KR101274854B1 - 감염성 호흡기 질환 진단용 전기화학 ｄｎａ 센서 및 이의 제조방법 - Google Patents

감염성 호흡기 질환 진단용 전기화학 ｄｎａ 센서 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 감염성 호흡기 질환 진단용 전기화학 DNA 센서 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 전기화학 DNA 센서는 다양한 작용기를 갖는 라디칼 발생 분자를 제조한 후, 전기를 가하여 라디칼 반응을 통해 탄소전극 또는 금속전극 표면에 다양한 작용기를 도입하고, 이 작용기에 아비딘을 공유결합시킨 다음 인플루엔자 바이러스 염기서열을 갖는 비오티닐화된 프로브 DNA를 결합시켜 전극에 고정화시킴으로써, 감도가 높고 간섭효과가 매우 작다. 따라서, 본 발명의 전기화학 DNA 센서는 인플루엔자 바이러스를 간단히, 신속히, 편리하게 측정하여 현장에서 호흡기 질환 감염자의 일차 분류를 위한 스크리닝 검사와 정확한 처방을 위한 확진 판정용 센서로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

감염성 호흡기 질환 진단용 전기화학 ＤＮＡ 센서 및 이의 제조방법 {Electrochemical DNA sensor for diagnosis of infectious respiratory disease and method for preparing the same}
본 발명은 감염성 호흡기 질환 진단용 전기화학 DNA 센서 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
신종플루(H1N1), 조류독감, 중증 급성 호흡기 증후군(severe acute respiratory syndrome; SARS) 등과 같은 감염성 호흡기 질환은 학교, 직장 등 공공장소에서 불특정 다수에게 전파되는 질환으로, 감염이 빠른 특징이 있다. 따라서, 호흡기 질환의 빠른 감염을 통한 대유행을 막기 위하여 조기대응이 매우 중요하며, 조기 감염 차단을 위해서는 감염자의 신속하고 정확한 진단이 필요하다.
신종플루(H1N1)의 확진검사로 인정되어 사용되고 있는 Real-Time PCR은 높은 감도와 정확도를 통해 감염성 호흡기 질환의 진단에 가장 효과적인 도구로 알려져 있다. 그러나, 상기 Real-Time PCR은 2~4시간의 검사시간이 소요되며, 현장검사가 불가능하여 전문기관에 의뢰하여야 하므로 통상적으로 2~3일 정도의 검사시간이 소요된다. 또한, 검사비용이 매우 높은 수준으로, 감염성 호흡기 질환의 대유행이 예상되는 시점에서 국가적 규모의 초기 대응수단으로 사용하기에는 불가능한 실정이다.
한편, 새로운 인플루엔자 바이러스에 의한 대유행이 예견되는 상황에서 WHO는 각국에 대유행에 대한 대책을 강구하도록 요청하고 있으며, 대책의 핵심은 백신의 생산, 항바이러스제 비축 등이다. 그러나, 무엇보다 중요한 것은 인플루엔자 바이러스 출현을 신속히 탐지할 수 있는 새로운 바이오센서의 개발이 시급하다.
바이오센서란 생체감지물질(bioreceptor)과 신호 변환기(signal transducer)로 구성되어 인식 가능한 신호로 변환하여 분석하고자 하는 물질을 선택적으로 감지하는 장치이다.
생체감지물질로는 특정 물질과 선택적으로 반응 및 결합할 수 있는 효소, 항체, 항원, 호르몬 수용체(hormone-receptor) 등이 있으며, 신호 변환 방법으로는 전기화학(electrochemical), 형광, 발색, SPR(surface plasmon resonance), FET (field effect transistor), QCM(quartz crystal microbalance), 열센서 등 다양한 물리화학적 방법을 사용한다.
바이오센서의 장점은 다른 분석방법과는 달리 측정하고자 하는 시료와 반응하여 신속하고 정확하게 물질을 분석하는데 있다. 즉, 의료분야에서는 바이오센서를 통해 질병의 진단과 관련된 감지의 한계를 줄이는 것이 가능하다. 또한, 바이오 분자를 인식할 수 있는 항체나 DNA를 이용하여 복잡한 물질의 분석을 용이하게 하고, 분석하고자 하는 물질만 선택적으로 검출할 수 있게 한다. 따라서, 전달된 신호를 이용하여 결합 반응과 사용자에 대한 최종 정보를 제공하게 되는 것이다.
