KR101263757B1 - Methods for Screening TLR4(Toll-like receptor 4) Signaling Inhibitors and Uses Thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 다음 단계를 포함하는 TLR4(Toll-like receptor 4) 시그널링 억제제를 스크리닝 하는 방법을 제공한다: (a) TLR4(Toll-like receptor 4) 또는 TLR4 세포외 도메인에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 시험물질이 TLR4의 세포외 도메인에 있는 시스테인 잔기에 공유결합하는 지 여부를 분석하는 단계를 포함하며, 상기 시험물질이 TLR4의 세포외 도메인에 있는 시스테인 잔기에 공유결합 하는 경우에는 TLR4 올리고머화를 억제하여 TLR4 시그널링 억제제로 판단한다. 본 발명의 TLR4 시그널링 억제제, 보다 바람직하게는 티올-반응성 화합물(예컨대, SFN)은 TLR4 또는 TLR4 세포외 도메인 내에 존재하는 시스테인 잔기와 공유결합하여 어덕트(adducts)를 형성하고, TLR4의 리간드-유도된 올리고머화 및 TLR4의 리간드-비의존적 올리고머화를 모두 억제한다. 따라서, 본 발명의 TLR4 시그널링 억제제 또는 이의 효능 증진제(예를 들어, SFN)을 유효성분으로 포함하는 조성물은 염증 반응을 현저하게 약화시켜 염증성 질환의 치료에 효과적이며 피부 상태의 개선 및 부종의 감소에도 효과적이다.The present invention provides a method for screening a Toll-like receptor 4 (TLL4) signaling inhibitor comprising the steps of: (a) contacting a test substance with a Toll-like receptor 4 (TLR4) or TLR4 extracellular domain; And (b) analyzing whether the test substance covalently binds to a cysteine residue in the extracellular domain of TLR4, wherein the test substance covalently binds to a cysteine residue in the extracellular domain of TLR4. TLR4 oligomerization is inhibited to determine it as a TLR4 signaling inhibitor. TLR4 signaling inhibitors of the invention, more preferably thiol-reactive compounds (e.g. SFN), covalently bond with cysteine residues present in the TLR4 or TLR4 extracellular domain to form adducts and ligand-induced TLR4 Both oligomerization and ligand-independent oligomerization of TLR4. Therefore, the composition comprising the TLR4 signaling inhibitor of the present invention or its potency enhancer (for example, SFN) as an active ingredient significantly weakens the inflammatory response and is effective in the treatment of inflammatory diseases, and also improves skin condition and reduces edema. effective.

Description

TLR4 시그널링 억제제의 스크리닝 방법 및 이의 용도{Methods for Screening TLR4(Toll-like receptor 4) Signaling Inhibitors and Uses Thereof}Methods for Screening TLR4 Signaling Inhibitors and Uses thereof {Methods for Screening Toll-like receptor 4 (TLL4) Signaling Inhibitors and Uses Thereof}

본 발명은 TLR4(Toll-like receptor 4) 시그널링 억제제 또는 이의 효능 증진제를 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for screening a toll-like receptor 4 (TLR4) signaling inhibitor or an efficacy enhancer thereof.

천연 이소티오시아네이트 유도체인 1-이소티오시아네이트-4-(메틸설피닐)-뷰테인(설포라판 또는 SFN)은 브로콜리 및 꽃양배추(cauliflower) 같은 십자화과 채소(cruciferous vegetable)에 풍부하다. SFN은 항-암(chemopreventive) 활성으로 잘 알려진 물질로, 이들의 활성은 발암물질(carcinogen)을 생산하는 제I상(phase I) 효소의 억제 및 발암물질의 해독에 포함되는 제II상(phase II) 효소의 유도를 통해 매개된다(1). 또한, SFN은 항-염 효능을 가진다. SFN은 LPS-처리된 대식세포 또는 신경세포에서 유도성 NO 합성효소(iNOS), 사이클로옥시게나제-2(COX-2) 및 TNF-α 같은 염증성 단백질의 발현을 감소시켰다(2, 3). SFN은 HMGB1(high-mobility group box 1)의 LPS-유도성 배출을 억제하였는데, 이들은 RAW264.7 세포에서 사이토카인-유사 분자로서 기능하고 면역자극에 의해 활발하게 배출된다(4). SFN은 LPS-처리된 상피세포에서 부착분자인 세포간 부착분자-1(intercellular adhesion molecule-1)의 발현을 억제하여 상피세포에 대한 단핵구 부착을 감소시켰다(5). SFN의 풍부한 소스로서 건조된 브로콜리 식이요법은 선천성 고혈압증 래트(spontaneous hypertensive rat)의 혈관세포벽, 심장 및 신장에 대한 대식세포의 침윤(infiltration)을 감소시켰다(6). 염증은 발암과정에서 중요한 병인학적 요소들 중 하나이기 때문에, SFN의 항-염증 활성도 항-암 효능에 기여할 수 있다.Natural isothiocyanate derivative 1-isothiocyanate-4- (methylsulfinyl) -butane (sulforaphane or SFN) is abundant in cruciferous vegetables such as broccoli and cauliflower. SFN is well known for its chemopreventive activity, and its activity is phase II involved in the inhibition of phase I enzymes that produce carcinogens and the detoxification of carcinogens. II) mediated through the induction of enzymes (1). In addition, SFN has anti-salt efficacy. SFN reduced the expression of inflammatory proteins such as inducible NO synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2) and TNF-α in LPS-treated macrophages or neurons (2, 3). SFN inhibited LPS-induced excretion of high-mobility group box 1 (HMGB1), which functions as cytokine-like molecules in RAW264.7 cells and is actively excreted by immunostimulation (4). SFN reduced monocyte adhesion to epithelial cells by inhibiting the expression of intercellular adhesion molecule-1, an adhesion molecule, in LPS-treated epithelial cells (5). Dried broccoli diet as a rich source of SFN reduced the infiltration of macrophages into the vascular cell wall, heart and kidney of congenital hypertensive rats (6). Since inflammation is one of the important etiological factors in carcinogenesis, the anti-inflammatory activity of SFN may contribute to anti-cancer efficacy.

염증은 미생물 감염 또는 조직 손상에 의해 개시될 수 있다. TLR은 침입하는 미생물 또는 손상된 세포/조직으로부터 유래된 구조적 구성성분을 검출하는 병원체 인식 수용체들(pathogen recognition receptors, PRRs)이다. TLRs의 활성화는 세포 내 시그널 전달(cellular signal transduction)의 활성화 및 면역 및 염증성 매개자의 발현을 통해 면역 및 염증성 반응을 유발한다. TLR4는 전신성 염증성 폐혈증(systemic inflammatory sepsis)을 야기하는 그람-음성 박테리아의 세포벽 구성성분인 LPS를 인식한다. 또한, TLR4는 손상된 조직 부위로부터 방출되어 무균성(aseptic) 염증 반응을 일으키는 헤파린 설페이트 및 파이브로넥틴 같은 내인성 분자들에 의해 활성화될 수 있다. LPS에 의한 TLR4의 활성화는 TLR4의 올리고머화를 야기하여 어뎁터 분자의 회귀를 초래한다. 일반적으로, TLR4 시그널링은 TLR의 세포질 부위와 상호작용하는 주요 어뎁터 분자인 MyD88 및 TRIF(Toll/IL-1R domain containing adaptor-inducing IFN-β)에 의존적이다. MyD88은 IRAK-4(IL-1R-associated kinase-4) 및 IRAK-1을 회귀시키는데, 이들은 TRAF 6(TNFR-associated factor 6)와 추가적으로 연관되어 IκB 키나제(IKK) α/β/γ 복합체 및 MAPKs의 활성화를 초래한다. TRIF는 MyD88-독립적 시그널링 경로의 활성화를 담당한다. TRIF는 TRAF 6 또는 TRAF 3와의 상호작용을 통해 수용체 상호작용 단백질 1, TBK 1(TANK-binding kinase 1) 및 IKKε을 활성화시킨다(7-11).Inflammation can be initiated by microbial infection or tissue damage. TLRs are pathogen recognition receptors (PRRs) that detect structural components derived from invading microorganisms or damaged cells / tissues. Activation of TLRs elicits immune and inflammatory responses through activation of cellular signal transduction and expression of immune and inflammatory mediators. TLR4 recognizes LPS, a cell wall component of Gram-negative bacteria that causes systemic inflammatory sepsis. In addition, TLR4 can be activated by endogenous molecules such as heparin sulphate and fibronectin, which are released from damaged tissue sites and cause an aseptic inflammatory response. Activation of TLR4 by LPS results in oligomerization of TLR4 resulting in regression of the adapter molecule. In general, TLR4 signaling is dependent on MyD88 and TRIF (Toll / IL-1R domain containing adapter-inducing IFN-β), which are the major adapter molecules that interact with the cytoplasmic region of TLRs. MyD88 regresses IRAK-4 (IL-1R-associated kinase-4) and IRAK-1, which are further associated with TRAF 6 (TNFR-associated factor 6), leading to IκB kinase (IKK) α / β / γ complexes and MAPKs Results in activation. TRIF is responsible for the activation of the MyD88-independent signaling pathway. TRIF activates receptor interacting protein 1, TANK-binding kinase 1, and IKKε through interaction with TRAF 6 or TRAF 3 (7-11).

