KR101274222B1 - Antimicrobial composition comprising bacillus licheniformis nb109 as an active ingredient - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) NB109 균주를 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물 및 항암용 조성물에 관한 것이다.
The present invention Bacillus licheniformis ( Bacillus licheniformis ) relates to an antimicrobial composition and an anticancer composition comprising the NB109 strain as an active ingredient.
생물농약은 일반적으로 동물, 식물, 미생물에서 유래한 농약이다 그 범위에 대한 정의는 국내에서 뚜렷이 정의된 바 없으나 생물 또는 그것으로부터 유래된 물질을 인위적으로 합성, 조작 등을 거치지 않은 상태로 제품화한 것을 정의하고 있다. 생물농약은 미생물농약과 생화학농약과 천적으로 나뉘어지며, 그 중 미생물농약은 작물보호를 위하여 사용하는 세균, 진균, 원생동물, 바이러스 등의 살아있는 미생물을 이용한 농약을 말한다. 미생물 농약의 작용 기작은 미생물로부터 생산된 항균물질이 병원균의 생육을 억제, 세포막의 용해, 세포 전체의 용해 등에 작용하여 방제하는 항생, 식물에 기생하여 병을 일으키는 식물병원균에 미생물이 기생하여 병원균을 괴사시키는 기생, 병원균이 식물로부터 배출되는 영양분이나 토양의 영양분을 이용하지 못하도록 하는 경쟁, 그리고 식물의 면역력을 높이는 저항성 유도 등의 방법이 있다.Biopesticides are generally pesticides derived from animals, plants and microorganisms. The definition of the scope is not clearly defined in Korea, but it is a product produced without artificial synthesis or manipulation of organisms or substances derived from them. It is defined. Biopesticides are divided into natural pesticides and biochemical pesticides, and among them, microbial pesticides refer to pesticides using living microorganisms such as bacteria, fungi, protozoa and viruses used for crop protection. The mechanism of action of microbial pesticides is that antibiotics produced by microorganisms inhibit the growth of pathogens; Necrosis parasites, competition to prevent pathogens from using plant nutrients or soil nutrients, and inducing resistance to increase plant immunity.
이러한 방법을 이용한 미생물 농약은 토양, 식물, 익충 및 인축에 안전하며 잔류걱정 및 약해가 없어 생육시기에 관계없이 사용 가능한 장점이 있다. 또한 내성과 작물에 스트레스가 없으며 작물의 생육이 촉진되며 토양병해충 방제의 경우는 장기적 방제 측면에서 이익이 된다.Microbial pesticides using this method is safe for soil, plants, insects, and human beings, and there is no residual worry and no harm, so it can be used regardless of the growth time. In addition, there is no resistance and stress to crops, crop growth is promoted, and soil pest control is beneficial in terms of long-term control.
지금까지 우리나라는 실제적으로 생물농약에 대한 개념은 없었고 토양 미생물제제가 비료 첨가용으로 주로 사용되어 왔다. 그러나 2000년 6월에 이르러 미생물 농약의 등록기준과 방법이 고시되어 토양 미생물제제들 중 살균 및 살충효과가 인정되는 제품들을 미생물 농약의 범주에 들어오도록 하는 제도적 뒷받침이 마련되었다. 또한 환경 친화적 생물농약의 필요성을 중요하게 인식하고 관련 기술 및 제품 개발을 위해 2005년까지 현재 사용되고 있는 화학 농약의 30%를 줄이거나 대체하고자 하는 추진 계획을 발표함에(2000, 농림부) 따라 본격적인 생물농약의 시대에 접어들었다. 하지만 현재 국내의 경우 미생물살충제를 중심으로 생물농약이 사용되는 도입 초기 단계이다. 곤충병원미생물을 이용한 해충방제가 일부 연구자들을 중심으로 제한적으로 수행되어 왔고 최근 일부 식물병을 효과적으로 방제할 가능성이 보이는 시제품들이 제시되고 있을 뿐, 전반적으로 관련 전문가의 부족, 해당기술의 경쟁력 열세 등으로 인해 아직은 극복해야 할 몇 가지 과제들이 존재하고 있는 현실이다. 그러나 정부 출연연구소 뿐 아니라 기업, 대학에서 연구 개발이 활발해지고 있으며 생물농약으로 미생물 특허를 출원하는 건수도 늘고 있다.
Up to now, Korea has no practical concept of biopesticides, and soil microbial agents have been mainly used for fertilizer addition. However, by June 2000, the registration criteria and methods of microbial pesticides were announced, providing institutional support for the entry of microbial pesticides into products that are recognized for their bactericidal and pesticidal effects. We also recognize the need for environmentally friendly biopesticides and announce a plan to reduce or replace 30% of chemical pesticides currently in use by 2005 (December 2000). Has entered the era of However, in Korea, it is in the early stages of introduction of biopesticides, mainly microbial pesticides. Pest control using insect pathogenic microorganisms has been limitedly conducted by some researchers, and recently, prototypes showing the possibility of effectively controlling some plant diseases have been proposed, and overall, due to the lack of related experts and the inferior competitiveness of the technology. As a result, there are still some challenges to overcome. However, research and development are actively being conducted not only in government-funded research institutes but also in companies and universities, and the number of applications for microbial patents for biopesticides is increasing.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.
본 발명자들은 생물 공학적 유용성을 갖는 세균을 발굴하고자 발효 퇴비로부터 항균활성을 갖는 세균을 분리 및 동정 연구하였다. 그 결과, 발효 퇴비 샘플로부터 항균활성을 갖는 세균을 분리 동정하였고, 이 균주가 신규한 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 균주이며, 항균 및 항암 활성을 가지고 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다. The present inventors have isolated and identified bacteria having antimicrobial activity from fermentation compost in order to discover bacteria having biotechnological usefulness. As a result, a bacterium having antimicrobial activity was isolated and identified from the fermented compost sample, and the strain was Bacillus licheniformis ( Bacillus). licheniformis ) strain, and the present invention was completed by identifying that it has antibacterial and anticancer activity.
따라서, 본 발명의 목적은 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) NB109(KCTC 12256BP) 균주 또는 상기 균주의 배양물을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공하는데 있다.Accordingly, an object of the present invention is Bacillus licheniformis ( Bacillus) licheniformis ) NB109 (KCTC 12256BP) strain or to provide an antimicrobial composition comprising the culture of the strain as an active ingredient.
본 발명의 다른 목적은 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) NB109(KCTC 12256BP) 균주 또는 상기 균주의 배양물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공하는데 있다.
Another object of the present invention Bacillus licheniformis ( Bacillus licheniformis ) NB109 (KCTC 12256BP) strain or to provide an anticancer composition comprising the culture of the strain as an active ingredient.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description and claims.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) NB109(KCTC 12256BP) 균주 또는 상기 균주의 배양물을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.
According to an aspect of the present invention, the present invention is Bacillus licheniformis ( Bacillus licheniformis ) NB109 (KCTC 12256BP) strain or provides a composition for antibacterial comprising the culture of the strain as an active ingredient.
본 발명자들은 생물 공학적 유용성을 갖는 세균을 발굴하고자 발효 퇴비로부터 항균활성을 갖는 세균을 분리 및 동정 연구하였으며, 그 결과, 발효 퇴비 샘플로부터 항균활성을 갖는 세균을 분리 동정하였고, 이 균주가 신규한 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 균주이며, 항균 및 항암 활성을 가지고 있음을 규명하였다. The present inventors have isolated and identified a bacterium having antimicrobial activity from fermented compost to find a bacterium having biotechnological usefulness. As a result, the bacterium having antimicrobial activity was isolated from the fermented compost sample. Richenformis ( Bacillus) licheniformis ) strain, which has been shown to have antibacterial and anticancer activity.
본 발명에 따르면, 분리된 미생물의 16S rRNA의 유전자 염기서열을 확인하여 계통학적 분석을 한 결과 바실러스 속 (Bacillus) 균주에 속하는 신규 미생물로 동정되었다. 이를 “바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) NB109 균주”라 명명하고 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures)에 2012년 8월 2일자로 기탁하였고, 기탁번호 KTCT 12256BP를 부여받았다.According to the invention, one to determine the base sequence of 16S rRNA gene of the isolated microorganism phylogenetic analysis was identified as a novel microorganism belonging to the genus Bacillus (Bacillus) strain. This is called the Bacillus licheniformis ( Bacillus licheniformis ) NB109 strain and was deposited on August 2, 2012 at the Korea Collection for Type Cultures, Korea Institute of Bioscience and Biotechnology, and was assigned accession number KTCT 12256BP.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) NB109(KCTC 12256BP) 균주는 서열목록 제1서열의 16S rRNA 유전자 서열을 갖는다. According to a preferred embodiment of the present invention, the Bacillus licheniformis ( Bacillus licheniformis ) NB109 (KCTC 12256BP) strain has the 16S rRNA gene sequence of SEQ ID NO: 1.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) NB109(KCTC 12256BP) 균주 또는 상기 균주의 배양물을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.According to a preferred embodiment of the present invention, the present invention provides an antimicrobial composition comprising Bacillus licheniformis NB109 (KCTC 12256BP) strain or culture of the strain as an active ingredient.
본 발명의 조성물은 다양한 미생물에 대해 항균활성을 발휘한다. 본 발명의 항균용 조성물은 다양한 미생물, 특히 세균에 대해 광범위한 항균 활성을 나타내고(도 10-13), 정상세포에 대한 세포 독성이 없으며(도 14) 급성경구독성(표 10-13), 급성경피독성(표 14-17), 급성어독성(표 18-20)을 나타내지 않았다.The composition of the present invention exhibits antimicrobial activity against various microorganisms. The antimicrobial composition of the present invention shows a wide range of antimicrobial activity against various microorganisms, in particular bacteria (Fig. 10-13), there is no cytotoxicity to normal cells (Fig. 14) acute oral toxicity (Table 10-13), acute dermal Toxicity (Table 14-17) and acute fish toxicity (Table 18-20) were not shown.
하기 본 발명의 일 실시예에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 조성물은 바실러스(Bacillus)속 세균, 포도상구균(Staphylococcus)속 세균, 슈도모나스(Pseudomonas)속 세균, 대장균(Escherichia coli), 칸디다(Candida) 속 세균, 프로테우스(Proteus) 속 세균, 에르비니아(Erwinia) 속 세균 및 랄스토니아(Ralstonia) 속 세균으로 구성된 군으로부터 선택되는 세균에 대해 항균활성을 갖는다.To As will be demonstrated in one embodiment of the invention, the composition of the present invention is Bacillus (Bacillus) in bacteria, Staphylococcus aureus (Staphylococcus) bacteria belonging to the genus Pseudomonas (Pseudomonas) in bacteria, E. coli (Escherichia coli), Candida (Candida) has the spp, Proteus (Proteus) in bacteria, El beanie O (Erwinia) and bacteria belonging to the genus LAL Stony O (Ralstonia) in bacteria, antimicrobial activity against bacteria selected from the group consisting of.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 대장균(Escherichia coli), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 무름병균(Erwinia carotovora), 마름병균(Erwinia chrisanthemi), 풋마름병균(Ralstonia solanacearum), 썩음병균(Pseudomonas fluorescens), 고사병균(Pseudomonas syringae), 마름병균(Erwinia tracheiphila) 또는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 대해 항균 활성을 갖는다. Preferably, the composition of the present invention Bacillus subtilis ( Bacillus subtilis ), Bacillus megaterium megaterium ), Staphylococcus aureus ), Escherichia coli ), Pseudomonas aeruginosa ), Proteus vulgaris ), erwinia carotovora), bacterial blight (Erwinia chrisanthemi ), Ralstonia solanacearum , Pseudomonas fluorescens ), Pseudomonas syringae ), Erwinia antimicrobial activity against tracheiphila or Candida albicans .
상기한 바와 같이 광범위한 항균 스펙트럼을 갖는 본 발명에 따른 항균 조성물은 농약, 의약, 화장품, 생활용품, 식품 등에서 항균, 살균, 소독, 방부 등의 목적을 달성하기 위해 광범위하게 사용될 수 있다. 구체적으로, 농업에 있어서는 항균, 살균, 소독의 목적으로, 의약에 있어서는 항생제나 오염방지제와 같은 목적으로, 식품에 있어서는 방부나 항균목적으로, 화장품이나 생활용품에 있어서는 비듬억제용, 무좀방지용, 겨드랑이 채취억제용, 항여드름용 등 미생물과 직접 연관된 제품에 사용되거나 청소용 세정제나 식기세척용 세정제 등에 방부나 항균 또는 살균목적으로 사용되어 질 수 있으며, 이러한 목적으로만 한정되는 것은 아니다.As described above, the antimicrobial composition according to the present invention having a broad antimicrobial spectrum may be widely used to achieve the purpose of antibacterial, sterilization, disinfection, antiseptic, etc. in pesticides, medicine, cosmetics, household goods, food, and the like. Specifically, for the purpose of antibacterial, disinfecting and disinfecting in agriculture, for antibiotics and antifouling agents in medicine, for antiseptic and antibacterial purposes in foods, for preventing dandruff in cosmetics and household goods, for preventing athlete's foot, for armpits. It may be used in products directly related to microorganisms such as anti-acne and anti acne, or for preservative, antibacterial or sterilizing purposes such as cleaning detergents or dish washing detergents, but is not limited thereto.
본 발명의 항균용 조성물 중 바실러스 리체니포르미스 NB109 균주 또는 상기 균주의 배양물 이외의 성분은 미생물 활성 및 항균 작용을 촉진하는 성분으로써 당업계에 공지된 다양한 성분이 포함될 수 있다.
In the antimicrobial composition of the present invention, the Bacillus licheniformis NB109 strain or a component other than the culture of the strain may include various components known in the art as a component for promoting microbial activity and antimicrobial activity.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) NB109(KCTC 12256BP) 균주 또는 상기 균주의 배양물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공한다. According to another aspect of the invention, the invention is Bacillus Richenformis (Bacillus licheniformis) Provides an anticancer composition comprising an NB109 (KCTC 12256BP) strain or a culture of the strain as an active ingredient.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 균주 또는 균주 배양물은 암 세포주에 있어서 세포 독성을 갖는다. According to a preferred embodiment of the invention, the strain or strain culture of the invention has cytotoxicity in cancer cell lines.
본 발명의 항암용 조성물 중 신규한 바실러스 리체니포르미스 NB109 균주 또는 상기 균주의 배양물 이외의 성분은 미생물 활성 및 암 세포 사멸을 촉진하는 성분으로써 당업계에 공지된 다양한 성분이 포함될 수 있다.