따라서, 인플루엔자 바이러스를 간단히, 신속히, 편리하게 측정할 수 있는 바이오센서의 개발의 필요성이 절실히 요구되고 있다.
본 발명자들은 인플루엔자 바이러스를 간단히, 신속히, 편리하게 측정할 수 있는 바이오센서에 대하여 연구하던 중, 다양한 작용기를 갖는 라디칼 발생 분자를 이용하여 전기화학 라디칼 반응을 통해 탄소전극 또는 금속전극 표면에 다양한 작용기를 도입하고, 이 작용기에 아비딘을 공유결합시킨 다음 인플루엔자 바이러스 염기서열을 갖는 비오티닐화된 프로브 DNA를 결합시켜 전극에 고정화하여 전기화학 DNA 센서를 제조하였으며, 상기 전기화학 DNA 센서의 감도가 높고 간섭효과가 매우 작음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 감염성 호흡기 질환 진단용 전기화학 DNA 센서 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.
도 1은 본 발명의 라디칼 발생 분자의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 도이다[(a) 4-아미노벤조산, (b) 4-카복시페닐 디아조늄 염].
도 2는 본 발명의 전기화학 라디칼 반응을 통해 카복실산기가 도입된 탄소 페이퍼의 광전자분광법(XPS) 스펙트럼을 나타낸 도이다[(a) 순수한 탄소 페이퍼, (b) 4-카복시페닐 디아조늄 염이 도입된 탄소 페이퍼].
도 3은 본 발명의 전기화학 라디칼 반응을 통해 카복실산기가 도입된 탄소전극 표면의 접촉각을 나타낸 도이다.
도 4는 반응 전·후의 탄소전극의 순환전압전류(CV) 곡선을 나타낸 도이다 [(a) GCE, (b) COOH-GCE, (c) EDC/NHS-GCE, (d) avidin-GCE, (e) probe DNA-GCE].
도 5는 표적 DNA의 농도에 따른 혼성화된 probe DNA-GCE의 순환전압전류(CV) 곡선[A]과 전류 값의 검량선(calibration curve)[B]을 나타낸 도이다[(a) probe DNA-GCE, (b) 1.0×10-13M의 표적 DNA로 혼성화된 probe DNA-GCE, (c) 1.0×10-12M의 표적 DNA로 혼성화된 probe DNA-GCE, (d) 1.0×10-11M의 표적 DNA로 혼성화된 probe DNA-GCE, (e) 1.0×10-10M의 표적 DNA로 혼성화된 probe DNA-GCE].
도 6은 표적 DNA, 1 mismatch DNA, 2 mismatch DNA와 혼성화된 probe DNA-GCE의 순환전압전류(CV) 곡선[A]과 이의 막대 그래프(histogram)[B]를 나타낸 도이다[(a) probe DNA-GCE, (b) 2-base mismatch DNA로 혼성화된 probe DNA-GCE, (c) 1-base mismatch DNA로 혼성화된 probe DNA-GCE, (d) 표적 DNA로 혼성화된 probe DNA-GCE].
본 발명은
1) 화학식 1의 아민 화합물과 NaNO2를 증류수에서 산 촉매 하에 반응시켜 화학식 2의 디아조늄 염 화합물을 제조하는 단계,
2) 0.1M NBu4BF4 (tetrabutylammonium tetrafluoroborate)이 포함된 아세토니트릴 용액에 상기 1)단계에서 제조한 화학식 2의 디아조늄 염 화합물을 용해시킨 후, 이 용액에 탄소전극 또는 금속전극을 담그고 실온에서 -1.0~0.5V의 전류를 가하여 전극 표면에 작용기를 도입하는 단계,
3) EDC(N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride)와 NHS(N-Hydroxysuccinimide)를 인산염 완충용액에 용해시킨 후, 이 용액에 상기 2)단계에서 제조한 작용기가 도입된 전극을 담그고 실온에서 반응시켜 EDC/NHS-작용기가 도입된 전극을 제조하는 단계,
4) 아비딘(avidin)을 인산염 완충용액에 용해시킨 후, 이 용액에 상기 3)단계에서 제조한 EDC/NHS-작용기가 도입된 전극을 담그고 실온에서 반응시켜 avidin-작용기가 도입된 전극을 제조하는 단계, 및
5) 상기 4)단계에서 제조한 avidin-작용기가 도입된 전극을 비오티닐화된 프로브 DNA 용액에 담그고 실온에서 반응시켜 비오티닐화된 프로브 DNA를 전극에 고정화시키는 단계를 포함하는, 감염성 호흡기 질환 진단용 전기화학 DNA 센서의 제조방법을 제공한다.