TLR4의 활성화는 iNOS, COX-2 및 TNF-α 같은 친-염증성 단백질의 생산을 현저하게 촉진시킨다. 이상조절된 TLR 활성은 면역학적 질병 뿐 아니라 만성 염증성 질환의 발병과 밀접하게 연관되어 있는 것으로 알려져 있다(12). TLRs 및 다운스트림 시그널링 성분들은 많은 염증성 질환의 효과적인 치료 타겟일 수 있다(13, 14). 따라서, 본 발명자들은 잘 알려진 항-염증성 인자인 SFN이 TLRs 및 다운스트림 시그널링 경로를 조절하는 지 및 SFN에 의해 조절되는 TLR4 시그널링 경로에서 항-염증성 타겟이 무엇인지를 조사하였다.
Activation of TLR4 significantly promotes the production of pro-inflammatory proteins such as iNOS, COX-2 and TNF-α. Aberrantly regulated TLR activity is known to be closely associated with the development of chronic inflammatory diseases as well as immunological diseases (12). TLRs and downstream signaling components may be effective therapeutic targets for many inflammatory diseases (13, 14). Thus, we investigated whether the well-known anti-inflammatory factor SFN regulates TLRs and downstream signaling pathways and what are the anti-inflammatory targets in the TLR4 signaling pathway regulated by SFN.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.

본 발명자들은 TLR4(Toll-like receptor 4) 시그널링 억제제 또는 이의 효능 증진제를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 티올-반응성(thiol-reactive) 화합물(예컨대, SFN)이 TLR4 또는 TLR4 세포외 도메인 내에 존재하는 시스테인 잔기들과 공유결합하여 어덕트를 형성하며, 리간드-의존성 및 리간드-비의존성 TLR4 세포외 도메인(extracellular domain)의 올리고머화를 억제하여 NF-κB 활성화 및 IRF3(interferon regulatory factor 3) 활성화를 억제시키고 친-염증성 사이토카인(예컨대, TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL(interleukin)-1β 또는 IL-6)의 생산을 감소시킨다는 것을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors have made extensive efforts to discover toll-like receptor 4 signaling inhibitors or potentiators thereof. As a result, the inventors have found that thiol-reactive compounds (eg, SFN) covalently bond with cysteine residues present in the TLR4 or TLR4 extracellular domain to form adducts, ligand-dependent and ligand-ratios. Inhibits oligomerization of the dependent TLR4 extracellular domain, thereby inhibiting NF-κB activation and interferon regulatory factor 3 (IRF3) activation and inhibiting pro-inflammatory cytokines (eg, TNF-α (tumor necrosis factor-α), The discovery of reduced production of IL (interleukin) -1β or IL-6) led to the completion of the present invention.

본 발명의 목적은 TLR4(Toll-like receptor 4) 시그널링 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 데 있다.It is an object of the present invention to provide a method for screening toll-like receptor 4 (TLR4) signaling inhibitors.

본 발명의 다른 목적은 TLR4(Toll-like receptor 4) 시그널링 억제제의 효능 증진제를 스크리닝 하는 방법을 제공하는 데 있다.
Another object of the present invention is to provide a method for screening an efficacy enhancer of a TLR4 (Toll-like receptor 4) signaling inhibitor.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 TLR4(Toll-like receptor 4) 시그널링 억제제를 스크리닝 하는 방법을 제공한다: (a) TLR4(Toll-like receptor 4) 또는 TLR4 세포외 도메인에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 시험물질이 TLR4의 세포외 도메인에 있는 시스테인 잔기에 공유결합하는 지 여부를 분석하는 단계를 포함하며, 상기 시험물질이 TLR4의 세포외 도메인에 있는 시스테인 잔기에 공유결합 하는 경우에는 TLR4 올리고머화를 억제하여 TLR4 시그널링 억제제로 판단한다.According to one aspect of the present invention, the present invention provides a method for screening a Toll-like receptor 4 (TLR4) signaling inhibitor comprising the following steps: (a) Toll-like receptor 4 or TLR4 extracellular domain Contacting the test substance with the test substance; And (b) analyzing whether the test substance covalently binds to a cysteine residue in the extracellular domain of TLR4, wherein the test substance covalently binds to a cysteine residue in the extracellular domain of TLR4. TLR4 oligomerization is inhibited to determine it as a TLR4 signaling inhibitor.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 TLR4(Toll-like receptor 4) 시그널링 억제제의 효능 증진제를 스크리닝 하는 방법을 제공한다: (a) TLR4(Toll-like receptor 4) 또는 TLR4 세포외 도메인에 TLR4 시그널링 억제제 및 시험물질을 접촉시키는 단계; (b) 대조군으로서 TLR4 또는 TLR4 세포외 도메인에 TLR4 시그널링 억제제를 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 단계 (a) 및 (b)에서 상기 TLR4 시그널링 억제제가 TLR4의 세포외 도메인에 있는 시스테인 잔기에 공유결합 하는 정도를 분석하는 단계를 포함하며, 상기 (a)에서 상기 TLR4 시그널링 억제제가 TLR4의 세포외 도메인에 있는 시스테인 잔기에 공유결합 하는 정도가 증가하는 경우에는 상기 시험물질은 TLR4 시그널링 억제제의 효능 증진제로 판단한다.
According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for screening a potency enhancer of a toll-like receptor 4 (TLR4) signaling inhibitor comprising the following steps: (a) Toll-like receptor 4 or TLR4 Contacting the TLR4 signaling inhibitor and the test substance with the extracellular domain; (b) contacting a TLR4 signaling inhibitor with a TLR4 or TLR4 extracellular domain as a control; And (c) analyzing the extent to which the TLR4 signaling inhibitor covalently binds to a cysteine residue in the extracellular domain of TLR4 in steps (a) and (b), wherein in (a) the TLR4 signaling inhibitor If the degree of covalent attachment to cysteine residues in the extracellular domain of TLR4 increases, the test substance is considered to be an potentiator of the TLR4 signaling inhibitor.

본 발명자들은 TLR4(Toll-like receptor 4) 시그널링 억제제 또는 이의 효능 증진제를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 티올-반응성(thiol-reactive) 화합물(예컨대, SFN)이 TLR4 또는 TLR4 세포외 도메인 내에 존재하는 시스테인 잔기들과 공유결합하여 어덕트를 형성하며, 리간드-의존성 및 리간드-비의존성 TLR4 세포외 도메인(extracellular domain)의 올리고머화를 억제하여 NF-κB 활성화 및 IRF3(interferon regulatory factor 3) 활성화를 억제시키고 친-염증성 사이토카인(예컨대, TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL(interleukin)-1β 또는 IL-6)의 생산을 감소시킨다는 것을 발견하였다.The present inventors have made extensive efforts to discover toll-like receptor 4 signaling inhibitors or potentiators thereof. As a result, the inventors have found that thiol-reactive compounds (eg, SFN) covalently bond with cysteine residues present in the TLR4 or TLR4 extracellular domain to form adducts, ligand-dependent and ligand-ratios. Inhibits oligomerization of the dependent TLR4 extracellular domain, thereby inhibiting NF-κB activation and interferon regulatory factor 3 (IRF3) activation and inhibiting pro-inflammatory cytokines (eg, TNF-α (tumor necrosis factor-α), It has been found to reduce the production of IL (interleukin) -1β or IL-6).

