred embodiment of the present invention is that various changes and modifications can be made without departing from the technical spirit of the present invention. Technicians will be well understood.

Claims (6)

페트리 접시 내에서 용매에 H2O2 표준액 및 H2DCF-DA를 첨가하여 교반한 다음 상온에서 일정시간 방치하여 DCF 형광 색상을 발색시킨 다음 H2O2 함량에 따른 표준 검량선을 작성하는 단계(P100)와;
별도로 페트리 접시 내에서 용매에 활성산소종 발생물질이 함유된 기재에 H2DCF-DA를 첨가하여 교반한 다음 상온에서 일정시간 방치하여 DCF 형광 색상을 발색시킨 다음 발색한 형광값을 측정하는 단계(P200) 및;
상기 P200 단계에서 측정한 DCF 형광값을 상기 P100 단계에서 작성한 표준 검량선과 대조하여 H2O2 함량을 산출하는 단계(P300):
로 이루어지는 것을 특징으로 하는 일반기재에서 총활성산소종의 정량적 측정방법.
H 2 O 2 standard solution and H 2 DCF-DA were added to the solvent in a Petri dish, stirred, and allowed to stand at room temperature for a certain time to develop a DCF fluorescent color and to prepare a standard calibration curve according to the H 2 O 2 content ( P100);
In addition, H 2 DCF-DA was added to the substrate containing active oxygen species generating substance in a solvent in a Petri dish and stirred, and the mixture was left at room temperature for a certain time to develop a DCF fluorescent color and then measure the fluorescence value. P200);
Computing the H 2 O 2 content by comparing the DCF fluorescence value measured in step P200 with the standard calibration curve prepared in step P100 (P300):
Quantitative measurement method of total free radical species in the general substrate, characterized in that consisting of.
제 1항에 있어서,
상기 용매는 증류수, 이온교환수 또는 일반 식용수인 것을 특징으로 하는 일반기재에서 총활성산소종의 정량적 측정방법.
The method of claim 1,
The solvent is distilled water, ion-exchanged water or general drinking water, characterized in that the quantitative measuring method of total active oxygen species in a general substrate.
제 1항에 있어서,
상기 P100 단계에서 시료의 총활성산소종을 정량함에 있어 안정성이 높은 활성산소종인 과산화수소(H2O2)를 사용하여 4 ~ 80 μM H2O2 표준액들(4, 10, 20, 30, 40, 60, 80 uM)의 검량선을 작성함으로써 시료의 총활성산소종과 동일한 총산화력을 나타내는 과산화수소(H2O2) 농도로 표시하는 것을 특징으로 하는 일반기재에서 총활성산소종의 정량적 측정방법.
The method of claim 1,
4 to 80 μM H 2 O 2 standard solutions (4, 10, 20, 30, 40) using hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), which is a highly stable active oxygen species, in quantifying the total active oxygen species of the sample in the step P100 , 60, 80 uM) is a quantitative measurement method of the total active oxygen species in a general substrate characterized in that expressed by the hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) concentration exhibiting the same total oxidation power as the total active oxygen species of the sample.
제 1항에 있어서,
상기 P200 단계에서 용매 내에 첨가하는 기재의 양은 고체 기재의 경우 용매에 대한 함량을 1~100 W/V %(g/ml) 기준으로 첨가하고 수면에 충분히 담기도록 하여 액체 또는 액체에 분산된 형태인 경우 1~100 V/V % (ml/ml)를 기준으로 첨가하며 측정하기 전 3000 rpm에서 원심분리하여 상등액을 사용하는 것을 특징으로 하는 일반기재에서 총활성산소종의 정량적 측정방법.
The method of claim 1,
The amount of the substrate added in the solvent in the step P200 is a solid substrate in the form of dispersed in a liquid or a liquid by adding the content of the solvent on the basis of 1 ~ 100 W / V% (g / ml) so as to be sufficiently immersed in the water surface When 1 ~ 100 V / V% (ml / ml) is added based on the quantitative measuring method of total free radical species in the general substrate, characterized in that the supernatant is used by centrifugation at 3000 rpm before measurement.
제 1항에 있어서,
상기 P100 단계 및 P200 단계에서 용매 내에 각각 첨가하는 H2DCF-DA는 최종 농도가 1 mM이 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하는 일반기재에서 총활성산소종의 정량적 측정방법.
The method of claim 1,
H 2 DCF-DA added in the solvent in the P100 step and P200 step is quantitative measuring method of total active oxygen species in a general substrate, characterized in that the final concentration is added to 1 mM.
제 1항에 있어서,
상기 P200 단계에서 활성산소종 발생물질은 은(Au), 금(Au), 망간(Mn), 아연(Zn), 백금(Pt), 팔라듐(Pd), 구리(Cu)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 일반기재에서 총활성산소종의 정량적 측정방법.The method of claim 1,
The active oxygen species generating material in step P200 is selected from the group consisting of silver (Au), gold (Au), manganese (Mn), zinc (Zn), platinum (Pt), palladium (Pd), and copper (Cu). Quantitative measurement method of total free radical species in the general substrate, characterized in that.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110441203A (en) * 2019-09-11 2019-11-12 生态环境部华南环境科学研究所 One kind is for active oxygen on-line monitoring acquisition equipment and monitoring device

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20010073833A (en) * 2000-01-21 2001-08-03 복성해 Method for high speed measurement of free radical of cell unsing 2',7'-dichlorofluorescin
KR20110043888A (en) * 2009-10-22 2011-04-28 주식회사 과학기술분석센타 Device for measuring ability of anti-oxidation and method of the same

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20010073833A (en) * 2000-01-21 2001-08-03 복성해 Method for high speed measurement of free radical of cell unsing 2',7'-dichlorofluorescin
KR20110043888A (en) * 2009-10-22 2011-04-28 주식회사 과학기술분석센타 Device for measuring ability of anti-oxidation and method of the same

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HYPERTENSION, 1999 *
METH MOL BIOL, 2012 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110441203A (en) * 2019-09-11 2019-11-12 生态环境部华南环境科学研究所 One kind is for active oxygen on-line monitoring acquisition equipment and monitoring device
CN110441203B (en) * 2019-09-11 2024-04-05 生态环境部华南环境科学研究所 Online active oxygen monitoring and capturing device and monitoring device

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