In the anticancer composition of the present invention, the novel Bacillus Richenium form NB109 strain or components other than the culture of the strain may include various components known in the art as components that promote microbial activity and cancer cell death.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:
(ⅰ) 본 발명은 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) NB109(KCTC 12256BP) 균주 또는 상기 균주의 배양물을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물 및 항암용 조성물을 제공한다.(Iii) The present invention Bacillus licheniformis ( Bacillus licheniformis ) NB109 (KCTC 12256BP) strain or a composition for antibacterial and anticancer composition comprising the culture of the strain as an active ingredient.
(ⅱ) 본 발명의 조성물은 다양한 균들에 대한 폭넓은 항균활성 스펙트럼을 나타내며, 동물 및 어류 안정성 시험에서 어떠한 독성이나 자극도 발생시키지 않은 안전한 물질로 농약, 의약, 화장품, 생활용품 등의 다양한 분야에서 살균, 항균, 방부 목적으로 유용하게 이용 가능하다.
(Ii) The composition of the present invention exhibits a broad spectrum of antimicrobial activity against a variety of bacteria and is a safe substance that does not cause any toxicity or irritation in animal and fish stability tests, and is widely used in various fields such as pesticides, medicines, cosmetics and household goods. It is useful for sterilization, antibacterial and antiseptic purposes.
도 1은 B. licheniformis NB109의 지방산 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 B. licheniformis NB109의 24시간 성장에 미치는 탄소원의 영향을 측정한 결과이다.
A, 만니톨 ; B, 프룩토오스 ; C, 글루코오스 ; D, D-솔비톨 ; E, 셀로비오스 ; F, 자일로오스 ; G, 갈락토오스 ; H, 말토오스 ; I, 액상 전분 ; J, 아라비노오스 ; K, 락토오스 ; L, 라피노오스.
도 3은 B. licheniformis NB109의 48시간 성장에 미치는 탄소원의 영향을 측정한 결과이다.
A, 만니톨 ; B, 프룩토오스 ; C, 글루코오스 ; D, D-솔비톨 ; E, 셀로비오스 ; F, 자일로오스 ; G, 갈락토오스 ; H, 말토오스 ; I, 액상 전분 ; J, 아라비노오스 ; K, 락토오스 ; L, 라피노오스.
도 4는 B. licheniformis NB109의 24시간 성장에 미치는 질소원의 영향을 측정한 결과이다.
A, 효모 추출물 ; B, 맥아 추출물 ; C, 소고기 추출물 ; D, NaNO3 ; E, NH4NO3 ; F, L-아스파라긴 ; G, 펩톤 ; H, (NH4)HPO4 ; I, NH4Cl.
도 5는 B. licheniformis NB109의 48시간 성장에 미치는 질소원의 영향을 측정한 결과이다.
A, 효모 추출물 ; B, 맥아 추출물 ; C, 소고기 추출물 ; D, NaNO3 ; E, NH4NO3 ; F, L-아스파라긴 ; G, 펩톤 ; H, (NH4)HPO4 ; I, NH4Cl.
도 6은 B. licheniformis NB109의 48시간 성장에 미치는 무기염의 영향을 측정한 결과이다.
A, MgCl2 ; B, AgNO3 ; C, HgCl2 ; D, ZnSO4·7H2O ; E, MgSO4·7H2O ; F, CaCl2..
도 7은 B. licheniformis NB109의 48시간 성장에 미치는 온도의 영향을 측정한 결과이다.
○, 30℃; ●, 42℃; □, 55℃; ■, 65℃.
도 8은 B. licheniformis NB109의 24시간 성장에 미치는 pH의 영향을 측정한 결과이다.
도 9는 B. licheniformis NB109의 24시간 성장에 미치는 배양 진탕 속도의 영향을 측정한 결과이다.
도 10은 디스크 확산법에 의한 B. licheniformis NB109 균주의 그람 양성 세균, 그람 음성 세균 및 진균에 대한 최소 억제 농도를 측정한 결과이다.
도 11은 미량 희석법에 의한 B. licheniformis NB109 균주의 식물 병원성 세균에 대한 농도를 측정한 결과이다.
도 12는 C. albicans의 전자현미경 사진이다.
A : B. licheniformis NB109 배양 여액 처리하지 않은 군; B : B. licheniformis NB109 배양 여액 처리 군.
도 13은 Ralstonia solacearum의 전자현미경 사진이다.
A : B. licheniformis NB109 배양 여액 처리하지 않은 군; B : 화학 농약 테부코나졸 처리 군; C : B. licheniformis NB109 배양 여액 처리 군.
도 14는 B. licheniformis NB109 배양 여액의 정상 세포 계통과 암 세포 계통에 대한 독성을 측정한 결과이다.
도 15는 신장암 관련 세포 계통(K-562)에서 B. licheniformis NB109 배양 여액의 세포 독성 효과(Facscan 방법)를 측정한 결과이다.
도 16은 B. licheniformis NB109의 산업용 배양에서 24시간 성장에 미치는 탄소원의 영향을 측정한 결과이다.
A, 밀가루 ; B, 옥수수 전분 ; C, 수크로오스 ; D, 말토오스 ; E, 프룩토오스 ; F, 글루코오스.
도 17은 B. licheniformis NB109의 산업용 배양에서 24시간 성장에 미치는 질소원의 영향을 측정한 결과이다.
A, 쌀겨 ; B, CSL(Corn steep liquor) ; C, 콩가루 ; D, 카제인 ; E, 효모 추출물 ; F, 당밀.
도 18은 B. licheniformis NB109의 산업용 배양에서 36시간 성장에 미치는 질소원의 영향을 측정한 결과이다.
A, 쌀겨 ; B, CSL(Corn steep liquor) ; C, 콩가루 ; D, 카제인 ; E, 효모 추출물 ; F, 당밀.
도 19는 B. licheniformis NB109의 산업용 배양에서 36시간 동안 효모 추출물의 농도에 따른 성장에 미치는 영향을 측정한 결과이다.
도 20은 B. licheniformis NB109의 산업용 배양에서 24시간 적정 배양 조건을 나타낸 결과이다.
○, 세포 성장 ; ●, DO ; □, pH.
도 21은 B. licheniformis NB109 균주의 산업용 배양에서 24시간 배양한 후에 균체를 제거한 배양 여액에 대한 고추 역병과 잘록병에 대한 항균 활성 결과이다. A, Phytophthora capsici ; B, Pythium ultimum.
도 22는 병원성 오염 미생물 검사 결과이다.
A : Escherichia coli ; B : Salmonella sp . ; C : Staphylococcus aureus ; D : Bacillus cereus ; E : Listeria monocytogenes 1 is a graph showing the results of fatty acid analysis of B. licheniformis NB109.
2 is a result of measuring the effect of the carbon source on the 24-hour growth of B. licheniformis NB109.
A, mannitol; B, fructose; C, glucose; D, D-sorbitol; E, cellobiose; F, xylose; G, galactose; H, maltose; I, liquid starch; J, arabinose; K, lactose; L, raffinose.
Figure 3 is the result of measuring the effect of the carbon source on the 48 hours growth of B. licheniformis NB109.
A, mannitol; B, fructose; C, glucose; D, D-sorbitol; E, cellobiose; F, xylose; G, galactose; H, maltose; I, liquid starch; J, arabinose; K, lactose; L, raffinose.
Figure 4 is the result of measuring the effect of nitrogen source on the 24-hour growth of B. licheniformis NB109.
A, yeast extract; B, malt extract; C, beef extract; D, NaNO 3 ; E, NH 4 NO 3 ; F, L-asparagine; G, peptone; H, (NH 4 ) HPO 4 ; I, NH 4 Cl.
5 is a result of measuring the effect of nitrogen source on the 48 hours growth of B. licheniformis NB109.
A, yeast extract; B, malt extract; C, beef extract; D, NaNO 3 ; E, NH 4 NO 3 ; F, L-asparagine; G, peptone; H, (NH 4 ) HPO 4 ; I, NH 4 Cl.
Figure 6 is the result of measuring the effect of inorganic salts on the 48 hours growth of B. licheniformis NB109.
A, MgCl 2 ; B, AgNO 3 ; C, HgCl 2 ; D, ZnSO 4 7H 2 O; E, MgSO 4 7H 2 O; F, CaCl 2 ..
7 shows the results of measuring the effect of temperature on the 48-hour growth of B. licheniformis NB109.
(Circle), 30 degreeC; , 42 ° C .; □, 55 ° C .; ■, 65 ° C.
8 shows the results of measuring the effect of pH on the 24-hour growth of B. licheniformis NB109.
Figure 9 is the result of measuring the effect of the culture shaking speed on the 24 hours growth of B. licheniformis NB109.
10 B. licheniformis by disk diffusion method The minimum inhibitory concentrations for Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and fungi of NB109 strains were measured.
11 is a result of measuring the concentration of phytopathogenic bacteria of B. licheniformis NB109 strain by the microdilution method.
12 is an electron micrograph of C. albicans .
A: B. licheniformis Untreated NB109 culture filtrate; B: B. licheniformis NB109 culture filtrate treatment group.
13 is Ralstonia An electron micrograph of solacearum .
A: B. licheniformis Untreated NB109 culture filtrate; B: chemical pesticide tebuconazole treatment group; C: B. licheniformis NB109 culture filtrate treatment group.
14 B. licheniformis Toxicity of NB109 culture filtrate to normal and cancer cell lines was measured.
Figure 15. B. licheniformis in kidney cancer-related cell lineage (K-562) It is the result of measuring cytotoxic effect (Facscan method) of NB109 culture filtrate.
16 B. licheniformis This is a result of measuring the effect of carbon source on 24-hour growth in industrial culture of NB109.
A, wheat flour; B, corn starch; C, sucrose; D, maltose; E, fructose; F, glucose.
17 B. licheniformis The result of measuring the effect of nitrogen source on 24 hours growth in the industrial culture of NB109.
A, rice bran; B, Corn steep liquor (CSL); C, soy flour; D, casein; E, yeast extract; F, molasses.
18 B. licheniformis The result of measuring the effect of nitrogen source on 36 hours growth in industrial culture of NB109.
A, rice bran; B, Corn steep liquor (CSL); C, soy flour; D, casein; E, yeast extract; F, molasses.
19 B. licheniformis The result of measuring the effect on the growth according to the concentration of yeast extract for 36 hours in the industrial culture of NB109.
20 B. licheniformis The results show the proper culture conditions for 24 hours in the industrial culture of NB109.
○, cell growth; ●, DO; □, pH.
FIG. 21 shows the results of antimicrobial activity against pepper blight and diarrhea on culture filtrates in which B. licheniformis NB109 strains were cultured for 24 hours in an industrial culture. A, Phytophthora capsici ; B, Pythium ultimum .
22 shows pathogenic contaminant microbial test results.
A: Escherichia coli ; B: Salmonella sp . ; C: Staphylococcus aureus ; D: Bacillus cereus ; E: Listeria monocytogenes
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .
실시예Example
실시예 1: 항균 활성을 갖는 미생물 탐색Example 1 Screening of Microorganisms Having Antimicrobial Activity
전남 장성 지역의 계분, 부식토 및 음식물 쓰레기를 이용한 발효 퇴비를 분쇄한 다음, 멸균수로 희석하여 10% NA(Nutrient Agar, 3g Beef extract, 5g Peptone, 15 g Bacto agar, Difco, 미국) 배지에서 45℃ 온도에서 2일간 배양 후 단일 균체를 백금이를 이용하여 새로운 NA 배지에 접종하여 45℃ 온도에서 2일간 배양하여 단일 균주들을 확보한 후에 역병균에 대한 항진균성을 검사한 후에 가장 우수한 미생물을 선별하여 NB109로 명명하였다. 선별한 미생물은 NB(Nutrient Broth, Difco, 미국) 배지에서 진탕 배양한 배양액과 50% 글리세린(glycerin)을 1:1 비율로 혼합하여 -70℃에 보관하여 미생물 동정 균주와 제품 생산 원균으로 사용하였다. 분리된 균주들을 대상으로 작물 병원성 곰팡이를 방제할 수 있는 길항 균주의 분리 및 선발을 위하여 PDA(potato dextrose agar, 2.0% 덱스트로스, 0.4% 감자전분, 1.5% 박토아가, pH= 6.0 ± 0.4)에서 대치 배양을 실시하여 항 진균 활성을 나타내는 균주들을 분리하였다. 항균 활성 실험은 국내 고추 재배에서 발생 빈도가 매우 높은 병원균인 식물병원성 곰팡이 중에서 고추 역병균(Phytophthora capsici)을 사용하였다.
The fermentation compost using ground manure, humus soil, and food waste from Jangseong, Jeollanam-do, was crushed and diluted with sterile water. After incubating for 2 days at ℃ temperature, single cells were inoculated in a new NA medium using platinum, followed by incubation at 45 ℃ for 2 days to secure single strains. Was designated as NB109. The selected microorganisms were mixed at a ratio of 1: 1 and 50% glycerin (glycerin) cultured in shaken culture in NB (Nutrient Broth, Difco, USA) medium and stored at -70 ° C to be used as microorganisms to identify microorganisms and to produce products. . Potato dextrose agar (2.0% dextrose, 0.4% potato starch, 1.5% bactoagar, pH = 6.0 ± 0.4) for the isolation and selection of antagonistic strains that can control crop pathogenic fungi Substituted cultures were performed to isolate strains showing antifungal activity. In the antibacterial activity test, phytophthora capsici was used among the phytopathogenic fungi, a pathogen which is very common in domestic pepper cultivation.