선천성 면역 수용체들은 사이토카인 생산을 야기하는 복잡한 반응 케스케이드를 조절할 수 있는 유망한 타겟으로, 그들의 분자적 특징에 따라 병원체 리간드를 특이적으로 인식하고 다양한 시그널 케스케이드를 활성화시켜 유전자 발현을 변화시킨다.Innate immune receptors are promising targets that can regulate complex reaction cascades that cause cytokine production, depending on their molecular characteristics, which specifically recognize pathogen ligands and activate various signal cascades to alter gene expression.

톨-유사 수용체(Toll-like receptors, TLRs)는 병원체 감염에 대한 감시자로서 기능하는 구조적으로 연관된 클래스 I 단일 패스 막관통(transmembrane) 단백질 패밀리에 속한다. 일반적으로, TLRs은 타겟 병원체 분자들(예를 들어, 매우 보존성이 높은 박테리아 단백질, 병원체 세포벽 구성성분 또는 병원체-관련된 핵산)에 의해 구분될 수 있으며, 대부분의 포유동물은 지놈 상에 10개 내지 15개의 TLRs을 포함한다. TLRs은 초파리부터 인간에 이르기 까지 매우 보존되어 있으며 구조적 및 기능적 유사성을 가진다. TLRs은 감염 인자들(infectious agents)에서 발현되는 병원체-관련된 분자 패턴(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)을 인식하고 효과적인 면역성의 발휘를 위해 필요한 사이토카인의 생산을 매개하며 다양한 발현 패턴을 나타낸다.Toll-like receptors (TLRs) belong to a family of structurally related class I single pass transmembrane proteins that function as monitors for pathogen infection. In general, TLRs can be distinguished by target pathogen molecules (eg, highly conserved bacterial proteins, pathogen cell wall components or pathogen-associated nucleic acids) and most mammals are 10 to 15 on the genome. Includes TLRs. TLRs are highly conserved from fruit flies to humans and have structural and functional similarities. TLRs recognize pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) expressed in infectious agents, mediate the production of cytokines necessary for effective immunity and exhibit a variety of expression patterns.

TLR4는 TLR4 유전자에 의해 코딩되는 인간 단백질로, 그람-음성 박테리아의 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)를 인지하기 때문에 선천성 면역 시스템의 활성화에 매우 중요하다. 또한, TLR4는 CD284(cluster of differentiation 284)로 명명되기도 한다. TLR4는 태반 및 백혈구의 골수단핵구성 아집단(myelomonocytic subpopulation)에서 가장 풍부하게 발현된다. 또한, TLR4는 대부분의 그람-음성 박테리아에서 발견되는 LPS에 의해 유발된 시그널 트랜스덕션 이벤트에 포함되어 있다.TLR4 is a human protein encoded by the TLR4 gene and is very important for the activation of the innate immune system because it recognizes lipopolysaccharides (LPS) of Gram-negative bacteria. TLR4 is also called CD284 (cluster of differentiation 284). TLR4 is most abundantly expressed in the myelomonocytic subpopulation of the placenta and leukocytes. In addition, TLR4 is involved in signal transduction events induced by LPS found in most Gram-negative bacteria.

상술한 바와 같이, LPS-유도된 TLR4의 활성화는 TLR4 올리고머화를 야기함으로써 다양한 어뎁터 분자들(예컨대, MyD88, TRIF, MD2, 등)의 회귀(recruitment)를 초래한다.As mentioned above, activation of LPS-induced TLR4 results in TLR4 oligomerization resulting in recruitment of various adapter molecules (eg, MyD88, TRIF, MD2, etc.).

본 발명은 다음 단계를 포함하는 TLR4(Toll-like receptor 4) 시그널링 억제제를 스크리닝 하는 방법을 제공한다.The present invention provides a method for screening a Toll-like receptor 4 (TLR4) signaling inhibitor comprising the following steps.

(a) TLR4(Toll-like receptor 4) 또는 TLR4 세포외 도메인에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및 (a) contacting a test substance with a TLR4 (Toll-like receptor 4) or TLR4 extracellular domain; And

(b) 상기 시험물질이 TLR4의 세포외 도메인에 있는 시스테인 잔기에 공유결합하는 지 여부를 분석하는 단계를 포함하며, 상기 시험물질이 TLR4의 세포외 도메인에 있는 시스테인 잔기에 공유결합 하는 경우에는 TLR4 올리고머화를 억제하여 TLR4 시그널링 억제제로 판단한다.(b) analyzing whether the test substance covalently binds to a cysteine residue in the extracellular domain of TLR4, and when the test substance covalently binds to a cysteine residue in the extracellular domain of TLR4 Inhibits oligomerization to determine TLR4 signaling inhibitors.

본 발명의 방법에 따르면, 우선 본 발명의 TLR4 또는 TLR4 세포외 도메인에 분석하고자 하는 시험물질을 접촉시킨다. 본 발명의 TLR4 또는 TLR4 세포외 도메인을 포함하는 세포는 특별하게 제한되지 않으며, 바람직하게는 면역세포 또는 피부세포이며, 보다 바람직하게는 상피세포, 대식세포 또는 섬유아세포이다. 본 발명 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시험물질”은 본 발명의 TLR4 또는 TLR4 세포외 도메인의 올리고머화에 영향을 미치는 지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.According to the method of the present invention, the test substance to be analyzed is first contacted with the TLR4 or TLR4 extracellular domain of the present invention. Cells comprising the TLR4 or TLR4 extracellular domain of the present invention are not particularly limited, preferably immune cells or skin cells, more preferably epithelial cells, macrophages or fibroblasts. As used to refer to the screening method of the present invention, the term “test material” refers to an unknown material used in screening to test whether it affects oligomerization of the TLR4 or TLR4 extracellular domain of the present invention. The test substance includes, but is not limited to, chemicals, nucleotides, antisense-RNAs, small interference RNAs (siRNAs), and natural extracts.

이어, 시험물질과 접촉된 본 발명의 TLR4 또는 TLR4 세포외 도메인에 있는 시스테인 잔기에 공유결합 여부를 분석한다. 이는 하기 기재한 바와 같이 실시할 수 있으며, 측정 결과, 시험물질이 TLR4의 세포외 도메인에 있는 시스테인 잔기에 공유결합하는 경우에는 상기 시험물질은 TLR4 올리고머화를 억제하여 TLR4 시그널링 억제제로 판정될 수 있다.Subsequently, the covalent attachment to the cysteine residue in the TLR4 or TLR4 extracellular domain of the present invention in contact with the test substance is analyzed. This can be done as described below, and as a result of the measurement, when the test substance covalently binds to a cysteine residue in the extracellular domain of TLR4, the test substance can be determined as a TLR4 signaling inhibitor by inhibiting TLR4 oligomerization. .

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 시험물질은 TLR4의 세포외 도메인에 존재하는 시스테인 잔기와 반응하여 어덕트(adducts)를 형성한다. 즉, TLR4 세포외 도메인의 시스테인 잔기는 본 발명의 시험물질의 처리에 의해 변형된다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 시험물질에 의해 변형되는 TLR4 세포외 도메인의 시스테인 잔기는 TLR4 수용체 또는 TLR4 세포외 도메인 내의 시스테인 잔기를 포함하고, 보다 더 바람직하게는 인간 TLR4의 88, 192, 246, 281, 340, 506, 542 및 609번째 시스테인 잔기, 또는 마우스 TLR4의 87, 164, 245, 280, 504, 549 및 606번째 시스테인 잔기를 포함하며, 가장 바람직하게는 인간 TLR4의 88, 192, 246, 281, 340, 506, 542 및 609번째 시스테인 잔기를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.According to a preferred embodiment of the present invention, the test substance of the present invention reacts with cysteine residues present in the extracellular domain of TLR4 to form adducts. That is, the cysteine residues of the TLR4 extracellular domain are modified by treatment of the test substance of the present invention. More preferably, the cysteine residue of the TLR4 extracellular domain modified by the test substance of the present invention comprises a TLR4 receptor or a cysteine residue in the TLR4 extracellular domain, even more preferably 88, 192, 246, 281, 340, 506, 542 and 609th cysteine residues, or 87, 164, 245, 280, 504, 549 and 606th cysteine residues of mouse TLR4, most preferably 88, 192, 246, of human TLR4 281, 340, 506, 542 and 609 th cysteine residues.