Figure 112010085057662-pat00001
Figure 112010085057662-pat00002
상기 화학식 1 및 2에서, R은 -COOH, -NH2, -OH, -SH, -NO2, -CN 또는 -(CH2)nOH 이며, n은 1~20의 정수이다.
또한, 본 발명은 상기 전기화학 DNA 센서의 제조방법으로 제조된 감염성 호흡기 질환 진단용 전기화학 DNA 센서를 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 전기화학 DNA 센서는 다양한 작용기를 갖는 라디칼 발생 분자를 제조한 후, 전기를 가하여 라디칼 반응을 통해 탄소전극 또는 금속전극 표면에 다양한 작용기를 도입하고, 이 작용기에 아비딘을 공유결합시킨 다음 인플루엔자 바이러스 염기서열을 갖는 비오티닐화된 프로브 DNA를 결합시켜 전극에 고정화한 것을 특징을 한다.
본 발명의 전기화학 DNA 센서의 제조방법에 대해 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.
상기 1)단계는 다양한 작용기를 갖는 라디칼 발생 분자(디아조늄 염 화합물)를 제조하는 단계로, 화학식 1의 아민 화합물과 NaNO2를 증류수에서 산 촉매 하에 반응시켜 화학식 2의 디아조늄 염 화합물을 제조한다.
상기 2)단계는 전기화학 라디칼 반응을 통해 전극 표면에 작용기를 도입하는 단계로, 0.1M NBu4BF4 이 포함된 아세토니트릴 용액에 화학식 2의 디아조늄 염 화합물을 용해시킨 후, 이 용액에 탄소전극 또는 금속전극을 담그고 실온에서 -1.0~0.5V의 전류를 1~10분 동안 가하여 전극 표면에 작용기를 도입한다. 전류를 가하는 과정에서 작용기를 갖는 화합물의 자유 라디칼과 디아조늄 자유 라디칼이 생성되고, 이 자유 라디칼들이 전극 표면에 공유결합하게 된다.
상기 탄소전극으로는 전기를 가할 때 발생하는 라디칼과 결합할 수 있는 유리상 탄소(glassy carbon; GC) 전극, 탄소나노튜브 전극, 그라핀 전극 및 흑연 전극으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 금속전극으로는 전기를 가할 때 발생하는 라디칼과 결합할 수 있는 철 (Fe) 전극, 코발트(Co) 전극, 니켈(Ni) 전극, 백금(Pt) 전극, 팔라듐(Pd) 전극, 아연(Zn) 전극, 구리(Cu) 전극, 금(Au) 전극으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 3)단계는 EDC/NHS-작용기가 도입된 전극을 제조하는 단계로, EDC(N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride)와 NHS(N-Hydroxysuccinimide)를 인산염 완충용액에 용해시킨 후, 이 용액에 작용기가 도입된 전극을 담그고 실온에서 반응시켜 EDC/NHS-작용기가 도입된 전극을 제조한다.
상기 4)단계는 avidin-작용기가 도입된 전극을 제조하는 단계로, 아비딘 (avidin)을 인산염 완충용액에 용해시킨 후, 이 용액에 EDC/NHS-작용기가 도입된 전극을 담그고 실온에서 반응시켜 avidin-작용기가 도입된 전극을 제조한다.