실시예Example 2: 항균 활성을 갖는 미생물의 동정 2: Identification of Microorganisms Having Antimicrobial Activity
16S rRNA 유전자는 종과 속간의 분화에 따른 다양성이 크고 세균을 종 수준으로 구분할 수 있는 정보를 담고 있는 영역으로 이들 16S rRNA 유전자 염기 서열 변화는 세균의 유연관계를 파악하는데 가장 중요한 정보로 사용하고 있다. 순수 분리되어 보관된 균주를 NA 배지에 접종하고 45℃에서 2일간 배양한 후에 단일 균체를 NB 배지에 재접종하여 45℃에서 2일간 진탕 배양하였다. 벤질 클로라이드법을 변형한 방법을 이용하여 추출한 DNA를 주형으로 사용하여 16S rRNA 유전자 PCR(Polymerase Chain Reaction) 증폭하였다. 16S rRNA 유전자 증폭에 사용된 프라이머는 27F(5’-AGAATTTGATCCTGGCTCAG -3’) 및 1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)이며, PCR 조건은 95℃에서 2분간 반응한 후에 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 45초 반응 순서로 30회 반응을 한 후에 72℃에서 5분간 반응을 하고 난 후에 4℃에서 방치하였다. 16S rRNA 유전자 PCR 증폭 산물은 PCR Product Purification Kit(Qiagen, USA)를 사용하여 정제하였다. 16S rRNA 유전자 PCR 정제 산물은 Genetic Analyzer 310A(Applied Biosystems, USA)를 사용하여 염기서열을 분석하였다. 염기서열은 DDBJ/NCBI/Genebank와 Ribosomal Database Project II(RDP II)의 데이터베이스에서 상동성 검색을 수행하였다. The 16S rRNA gene is a region that has a large diversity according to differentiation between species and genus, and contains information that can distinguish bacteria at the species level. These 16S rRNA gene sequencing changes are used as the most important information for identifying the softness of bacteria. . Purely isolated strains were inoculated in NA medium and incubated at 45 ° C. for 2 days, and then single cells were reinoculated in NB medium and shaken at 45 ° C. for 2 days. 16S rRNA gene PCR (Polymerase Chain Reaction) was amplified using the extracted DNA as a template using the modified benzyl chloride method. Primers used for 16S rRNA gene amplification were 27F (5'-AGAATTTGATCCTGGCTCAG-3 ') and 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'), PCR conditions were 94 ℃ 30 seconds, 58 ℃ after 2 minutes of reaction at 95 ℃ The reaction was carried out 30 times in a sequence of 30 seconds, 72 ° C. and 45 seconds, followed by 5 minutes of reaction at 72 ° C., and then left at 4 ° C. 16S rRNA gene PCR amplification products were purified using PCR Product Purification Kit (Qiagen, USA). 16S rRNA gene PCR purified product was analyzed by nucleotide sequence using Genetic Analyzer 310A (Applied Biosystems, USA). The base sequence was searched for homology in the database of DDBJ / NCBI / Genebank and Ribosomal Database Project II (RDP II).
근권 길항 미생물 NB109의 16S rRNA 유전자 염기 서열(서열목록 제1서열)을 DDBJ/NCBI/Genebank와 Ribosomal Database Project II(RDP II)의 데이터베이스에서 상동성 검색을 수행한 결과, Bacillus 속의 종을 포함하는 계통학적 그룹에 속하는 균주로서, Bacillus licheniformis DSM13T(X68416)과 99.57%의 유연관계를 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서 근권 길항 미생물 NB109는 Bacillus licheniformis로 동정되었다.
Homology of 16S rRNA gene sequence (SEQ ID NO: 1) of the root antagonist microorganism NB109 from the databases of DDBJ / NCBI / Genebank and Ribosomal Database Project II (RDP II) showed a strain containing the species of the genus Bacillus Bacillus , a strain belonging to a chemical group licheniformis DSM13 T (X68416) was found to have a flexible relationship of 99.57%. Thus, the rhizosphere antagonist NB109 Bacillus identified as licheniformis .
실시예Example 3: 지방산 조성 분석 3: fatty acid composition analysis
고등생물의 경우에 균체 지방산 조성이 단순하고 동일한 성분을 갖기 때문에 분류 지표로 활용하기 어렵지만 세균의 경우에는 균체 지방산 조성이 다양하여 화학 분류학적인 측면에서 유용한 정보로 사용되고 있다. 순수 분리되어 보관된 균주를 NA 배지에 접종하고 45℃에서 2일간 배양한 후에 단일 균체를 TSA(Trypticase Soy Broth, Difco, USA)에 재접종하여 45℃에서 2일간 진탕 배양하였다. 균체 지방산의 추출 및 정제는 배양된 균체 생중량 50 mg을 Ikemoto & Miyagawa의 방법에 의하여 균체 지방산 메틸에스테르(methyl ester)화 및 추출을 수행하였다. 군체 지방산의 분석은 Microbial Identification System(MIDI : Microbial ID, Inc., Newark, Del., 미국)을 이용하여 가스크로마토그래프(Gas Chromatograph, 6890N, Agilent Technologies Inc., USA)로 분석하였다. In the case of higher organisms, since the cell fatty acid composition is simple and has the same components, it is difficult to use as a classification index, but in the case of bacteria, the cell fatty acid composition is used as a useful information in terms of chemical taxonomy. Purely isolated strains were inoculated in NA medium and incubated at 45 ° C. for 2 days, and then single cells were reinoculated with TSA (Trypticase Soy Broth, Difco, USA) and shaken at 45 ° C. for 2 days. Extraction and purification of cell fatty acids was performed by Ikemoto & Miyagawa method to extract the cell fatty acid methyl ester (50%) by the method of Ikemoto & Miyagawa. Colony fatty acids were analyzed by Gas Chromatograph (Gas Chromatograph, 6890N, Agilent Technologies Inc., USA) using a Microbial Identification System (MIDI: Microbial ID, Inc., Newark, Del., USA).
B. licheniformis NB109의 균체 지방산 조성 분석 결과 주요 지방산으로 C15 :0 anteiso(54.74%), C15 :0 iso(19.30%)를 나타내었으며, C14 :0 iso, C16 :0 iso, C17 :0 iso 그리고 C17 :0 anteiso와 같은 다양한 분자형 지방산을 함유하는 특징을 나타냈다(표 1). 또한 B. licheniformis NB109-B1은 B. licheniformis DSM13T(X68416) 표준 균주의 주요 균체 지방산 조성과도 유사한 균체 지방산 조성을 갖는 것으로 확인되었다(도 1).
B. licheniformis Analysis of cell fatty acid composition of NB109 showed C 15 : 0 anteiso (54.74%), C 15 : 0 iso (19.30%) as major fatty acids, C 14 : 0 iso, C 16 : 0 iso, and C 17 : 0 iso And various molecular fatty acids such as C 17 : 0 anteiso (Table 1). Also B. licheniformis NB109-B1 is B. licheniformis It was confirmed that the cell fatty acid composition was similar to the main cell fatty acid composition of the DSM13 T (X68416) standard strain (FIG. 1).
실시예Example 4: 균주 배양에 필요한 최적 배지 성분 조건 확립 4: Establish Optimal Media Component Conditions for Strain Culture
분리 균주 B. licheniformis NB109의 최적 배지 검토를 위한 최소 배지는 M9 최소 배지(글루코오스 2%, MgSO·7H2O 0.2%, Na2HPO4·7H2O 6.4%, KH2PO4 1.5%, NH4Cl 0.5% 및 NaCl 0.02%)를 사용하였다. 배지는 고온 고압 살균 시 당의 카라멜화(caramelization) 반응, 당이 암모늄이온이나 아미노산과 반응하여 나타나는 아미노카보닐(amino-carbonyl) 반응과 무기물 침전을 막기 위하여 각각의 배지를 따로 용해하여, 고압 증기 살균한 후 무균대 안에서 다른 배지와 혼합하여 사용하였다. 무기염은 상온에서 녹여 0.45 ㎛ 필터에 여과해서 바로 혼합하였다. 분리 균주 B. licheniformis NB109의 최적 배지성분은 M9 최소 배지를 기준으로 탄소원 만니톨, 프룩토오스, 글루코오스, D-소르비톨, 셀로비오스, 자일로오스, 갈락토오스, 말토오스, 액상 전분, 아라비노오스, 락토오스 및 라피노오스를 각각 2% 농도로 첨가하고 분리 균주 B. licheniformis NB109 전 배양액을 2%씩 접종한 후 42℃에서 20-60시간, 180 rpm으로 진탕 배양한 다음 배양액의 탁도를 660 nm에서 측정하였다. 탄소원 첨가농도의 영향은 선정된 탄소원을 0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0 및 5.0% 씩 각각 첨가하여 동일 조건에서 검토하였다. 그리고 질소원은 효모 추출물, 맥아 추출물, 소고기 추출물, NaNO3, NH4NO3, L-아스파라긴, 펩톤, (NH4)2HPO4 및 NH4Cl 등을 각각 0.5%씩 첨가한 후 탄소원의 검토 방법과 동일하게 실험하였다. 무기염은 CaCl2, MgCl2, AgNO3, HgCl2, ZnSO4·7H2O 및 MgSO4·7H2O 등을 각각 0.05%씩 첨가하여 탄소원의 검토방법과 동일하게 행하였다(표 2).
The minimum medium for the optimal medium review of the isolated strain B. licheniformis NB109 was M9 minimal medium (
실시예Example 5: 균주 최적 배양 조건 확립 5: Establish Optimal Culture Conditions
분리 균주 B. licheniformis NB109의 최적 배양조건은 500 ㎖ 삼각플라스크에 액체배지를 200 ㎖ 첨가한 다음 분리균주의 전 배양액을 2.0%씩(50:1) 접종하여 검토하였다. 최적 배양 온도는 30-60℃의 범위로 변화시키면서 180 rpm에서 24시간 배양한 후 660 nm에서 배양액의 흡광도를 측정하였다. 배지의 초기 pH는 0.5 N HCl과 0.5 N NaOH를 첨가하여 초기 pH를 4-8 범위로 조절한 다음 행하였고, 진탕속도의 영향은 최적배지의 초기 pH를 7.0으로 조절한 후 진탕 속도를 100, 140, 180, 220 rpm으로 변화시키면서 42℃에서 24시간 배양하여 배양액의 흡광도를 660 nm에서 측정하였다.
Optimal culture conditions of the isolate strain B. licheniformis NB109 were examined by adding 200 ml of liquid medium to 500 ml Erlenmeyer flask and inoculating 2.0% (50: 1) of the whole culture of the isolated strain. Optimal incubation temperature was incubated at 180 rpm for 24 hours while varying in the range of 30-60 ℃ and the absorbance of the culture at 660 nm was measured. The initial pH of the medium was adjusted after the initial pH was adjusted to 4-8 by adding 0.5 N HCl and 0.5 N NaOH, and the effect of shaking speed was controlled by adjusting the initial pH of the optimum medium to 7.0 and then shaking speed of 100, The absorbance of the culture was measured at 660 nm by incubating at 42 ° C. for 24 hours while changing at 140, 180, and 220 rpm.
5-1. 5-1. 탄소원의Carbon source 영향 effect
탄소원의 종류가 B. licheniformis NB109의 생육에 미치는 영향을 검토한 결과 액상 전분, 프룩토오스 및 아라비노오스, 갈락토오스, 글루코오스 등의 순으로 높게 나타난 반면 락토오스 및 라피노오스 등은 생육에 영향력이 낮은 것으로 나타났다(도 2). 이러한 결과로 B. licheniformis NB109의 최적 탄소원은 액상 전분임이 확인되었으며, 탄소원의 종류에 따라 균의 생육 속도가 차이가 있는 것으로 나타났다. 특히, 자일로오스의 경우 균의 영양 성분 이용 속도가 늦게 나타났으며, 다른 탄소원의 경우 생육에 대한 이용 속도가 빠른 것으로 나타났다(도 2). Qingzhao Wang 등은 탄소원 10 % 이상 첨가할 경우에는 오히려 생육이 저해되고 당의 전환율도 낮은 것으로 보고하였고, Jeong 등은 갈락토오스에서 균체량이 가장 높았다고 보고하였다.
As a result of examining the effect of carbon source on the growth of B. licheniformis NB109, liquid starch, fructose and arabinose, galactose and glucose were shown to be higher in order, whereas lactose and raffinose were less affected to growth. (FIG. 2). As a result, it was confirmed that the optimum carbon source of B. licheniformis NB109 was liquid starch, and the growth rate of bacteria was different depending on the type of carbon source. In particular, xylose showed a slow rate of use of the nutritional component of the bacteria, and other carbon sources appeared to have a high rate of use for growth (Fig. 2). Qingzhao Wang et al. Reported that when more than 10% of the carbon source was added, growth was inhibited and sugar conversion was low, and Jeong et al. Reported the highest cell mass in galactose.
5-2. 질소원의 영향5-2. Effect of nitrogen source
질소원의 종류가 항균미생물인 B. licheniformis NB109의 생육에 미치는 영향을 검토한 결과는 도 4에 나타내었다. M9 최소 배지에 글루코오스 2%와 질소원을 각각 0.5%씩 첨가하여 배양한 결과 무기질소원에서는 NaNO3, 유기질소원은 맥아 추출물을 제외한 나머지 모두 생육하는 것으로 나타났고, 배양 24시간에 L-아스파라긴이 균 생육이 가장 높은 것으로 나타났다. 배양 48시간 이상의 경우 효모 추출물이 생육에 지속적인 영향을 미치는 것으로 보아 대량 배양 시기에는 효모 추출물이 질소원으로 가장 적합한 것으로 확인되었다(도 5). Jeong 등은 효모 추출물을 최적 질소원으로 선정하였고, 배양시간이 길어질수록 생육에 큰 영향을 미치는 것으로 보고하였다.
The results of examining the effect of the nitrogen source on the growth of B. licheniformis NB109, an antimicrobial microorganism, are shown in FIG. 4. Incubation with 2% glucose and 0.5% nitrogen in the M9 minimal medium resulted in growth of NaNO 3 and organic nitrogen sources except for malt extract in inorganic nitrogen sources, and L-asparagine growth in 24 hours of culture. This was found to be the highest. Yeast extract was found to have a lasting effect on growth for more than 48 hours incubation, it was confirmed that yeast extract is most suitable as a nitrogen source at the time of mass culture (Fig. 5). Jeong et al. Selected the yeast extract as an optimal nitrogen source and reported that the longer the incubation time, the greater the effect on growth.
5-3. 5-3. 무기염의Inorganic 영향 effect
무기염이 항균미생물인 B. licheniformis NB109의 생육에 미치는 영향을 검토한 결과를 도 6에 나타내었다. M9 최소배지에서 무기염을 0.05% 첨가하고 생육 정도를 660 nm에서 검토한 결과, MgSO47H2O가 균 생육에 큰 영향을 미치는 것으로 나타났다.
B. licheniformis, whose inorganic salt is an antimicrobial microorganism The result of having examined the effect on the growth of NB109 is shown in FIG. MgSO 4 7H 2 O was found to have a significant effect on the growth of bacteria by adding 0.05% inorganic salt and minimizing the growth at 660 nm.
5-4. 온도의 영향5-4. Influence of temperature
분리한 항균 미생물인 B. licheniformis NB109의 생육에 배양 온도가 미치는 영향을 검토하여 도 7에 나타내었다. 배양 온도를 30-65℃ 범위로 배양한 결과, 배양 온도 42℃에서 균 생육이 높은 반면 60℃이상에서는 균 생육이 거의 없는 것으로 확인되었다.