또한, 본 발명의 TLR4 또는 TLR4 세포외 도메인에 있는 시스테인 잔기에 공유결합 여부의 분석은 당업계에 공지된 다양한 면역분석 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, TLR4 또는 TLR4 세포외 도메인의 변화는 면역염색, 방사능면역분석, 방사능면역침전, 웨스턴 블롯팅, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 그리고 샌드위치 분석을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.In addition, analysis of the covalent binding to the cysteine residue in the TLR4 or TLR4 extracellular domain of the present invention can be carried out through various immunoassay methods known in the art. For example, changes in the TLR4 or TLR4 extracellular domain may include immunostaining, radioimmunoassay, radioimmunoprecipitation, western blotting, immunoprecipitation, enzyme-linked immunosorbent assay, capture-ELISA, inhibition or competition assay, and Sandwich analysis includes, but is not limited to.

상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.Methods of immunoassay or immunostaining are described in Enzyme Immunoassay , ET Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), in Methods in Molecular Biology , Vol. 1, Walker, JM ed., Humana Press, NJ, 1984; And Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, which is incorporated herein by reference.

예를 들어, 본 발명의 방법이 면역침전 방법에 따라 실시되는 경우, 본 발명의 TLR4 또는 TLR4 세포외 도메인에 레이블을 융합시킨 형태를 분석에 이용할 수 있다. 면역침전은 특정 타겟(예컨대, 단백질 또는 레이블로 이용되는 펩타이드)에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 반응액 내에서 항원 단백질을 침전시키는 기법이다. 일반적으로, 면역침전 기법은 개별 단백질 면역침전(IP), 단백질 복합체 면역침전(Co-IP), 크로마틴 면역침전(ChIP), RNA 면역침전(RIP), 등이 있다. 면역침전 과정을 통하여 시료 내 다른 단백질들로부터 특정 타겟 단백질, 바람직하게는 본 발명의 TLR4 또는 TLR4 세포외 도메인을 풀다운(pull down)하여 검출할 수 있다. 면역침전 방법의 가장 큰 단점은 타겟에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 필요하다는 것이다. 이러한 단점을 극복하기 위해, 타겟 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 면역침전을 위한 택(tag)을 융합한 컨스트럭트를 제작한다. 예를 들어, 단백질 말단에 융합될 수 있는 tag은 다양한 형광단백질(Fluorescent proteins; 예컨대, GFP, RFP, CFP, 등), FLAG, HA, His6 또는 글루타티온-S-트랜스퍼라제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서는, 본 발명의 타겟 단백질인 TLR4 또는 TLR4 세포외 도메인에 다양한 택(예를 들어, FLAG, HA, GFP)을 융합시킨 컨스트럭트를 세포 내로 트랜스펙션시키고 다양한 시험물질들(예컨대, SFN, 파테놀리드, 에타크린산)을 처리한 후, 면역침전을 실시하여 TLR4 또는 TLR4 세포외 도메인의 변화를 분석하였다(참조: 도 4-6).For example, when the method of the present invention is carried out according to the immunoprecipitation method, a form in which the label is fused to the TLR4 or TLR4 extracellular domain of the present invention can be used for analysis. Immunoprecipitation is a technique of precipitating antigenic proteins in a reaction solution using an antibody that specifically binds to a specific target (eg, a protein or a peptide used as a label). In general, immunoprecipitation techniques include individual protein immunoprecipitation (IP), protein complex immunoprecipitation (Co-IP), chromatin immunoprecipitation (ChIP), RNA immunoprecipitation (RIP), and the like. Through immunoprecipitation, specific target proteins, preferably the TLR4 or TLR4 extracellular domain of the present invention, can be detected by pulling down from other proteins in a sample. The biggest disadvantage of immunoprecipitation methods is the need for antibodies that can specifically bind to the target. To overcome this disadvantage, a construct is constructed in which a tag for immunoprecipitation is fused to the N-terminus or C-terminus of the target protein. For example, tags that can be fused to a protein terminus include, but are not limited to, various fluorescent proteins (eg, GFP, RFP, CFP, etc.), FLAG, HA, His 6 or glutathione-S-transferases. It doesn't happen. In the present invention, a construct in which various tags (eg, FLAG, HA, GFP) are fused to a TLR4 or TLR4 extracellular domain, which is a target protein of the present invention, is transfected into cells and various test substances (eg, SFN, Parthenolide, Ethacrynic Acid) and then immunoprecipitation was performed to analyze changes in TLR4 or TLR4 extracellular domains (see Figures 4-6).

한편, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 레이블링된 항체가 본 발명의 TLR4 또는 TLR4 세포외 도메인을 검출하는 데 이용될 수 있다.On the other hand, when the method of the present invention is carried out according to the method of radioimmunoassay, an antibody labeled with radioisotopes (eg, C 14 , I 125 , P 32 and S 35 ) may be used for the TLR4 or TLR4 extracellular domain of the present invention. Can be used to detect.

본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명은 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 타겟(예컨대, TLR4 또는 TLR4 세포외 도메인)에 대한 항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 추가적으로 포함한다.When the method of the present invention is carried out by ELISA, the present invention comprises the steps of: (i) coating an unknown cell sample lysate to be analyzed on the surface of a solid substrate; (Ii) reacting said cell lysate with an antibody to a target (eg, TLR4 or TLR4 extracellular domain) as a primary antibody; (Iii) reacting the result of step (ii) with an enzyme-conjugated secondary antibody; And (iii) measuring the activity of the enzyme.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.Suitable as the solid substrate are hydrocarbon polymers (eg polystyrene and polypropylene), glass, metal or gel, most preferably microtiter plates.

상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.The enzyme bound to the secondary antibody may include an enzyme catalyzing a chromogenic reaction, a fluorescence reaction, a luminescent reaction, or an infrared reaction, but is not limited thereto. For example, an alkaline phosphatase,? -Galactosidase, Radish peroxidase, luciferase, and cytochrome P 450 . In the case where alkaline phosphatase is used as an enzyme binding to the secondary antibody, it is preferable that the substrate is selected from the group consisting of bromochloroindole phosphate (BCIP), nitroblue tetrazolium (NBT), naphthol-AS -Bl-phosphate and ECF (enhanced chemifluorescence) are used. When horseradish peroxidase is used, chloronaphthol, aminoethylcarbazole, diaminobenzidine, D-luciferin, lucigenin (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine), HYR (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB (tetramethylbenzidine), ABTS (2,2'- Azine-di [3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o - phenylene diamine (OPD) and naphthol / pie Ronin, glucose oxidase and t-NBT (nitroblue tetrazolium) and m-PMS a substrate such as phenzaine methosulfate may be used All.