상기 5)단계는 비오티닐화된 프로브 DNA를 전극에 고정화시키는 단계로, 상기 avidin-작용기가 도입된 전극을 비오티닐화된 프로브 DNA 용액에 담그고 실온에서 반응시켜 비오티닐화된 프로브 DNA를 전극에 고정화시킨다.
상기 방법으로 제조된 전기화학 DNA 센서(고정화된 프로브 DNA)는 표적 DNA와의 혼성화를 통해, 표적 DNA의 농도가 증가할수록 혼성화된 프로브 DNA 센서의 전류 값이 낮아지며, 전기화학 DNA의 센싱 범위가 0.1~100pM 로 고감도 센서임을 확인하였다.
또한, 상기 방법으로 제조된 전기화학 DNA 센서(고정화된 프로브 DNA)는 mismatch DNA 및 표적 DNA와의 혼성화를 통해, mismatch DNA가 존재할 때에도 전류 값이 변화하긴 하지만, 표적 DNA의 센싱 범위의 전류 값(1.24㎂)에는 영향을 미치지 않아 mismatch DNA에는 전혀 간섭효과가 없음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 전기화학 DNA 센서는 간섭효과가 매우 작은 센서임을 알 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 전기화학 DNA 센서는 다양한 작용기를 갖는 라디칼 발생 분자를 제조한 후, 전기를 가하여 라디칼 반응을 통해 탄소전극 또는 금속전극 표면에 다양한 작용기를 도입하고, 이 작용기에 아비딘을 공유결합시킨 다음 인플루엔자 바이러스 염기서열을 갖는 비오티닐화된 프로브 DNA를 결합시켜 전극에 고정화시킴으로써, 감도가 높고 간섭효과가 매우 작다. 따라서, 본 발명의 전기화학 DNA 센서는 인플루엔자 바이러스를 간단히, 신속히, 편리하게 측정하여 현장에서 호흡기 질환 감염자의 일차 분류를 위한 스크리닝 검사와 정확한 처방을 위한 확진 판정용 센서로서 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 전기화학 DNA 센서는 임상, 의료, 연구 분야뿐만 아니라 식품, 환경, 헬스-케어 분야에서 고민감도, 초소형, 휴대용 호흡기 질환 감염 진단 센서로서 유용하게 사용될 수 있다.
상기 감염성 호흡기 질환은 신종플루(H1N1), 조류독감, 중증 급성 호흡기 증후군(severe acute respiratory syndrome; SARS) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 전기화학 DNA 센서의 제조
1. 라디칼 발생 분자(4-carboxyphenyl diazonium salt)의 제조
Figure 112010085057662-pat00003
4-아미노벤조산(1.37g, 10mM)과 NaNO2(0.752g, 10mM)를 증류수(20㎖)에서 교반시킨 후, 40mM HCl을 가하여 4-카복시페닐 디아조늄 염(4-carboxyphenyl diazonium salt)을 제조하였다.
상기 제조된 라디칼 발생 분자의 합성 여부는 FT-IR 스펙트럼을 통하여 확인하였으며, 도 1에 나타내었다[(a) 4-아미노벤조산, (b) 4-카복시페닐 디아조늄 염].
도 1에 나타난 바와 같이, 4-아미노벤조산의 FT-IR 스펙트럼에서는 3300㎝-1 부근에서 OH 피크, 3500㎝-1 부근에서 NH2 피크가 날카롭게 나타났으나, 4-카복시페닐 디아조늄 염의 FT-IR 스펙트럼에서는 3500㎝-1 부근에서 NH2 피크가 나타나지 않고 3300~3400㎝-1 부근에서만 OH 피크가 넓게 나타남을 확인하였다. 따라서, 카복실기를 갖는 전기화학 라디칼 발생 분자인 4-카복시페닐 디아조늄 염이 성공적으로 제조됨을 알 수 있다.