B. licheniformis , an isolated antimicrobial microorganism The influence of the culture temperature on the growth of NB109 was examined and shown in FIG. 7. As a result of incubating the culture temperature in the range of 30-65 ° C., it was confirmed that the growth of bacteria was high at the culture temperature of 42 ° C., but there was little growth of the bacteria above 60 ° C.
5-5. 초기 5-5. Early pHpH 의 영향Influence of
초기 pH가 B. licheniformis NB109의 생육에 미치는 영향을 검토하여 도 8에 나타내었다. pH별로 균 생육을 확인한 결과, 5.0 이하와 pH 10 이상에서 균 생육력이 낮은 반면에 pH 5.0-9.0범위에서 가장 안정한 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 항균 미생물인 B. licheniformis NB109의 생육범위가 광범위하고 환경 적응력이 우수한 것으로 사료된다.
Initial pH B. licheniformis The influence on the growth of NB109 was examined and shown in FIG. 8. As a result of confirming the growth of bacteria by pH, it was confirmed that the growth of bacteria was lower than 5.0 and above
5-6. 5-6. 진탕속도의Of shaking speed 영향 effect
진탕 속도가 B. licheniformis NB109의 생육에 미치는 영향을 검토하여 도 9에 나타내었다. 배지의 초기 pH 7.0, 배양온도 42℃에서 진탕속도를 100-220 rpm으로 조절하여 균의 생육을 측정한 결과 진탕 속도를 증가시킬수록 미생물 생육이 왕성하였다. Ishwar B는 B. licheniformis NCIM2324 배양에서 폴리(γ-글루타민산)의 생산이 교반 속도에 따라 매우 민감하게 작용한다고 보고하였다.
Shaking speed B. licheniformis The influence on the growth of NB109 was examined and shown in FIG. 9. As a result of measuring the growth of the fungi by adjusting the shaking speed to 100-220 rpm at the initial pH of 7.0 and the culture temperature of 42 ° C., the growth of microorganisms increased as the shaking speed was increased. Ishwar B is B. licheniformis It has been reported that the production of poly (γ-glutamic acid) in NCIM2324 cultures is very sensitive to the agitation rate.
실시예Example 6: 항균 활성물질 대량생산 조건 확립 6: Establishment of mass production conditions for antimicrobial active substances
분리 균주 B. licheniformis NB109의 항균 활성 물질의 최적 조건을 알아보기 위하여 500 ㎖ 삼각 플라스크에 최적 배지를 200 ㎖ 첨가한 다음 분리 균주의 전 배양액을 2.0 %씩(50:1) 접종하여 검토하였다. 최적 배양 온도 42℃, 진탕 속도 180 rpm에서 48시간 배양하면서 시간대 별로 배양액을 원심분리 한 후에 회수한 항균 활성 물질을 함유하고 있는 여액을 이용하여 페이퍼 디스크 확산법에 의한 투명 영역(clear zone)을 측정하여 조사하였다. In order to determine the optimal condition of the antimicrobial active material of the isolated strain B. licheniformis NB109, 200 ml of optimal medium was added to a 500 ml Erlenmeyer flask, and the whole culture of the isolated strain was inoculated by 2.0% (50: 1). After culturing for 48 hours at the optimum culture temperature of 42 ° C and shaking speed of 180 rpm, the clear zone was measured by paper disk diffusion method using the filtrate containing the antimicrobial active material recovered after centrifugation of the culture medium for each time period. Investigate.
분리 균주 B. licheniformis NB109의 항균 활성 물질의 최적 조건을 알아보기 위하여 500 ㎖ 삼각 플라스크에 최적 배지를 200 ㎖ 첨가한 다음 분리 균주의 전 배양액을 2.0 %씩(50:1) 접종하여 최적 배양 온도 42℃, 진탕 속도 180 rpm에서 48시간 배양하면서 시간대 별로 배양액을 원심분리 한 후에 회수한 항균 활성 물질 펩타이드를 함유하고 있는 여액을 이용하여 페이퍼 디스크 확산법에 의한 투명 영역(clear zone)을 측정한 결과는 24시간 배양한 여액에서 가장 높은 항균 활성 투명 영역이 나타났다. 그리고 배양 시간이 증가할수록 세포 개체수는 증가하였으나 항균 활성은 다소 감소하는 경향을 보였다.
In order to determine the optimal condition of the antimicrobial active material of the isolated strain B. licheniformis NB109, 200 ml of the optimum medium was added to a 500 ml Erlenmeyer flask, and the whole culture solution of the isolated strain was inoculated 2.0% (50: 1) to incubate the optimum culture temperature. The clear zone was measured by paper disk diffusion method using filtrate containing the antimicrobial active substance peptide recovered after centrifugation of the culture medium at each time period while incubating for 48 hours at 180 rpm with shaking speed. The highest antimicrobial active clear areas appeared in the time-cultured filtrate. As the incubation time increased, the cell population increased but the antimicrobial activity tended to decrease somewhat.
실시예Example 7: 생물학적 활성 평가 7: evaluation of biological activity
7-1. 디스크 확산법(7-1. Disk diffusion method ( DiscDisc diffusiondiffusion methodmethod ))
디스크 확산법을 이용한 B. licheniformis NB109 균주의 항균 효과는 NA 한천 배지를 만들어 멸균하고 멸균된 평판 배지에 4 mm 정도 부어서 굳힌 후 여기에 한천 및 각 시험용 균주를 각각 0.7%, 1% 첨가한 한천 배지를 4-5 mm 두께로 도말하여 굳히고 그 표면에 페이퍼 디스크(8 mm, Toyo, Japan)를 추출된 분획물을 50 ㎕씩 흡수시키고, 용매를 완전히 증발시킨 후 표면에 놓아 밀착시키고 떨어뜨려 37℃에서 24시간 배양하여 균의 증식이 억제된 페이퍼 디스크의 투명 영역을 조사하여 항균 활성을 측정하였다. B. licheniformis by Disk Diffusion The antimicrobial effect of NB109 strain was made by making NA agar medium and sterilizing it, pouring 4 mm on the sterilized flat medium, and hardening it. Then, agar medium and 0.7% and 1% of each test strain were added to 4-5 mm thickness. 50 μl of the fraction extracted from the paper disk (8 mm, Toyo, Japan) was absorbed on the surface, and the solvent was completely evaporated and then placed on the surface to be adhered and dropped, followed by incubation at 37 ° C. for 24 hours. The antimicrobial activity was measured by examining the clear area of the suppressed paper disk.
디스크 확산법을 이용한 B. licheniformis NB109 균주의 항균 효과는 그람 양성 세균 3종, 그람 음성 세균 3종 및 진균 2종에 대하여 최소 억제 농도를 조사하였다(도 10). 그람 양성 세균에서의 MIC는 0.78-1.58 μM 범위였고 그람 음성 세균에서의 MIC는 0.78-3.25 μM 범위였다. 그리고 진균 2종에서는 동일하게 12.5 μM이었다. 그람 양성 세균에서는 Bacillus 계통의 병원균에 대하여 강한 항균 활성을 나타내었으며 그람 음성 세균에서는 Pseudomonas 계통에 강한 항균 활성을 나타내었다.
B. licheniformis by Disk Diffusion The antimicrobial effect of the strain NB109 was investigated for the minimum inhibitory concentration against three Gram-positive bacteria, three Gram-negative bacteria and two fungi (FIG. 10). MIC in gram positive bacteria ranged from 0.78-1.58 μM and MIC in gram negative bacteria ranged from 0.78-3.25 μM. And in two fungi, the same was 12.5 μM. Bacillus in Gram-positive Bacteria It showed strong antimicrobial activity against pathogens of strains, and Gram-negative bacteria showed strong antibacterial activity against Pseudomonas strains.
7-2. 미량 희석법(7-2. Microdilution method ( MicroMicro DilutionDilution methodmethod ))
항균 실험 표준 미생물 균주들은 NB(Nutrient Broth, Difco, 미국) 액체 배지에서 30-37℃ 에서 18-24시간 동안 배양한 후에 배양액을 새로운 NB 배지로 2 × 104 cfu/㎖이 되도록 희석하였다. B. licheniformis NB109 균주의 배양 여액은 무균 상태인 멸균된 NB 배지로 단계희석하였다. 그런 다음에 항균 실험 표준 미생물 균주 100 ㎕를 96-웰 폴리프로필렌 마이크로타이터 플레이트(Costar 3790, Corning, USA)의 각 구멍에 넣고 각각의 웰에 준비된 농도의 B. licheniformis NB109 균주의 배양 희석 여액을 혼합하였다. B. licheniformis NB109 균주의 항균 활성을 보기 위해 30℃에서 18시간 동안 배양한 후 각 ELISA 리더(Molecular Devices, 미국)를 이용하여 620 nm에서 흡광도를 읽어 최소 억제 농도(MIC, Minimal Inhibition Concentration)를 확인하였다. Antimicrobial Experiments Standard microbial strains were incubated for 18-24 hours at 30-37 ° C. in NB (Nutrient Broth, Difco, USA) liquid medium, and then the culture was diluted to 2 × 10 4 cfu / mL with fresh NB medium. B. licheniformis The culture filtrate of the NB109 strain was step diluted with sterile NB medium that was sterile. 100 μl of the antimicrobial test standard microbial strain was then placed in each hole of a 96-well polypropylene microtiter plate (Costar 3790, Corning, USA) and the concentration of B. licheniformis prepared in each well. Culture dilutions of the NB109 strain were mixed. B. licheniformis Minimal Inhibition Concentration (MIC) was confirmed by reading the absorbance at 620 nm using an ELISA reader (Molecular Devices, USA) after incubation at 30 ° C. for 18 hours to see the antimicrobial activity of the NB109 strain.
B. licheniformis NB109 균주의 배양 희석 여액을 농도별로 식물 병원성 세균 Erwinia carotovora(무름병), Erwinia chrisanthemi(마름병), Ralstonia solacearum(풋마름병), Pseudomonas fluorescence(썩음병), Pseudomonas syringae (고사병), Erwinia tracheliphila(마름병) 6종에 대하여 미량 희석법에 의하여 항균 활성에 대한 최소 억제 농도를 조사하였다(도 11). 대조군으로 사용한 광범위 항생제인 카나마이신과 암피실린보다는 다소 낮은 항균 활성을 보였지만, 특히 대조군 암피실린보다 Pseudomonas 계통의 식물 병원성 세균에 대하여 탁월한 항균 활성 효과가 나타났다. 그리고 E. carotovora와 E. tracheliphila에 대조군 항생제와 유사한 매우 높은 항균 활성을 나타내었다.
B. licheniformis Dilution of the cultured filtrate of the strain NB109 by plant concentration pathogenic bacteria Erwinia carotovora ( softwood ), Erwinia chrisanthemi (blight), Ralstonia solacearum (foot blight), Pseudomonas fluorescence , Pseudomonas The minimum inhibitory concentration for antimicrobial activity was examined by microdilution method for six syringae ( diabetic ) and Erwinia tracheliphila ( dry blight) (Fig. 11). Although the antimicrobial activity was slightly lower than that of kanamycin and ampicillin, the broad-spectrum antibiotics used as controls, the antimicrobial activity was significantly higher than that of the control ampicillin against Pseudomonas strains. And E. carotovora and E. tracheliphila showed very high antimicrobial activity similar to control antibiotics.
7-3. 전자현미경(7-3. Electron microscope ElectronElectron MicroscopyMicroscopy ))
B. licheniformis NB109 균주의 항균 활성 물질 펩타이드를 포함하고 있는 배양 여액 처리하여 효모와 유사한 병원성 대표 진균인 C. albicans와 Ralstonia solacearum(풋마름병)의 형태학적인 변화를 관찰하기 위해 2.5% 글루타르알데히드 용액(0.1 M 카코딜염산 버퍼, pH 7.4, 4℃)에서 2시간 동안 고정을 한 후 0.1M 카코딜염산 버퍼로 20분 간 3회에 걸쳐 세척을 한 후, 1% 삼투 산(0.1M 카코딜염산 버퍼, pH 7.4)로 실온에서 2시간 동안 고정한 후 에틸 알코올 용액으로 일련의 탈수 과정을 거친 후 금 이온 파티클에 코팅을 시켜서 DSM 940A 주사전자현미경(Hitachi S-4300, Japan)으로 관찰하였다. B. licheniformis C. albicans and yeast-like pathogenic fungi treated with culture filtrate containing the antimicrobial active substance peptide of NB109 strain Ralstonia To observe the morphological changes of solacearum (foot blight), fix for 2 hours in 2.5% glutaraldehyde solution (0.1 M cacodyl hydrochloric acid buffer, pH 7.4, 4 ° C) and then 20 minutes with 0.1 M cacodyl hydrochloride buffer. After washing three times in the liver, it was fixed for 2 hours at room temperature with 1% osmotic acid (0.1M cacodylate hydrochloric acid buffer, pH 7.4), followed by a series of dehydration with ethyl alcohol solution, and the coating on the gold ion particles. It was observed with a DSM 940A scanning electron microscope (Hitachi S-4300, Japan).
B. licheniformis NB109 배양 여액을 처리하지 않은 C. albicans군은 표면이 매끄러웠으나 B. licheniformis NB109 배양 여액(20 ㎍/20 L)을 처리한 C. albicans군은 그 표면에 구멍이 나 있음을 확인하였다(도 12). 그리고 풋마름병(청고병)을 야기하는 Ralstonia solacearum(풋마름병)군은 화학 농약 테부코나졸(20 ㎍/20 L) 처리군과 유사한 세포 파괴 현상이 나타났다(도 13). 이러한 현상은 생물학적 기전으로는 세포 탈분극, 세포 투과성, 세포 지질 누출에 영향을 미치는 것으로 사료되어진다.
B. licheniformis C. albicans group without NB109 culture filtrate had smooth surface but B. licheniformis C. albicans group treated with NB109 culture filtrate (20 ㎍ / 20 L) was confirmed that the hole in the surface (Fig. 12). In addition, the Ralstonia solacearum (foot blight) group, which causes foot blight ( blue eye disease ), exhibited cell destruction similar to that of the chemical pesticide tebuconazole (20 μg / 20 L) treatment group (FIG. 13). These phenomena are thought to affect cell depolarization, cell permeability, and cell lipid leakage.
7-4. 약효 및 7-4. Efficacy and 약해시험Weak test
B. licheniformis NB109 균주의 약효와 약해 실험을 위하여 공시 작물인 고추를 대상으로 고추에 발생하는 역병에 대한 항균 활성 조사(방제 효과)와 농도별 약해 발생 유무 분석에 관한 실험을 전남 생물방제센터 실험 포장(전라남도 곡성군 입면 창전리 272) 비닐하우스에서 실시하였다. 시험구 배치는 무처리구, 시료 배량구 및 시료 추천구의 총 3개의 처리구로 구분하였으며 처리구당 20주씩 구분하여 난괴법 3회 반복으로 실시하였다. 약제 사용은 무처리구는 지하수, 배량구는 원액의 500배(배량), 그리고 추천구는 원액의 1,000배(기준량)으로 처리하였다.