본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 본 발명의 타겟에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 세포 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, 본 발명의 TLR4 또는 TLR4 세포외 도메인에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.When the method of the invention is carried out in a capture-ELISA mode, certain embodiments of the invention comprise (i) coating an antibody against a target of the invention as a capturing antibody on the surface of a solid substrate; (Ii) reacting the capture antibody with the cell sample; (Iii) reacting the product of step (ii) with a detecting antibody that has a label generating a signal and which specifically reacts with the TLR4 or TLR4 extracellular domain of the present invention; And (iv) measuring a signal originating from said label.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질((예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질( chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.The detection antibody has a label that generates a detectable signal. The label may include chemicals (eg biotin), enzymes (alkaline phosphatase, β-galactosidase, horse radish peroxidase and cytochrome P 450 ), radioactive substances (eg C 14 , I 125 , P 32 and S 35 ), fluorescent materials (eg, fluorescein), luminescent materials, chemiluminescent, and fluorescence resonance energy transfer (FRET). Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널의 검출은 본 발명의 타겟의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.The final signal measurement in the ELISA method and the capture-ELISA method can be performed according to various methods known in the art. Detection of such signals allows for qualitative or quantitative analysis of the targets of the present invention. If biotin is used as a label, the signal can be easily detected with streptavidin and luciferin if luciferase is used.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 시험물질은 티올-반응성(thiol-reactive) 화합물을 포함한다.According to a preferred embodiment of the invention, the test substance of the invention comprises a thiol-reactive compound.

티올은 유기화학적으로 설퍼-하이드로젠 결합(-SH)으로 이루어진 작용기(functional group)를 포함하는 화합물로, 상기 작용기는 티올 그룹 또는 설프하이드릴 그룹(sulfhydryl groups)을 의미한다. 전통적으로, 머캅탄(mercaptans)으로도 명명되는 티올 그룹은 시스테인 잔기의 작용기로서 기능하기 때문에 생물학적 측면에서 매우 중요하다. 단백질 폴딩 과정에서 두 개의 시스테인 잔기가 서로 근접하게 되면, 시스테인 잔기 내의 티올 그룹이 산화 반응을 통해 이황화결합(-S-S-)을 가진 시스틴을 형성한다. 또한, 효소의 활성 부위 내 설프하이드릴 그룹은 효소 기질과 비-공유 결합을 형성하여 촉매 활성에 기여한다. 한편, 활성 부위 시스테인 잔기는 중금속 이온(예를 들어, Pb2+, Hg2+, Ag2+)과 반응하여 단백질을 불활성화시킬 수 있다.Thiol is a compound comprising a functional group (organic chemically composed of a sulfur-hydrogen bond (-SH), the functional group refers to a thiol group or sulfhydryl groups (sulfhydryl groups). Traditionally, thiol groups, also called mercaptans, are very important in biological terms because they function as functional groups of cysteine residues. When two cysteine residues are in close proximity to each other during protein folding, the thiol group in the cysteine residues forms a cystine with disulfide bonds (-SS-) through oxidation. In addition, sulfhydryl groups in the active site of the enzyme form non-covalent bonds with the enzyme substrate, contributing to catalytic activity. Active site cysteine residues, on the other hand, can react with heavy metal ions (eg, Pb 2+ , Hg 2+ , Ag 2+ ) to inactivate the protein.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 티올-반응성 화합물은 SFN(sulforaphane), 파테놀리드(parthenolide), 에타크린산(ethacrynic acid), 아우라노핀(auranofin), 시남알데하이드(cinnamaldehyde), 말레이미드, N-메틸 말레이미드(NNM), N-에틸 말레이미드(NEM), 무수말레산(maleic anhydride), 다이에틸말리에이트(DEM), IAA(2-Iodoacetamide), 시스틴 또는 이의 유도체, 시스타민, 디티오클리콜산, 산화된 글루타티온, 요오드, 과산화수소, DHA(dihydroascorbic acid), 테트라티오네이트 또는 o-아이도소벤조에이트(o-iodosobenzoate)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 티올-반응성 화합물은 SFN, 파테놀리드, 에타크린산, 아우라노핀 또는 시남알데하이드이며, 보다 더 바람직하게는 SFN, 파테놀리드 또는 에타크린산이고, 가장 바람직하게는 SFN이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the thiol-reactive compounds of the present invention are sulforaphane, parthenolide, ethacrynic acid, auranofin, cinnamicaldehyde, malein Mead, N-methyl maleimide (NNM), N-ethyl maleimide (NEM), maleic anhydride, diethyl maleate (DEM), 2-AAodoacetamide (IAA), cystine or derivatives thereof, cystamine , Dithioglycolic acid, oxidized glutathione, iodine, hydrogen peroxide, dihydroascorbic acid (DHA), tetrathionate or o-iodosobenzoate (o-iodosobenzoate). More preferably, the thiol-reactive compound of the present invention is SFN, Parthenolide, Ethacrynic Acid, Auranopine or Cinnamicaldehyde, even more preferably SFN, Parthenolide or Ethacrynic Acid, most preferably SFN.

SFN은 항암, 항당뇨 및 항균 활성을 가지는 유기 황화합물(organosulfur compound)이다. SFN은 브로콜리 같은 십자화과 채소에서 얻을 수 있다. 식물체가 상처를 입었을 때, 이에 대한 대응으로 식물체는 미로시나제를 이용하여 글루코시놀레이트인 글루코라파닌을 설포라판(SFN)으로 변형시켜 생산한다. SFN은 브로콜리, 방울다다기양배추(brussel), 양배추, 꽃양배추, 복초이(bok choy), 케일, 콜라드(collards), 카이란(chinese broccoli), 브로콜리 라브(broccoli raab), 구경양배추(kohlrabi), 겨자, 순무, 무(radish), 아루굴라(arugula), 물냉이 등에 풍부하게 존재한다.SFN is an organosulfur compound with anticancer, antidiabetic and antibacterial activity. SFN can be obtained from cruciferous vegetables such as broccoli. When a plant is injured, in response, the plant uses a myrosinase to transform the glucosinolate, glucopanin, into sulforaphane (SFN). SFN is broccoli, brussels, cabbage, cauliflower, bok choy, kale, collards, chinese broccoli, broccoli raab, kohlrabi, It is abundant in mustard, turnips, radishes, arugula and watercress.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 시험물질(예컨대, SFN)은 리간드-의존성 및 리간드-비의존성 TLR4 올리고머화를 억제한다.According to a preferred embodiment of the invention, the test substance of the invention (eg, SFN) inhibits ligand-dependent and ligand-independent TLR4 oligomerization.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 시험물질(예컨대, SFN)은 LPS-, TLR4-, MyD88- 및 IKKβ(IκB kinase β)-유도된 NF-κB 활성화를 억제시킨다.According to a preferred embodiment of the invention, the test substance of the invention (eg SFN) inhibits LPS-, TLR4-, MyD88- and IKKβ (IκB kinase β) -induced NF-κB activation.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 시험물질(예컨대, SFN)은 LPS- 및 TLR4-유도된 IRF3(interferon regulatory factor 3) 활성화를 억제시킨다.According to a preferred embodiment of the invention, the test substance of the invention (eg SFN) inhibits LPS- and TLR4-induced interferon regulatory factor 3 (IRF3) activation.