2. 전기화학 라디칼 반응을 통해 탄소전극 표면에 작용기(카복실산기)의 도입
Figure 112010085057662-pat00004
0.1M NBu4BF4 (tetrabutylammonium tetrafluoroborate)이 포함된 아세토니트릴(acetonitrile; ACN) 용액에 상기 1에서 제조한 4-카복시페닐 디아조늄 염을 5.0mM이 되게 용해시킨 후, 이 용액에 탄소전극을 담그고 실온에서 일정전류(-0.7V)를 5분 동안 가하였다. 이 과정에서 4-카복시페닐 자유 라디칼(4-carboxyphenyl free radical)과 디아조늄 자유 라디칼(diazonium free radical)이 생성되고, 이 자유 라디칼들이 탄소전극(glassy carbon; GC) 표면에 공유결합하게 된다. 탄소전극의 경우 XPS 샘플을 제조할 수 없어서, 상기와 동일한 방법으로 탄소 페이퍼에 4-카복시페닐기를 도입한 후 카복실산기를 갖는 탄소 페이퍼 전극의 광전자분광법(XPS) 스펙트럼을 측정하였다.
전기화학 라디칼 반응을 통해 카복실산기를 도입한 탄소 페이퍼의 광전자분광법(XPS) 스펙트럼은 도 2에 나타내었고[(a) 순수한 탄소 페이퍼, (b) 4-카복시페닐 디아조늄 염이 도입된 탄소 페이퍼], 전기화학 라디칼 반응을 통해 카복실산기가 도입된 탄소전극 표면의 접촉각은 도 3에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 순수한 탄소 페이퍼의 광전자분광법(XPS) 스펙트럼에서는 질소 원자(N) 피크가 나타나지 않았으나, 4-카복시페닐 디아조늄 염이 도입된 탄소 페이퍼의 광전자분광법(XPS) 스펙트럼에서는 질소 원자(N) 피크가 나타남을 확인하였다. 따라서, 탄소전극 표면에 4-카복시페닐기가 도입됨을 알 수 있다.
또한 도 3에 나타난 바와 같이, 탄소전극 표면의 접촉각은 123.3°이고, 4-카복시페닐기가 도입된 탄소전극 표면의 접촉각은 87.69°로 나타났다. 즉, 탄소전극 표면에 카복실산기가 도입됨으로써 접촉각의 값이 작아지며, 이로써 전기화학 라디칼 반응을 통하여 기능성기가 탄소전극 표면에 쉽게 도입된다는 것을 알 수 있었다.
3. 아비딘-비오틴 결합을 통해 카복실산기가 도입된 탄소전극 표면에 프로브 DNA의 고정화
Figure 112010085057662-pat00005
결합제(coupling agent)인 EDC(N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride, 30mM)와 NHS(N-Hydroxysuccinimide, 30mM)를 인산염 완충용액에 용해시킨 후, 이 용액에 4-카복시페닐기가 도입된 탄소전극을 담그고 실온에서 2시간 동안 반응시켜 EDC/NHS-GCE를 제조하였다. 그 다음, 아비딘 (avidin)을 인산염 완충용액에 200㎍/㎖가 되게 용해시킨 후, 이 용액에 EDC/NHS-GCE를 담그고 실온에서 2시간 동안 반응시켜 avidin-GCE를 제조하였다. 상기 avidin-GCE를 비오티닐화된 프로브 DNA 용액(10pM)에 담그고 실온에서 1시간 동안 반응시켜 비오티닐화된 프로브 DNA가 고정화된 전극(probe DNA-GCE)을 제조하였다. 반응의 성공 여부를 판단하기 위하여, 0.1M KCl을 함유하는 1.0mM K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6(1:1) 용액에서 50mV/s의 주사 속도(scan rate)로 반응 전과 반응 후의 탄소전극에 대한 전류 값을 측정하였다.
반응 전·후의 탄소전극의 순환전압전류(cyclic voltammetry; CV) 곡선은 도 4에 나타내었다[(a) GCE, (b) COOH-GCE, (c) EDC/NHS-GCE, (d) avidin-GCE, (e) probe DNA-GCE].
도 4에 나타난 바와 같이, COOH-GCE에서 카복실산기(COOH)는 전극의 산화 환원을 차단시켜 전류를 감소시켰다(b). 그러나, EDC/NHS-GCE에서 EDC/NHS는 카복실산기(COOH)를 활성화시켜 전극의 산화 환원의 차단 현상을 감소시킴으로써 전류를 증가시켰다(c). 따라서, 본 발명의 전기화학 DNA 센서는 분자가 전극 표면에 길게 공유결합 될수록 전류 값이 낮아지는 패턴으로 반응이 성공적으로 이루어짐을 알 수 있다.