To investigate the efficacy and weakness of B. licheniformis NB109 strain, the experiment on the antimicrobial activity (control effect) and the analysis on the presence or absence of weakness by concentrations in peppers, which are the public crops, were carried out in the experimental crop of Jeonnam Biocontrol Center. (272, Changjeon-ri, Gokseong-gun, Jeollanam-do) The test batches were divided into three treatment groups: no treatment, sample dispensing, and sample recommendation. Twenty weeks per treatment were performed in three replicates of the egg mass method. Drug treatment was treated with groundwater for untreated plot, 500 times (drainage) for undiluted solution, and 1,000 times (standard amount) for undiluted solution.
7-4-1. 고추 종자 파종7-4-1. Pepper seed sowing
고추 종자를 70% 에탄올과 2% NaOCl을 이용하여 소독한 후에 멸균수를 이용하여 충분히 세척하였다. 멸균된 고추 종자를 멸균된 식물 세포 배양용 MS(Murashige and Skoog, Duchefa, Netherland) 배지에 파종 한 후에 최아된 종자를 12구 묘판에 옮겨 1차 파종을 실시하였다. 종자 발아 및 1차 생육은 무균 조직배양실에서 실시하였으며 생육 온도는 25℃를 유지하였다.
Pepper seeds were sterilized with 70% ethanol and 2% NaOCl, and then thoroughly washed with sterile water. Sterilized pepper seeds were sown in sterilized plant cell culture MS (Murashige and Skoog, Duchefa, Netherland) medium, and then the seeded seeds were transferred to 12-row seedlings and subjected to primary sowing. Seed germination and primary growth were carried out in a sterile tissue culture room and the growth temperature was maintained at 25 ℃.
7-4-2. 고추 정식 및 시료 처리7-4-2. Chili Pepper and Sample Processing
1차 묘판 이식은 12구 묘판에서 본 엽이 나온 어린 묘를 1차 소형 화분에 이식하였다. 이식 토양은 상토와 질석(Vermiculite) 및 진주암(Perlite)을 5:1:1로 혼합한 토양을 사용하였다. 2차 토양 정식은 소형 화분에서 활착을 완료한 모종 중 생육이 균일한 모종을 선발하여 온실 내 본토양(처리구당 12 m2)으로 이식하였다. 역병균(Phytophthora capsici)은 72.5 g/L 오트밀(Oatmeal, Difco, 미국) 배지에서 일주일 동안 25℃에서 생장시킨 후 균사체를 멸균수로 긁어낸 후 25℃로 유지된 성장배양기(Growth chamber)에서 24시간 광 처리한 후에 도말기(Spreader)를 이용하여 4℃에 보관된 멸균수로 유주자낭을 긁어낸 후에 멸균수로 다시 희석하여 1 × 104 유주자낭(sporangium)/㎖로 맞추었다. 희석한 유주자낭은 4℃에서 4시간 보관하여 유주자를 방출시킨 후에 식물의 뿌리에 관주 처리한 후 병 발생 유무를 조사하였다. 시료는 기준량 1,000배와 배량 500배로 나누어 1주 간격으로 3회 처리하였으며 무처리구는 시료 처리와 동일한 양으로 지하수를 처리하여 최종 병 발생 유무를 조사하였다(표 3).
In the first seedling transplant, young seedlings with leaves from 12 ball nurseries were transplanted into the first small pots. The transplanted soil was a mixture of soil, vermiculite and perlite 5: 1: 1. In the second soil formulation, seedlings with uniform growth were selected among the seedlings that had completed their swelling in small pots and transplanted into the mainland soil (12 m 2 per treatment). Late blight ( Phytophthora) capsici ) was grown at 72.5 g / L oatmeal (Oatmeal, Difco, USA) medium for one week at 25 ° C., and then mycelium was scraped with sterile water and then treated with light in a growth chamber maintained at 25 ° C. for 24 hours. After using the spreader (Spreader) was scraped with sterile water in sterile water stored at 4 ℃ and then diluted again with sterile water was adjusted to 1 × 10 4 sporangium / ml. After diluting the zygote sac at 4 ° C for 4 hours to release the spermatozoa, irrigation was performed on the roots of the plants and examined for disease. The samples were treated three times at weekly intervals by dividing the sample into 1,000-fold and 500-fold volumes, and the untreated plots were treated with groundwater in the same amount as the sample treatment to investigate the final disease occurrence (Table 3).
7-4-3. 방제가 및 약해 발생 유무 조사 7-4-3. Control and weakness investigation
각 처리구별 고추 역병이 발생한 이병주수를 조사하여 전체 주수에서 병 발생 주수를 계산하여 그 비율을 통계 처리하였으며, 고추를 대상으로 시료 처리 기준량과 배량을 충분히 살포한 후에 24, 48, 72시간으로 나누어 발생하는 약해 유무를 육안으로 판별하였다. 통계 분석은 DMRT(Duncan’s Multiple Range Test)로 유의 수준 95%로 분석하였다.The number of disease-causing disease was calculated from the total number of bottles, and the ratio was statistically processed.Then, the sample was divided into 24, 48, and 72 hours after adequate application of the sample processing volume and the volume of pepper. It was visually determined whether the weakness occurred. Statistical analysis was performed using Duncan's Multiple Range Test (DMRT) with a significance level of 95%.
고추 역병에 대한 병 방제 효과를 분석한 결과는 무처리구와 비교하여 배량구인 500 배에서는 약 64.09%의 병 방제 효과를 나타내었으며 기준량인 1,000 배에서는 약 63.02%의 방제가를 나타내었다(표 4). 방제가 조사는 95%의 유의성 수준에서 조사하였으며 무처리구와 비교하여 각 처리구는 유의성이 있음을 확인하였다. 시료에 대한 작물체의 약해 발생 유무를 분석하기 위하여 시료 배량의 500 배액과 기준 비율인 1,000 배액을 고추에 처리한 결과는 모두 처리구에서 전혀 약해가 발생하지 않았다(표 5).
As a result of analyzing the disease control effect against pepper blight, the disease control effect was about 64.09% in 500 times of the cultivation group and 63.02% in 1,000 times the standard amount (Table 4). The control value survey was conducted at the significance level of 95%, and it was confirmed that each treatment group was significant compared to the untreated group. In order to analyze whether or not crops were harmed to the sample, pepper was treated at 500 times the sample volume and 1,000 times the standard ratio, which did not cause any damage at all (Table 5).
약제exam
drugs
농도(배)drugs
Concentration (times)
(DMRT)valence
(DMRT)
(%)The control
(%)
약제exam
drugs
실시예Example 8: 독성 평가 8: Toxicology Assessment
MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일) 2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드, Sigma, 미국) 분석은 Mosmann(1983)방법에 따른다. MTT 분석은 세포 소기관 중 미토콘드리아의 숙신산 탈수소효소(succinate dehydrogenase)의 활성도를 측정하여 세포 생존을 측정하는 방법이다. 용해성 노란색 MTT 테트라졸륨이 숙신산 탈수소효소에 의해 불용성의 보라색 MTT 포르마잔으로 환원되는 정도를 흡광도로 측정하는 방법으로 트립판 블루에 의한 색소배제시험 방법보다 민감하여 세포 사멸 진행 과정의 초기 시점에서 세포의 생존율을 보다 정확히 측정할 수 있는 장점이 있다. MTT는 수용액 속에서는 무색이지만 살아있는 세포의 미토콘드리아 내의 효소인 숙신산 탈수소효소에 의해서 물에 녹지 않는 보라색 색소로 전환되므로, 색소의 농도를 ELISA(Enzyme-linked immuno sorbent assay, 효소결합면역흡착검사) 비색계로 측정하여 살아있는 세포의 증식과 독성을 측정할 수 있다. 세포 독성 검정을 위해 세포는 D-MEM(GIBCO Co, USA)에 10% FBS(Fetal bovine serum, Sigma, 미국), 25 유닛/㎖ 페니실린 G(Sigma, USA), 25 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(Sigma, 미국), Fungizone(3 ㎕/㎖) 및 10 ㎕/㎖ 항생제를 첨가해 배양하여 4 × 103 cell/㎖를 96-웰 폴리프로필렌 마이크로타이터 플레이트에 각각 200 ㎕씩 분주하여 세포가 웰 당 70% 정도 채워졌을 때 각각의 항균 펩타이드를 농도별로 처리한다. 24시간 경과 후 MTT가 포함된 배양액으로 교환하여 3시간 더 배양한 후 DMSO(Dimetylsulfoxide, Sigma, 미국)로 프로마잔(Sigma, 미국)을 용해시켜 ELISA 리더(Molecular Devices, USA)로 570 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군과 비교하였다. The MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyl tetrazolium bromide, Sigma, USA) analysis is according to Mosmann (1983) method. MTT assay is a method of measuring cell survival by measuring the activity of mitochondrial succinate dehydrogenase in cell organelles. As a measure of the absorbance of soluble yellow MTT tetrazolium to soluble succinate dehydrogenase by insoluble purple MTT formazan, it is more sensitive than the pigment exclusion test by trypan blue. The advantage is that the survival rate can be measured more accurately. MTT is colorless in aqueous solution, but is converted into a purple pigment that is insoluble in water by succinic acid dehydrogenase, an enzyme in the mitochondria of living cells, so the concentration of the pigment is measured by an ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) colorimetric system. The proliferation and toxicity of living cells can be measured. For cytotoxicity assay, cells were placed in D-MEM (GIBCO Co, USA) in 10% FBS (Fetal bovine serum, Sigma, USA), 25 units / ml penicillin G (Sigma, USA), 25 μg / ml streptomycin (Sigma). , USA), Fungizone (3 μl / ml) and 10 μl / ml antibiotics were incubated to divide 4 × 10 3 cells / ml into 96-well polypropylene microtiter plates at 200 μl each to allow cells to per well. Each antimicrobial peptide is treated by concentration when it is about 70% full. After 24 hours, the cells were exchanged with a culture medium containing MTT for 3 hours, followed by dissolution of promazan (Sigma, USA) with DMSO (Dimetylsulfoxide, Sigma, USA) and absorbance at 570 nm with ELISA reader (Molecular Devices, USA). Was measured and compared with the control.
B. licheniformis NB109 배양 여액의 독성 평가는 3가지 세포에서 성장 억제의 정도를 확인함으로써 결정하였다. B. licheniformis NB109 배양 여액의 IC50은 배양 여액의 농도에 대해 세포 생존을 확인하여 얻어졌다(도 14). B. licheniformis NB109 배양 여액은 유방암 관련 세포 계통(MDA-MB-361), 면역암 관련 세포 계통(Jurkat), 신장암 관련 세포 계통(K-562) 모두에서 세포 독성이 높게 나타났으며, 정상 세포 계통(NIH 3T3)에는 세포 독성을 나타내지 않았다. B. licheniformis NB109 배양 여액은 암 세포주에서만 세포 독성을 일으키는 것으로 조사되었다. 이러한 결과는 향후 B. licheniformis NB109 배양 여액에 포함되어 있는 항균 펩타이드가 항암제 역할을 할 것으로 사료되어진다. B. licheniformis NB109 배양 여액의 세포 독성 평가에서 특히 신장암 관련 세포 계통에서 세포 성장 억제 정도를 Facscan 방법으로 확인함으로써, B. licheniformis NB109 배양 여액을 처리하지 않은 정상군(positive control)보다 대조군(negative control) 이산화수소(H2O2)에 거의 가깝게 세포 성장을 억제하였다(도 15).
B. licheniformis Toxicity evaluation of NB109 culture filtrates was determined by identifying the extent of growth inhibition in the three cells. B. licheniformis IC 50 of the NB109 culture filtrate was obtained by confirming cell viability against the concentration of the culture filtrate (FIG. 14). B. licheniformis NB109 culture filtrate showed high cytotoxicity in all breast cancer related cell lines (MDA-MB-361), immune cancer related cell line (Jurkat) and kidney cancer related cell line (K-562), and normal cell line (NIH). 3T3) showed no cytotoxicity. B. licheniformis NB109 culture filtrate was investigated to cause cytotoxicity only in cancer cell lines. These results suggest that antimicrobial peptides in B. licheniformis NB109 culture filtrate may act as anticancer agents. B. licheniformis In the cytotoxicity evaluation of NB109 culture filtrates, B. licheniformis was determined by Facscan method to determine the extent of cell growth inhibition, especially in renal cancer-related cell lines. Cell growth was inhibited more closely to the control (negative control) hydrogen dioxide (H 2 O 2 ) than to the normal control without NB109 culture filtrate (FIG. 15).
실시예Example 9: 항균 활성 물질 고생산성 대량 생산 조건 확립 9: Establish antimicrobial active substance high productivity mass production condition
B. licheniformis NB109 균주의 생육에 탐색된 최적 배지를 50 L 발효조(코바이오텍, 한국)에 넣고 최종 부피를 30 L로 맞추고 121℃, 20분간 멸균한 후 에어 공급관과 배출구, 냉각수 등을 연결하고 교반을 하면서 최적배양 온도가 될 때까지 식힌 후 종균을 접종하여 최적 배양 조건을 탐색하였다. 산소 공급의 영향 및 교반 속도의 영향은 대량 배양 조건에 따른 온도 조절 문제로 배양 온도를 42-45℃, 산소 공급은 0.5 및 1.0 vvm으로 하고 교반 속도를 각각 150, 200, 250, 300 rpm으로 산소 공급에 따른 생육 속도를 조사하였다. 배양에 따른 pH 및 DO 변화는 초기 배지의 pH 7.0을 기준으로 pH 조절없이 배양을 하여 시간에 따른 pH 변화를 관찰하였고 생육 곡선과 pH 변화의 관계를 조사하였다. 배양 조건에 따른 시간별로 항균 활성 물질 생산에 대한 활성을 조사하여 생육과 활성에 대한 관계를 조시하였다.
B. licheniformis NB109 strain was found in the optimum medium to 50 L fermenter (COBIOTECH, Korea), the final volume was adjusted to 30 L, sterilized at 121 ℃, 20 minutes, and then connected to the air supply pipe and the outlet, cooling water and stirred While cooling down to the optimum culture temperature while inoculating the seed was searched for the optimum culture conditions. The effect of oxygen supply and the stirring speed is a temperature control problem according to the mass culture conditions. The culture temperature is 42-45 ° C., the oxygen supply is 0.5 and 1.0 vvm, and the stirring speed is 150, 200, 250, 300 rpm, respectively. The growth rate with supply was examined. The pH and DO changes according to the culture were observed without changing the pH based on the pH 7.0 of the initial medium to observe the pH change over time and the relationship between the growth curve and pH change. The relationship between growth and activity was investigated by investigating the activity of antimicrobial active substances produced over time according to the culture conditions.