보다 바람직하게는, 본 발명의 시험물질, 보다 더 바람직하게는 SFN은 친-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인의 생산을 감소시킨다. 친-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인은 종양괴사인자(TNF), IL(interleukin)-1α, 1L-1β, IL-6, IL-8, IL-18, 인터페론 γ, HMG-1, 혈소판-활성화 인자(platelet-activating factor, PAF) 또는 대식세포 이동억제 인자(macrophage migration inhibitory factor, MIF)을 포함하며, 보다 바람직하게는 TNF-α, IL-1β 또는 IL-6을 포함한다.More preferably, the test substance of the present invention, even more preferably SFN, reduces the production of pro-inflammatory cytokines. Pro-inflammatory cytokines include tumor necrosis factor (TNF), interleukin-1α, 1L-1β, IL-6, IL-8, IL-18, interferon γ, HMG-1, platelet- Activating factor (platelet-activating factor (PAF) or macrophage migration inhibitory factor (MIF)), more preferably TNF-α, IL-1β or IL-6.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 시험물질(예컨대, SFN)은 염증성 질환을 치료할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the test substance of the present invention (eg, SFN) can treat an inflammatory disease.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상술한 시험물질을 유효성분으로 포함하는 조성물에 의해 치료될 수 있는 염증성 질환은 염증성 피부질환[예: 천식, 습진, 건선, 알러지, 류마티스 관절염, 건선 관절염(psoriatic arthritis), 접촉성 피부염(contact dermatitis), 아토피성 피부염, 건선, 여드름, 아토피성 비염(건초열), 알레르기성 피부염(습진), 만성 부비동염 또는 지루성 피부염(seborrheic dermatitis)], 골질환, 위염, 통풍, 통풍 관절염, 궤양, 만성 기관지염, 급성 폐손상, 폐염증, 기도 과민반응, 지연성 과민반응(delayed-type hypersensitivity), 식품 민감성, 상처-치유, 염증성 장질환(예: 크론병, 궤양성 대장염), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 글루텐 과민성 장질환(gluten-sensitive enteropathy), 폐혈증, 폐혈성 쇼크, 맥관염 및 활액낭염 같은 급성 또는 만성 염증 질환; 루프스, 류마티스 다발성 근육통, 공피증, 베게너육아종증, 측두 동맥염, 저온형글로불린혈증(cryoglobulinemia) 및 다발성 경화증 같은 자가면역 질환; 이식 거부; 고형암(예: 폐, CNS, 장, 신장 및 췌장)을 포함하는 암; 알쯔하이머병; 동맥경화증, 인슐린 저항성, 비만; 바이러스 감염(예: HIV 또는 인플루엔자); 만성 바이러스 감염(예, 엡스타인-바 바이러스, 거대세포 바이러스, 헤르페스 바이러스(herpes simplex virus); 또는 모세혈관 확장성 운동실조증을 포함하며, 보다 바람직하게는 폐혈증, 동맥경화증, 인슐린 저항성, 비만 또는 암이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the inflammatory disease which can be treated by the composition comprising the above-described test substance as an active ingredient is an inflammatory skin disease [eg, asthma, eczema, psoriasis, allergy, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis arthritis, contact dermatitis, atopic dermatitis, psoriasis, acne, atopic rhinitis (hay fever), allergic dermatitis (eczema), chronic sinusitis or seborrheic dermatitis], bone disease, gastritis, gout Gout arthritis, ulcers, chronic bronchitis, acute lung injury, pulmonary inflammation, airway hypersensitivity, delayed-type hypersensitivity, food sensitivity, wound-healing, inflammatory bowel disease (e.g. Crohn's disease, ulcerative colitis) ), Acute or chronic inflammatory diseases such as ankylosing spondylitis, gluten-sensitive enteropathy, pneumonia, pulmonary shock, vasculitis and bursitis; Autoimmune diseases such as lupus, rheumatic polymyalgia, scleroderma, Wegener's granulomatosis, temporal arteritis, cryoglobulinemia and multiple sclerosis; Rejection of transplants; Cancers including solid cancers such as lungs, CNS, intestines, kidneys and pancreas; Alzheimer's disease; Atherosclerosis, insulin resistance, obesity; Viral infections (eg HIV or influenza); Chronic viral infections (eg, Epstein-Barr virus, cytomegalovirus, herpes simplex virus) or capillary dilatation ataxia, more preferably pneumonia, atherosclerosis, insulin resistance, obesity or cancer .

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상술한 시험물질을 유효성분으로 포함하는 조성물에 의해 치료될 수 있는 암은 유방암, 신장암, 신경 내분비 암, 위암, 폐암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 부신암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 전립선암, 골암, 뇌암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.According to a preferred embodiment of the present invention, the cancer which can be treated by the composition containing the above-described test substance as an active ingredient is breast cancer, kidney cancer, neuroendocrine cancer, gastric cancer, lung cancer, ovarian cancer, liver cancer, bronchial cancer, non-phosphorus Head cancer, laryngeal cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, adrenal cancer, colon cancer, colon cancer, cervical cancer, prostate cancer, bone cancer, brain cancer, skin cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer or ureter cancer.

또한, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 TLR4(Toll-like receptor 4) 시그널링 억제제의 효능 증진제를 스크리닝 하는 방법을 제공한다: The present invention also provides a method for screening for potency enhancers of Toll-like receptor 4 (TLR4) signaling inhibitors comprising the following steps:

(a) TLR4(Toll-like receptor 4) 또는 TLR4 세포외 도메인에 TLR4 시그널링 억제제 및 시험물질을 접촉시키는 단계;(a) contacting a TLR4 signaling inhibitor and a test substance with a TLR4 (Toll-like receptor 4) or TLR4 extracellular domain;

(b) 대조군으로서 TLR4 또는 TLR4 세포외 도메인에 TLR4 시그널링 억제제를 접촉시키는 단계; 및(b) contacting a TLR4 signaling inhibitor with a TLR4 or TLR4 extracellular domain as a control; And

(c) 상기 단계 (a) 및 (b)에서 상기 TLR4 시그널링 억제제가 TLR4의 세포외 도메인에 있는 시스테인 잔기에 공유결합 하는 정도를 분석하는 단계를 포함하며, 상기 (a)에서 상기 TLR4 시그널링 억제제가 TLR4의 세포외 도메인에 있는 시스테인 잔기에 공유결합 하는 정도가 증가하는 경우에는 상기 시험물질은 TLR4 시그널링 억제제의 효능 증진제로 판단한다.(c) analyzing the extent to which the TLR4 signaling inhibitor covalently binds to a cysteine residue in the extracellular domain of TLR4 in steps (a) and (b), wherein in step (a) the TLR4 signaling inhibitor is If the degree of covalent binding to cysteine residues in the extracellular domain of TLR4 increases, the test substance is considered to be an potentiator of the TLR4 signaling inhibitor.

본 발명의 방법은 상술한 본 발명의 TLR4 시그널링 억제제를 스크리닝 하는 방법을 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
Since the method of the present invention includes the above-described method for screening the TLR4 signaling inhibitor of the present invention, the contents in common between the two are omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 TLR4 시그널링 억제제(예를 들어, 티올-반응성 화합물) 또는 이의 효능 증진제의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 TLR4 시그널링 억제제 또는 이의 효능 증진제의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.According to a preferred embodiment of the present invention, the composition of the present invention comprises (a) a pharmaceutically effective amount of the above-described TLR4 signaling inhibitor (eg thiol-reactive compound) or potency enhancer thereof; And (b) a pharmaceutically acceptable carrier. As used herein, the term "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to achieve the efficacy or activity of the above-described TLR4 signaling inhibitor or potency enhancer thereof.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the present invention are those commonly used in the preparation, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oils, and the like. It doesn't happen. In addition to the above components, the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington ' s Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 근육 주입, 정맥내 주입, 피하 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, preferably parenterally, and in the case of parenteral administration, may be administered by intramuscular injection, intravenous injection, subcutaneous injection, intraperitoneal injection, topical administration, transdermal administration, or the like. Can be.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 1일 당 0.0001-1000 ㎍이다.The appropriate dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on factors such as the formulation method, administration method, age, body weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, . On the other hand, the preferred dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.0001-1000 μg per day.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
The pharmaceutical composition of the present invention may be formulated into a unit dose form by formulating it using a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by a person having ordinary skill in the art to which the present invention belongs. Or by intrusion into a multi-dose container. The formulations may be in the form of solutions, suspensions or emulsions in oils or aqueous media, or in the form of excipients, powders, granules, tablets or capsules, and may additionally contain dispersing or stabilizing agents.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 TLR4 시그널링 억제제 또는 이의 효능 증진제를 유효성분으로 포함하는 피부 상태(skin conditions) 개선용 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a composition for improving skin conditions comprising the above-described TLR4 signaling inhibitor of the present invention or an efficacy enhancer thereof as an active ingredient.

본 발명의 방법은 상술한 본 발명의 TLR4 시그널링 억제제 또는 이의 효능 증진제를 유효성분으로 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.Since the method of the present invention includes the above-described TLR4 signaling inhibitor of the present invention or an efficacy enhancer thereof as an active ingredient, the common content between the two is omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.