실험예 1 : 고정화된 프로브 DNA와 표적 DNA의 혼성화를 통한 전기화학 DNA의 센싱 범위 측정
본 실험에 사용한 인플루엔자 바이러스(타입 A, 조류독감 바이러스) DNA는 (주)바이오닉스로부터 구입하여 사용하였다[① biotinylated probe DNA: 5'-biotin-ATG AGT CTT CTA ACC GAG GTC GAA-3'; ② 표적 DNA: 5'-TTC GAC CTC GGT TAG AAG ACT CAT-3'].
상기 실시예 1에서 제조한 전기화학 DNA 센서(고정화된 프로브 DNA)를 표적 DNA를 함유한 0.1M 인산염 완충용액(PBS, pH 7.0)에 담그고 37℃에서 45분 동안 혼성화시켰다. 이때, 표적 DNA의 농도를 1.0×10-13M, 1.0×10-12M, 1.0×10-11M, 1.0×10-10M로 변화시키면서 혼성화시켰다. 그 다음, 0.1M KCl을 함유하는 1.0mM K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6(1:1) 용액에서 50mV/s의 주사 속도로 혼성화된 probe DNA-GCE에 대한 전류 값을 측정하였다.
표적 DNA의 농도에 따른 혼성화된 probe DNA-GCE의 순환전압전류(CV) 곡선 [A]과 전류 값의 검량선(calibration curve)[B]은 도 5에 나타내었다[(a) probe DNA-GCE, (b) 1.0×10-13M의 표적 DNA로 혼성화된 probe DNA-GCE, (c) 1.0×10-12M의 표적 DNA로 혼성화된 probe DNA-GCE, (d) 1.0×10-11M의 표적 DNA로 혼성화된 probe DNA-GCE, (e) 1.0×10-10M의 표적 DNA로 혼성화된 probe DNA-GCE].
도 5에 나타난 바와 같이, 표적 DNA의 농도가 증가할수록 혼성화된 probe DNA-GCE의 전류 값이 낮아졌으며, 본 발명의 전기화학 DNA의 센싱 범위는 0.1~100pM 임을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 전기화학 DNA 센서는 고감도 DNA 센서임을 알 수 있다.
실험예 2 : mismatch DNA가 존재할 경우 본 발명의 전기화학 DNA 센서에 미치는 영향
본 실험에 사용한 인플루엔자 바이러스(타입 A, 조류독감 바이러스) DNA는 (주)바이오닉스로부터 구입하여 사용하였다[① biotinylated probe DNA: 5'-biotin-ATG AGT CTT CTA ACC GAG GTC GAA-3'; ② 1 mismatch DNA: 5'-TTC GAC CTC GGT TAT AAG ACT CAT-3'; ③ 2 mismatch DNA: 5'-TTC GAC AGC GGT TAT AAG ACT CAT-3'].
표적 DNA, 1 mismatch DNA, 2 mismatch DNA의 농도를 각각 10pM로 일정하게 만들어 사용하였다. 상기 실시예 1에서 제조한 전기화학 DNA 센서(고정화된 프로브 DNA)를 표적 DNA, 1 mismatch DNA, 2 mismatch DNA를 각각 함유한 0.1M 인산염 완충용액(PBS, pH 7.0)에 담그고 37℃에서 45분 동안 혼성화시켰다. 그 다음, 0.1M KCl을 함유하는 1.0mM K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6(1:1) 용액에서 50mV/s의 주사 속도로 혼성화된 probe DNA-GCE에 대한 전류 값을 측정하였다.
표적 DNA, 1 mismatch DNA, 2 mismatch DNA와 혼성화된 probe DNA-GCE의 순환전압전류(CV) 곡선[A]과 이의 막대 그래프(histogram)[B]는 도 6에 나타내었다 [(a) probe DNA-GCE, (b) 2-base mismatch DNA로 혼성화된 probe DNA-GCE, (c) 1-base mismatch DNA로 혼성화된 probe DNA-GCE, (d) 표적 DNA로 혼성화된 probe DNA-GCE].