9-1. 9-1. 탄소원의Carbon source 영향 effect
산업용 탄소원 배지가 B. licheniformis NB109의 생육에 미치는 영향을 조사하여 도 16에 나타내었다. 실험용 배지와 동일하게 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등의 순으로 균 생육이 높았으며, 특히, 액상 녹말이 균 생육에 미치는 영향력은 높은 반면, 옥수수 전분 및 밀가루는 낮은 것으로 확인되었다. 특히, 탄소원인 글루코오스의 농도별 배양하여 생육에 미치는 영향을 확인한 결과 1.5-2.0% 범위, 배양온도 42℃, 배양시간 24시간이 가장 적합한 것으로 나타났다.
Industrial carbon source medium B. licheniformis The effect on the growth of NB109 was investigated and shown in FIG. 16. As in the experimental medium, the growth of bacteria was higher in order of glucose, fructose, sucrose, maltose, and the like. In particular, it was confirmed that liquid starch had a high influence on bacterial growth, while corn starch and flour were low. In particular, as a result of confirming the effect on the growth by the concentration of glucose as a carbon source, the range of 1.5-2.0%,
9-2. 질소원의 영향9-2. Effect of nitrogen source
산업용 질소원 배지가 B. licheniformis NB109의 생육에 미치는 영향을 조사하여 도 17 및 18에 나타냈다. 실험용 배지와 동일하게 효모 추출물 및 CSL(corn steep liquor)에서 균 생육이 가장 높은 반면, 당밀의 경우 균 생육에 미치는 영향력이 낮은 것으로 확인되었다. 특히, 질소원인 효모 추출물을 농도별 배양하여 생육에 미치는 영향을 확인한 결과 1.0-1.5% 범위, 배양 온도 42℃, 배양 시간 24-36시간이 가장 적합한 한 것으로 나타난 반면에 CSL(corn steep liquor)는 농도 의존적으로 생육에 영향을 미치는 것으로 나타났으나, 생육 기간은 다소 낮게 나타났다(도 19).
Industrial Nitrogen Source Medium B. licheniformis The effects on the growth of NB109 were investigated and shown in FIGS. 17 and 18. As in the experimental medium, yeast extract and CSL (corn steep liquor) showed the highest bacterial growth, while molasses was found to have low effect on bacterial growth. In particular, as a result of confirming the effect on the growth by cultivating the yeast extract, a nitrogen source by concentration, 1.0 ~ 1.5% range, the
9-3. 9-3. pHpH , , DODO 및 O.D 변화 And O.D change
산업용 최적배지(glucose, yeast extracts, 무기염)를 활용하여 50 L 발효기(코바이오텍, 대한민국)에 30 L 배지를 만들어 넣고 최적 조건을 탐색한 결과 산소공급(1.0 vvm), 교반속도(200 rpm)의 조건으로 배양하는 것이 생육에 최적 조건으로 확인되었다. 배양 중 pH, DO, O.D의 변화 추이를 도 20에 나타냈다.
30 L medium was prepared in 50 L fermenter (COBIOTECH, South Korea) by using industrial optimum medium (glucose, yeast extracts, inorganic salt) and oxygen supply (1.0 vvm), stirring speed (200 rpm) Incubation under the condition of was confirmed as the optimum conditions for growth. The change in pH, DO, OD during the culture is shown in FIG. 20.
9-4. 배양 시간에 따른 항균 활성 물질 생산9-4. Production of antimicrobial active substances by incubation time
산업용 최적 배지조성으로 50 L 배양기에 1.0 vvm, 0.5 kg/cm2, 42℃, 200 rpm의 조건으로 24시간 배양한 B. licheniformis NB109를 회수하여 8000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 0.45 ㎛ 여과지로 여과한 상등액을 얻었다. V10 쥬스 아가 평판 배지에 코르커 보러(corker borer)로 직경 7 mm의 디스크 페이퍼를 100 ㎕ 상등액에 적신 후 평판 배지 한쪽 끝에서 1 ㎝ 떨어진 곳에 올린 후 28℃에서 24-72시간 대치 배양하면서 식물 병원성균주의 균사 성장 억제 정도(inhibition zone)를 관찰하였다. 그 결과 균체수가 급격히 증가하는 대수 증식기에 회수한 균주의 상등액이 균체 생장 식물 병원성 균주의 성장을 억제하는 것을 확인할 수 있었다(도 21).
Optimal medium composition for industry, 1.0 vvm, 0.5 kg / cm 2 , in 50 L incubator B. licheniformis incubated at 42 ° C and 200 rpm for 24 hours NB109 was recovered and centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes to obtain a supernatant filtered with 0.45 탆 filter paper. Phytopathogenic plants were soaked in 100 μl supernatant of 7 mm diameter disc paper with corker borer on V10 juice agar plate medium, and placed 1 cm away from one end of plate medium, and then incubated for 24-72 hours at 28 ° C. Mycelial growth inhibition (inhibition zone) of the strain was observed. As a result, it was confirmed that the supernatant of the strain recovered in the logarithmic growth period in which the number of cells increased rapidly (Fig. 21).
실시예Example 10: 항균 활성 물질 대량 생산 변이 균주 탐색 및 개발 10: Exploration and Development of Mutant Strains for Mass Production of Antimicrobial Active Substances
돌연변이(mutation)를 일으키는 비율을 증가시키는 외적인 인자를 돌연변이원(mutagen)이라고 한다. 돌연변이원으로는 물리적 요인으로 자외선(Ultraviolet, UV)과 전리 방사능이 있고 화학적 요인인 물질로는 염기 유사물질, 알킬화 물질, 색소류 및 기타 물질이 있다. 본 실험에서는 물리적 요인인 자외선을 0, 10, 20, 30초 동안 조사한 후에 평판 배지에서 생존한 군락들을 액체 배양하여 디스크 확산법에 의하여 항균 활성 효과를 야생형 B. licheniformis NB109 균주와 비교하여 조사하였다. External factors that increase the rate of mutation are called mutagens. Mutants include ultraviolet (Ultraviolet) and ionizing radiation as physical factors, and chemical substances include base-like substances, alkylated substances, pigments and other substances. In this experiment, we investigated the antimicrobial activity of wild type B. licheniformis by the disk diffusion method by incubating the colonies surviving in the plate medium after irradiation with UV, which is a physical factor for 0, 10, 20, 30 seconds. The comparison was made with the NB109 strain.
항균 활성 물질 대량 생산 변이 균주 탐색을 위하여 돌연변이 유발체인 자외선을 이용하여 획득한 B. licheniformis NB109 돌연변이체들을 배양하여 미량 희석법에 의한 항균 활성을 조사하였다. B. licheniformis NB109 돌연변이체 96개 독립 군락에서 야생형 B. licheniformis NB109보다 탁월한 항균 활성을 나타내는 돌연변이체는 발견하지를 못하였다. 일반적으로 Bacillus 계통의 미생물의 경우에는 그람 양성 세균으로 화학적 또는 물리적인 외부 요인에 의한 돌연변이체를 유도하기는 매우 어려운 것으로 보고되고 있다.
B. licheniformis NB109 mutants were obtained by culturing ultraviolet light, which is a mutagen, to investigate antimicrobial activity by mass dilution. B. licheniformis NB109 Mutants No mutants exhibiting superior antimicrobial activity than wild-type B. licheniformis NB109 were found in 96 independent communities. Bacillus in general In the case of strain microorganisms, gram-positive bacteria have been reported to be very difficult to induce mutants caused by chemical or physical external factors.
실시예Example 11: 미생물 11: microorganism 제형화Formulation
11-1. 미생물 11-1. microbe 액제Liquid 제형화Formulation
B. licheniformis NB109 균주를 42℃ 환경에서 24시간 NA 배지에서 배양한 독립 군락을 5 ㎖ NB 배지에 동일한 조건으로 배양한 배양액을 500 ㎖ NB 배지로 옮겨 동일한 조건에서 배양하였다. 배양한 500 ㎖ 배양액의 300 ㎖를 2% 액상 전분과 0.5% 효모 추출물을 첨가된 30 L 최적 배지에 옮겨 50 L 배양기에서 최적 배양 조건과 항균 활성이 가장 높은 조건에서 배양한 1.0-1.2 ×107 cfu/㎖ B. licheniformis NB109 균주 배양액과 제품 효력 증진제로 국내산 100% 당밀[(하이덱스스토리지(주), 군산, 대한민국]과 식품 첨가물인 효모 추출물 Yeastex LSP [Yeast Extract, Leiber GmbH, 독일, 수입원 ㈜비전바이오켐]을 다양한 조성 배합 비율로 혼합하여 제형화하였다. B. licheniformis NB109 strains were cultured in an independent colony cultured in NA medium for 24 hours at 42 ° C. under 5 mL NB medium under the same conditions, and then transferred to 500 mL NB medium and cultured under the same conditions. 300 ml of cultured 500 ml cultures were transferred to 30 L optimal medium containing 2% liquid starch and 0.5% yeast extract, and 1.0-1.2 × 10 7 cultured at 50 L incubator under the optimum culture conditions and the highest antibacterial activity. cfu / mL B. licheniformis NB109 strain 100% molasses [(Hydex Storage Co., Ltd., Gunsan, South Korea) and yeast extract as a food additive Yeastex LSP [Yeast Extract, Leiber GmbH, Germany, Import Source Co., Ltd. VISION BIOCHEM] was formulated by mixing in various composition ratios.
항균 활성 물질 생산 최적 조건에서 배양한 B. licheniformis NB109 균주 배양액(1.0-1.2 ×107 cfu/㎖) 제품 효력 증진제로 4% 당밀 1% 식품 첨가물인 효모 추출물 Yeastex LSP의 비율로 조성하여 제형화하는 경우에 항균 활성 효력이 장기간 유지되는 것으로 확인하였다(표 6).
B. licheniformis NB109 strain culture medium (1.0-1.2 × 10 7 cfu / mL) cultured under optimal conditions for the production of antimicrobial active substances. Formulated by formulating a yeast extract Yeastex LSP, a 4
Bacillus licheniformis
1×107 cfu/mLMicrobial cell count
Bacillus licheniformis
1 × 10 7 cfu / mL
전체 P2O5
전체 K2O
전체 Sugar(as invert)
당도(Brix)
수분(Moisture)Total nitrogen
Total P 2 O 5
Full K 2 O
Full Sugar (as invert)
Brix
Moisture
0.25%
3.18%
50.5%
83.0 Degrees
24.7%0.94%
0.25%
3.18%
50.5%
83.0 Degrees
24.7%
pH (5% solution)
Protein
Bitterness/100g
NaClDry matter (4h, 105 ℃)
pH (5% solution)
Protein
Bitterness / 100g
NaCl
6.0
68
3
0.395
6.0
68
3
0.3
%d.m.
BU/100g
%d.m.%
% dm
BU / 100g
% dm
11-2. 미생물 11-2. microbe 입제Granulation 제형화Formulation
B. licheniformis NB109 균주를 42℃ 환경에서 24시간 NA 배지에서 배양한 독립 군락을 5 ㎖ NB 배지에 동일한 조건으로 배양한 배양액을 500 ㎖ NB 배지로 옮겨 동일한 조건에서 배양하였다. 배양한 500 ㎖ 배양액의 300 ㎖를 2% 액상 전분과 0.5% 효모 추출물을 첨가된 30 L 최적 배지에 옮겨 50 L 배양기에서 최적 배양 조건과 항균 활성이 가장 높은 조건에서 배양한 1.0-1.2 ×107 cfu/㎖ B. licheniformis NB109 균주 배양액과 제품 입제 담체로 부식산(Humic Acid, Yantai Humus Agrotech, 중국]과 다양한 조성 배합 비율로 미생물을 도포하여 제형화하였다. B. licheniformis NB109 strains were cultured in an independent colony cultured in NA medium for 24 hours at 42 ° C. under 5 mL NB medium under the same conditions, and then transferred to 500 mL NB medium and cultured under the same conditions. 300 ml of cultured 500 ml cultures were transferred to 30 L optimal medium containing 2% liquid starch and 0.5% yeast extract, and 1.0-1.2 × 10 7 cultured at 50 L incubator under the optimum culture conditions and the highest antibacterial activity. Cfu / ml B. licheniformis NB109 strain cultures and products were formulated by applying microorganisms with humic acid (Humic Acid, Yantai Humus Agrotech, China) in various composition ratios.
B. licheniformis NB109 균주를 42℃ 환경에서 24시간 NA 배지에서 배양한 독립 군락을 5 ㎖ NB 배지에 동일한 조건으로 배양한 배양액을 500 ㎖ NB 배지로 옮겨 동일한 조건에서 배양하였다. 배양한 500 ㎖ 배양액의 300 ㎖를 2% 액산 녹말과 0.5% 효모 추출물을 첨가된 30 L 최적 배지에 옮겨 50 L 배양기에서 최적 배양 조건과 항균 활성이 가장 높은 조건에서 배양한 1.0-1.2 ×107 cfu/㎖ B. licheniformis NB109 균주 배양액과 제품 입제 담체로 부식산(Humic Acid, Yantai Humus Agrotech, 중국]과 다양한 조성 배합 비율로 미생물을 도포하여 제형화하였다(표 9).
B. licheniformis NB109 strains were cultured in an independent colony cultured in NA medium for 24 hours at 42 ° C. under 5 mL NB medium under the same conditions, and then transferred to 500 mL NB medium and cultured under the same conditions. 300 ml of cultured 500 ml culture solution was transferred to 30 L optimal medium containing 2% liquid starch and 0.5% yeast extract, and 1.0-1.2 × 10 7 cultured at 50 L incubator under the optimum culture conditions and the highest antibacterial activity. cfu / ml B. licheniformis NB109 strain cultures and products were formulated by applying microorganisms in various composition ratios with humic acid (Humic Acid, Yantai Humus Agrotech, China) as a preparation carrier (Table 9).