하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 TLR4 올리고머화 억제제, 바람직하게는 티올-반응성 화합물, 보다 바람직하게는 SFN, 파테놀리드 또는 에타크린산, 가장 바람직하게는 SFN은 리간드-의존성 및 리간드-비의존성 TLR4 올리고머화를 억제하였다. 즉, 본 발명의 SFN은 LPS-, TLR4-, MyD88- 및 IKKβ(IκB kinase β)-유도된 NF-κB 활성화를 억제시켰으며, LPS- 및 TLR4-유도된 IRF3(interferon regulatory factor 3) 활성화를 약화시켰다. 또한, 본 발명의 SFN은 SFN은 친-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인(예를 들어, TNF-α, IL-1β 또는 IL-6)의 생산을 감소시켜 염증 반응을 약화시켰다. 이러한 결과를 토대로 실시한 염증 동물 모델에서, 본 발명의 TLR4 올리고머화 억제제는 마우스의 피부에서 LPS-유도된 염증을 인 비보에서 현저하게 약화시킨다는 것을 알 수 있었다(참고: 도 9). 이러한 효과는 잘 알려진 항-염증 약물인 인도메타신 만큼 강력하였다. 따라서, 본 발명의 조성물은 피부 상태의 개선에 매우 효과적이다.As demonstrated in the Examples below, the TLR4 oligomerization inhibitors of the invention, preferably thiol-reactive compounds, more preferably SFN, parthenolide or ethacrynic acid, most preferably SFN are ligand-dependent and Ligand-independent TLR4 oligomerization was inhibited. That is, the SFN of the present invention inhibited LPS-, TLR4-, MyD88- and IKBβ (IκB kinase β) -induced NF-κB activation, and inhibited LPS- and TLR4-induced interferon regulatory factor 3 (IRF3) activation. Weakened. In addition, the SFN of the present invention attenuated the inflammatory response by reducing the production of pro-inflammatory cytokines (eg, TNF-α, IL-1β or IL-6). In an inflammatory animal model based on these results, it was found that the TLR4 oligomerization inhibitor of the present invention significantly attenuates LPS-induced inflammation in vivo in mice (see FIG. 9). This effect was as strong as indomethacin, a well-known anti-inflammatory drug. Therefore, the composition of the present invention is very effective for improving the skin condition.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 TLR4 올리고머화 억제제에 의한 피부 상태의 개선은 피부염증 또는 부종의 개선이다.
According to a preferred embodiment of the invention, the improvement of the skin condition by the TLR4 oligomerization inhibitor of the invention is an improvement of dermatitis or edema.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(a) 본 발명은 TLR4(Toll-like receptor 4) 시그널링 억제제 또는 이의 효능 증진제를 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.(a) The present invention relates to a method for screening a Toll-like receptor 4 (TLR4) signaling inhibitor or an efficacy enhancer thereof.

(b) 본 발명의 TLR4 시그널링 억제제인 티올-반응성 화합물, 바람직하게는 SFN은 TLR4 또는 TLR4 세포외 도메인 내에 존재하는 시스테인 잔기와 공유결합하여 어덕트(adducts)를 형성한다.(b) A thiol-reactive compound, preferably SFN, which is a TLR4 signaling inhibitor of the invention, covalently bonds with cysteine residues present in the TLR4 or TLR4 extracellular domain to form adducts.

(c) 본 발명의 TLR4 시그널링 억제제인 티올-반응성 화합물, 바람직하게는 SFN은 TLR4의 리간드-유도된 올리고머화 및 TLR4의 리간드-비의존적 올리고머화를 모두 억제한다.(c) Thiol-reactive compounds, preferably SFNs, which are TLR4 signaling inhibitors of the invention, inhibit both ligand-induced oligomerization of TLR4 and ligand-independent oligomerization of TLR4.

(d) 본 발명의 SFN은 LPS-, TLR4-, MyD88- 및 IKKβ(IκB kinase β)-유도된 NF-κB 활성화를 억제시키고, LPS- 및 TLR4-유도된 IRF3(interferon regulatory factor 3) 활성화를 약화시킨다.(d) SFNs of the present invention inhibit LPS-, TLR4-, MyD88- and IKKβ (IκB kinase β) -induced NF-κB activation and inhibit LPS- and TLR4-induced interferon regulatory factor 3 (IRF3) activation Weakens.

(e) 본 발명의 SFN은 친-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인(예를 들어, TNF-α, IL-1β 또는 IL-6)의 생산을 감소시켜 염증 반응을 약화시킨다.(e) SFN of the present invention reduces the production of pro-inflammatory cytokines (eg, TNF-α, IL-1β or IL-6), thereby attenuating the inflammatory response.

(f) 따라서, 본 발명의 TLR4 시그널링 억제제 또는 이의 효능 증진제(예를 들어, SFN)을 유효성분으로 포함하는 조성물은 염증 반응을 현저하게 약화시켜 염증성 질환의 치료에 효과적이며 피부 상태의 개선 및 부종의 감소에도 효과적이다.
(f) Therefore, the composition comprising the TLR4 signaling inhibitor of the present invention or its potency enhancer (e.g. SFN) as an active ingredient significantly weakens the inflammatory response to be effective in the treatment of inflammatory diseases and improves and swells the skin condition. It is also effective in reducing.