도 6에 나타난 바와 같이, 1 mismatch DNA, 2 mismatch DNA가 존재할 때에도 전류 값이 변화하긴 하지만, 표적 DNA의 센싱 범위의 전류 값(1.24㎂)에는 영향을 미치지 않아 mismatch DNA에는 전혀 간섭효과가 없음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 전기화학 DNA 센서는 간섭효과가 매우 작은 센서임을 알 수 있다.
본 발명의 전기화학 DNA 센서는 다양한 작용기를 갖는 라디칼 발생 분자를 제조한 후, 전기를 가하여 라디칼 반응을 통해 탄소전극 또는 금속전극 표면에 다양한 작용기를 도입하고, 이 작용기에 아비딘을 공유결합시킨 다음 인플루엔자 바이러스 염기서열을 갖는 비오티닐화된 프로브 DNA를 결합시켜 전극에 고정화시킴으로써, 감도가 높고 간섭효과가 매우 작다. 따라서, 본 발명의 전기화학 DNA 센서는 인플루엔자 바이러스를 간단히, 신속히, 편리하게 측정하여 현장에서 호흡기 질환 감염자의 일차 분류를 위한 스크리닝 검사와 정확한 처방을 위한 확진 판정용 센서로서 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (5)

1) 화학식 1의 아민 화합물과 NaNO2를 증류수에서 산 촉매 하에 반응시켜 화학식 2의 디아조늄 염 화합물을 제조하는 단계,
2) 0.1M NBu4BF4 (tetrabutylammonium tetrafluoroborate)이 포함된 아세토니트릴 용액에 상기 1)단계에서 제조한 화학식 2의 디아조늄 염 화합물을 용해시킨 후, 이 용액에 탄소전극 또는 금속전극을 담그고 실온에서 -1.0~0.5V의 전류를 가하여 전극 표면에 작용기를 도입하는 단계,
3) EDC(N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride)와 NHS(N-Hydroxysuccinimide)를 인산염 완충용액에 용해시킨 후, 이 용액에 상기 2)단계에서 제조한 작용기가 도입된 전극을 담그고 실온에서 반응시켜 EDC/NHS-작용기가 도입된 전극을 제조하는 단계,
4) 아비딘(avidin)을 인산염 완충용액에 용해시킨 후, 이 용액에 상기 3)단계에서 제조한 EDC/NHS-작용기가 도입된 전극을 담그고 실온에서 반응시켜 avidin-작용기가 도입된 전극을 제조하는 단계, 및
5) 상기 4)단계에서 제조한 avidin-작용기가 도입된 전극을 비오티닐화된 프로브 DNA 용액에 담그고 실온에서 반응시켜 비오티닐화된 프로브 DNA를 전극에 고정화시키는 단계를 포함하는, 감염성 호흡기 질환 진단용 전기화학 DNA 센서의 제조방법:
<화학식 1>
Figure 112010085057662-pat00006

<화학식 2>
Figure 112010085057662-pat00007

상기 화학식 1 및 2에서, R은 -COOH, -NH2, -OH, -SH, -NO2, -CN 또는 -(CH2)nOH 이며, n은 1~20의 정수이다.
제 1항에 있어서, 상기 탄소전극은 유리상 탄소(glassy carbon; GC) 전극, 탄소나노튜브 전극, 그라핀 전극 및 흑연 전극으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 감염성 호흡기 질환 진단용 전기화학 DNA 센서의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 금속전극은 철(Fe) 전극, 코발트(Co) 전극, 니켈(Ni) 전극, 백금(Pt) 전극, 팔라듐(Pd) 전극, 아연(Zn) 전극, 구리(Cu) 전극, 금(Au) 전극으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 감염성 호흡기 질환 진단용 전기화학 DNA 센서의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 감염성 호흡기 질환은 신종플루(H1N1), 조류독감 및 중증 급성 호흡기 증후군(severe acute respiratory syndrome; SARS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 감염성 호흡기 질환 진단용 전기화학 DNA 센서의 제조방법.
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