액체 배양액 Containing microbial strains
EPAlist 4ACAS No. 68131-04-4
EPAlist 4A
Bacillus licheniformis
1.0×106 cfu/gMicrobial cell count
Bacillus licheniformis
1.0 × 10 6 cfu / g
실시예Example 12: 미생물 제제 안전성 평가 12: Microbial product safety assessment
12-1. 급성 경구 독성 평가12-1. Acute Oral Toxicity Assessment
① 시험 동물① test animal
시험 동물 종(계통)은 ㈜한림실험동물연구소에서 공급한 SPF 마우스(ICR계)로 농촌진흥청 고시 제 2010-29호 농약의 독성 시험 기준과 방법에 마우스를 사용하도록 되어 있으며, ICR 계통은 농약의 독성 시험에 널리 시용되고 있어 기초 자료가 충분히 축적되어 있으므로 실험 결과 해석 및 평가가 용이하기 때문이다. 시험 동물 수컷의 구입 시기의 주령과 체중은 4주, 17.7-19.1 g이었고, 투여 시기의 주령과 체중은 5주, 19.2-21.5 g이었다. 그리고 시험 동물 암컷의 구입 시기의 주령과 체중은 4주, 16.0-18.7 g이었고, 투여 시기의 주령과 체중은 5주, 18.1-20.2 g이었다. 시험 동물을 구입한 후 2일 동안 동물 실험실의 환경에서 순화시키면서 일반 건강 상태를 관찰한 후 건강한 개체를 시험에 공시하였다.
The test animal species (systems) are SPF mice (ICR system) supplied by Hallym Laboratory Animal Research Institute Co., Ltd., and the mouse is used for the toxicity test standard and method of agricultural chemicals notification No. 2010-29 of the Rural Development Administration. It is widely used in toxicological tests, and since the basic data are sufficiently accumulated, it is easy to interpret and evaluate the experimental results. The age and body weight of the test animals were 4 weeks and 17.7-19.1 g at the time of purchase, and the age and weight at the time of administration were 5 weeks and 19.2-21.5 g. The age and body weight of the test animals were 4 weeks and 16.0-18.7 g at the time of purchase, and the age and weight at the time of administration were 5 weeks and 18.1-20.2 g. Healthy individuals were published in the test after observing general health while purifying in the environment of the animal laboratory for 2 days after purchasing the test animals.
② 사육 환경② Breeding environment
본 시험의 사육 환경은 온도 23 ± 2℃, 상대 습도 50 ± 10℃, 환기 시설(공조 기계), 조명 시간 12시간(오전 7시-오후 7시) 및 조도 200-300 Lux의 실험실 조건에서 사료와 음용수를 급여하여 순화 및 시험 기간 동안 격리 사육하였다. 순화 및 시험 기간 중 폴리카보네이트 사육 상자(26× 20× 12 ㎝)에 5마리씩 넣어 짚을 깔아 사육하였다. 사료는 실험 동물용 고형 사료[E.P 수퍼피드(주)]를 자외선 멸균시켜 자유 급식 시켰으며 물은 정수 필터를 통과한 지하수(수질 검사: 2010년 11월 25일)를 섭취시켰다.
The breeding environment for this test is fed under laboratory conditions of temperature 23 ± 2 ° C,
③ 투여 약량 수준 설정 및 약제 조제③ Dose level setting and drug preparation
기초 실험으로 수컷과 암컷 모든 시험 동물의 투여 약량은 5,000 ㎎/㎏으로 설정하였다. 투여 약량 수준별 공시 동물수는 암수 각각 5마리씩 10마리를 1군으로 하였으며, 개체별 식별은 피모에 색소로 일련번호를 표시하였다. 시험 물질이 액상으로 투여 약제 조제시 증류수에 잘 현탁되므로 용매 대조군은 설정하지 않았다. 공시 약제 조제시 용매의 선택은 시험 물질이 액상으로 증류수에 잘 현탁되므로 증류수를 용매로 선정하였고 소정 약량의 조제는 50 ㎖ 메스플라스크에 넣고 증류수를 가하여 현탁시켜 조제하였다. 투여 액량은 투여 약량 수준별로 공히 10 ㎎/㎏(체중)으로 설정하였다.
In the basic experiments, the doses of all male and female test animals were set to 5,000 mg / kg. The number of published animals per dose level was 10 males and 5 males and 5 females, respectively, and individual identification was indicated by pigments on the hair. The solvent control was not set because the test substance was well suspended in distilled water when the drug was administered in liquid form. Since the test material was well suspended in distilled water in the liquid phase, the choice of solvent was selected as distilled water as a solvent, and a predetermined amount of the preparation was prepared by suspending it in a 50 ml volumetric flask and adding distilled water. The amount of administration was set to 10 mg / kg body weight for each dose level.
④ 시험 물질의 투여④ Administration of test substance
시험 물질 투여 개시 3-4시간 전, 시험 물질 투여 후 3시간 동안은 사료를 절식하였으며, 마우스용 경구 투여 주사 바늘을 이용하여 체중 측정치를 기준으로 소정의 시험 물질 조제 액량을 산출한 후 경구 투여 경로로 위내에 1회에 한하여 강제 투여하였다.
The feed was fasted for 3-4 hours before the start of the test substance administration and for 3 hours after the test substance administration, and the prescribed amount of the test substance preparation was calculated based on the weight measurement using an oral injection needle for the mouse, and then the oral route of administration. Only once in the stomach was forced to administer.
⑤ 관찰 및 검사 항목⑤ Observation and Inspection Items
투여 당일은 투여 후 1시간에서 4시간째까지 매시간 그리고 익일부터는 매일 1회씩 일반 중독 증상 및 치사된 동물수를 14일간 관찰 조사하였다. 시험된 모든 동물에 대하여 투여 당일과 투여 후 1, 7 및 14일째 개체별 체중을 측정하였다. 관찰 기간 종료 후 에테르로 마취시켜 내부 장기의 육안적 이상 유무를 관찰하였다. LD50 산출은 기초 시험에서 시험이 종료되어 통계 처리는 수행하지 않았다.
On the day of dosing, the general poisoning symptoms and the number of killed animals were observed for 14 days, every hour from 1 hour to 4 hours after administration and once daily from the following day. All animals tested were body weighted on the day of dosing and on
⑥ 평가 결과⑥ Evaluation result
기초 실험 결과 투여 약량은 5,000 ㎎/㎏에서 치사 동물은 없었으며, 급성 경구 독성의 LD50값은 암수 모두 5,000 ㎎/㎏이상으로 농약관리법에 의거 독성을 구분하여 IV급(저독성)으로 분류되었다(표 10). 본 시험에서 경구투여 후 일반 중독 증상은 관찰되지 않았다(표 11). 체중 변화는 약제 투여 후 경과 일수에 따라 암수 모두에서 1일째까지 감소를 보였으나 3일째부터는 회복되어 증가 추세를 보였다(표 12). 부검은 시험 종료 후에 에테르로 마취시켜 각 주요 장기에 대한 육안적 관찰을 실시하였고 약제 투여에 의한 특이한 증상은 관찰되지 않았다(표 13).
As a result of the basic experiment, the dose was 5,000 mg / kg, and there were no lethal animals, and the LD 50 value of acute oral toxicity was 5,000 mg / kg in both sexes and classified as Class IV (low toxicity) according to the pesticide control method. Table 10). No symptoms of general intoxication were observed after oral administration in this study (Table 11). Changes in body weight decreased until
-* : 정상
- * : Normal
( )* : 마리, (단위 : g)
() * : Horses, (unit: g)
N* : 정상
N * : normal
12-2. 급성 12-2. Acute 경피Transdermal 독성 평가 Toxicity Assessment
① 시험 동물① test animal
시험 동물 종(계통)은 ㈜한림실험동물연구소에서 공급한 SPF 랫드(S.D.계)로 농촌진흥청 고시 제 2010-29호 농약의 독성 시험 기준과 방법에 랫드를 사용하도록 되어 있으며, S.D. 계통은 농약의 독성 시험에 널리 시용되고 있어 기초 자료가 충분히 축적되어 있으므로 실험 결과 해석 및 평가가 용이하기 때문이다. 시험 동물 수컷의 구입 시기의 주령과 체중은 7주, 240-260 g이었고, 투여 시기의 주령과 체중은 8주, 248-270 g이었다. 그리고 시험 동물 암컷의 구입 시기의 주령과 체중은 7주, 160-180 g이었고, 투여 시기의 주령과 체중은 8주, 170-190 g이었다. 시험 동물을 구입한 후 3일 동안 동물 실험실의 환경에서 순화시키면서 외관상 건강한 동물을 선별하여 무작위로 추출하여 시험에 공시하였다.
The test animal species (systems) are SPF rats (SD system) supplied by Hallym Laboratory Animal Research Institute, and the rats are to be used in the standard and method for testing toxicity of pesticides published by Rural Development Administration Notification No. 2010-29. It is widely used in toxicological tests, and since the basic data are sufficiently accumulated, it is easy to interpret and evaluate the experimental results. The age and body weight of the test animals were 240-260 g at 7 weeks of purchase, and 248-270 g at 8 weeks of body weight. The age and body weight of the test female were 7 weeks and 160-180 g at the time of purchase, and the age and weight at the time of administration were 8 weeks and 170-190 g. After purchasing test animals, apparently healthy animals were selected and randomized for 3 days in the environment of the animal laboratory and published in the test.
② 사육 환경② Breeding environment
본 시험의 사육 환경은 온도 23 ± 2℃, 상대 습도 50 ± 10℃, 환기 시설(공조 기계), 조명 시간 12시간(오전 7시-오후 7시) 및 조도 200-300 Lux의 실험실 조건에서 사료와 음용수를 급여하여 순화 및 시험 기간 동안 격리 사육하였다. 순화 및 시험 기간 중 폴리카보네이트 사육 상자(26× 20× 12 ㎝)에 5마리씩 넣어 펄프드라이를 깔아 사육하였다. 사료는 실험 동물용 고형 사료[E.P 수퍼피드(주)]를 자외선 멸균시켜 자유 급식 시켰으며 물은 정수 필터를 통과한 지하수(수질 검사: 2010년 11월 25일)를 섭취시켰다.
The breeding environment for this test is fed under laboratory conditions of temperature 23 ± 2 ° C,
③ 처리 약량 수준 설정 및 약제 조제③ Establishment of dosage level and preparation of drug
기초 실험으로 수컷과 암컷 모든 시험 동물의 투여 약량은 4,000 ㎎/㎏으로 설정하였다. 투여 약량 수준별 공시 동물수는 암수 각각 5마리씩 10마리를 1군으로 하였으며, 개체별 식별은 피모에 색소로 일련번호를 표시하였다. 시험 물질이 액상으로 투여 약제 조제시 증류수에 잘 현탁되므로 용매 대조군은 설정하지 않았다. 공시 약제 조제시 용매의 선택은 시험 물질이 액상으로 증류수에 잘 현탁되므로 증류수를 용매로 선정하였고 소정 약량의 조제는 50 ㎖ 메스플라스크에 넣고 증류수를 가하여 현탁시켜 조제하였다. 투여 액량은 투여 약량 수준별로 공히 5.0 ㎎/㎏(체중)으로 설정하였다.
In the basic experiments, the doses of all male and female test animals were set to 4,000 mg / kg. The number of published animals per dose level was 10 males and 5 males and 5 females, respectively, and individual identification was indicated by pigments on the hair. The solvent control was not set because the test substance was well suspended in distilled water when the drug was administered in liquid form. Since the test material was well suspended in distilled water in the liquid phase, the choice of solvent was selected as distilled water as a solvent, and a predetermined amount of the preparation was prepared by suspending it in a 50 ml volumetric flask and adding distilled water. The amount of administration was set to 5.0 mg / kg body weight for each dose level.
④ 시험 물질의 처리④ treatment of test substance
공시 동물을 시험 물질 처리 전에 흉복배부에 제모기를 이용하여 5 × 6 ㎝ 이상 크기 넓이로 제모하고, 4 × 5 ㎝ 크기 면적의 거즈에 조제된 시험 물질을 체중 측정치를 기준으로 소정 액량을 산출한 후 균일하게 묻힌 다음 제모된 부위에 도포한 후 의료용 반창고로 고정 유지시켰다.
Before the test material is treated, the epigastric abdomen is epilated to the chest abdomen using a hair removal device at a size of 5 × 6 cm or more, and a predetermined amount of the test substance prepared in a gauze having a size of 4 × 5 cm is calculated based on the weight measurement. After it was evenly applied, it was applied to the depilated area and then fixed with a medical band-aid.
⑤ 관찰 및 검사 항목⑤ Observation and Inspection Items
처리 당일은 처리 후 10분, 30분, 1-4시간가지 4시간째까지 매시간 그리고 익일부터는 매일 1회씩 일반 중독 증상 및 치사된 동물수를 14일간 관찰 조사하였다. 시험된 모든 동물에 대하여 처리 당일과 처리 후 1, 3, 7일 및 14일째 개체별 체중을 측정하였다. 관찰 기간 종료 후 에테르로 마취시켜 내부 장기의 육안적 이상 유무를 관찰하였다. LD50 산출은 기초 시험에서 시험이 종료되어 통계 처리는 수행하지 않았다.
On the day of treatment, the general poisoning symptoms and the number of animals killed were observed for 14 days for 10 minutes, 30 minutes, 4 hours after 1-4 hours, and once every day after the next day. All animals tested were body weighted on the day of treatment and on
⑥ 평가 결과⑥ Evaluation result
기초 실험 결과 처리 약량은 4,000 ㎎/㎏에서 치사 동물은 없었으며, 급성 경피 독성의 LD50값은 암수 모두 4,000 ㎎/㎏이상으로 농약관리법에 의거 독성을 구분하여 IV급(저독성)으로 분류되었다(표 14). 본 시험에서 경피 처리 후 일반 중독 증상은 관찰되지 않았다(표 15). 체중 변화는 약제 투여 후 경과 일수에 따라 암수 모두에서 1일째까지 감소를 보였으나 3일째부터는 회복되어 증가 추세를 보였다(표 16). 부검은 시험 종료 후에 에테르로 마취시켜 각 주요 장기에 대한 육안적 관찰을 실시하였고 약제 투여에 의한 특이한 증상은 관찰되지 않았다(표 17).
As a result of the basic experiment, the treatment dose was 4,000 mg / kg, and there were no lethal animals, and the LD 50 value of acute dermal toxicity was more than 4,000 mg / kg in both sexes and classified as class IV (low toxicity) according to the pesticide control method. Table 14). In this study, no general poisoning symptoms were observed after transdermal treatment (Table 15). Changes in body weight decreased until
-* : 정상
- * : Normal
(5)* 258.7 ± 9.0
(5) *
(5)251.8 ± 9.6
(5)
(5)266.8 ± 9.1
(5)
(5)287.0 ± 8.9
(5)
(5)317.8 ± 8.7
(5)
(5)183.1 ± 6.2
(5)
(5)176.5 ± 6.5
(5)
(5)192.9 ± 5.4
(5)
(5)210.6 ± 5.4
(5)
(5)228.8 ± 5.0
(5)
( )* : 마리, (단위 : g)
() * : Horses, (unit: g)
N* : 정상
N * : normal
12-3. 급성 12-3. Acute 어독성Fish toxicity 평가 evaluation
① 시험 동물① test animal
시험 동물 종(계통)은 개인사업자 박영택이 공급한 잉어(Cyprinus carpio)로 농촌진흥청 고시 제2010-29호 농약의 독성 시험 기준과 방법에 잉어를 사용하도록 되어 있으며, 농약의 독성 시험에 널리 시용되고 있어 기초 자료가 충분히 축적되어 있으므로 실험 결과 해석 및 평가가 용이하기 때문이다.
The test animal species were lined with carp, Cyprinus carpio ) is to use carp in the standard and method of pesticide toxicity test No. 2010-29, and it is widely used in the toxicity test of pesticide, so it is easy to interpret and evaluate the test result. Because.
② 사육 환경② Breeding environment
본 시험의 사육 환경은 온도 22-24℃, 광 200-300 Lux의 실험실 조건에서 2달간 순화하였다. 순화 및 시험 기간 중 원통형의 유리 제품 12.5 ℓ(높이 25.5 × 25.5 ㎝) 용기를 사용하였으며 사료는 실험 동물용 고형 사료[Bio Meal(E.P-채색 관상어 사료), 제일사료(주)]를 1일 2회 급여하였다. 시험 용수는 정수 필터를 통과한 지하수(수질 검사 : 2010년 11월 25일)를 사용하였다.
The breeding environment of this test was purified for 2 months under laboratory conditions of temperature 22-24 ° C and light 200-300 Lux. Cylindrical glassware 12.5 ℓ (25.5 × 25.5 cm) containers were used during the acclimation and testing periods. The feed was prepared from solid foods for experimental animals (Bio Meal, Cheil Feed Co., Ltd.). Salary was paid twice. The test water was ground water (water quality test: November 25, 2010) that passed through the water filter.
③ 처리 약량 수준 설정 및 약제 조제③ Establishment of dosage level and preparation of drug
시험 물질 1.05 g을 정확히 평량하여 100 ㎖ 용량의 용량플라스크에 넣고 시험 용수를 가하여 100 ㎖를 채운 후에 완전히 현탁될 때까지 충분히 현탁시켜 10,000 ㎎/ℓ 보관 용액을 조제하였다. 조제된 10,000 ㎎/ℓ 보관 용액을 1,000 ㎖ 비이커에 넣고 900 ㎖의 시험 용수를 가하여 충분히 현탁시켜 시험 물질 용액(1,000 ㎎/ℓ 보관 용액)을 조제하였다. 시험 물질 용액(1,000 ㎎/ℓ 보관 용액) 100 ㎖를 정확히 취하여 시험 용수 9,900 ㎖와 함께 12.5 ℓ의 시험조에 넣고 완전히 현탁될 때까지 충분히 교반시킨 후에 시험 용액으로 사용하였다.
10,000 mg / L stock solution was prepared by accurately weighing 1.05 g of the test substance into a 100 ml volumetric flask and adding test water to 100 ml, then suspending until completely suspended. The prepared 10,000 mg / L stock solution was placed in a 1,000 ml beaker, and 900 ml of test water was added thereto to suspend sufficiently to prepare a test substance solution (1,000 mg / L stock solution). 100 ml of the test substance solution (1,000 mg / l stock solution) was accurately taken and placed in a 12.5 L test bath with 9,900 ml of test water, followed by sufficient stirring until complete suspension before use as the test solution.
④ 시험 물질의 처리④ treatment of test substance
예비 시험 후에 10 ㎎/ℓ 단일 농도로 2회 시험하였다. 시험 물질 처리 24시간 전부터 시험 종료 시기까지 사료 급여를 중단하여 절식하였으며 시험 어류 수는 10(마리/농도)을 사용하였다. 시험 용수인 지하수로 음성 대조군 시험을 실시하였으며 PCP-Na염(90%)을 잉어에 대한 급성 어독성 양성 대조군 시험을 실시하였다. 기초 시험(10 ㎎/ℓ)에서 시험이 종료되어 LC50 산출은 통계 처리는 하지 않았다.
After the preliminary test, two tests were conducted at a single concentration of 10 mg / L. Feeding was stopped and fasted 24 hours before treatment of the test substance to the end of the test and 10 fish (concentration) were used. A negative control test was performed with the groundwater, which is test water, and PCP-Na salt (90%) was tested for acute fish toxicity to carp. The test was terminated in the basic test (10 mg / L) with LC 50 The output was not statistically processed.
⑤ 관찰 및 검사 항목⑤ Observation and Inspection Items
시험 개시 1시간 후 그리고 24시간 간격으로 일반 중독 증상 및 치사어를 기록하였으며 치사어의 판정은 공시어에 유리 박대로 건드렸을 때에 움직임이 없거나 아가미 호흡이 중단된 경우에는 치사로 판정하였다. 수질 측정은 시험 개시전과 24시간 간격으로 시험 종료 시기까지 DO, pH, 수온을 Orion 1 star 모델로 측정하여 조사하였다.
General poisoning symptoms and lethality were recorded 1 hour after the start of the test and at 24 hour intervals. The determination of the lethal was fatal if there was no movement or gill breathing was stopped when the rat was touched with a glass foil. Water quality measurement was investigated by measuring the DO, pH, and water temperature by
⑥ 평가 결과⑥ Evaluation result
시험 약제의 잉어(Cyprinus carpio)에 대한 급성 어독성 시험을 96시간 동안 실시하여 생사수와 일반 중독 증상을 관찰하고 체중 및 전장을 조사하였다. 일반 중독 증상 및 다른 특이 증상은 관찰되지 않았다(표 18). 체중은 평균 1.91 ± 0.09 g, 전장은 평균 4.20 ± 0.12 ㎝이었다(표 19). 시험조의 용수 pH는 평균 7.52(최저 7.31-최고 7.78)이었고 얘는 평균 6.90 ㎎/ℓ(최저 5.3-최고 9.1)이었다. 시험 기간의 평균 수온은 22.7℃(최저 22.4-최고 23.1)이었다(표 20). 본 시험 물질의 잉어에 대한 48시간 및 96시간 반수 치사 농도(LC50)는 모두 10 ㎎/ℓ 이상으로서 농약 관리법에 의거 독성을 구분하면 III급으로 분류되었다.Carp test drug (Cyprinus Acute fish toxicity test for carpio ) was performed for 96 hours to observe the number of live death and general poisoning symptoms, and to investigate the body weight and overall length. General poisoning symptoms and other specific symptoms were not observed (Table 18). The average body weight was 1.91 ± 0.09 g and the overall length was 4.20 ± 0.12 cm (Table 19). The water pH of the test tank averaged 7.52 (lowest 7.31-highest 7.78) and this averaged 6.90 mg / l (lowest 5.3-highest 9.1). The average water temperature for the test period was 22.7 ° C. (lowest 22.4-highest 23.1) (Table 20). The 48 and 96 hour half lethal concentrations (LC 50 ) for carp of this test substance were all 10 mg / l or more and were classified as Class III by toxicity according to the pesticide control method.
(0.103~0.129)** 0.116
(0.103-0.129) **
(0.096~0.119)0.108
(0.096-0.119)
※ 중독 증상 : N(정상), SUR(수면 부상)※ Symptoms of poisoning: N (normal), SUR (sleep injury)
* 양성 대조구 시험 기간 : 4일* Positive control trial period: 4 days
** 95% 신뢰한계** 95% confidence limit
*** 평균 ± 표준편차
*** Mean ± Standard Deviation
/시험 생물 투입 전Immediately after treatment of the test substance
/ Before inputting test organism
48시간 후Test substance treatment
After 48 hours
12-4. 병원성 미생물 검사12-4. Pathogenic microbial testing
① 병원성 대장균 검사① Escherichia coli test
병원성 대장균(Escherichia coli)을 판별하는 전용 배지인 대장균 아가(Merck, USA)에 시험 물질을 접종한 후 평판 배지위에 형성된 단일 군락이 청록색 또는 적색을 띄는 단일 군락을 양성으로 판정하였다. 청록색 또는 적색을 띄는 단일 군락이 검출되지 않아 병원성 대장균 음성으로 판정하였다(도 22).
E. coli (Escherichia coli) the E. coli only agar medium to determine (Merck, USA) were inoculated to the test substance was determined as a positive single colonies stand the single colonies formed on the plate medium cyan or red. A single colony with cyan or red color was not detected and was determined to be pathogenic E. coli negative (FIG. 22).
② 병원성 살모넬라 검사② Pathogenic Salmonella Test
병원성 살모넬라(Salmonella sp .)를 판별하는 전용 배지인 SS 아가(Difco, 미국)에 시험 물질을 접종한 후 평판 배지 위에 형성된 단일 군락이 흑갈색을 띄는 단일 군락을 양성으로 판정하였다. 흑갈색을 띄는 단일 군락이 검출되지 않아 병원성 살모넬라(Salmonella sp .) 음성으로 판정하였다(도 22).
Pathogenic Salmonella sp . After inoculation of the test substance to SS agar (Difco, USA), which is a dedicated medium for determining), a single colony formed on a flat medium was determined to be positive. No dark brown single colonies were detected, resulting in pathogenic Salmonella sp . ) Negative result (FIG. 22).
③ Staphylococcus aureus 검사③ Staphylococcus aureus inspection
Staphylococcus aureus를 판별하는 전용 배지인 만니톨 염 아가(Difco, 미국)에 시험 물질을 접종한 후 평판 배지(적색) 위에 형성된 단일 군락에 의해 주변의 배지색이 황색으로 변한 단일 군락을 양성으로 판정하였다. 평판 배지(적색) 위에 형성된 단일 군락에 의해 주변의 배지색이 황색으로 변한 단일 군락이 검출되어 16S rRNA 유전자 분석에 의한 확정 실험은 Bacillus licheniformis와 99.56%의 상동성을 나타냈다. 평판 배지 위에 형성된 단일 군락은 Bacillus licheniformis 단일 군락에 의하여 배지색이 황색으로 변한 것이므로 Staphylococcus aureus 음성으로 판정하였다(도 22).
Staphylococcus After inoculation of the test substance to the mannitol salt agar (Difco, USA), which is a medium for determining aureus , a single colony formed on a flat medium (red) was determined as positive in a single colony in which the surrounding medium color turned yellow. A single colony formed on a plate medium (red) was detected and a single colony in which the surrounding medium color turned yellow was detected. Confirmation experiment by 16S rRNA gene analysis was confirmed by Bacillus. 99.56% homology with licheniformis . The single colony formed on the plate medium is Bacillus Staphylococcus as the medium color changed to yellow due to a single colony of licheniformis It was judged as aureus negative (FIG. 22).
④ Bacillus cereus 검사④ Bacillus cereus inspection
Bacillus cereus를 판별하는 전용 배지인 MYP 아가(Difco, 미국)에 시험 물질을 접종한 후 평판 배지 위에 형성된 단일 군락이 연분홍색을 띄는 단일 군락을 양성으로 판정하였다. 평판 배지 위에 형성된 연분홍색 단일 군락이 검출되어 16S rRNA 유전자 분석에 의한 확정 실험은 Bacillus licheniformis와 99.56%의 상동성을 나타냈다. 평판 배지 위에 형성된 연분홍색 단일 군락은 Bacillus licheniformis이므로 Bacillus cereus 음성으로 판정하였다(도 22).
Bacillus After inoculation of the test substance to MYP agar (Difco, USA), a medium for determining cereus , a single colony formed on a flat medium was determined to be positive. Single pink colonies formed on plate medium were detected and confirmed by Bacillus 16S rRNA gene analysis. 99.56% homology with licheniformis . The pale pink single colony formed on the plate medium is Bacillus Since it is licheniformis, it was determined as Bacillus cereus negative (FIG. 22).
⑤ Listeria monocytogenes 검사⑤ Listeria monocytogenes test
Listeria monocytogenes를 판별하는 전용 배지인 리스테리아 농화 아가(Difco, 미국)에 시험 물질을 접종한 후 평판 배지 위에 형성된 단일 군락이 청록색을 띄는 단일 군락을 양성으로 판정하였다. 청록색을 띄는 단일 군락이 검출되지 않아 Listeria monocytogenes 음성으로 판정하였다(도 22). Listeria After inoculating the test substance into Listeria thickening agar (Difco, USA), a medium for determining monocytogenes , a single colony formed on a flat medium was determined to have a positive cyan colony. A single colony with a turquoise color was not detected and was judged to be Listeria monocytogenes negative (FIG. 22).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Having described the specific part of the present invention in detail, it is apparent to those skilled in the art that such a specific technology is only a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereto. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
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Claims (4)
Bacillus licheniformis ) NB109 (KCTC 12256BP) strain or a composition for antimicrobial comprising a culture of the strain as an active ingredient.
The composition of claim 1, wherein the strain has a 16S rRNA sequence of SEQ ID NO: 1.
The method of claim 1 wherein the strain is Bacillus (Bacillus) in bacteria, Staphylococcus aureus (Staphylococcus) bacteria belonging to the genus Pseudomonas (Pseudomonas) in bacteria, E. coli (Escherichia characterized in that it has a coli), Candida (Candida) spp, Proteus (Proteus) in bacteria, El beanie O (Erwinia) in bacteria and Lal antimicrobial activity against bacteria selected from Stony O (Ralstonia) bacteria belonging to the genus group consisting of Composition.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020120101793A KR101274222B1 (en) | 2012-09-13 | 2012-09-13 | Antimicrobial composition comprising bacillus licheniformis nb109 as an active ingredient |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020120101793A KR101274222B1 (en) | 2012-09-13 | 2012-09-13 | Antimicrobial composition comprising bacillus licheniformis nb109 as an active ingredient |
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CN109777758A (en) * | 2019-03-04 | 2019-05-21 | 青岛红樱桃生物技术有限公司 | One kind having the active bacillus licheniformis HYT-9 of broad-spectrum antibacterial and its bacterial preparation process and application |
Citations (2)
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---|---|---|---|---|
KR20120020624A (en) * | 2010-08-30 | 2012-03-08 | 순창군 | Non-toxic new microbes having inhibitory activity growing for bacillus cereus and sauce including them |
KR20120063581A (en) * | 2010-12-08 | 2012-06-18 | 박희태 | Bacillus licheniformis bacteria having anti-microbial activities |
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2012
- 2012-09-13 KR KR1020120101793A patent/KR101274222B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (2)
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