도 1은 TLR4 시그널링의 LPS-유도된 활성화 및 타겟 유전자의 발현을 억제한다는 결과이다. A, RAW264.7 세포에 SFN(10 및 20 μM)을 1시간 동안 전처리한 후 LPS(5 ng/ml)를 30분 동안 추가적으로 처리하였다. 면역블롯팅을 이용하여 IRAK-1 및 액틴 단백질의 레벨을 세포 용해물에서 분석하였다. B 및 C, NF-κB 결합 위치(2×)(B) 또는 IRF3 결합 위치의 IFN-β 프로모터 도메인(IFN-β PRDIII-I)(C)을 포함하는 루시퍼라제 리포터 플라스미드를 RAW264.7 세포에 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션된 세포에 SFN(10 및 20 μM)을 1시간 동안 전처리한 후 LPS(5 ng/ml)를 6시간 동안 추가적으로 처리하였다. 루시퍼라제 및 β-갈락토시다제 효소 활성을 세포 용해물에서 분석하였다. β-갈락토시다제 활성으로 표준화시켜 상대적인 루시퍼라제 활성(RLA)를 계산하였다. 값은 평균값 ± 표준오차(n = 3)를 의미한다. *p < 0.05; **p < 0.01. D, RAW264.7 세포에 SFN(10 및 20 μM)을 1시간 동안 전처리한 후 LPS(5 ng/ml)를 6시간 동안 추가적으로 처리하였다. 면역블롯팅을 이용하여 COX-2 및 액틴 단백질의 레벨을 세포 용해물에서 분석하였다. Veh, 대조군(vehicle).
도 2는 SFN이 TLR4의 리간드-비의존성 활성화를 억제한다는 결과이다. 지시된 바와 같이, NF-κB 결합 위치(2×) 또는 IRF3 결합 위치(IFN-β PRDIII-I)(C)을 포함하는 루시퍼라제 리포터 플라스미드 및 지속적으로 활성화된 TLR4(CD4-TLR4) 또는 WT TLR4의 발현 플라스미드를 293T 세포(A 및 B) 또는 RAW264.7 세포(C)에 트랜스펙션시켰다. 24시간 후, SFN(10 및 20 μM)을 세포에 추가적으로 8시간 동안 처리하고 RLA를 측정하였다. 값은 평균값 ± 표준오차(n = 3)를 의미한다. Veh, 대조군(vehicle); *p < 0.05; **p < 0.01.
도 3은 SFN이 MyD88 및 IKKβ에 의해 유도된 NF-κB 활성화를 억제하지만 TRIF 및 TBK1에 의해 유도된 IRF3 활성화를 억제하지 않는다는 것을 나타내는 결과이다. 지시된 바와 같이, NF-κB 결합 위치(2×) 또는 IRF3 결합 위치(IFN-β PRDIII-I)를 포함하는 루시퍼라제 리포터 플라스미드 및 MyD88, IKKβ, TRIF 또는 TBK1의 발현 플라스미드를 293T 세포에 트랜스펙션시켰다. SFN(10 및 20 μM)을 세포에 추가적으로 8시간 동안 처리하고 RLA를 측정하였다. 값은 평균값 ± 표준오차(n = 3)를 의미한다. Veh, 대조군(vehicle); *p < 0.05; **p < 0.01.
도 4는 SFN이 TLR4의 올리고머화를 억제한다는 결과이다. A, Flag-TLR4, GFP-TLR4, MD-2, CD14 및 NF-κB 리포터 유전자를 발현하는 Ba/F3 세포에 SFN(10 및 20 μM)을 1시간 동안 전처리한 후 LPS(50 ng/ml)를 20분 동안 추가적으로 처리하였다. 이후, 세포를 항-Flag 항체로 면역침전시키고, 항-GFP(위쪽 패널) 및 항-Flag(아래쪽 패널)로 면역블롯팅하였다. B, 다른 배치(batch)의 Ba/F3 세포에 SFN(10 및 20 μM)을 1시간 동안 전처리한 후 LPS(1 ng/ml)를 8시간 동안 추가적으로 처리하였다. 세포 용해물에서 루시퍼라제 효소 활성을 측정하였다. C, HA- 및 Flag-ΔTLR4로 트랜스펙션된 293T 세포에 SFN(10 및 20 μM)을 8시간 동안 추가적으로 처리하였다. 이후, 세포를 항-HA 항체로 면역침전시키고, 항-Flag(위쪽 패널) 및 항-HA(아래쪽 패널)로 면역블롯팅하였다. D, Flag-ΔTLR4 및 NF-κB 리포터 유전자로 트랜스펙션된 293T 세포에 SFN(10 및 20 μM)을 8시간 동안 추가적으로 처리하였다. 값은 평균값 ± 표준오차(n = 3)를 의미한다. Veh, 대조군(vehicle); *p < 0.05; **p < 0.01.
도 5는 티올 도우너가 TLR4 올리고머화 및 NF-κB 활성화에 대한 SFN의 억제 효과를 차단한다는 결과이다. A, Flag-TLR4, GFP-TLR4, MD-2, CD14 및 NF-κB 리포터 유전자를 발현하는 Ba/F3 세포에 SFN(20 μM)을 DTT(300 μM) 또는 NAC(2 mM)의 부존재 또는 존재 하에서 1시간 동안 처리한 후 LPS(50 ng/ml)를 20분 동안 추가적으로 처리하였다. 이후, 세포를 항-Flag 항체로 면역침전시키고, 항-GFP 또는 항-Flag으로 면역블롯팅하였다. B, 다른 배치의 Ba/F3 세포를 도 5A에 기재된 바와 같이 처리한 후 LPS(1 ng/ml)를 8시간 동안 추가적으로 처리하였다. 세포 용해물에서 루시퍼라제 효소 활성을 측정하였다. 값은 평균값 ± 표준오차(n = 3)를 의미한다. Veh, 대조군(vehicle); **p < 0.01.
도 6은 TLR4의 LPS-유도된 올리고머화 상에 파테놀리드 및 에타크린산의 효과를 나타내는 결과이다. A 및 C, Flag-TLR4, GFP-TLR4, MD-2, CD14 및 NF-κB 결합 위치를 포함하는 루시퍼라제 리포터 유전자를 발현하는 Ba/F3 세포에 파테놀리드(Par; 5 및 10 μM) 및 에타크린산(EA; 50 및 100 μM)을 1시간 동안 전처리한 후 LPS(50 ng/ml)를 20분 동안 추가적으로 처리하였다. 이후, 세포를 항-Flag 항체로 면역침전시키고, 항-GFP(위쪽 패널) 및 항-Flag(아래쪽 패널)로 면역블롯팅하였다. B 및 D, 다른 배치의 Ba/F3 세포에 Par(5 및 10 μM) 및 EA(50 및 100 μM)을 전처리한 후 LPS(1 ng/ml)를 8시간 동안 추가적으로 처리하였다. 세포 용해물에서 루시퍼라제 효소 활성을 측정하였다. 값은 평균값 ± 표준오차(n = 3)를 의미한다. Veh, 대조군(vehicle); *p < 0.05; **p < 0.01.
도 7은 TLR4-의존성 시그널링에 대한 SFN의 억제 효과가 WT 세포 뿐만 아니라, Nrf2-KO 세포에서도 관찰된다는 것을 보여주는 결과이다. A, WT 또는 Nrf2-KO 마우스로부터 분리된 MEFs에 NF-κB 결합 위치를 포함하는 루시퍼라제 리포터 유전자를 트랜스펙션시켰다. 세포에 SFN(20 μM)을 1시간 동안 전처리한 후 LPS(100 ng/ml)를 8시간 동안 추가적으로 처리하였다. 세포 용해물에서 루시퍼라제 효소 활성을 측정하였다. 값은 평균값 ± 표준오차(n = 3)를 의미한다. B, WT 또는 Nrf2-KO 마우스로부터 분리된 MEFs에 SFN(10 및 20 μM)을 1시간 동안 전처리한 후 LPS(1 μg/ml)를 15분 동안 추가적으로 처리하였다. 면역블롯팅을 이용하여 포스포-Ser473-Akt(p-Akt) 및 Akt 단백질의 레벨을 세포 용해물에서 분석하였다. C, WT 또는 Nrf2-KO MEFs에 지속적으로 활성화된 TLR4(ΔTLR4) 및 NF-κB 결합 위치를 포함하는 루시퍼라제 리포터 유전자의 발현 플라스미드를 트랜스펙션시켰다. 세포에 SFN(20 μM)을 9시간 동안 추가적으로 처리한 후, 세포 용해물에서 루시퍼라제 효소 활성을 측정하였다. 값은 평균값 ± 표준오차(n = 3)를 의미한다. Veh, 대조군(vehicle); ***p < 0.001.
도 8은 SFN이 마우스에서 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 같은 염증성 사이토카인의 LPS-유도된 생산을 차단한다는 것을 보여주는 결과이다. 마우스에 LPS(7.5 mg/kg, 복강 내 주사)를 처리(challenge)하기 전에 SFN(25 mg/kg)을 24시간 및 1시간 동안 경구 투여시켰다. LPS를 처리하고 2시간 후, 혈청 시료를 얻었다. 특이적 ELISA를 이용하여 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 혈청 농도를 측정하였다. 값은 평균값 ± 표준오차(n = 3-4)를 의미한다. PBS를 대조군(vehicle)으로 이용하였다. *p < 0.05; ***p < 0.001.
도 9는 SFN이 마우스에서 LPS 주입에 의해 유도된 피부 염증을 감소시킨다는 것을 보여주는 결과이다. 마우스의 오른쪽 귀 중앙에 LPS(50 ㎍/25 ㎕ in PBS)를 피내 주사 24시간 및 1시간 전, 및 6시간 후에 SFN(10 및 30 mg/kg) 또는 인도메타신(INDO; 3 mg/kg)을 구강으로 투여하였다. A, LPS를 주사하고 24시간 후에 양쪽 귀의 무게를 측정하였다. 비-처리된 왼쪽 귀를 개별 변이의 표준화를 위해 이용하였고 왼쪽 귀에 대한 오른쪽 귀의 비를 귀 부종값(ear swelling values)으로 제시하였다. 값은 평균값 ± 표준오차(n = 3-5)를 의미한다. *p < 0.05; **p < 0.01. B, 무게를 측정한 후, 생체검사 조직을 고정하고 조직학적 조사를 위한 H&E 염색을 실시하였다. 대표적인 사진이 제시되어 있다. Veh, 대조군(vehicle).
1 shows the result of inhibiting LPS-induced activation of TLR4 signaling and expression of target genes. A, RAW264.7 cells were pretreated with SFN (10 and 20 μM) for 1 hour and then further treated with LPS (5 ng / ml) for 30 minutes. The levels of IRAK-1 and actin protein were analyzed in cell lysates using immunoblotting. Luciferase reporter plasmids comprising IFN-β promoter domains (IFN-β PRDIII-I) (C) at B and C, NF-κB binding sites (2x) (B) or IRF3 binding sites, were transferred to RAW264.7 cells. Transfection. Transfected cells were pretreated with SFN (10 and 20 μM) for 1 hour and then further treated with LPS (5 ng / ml) for 6 hours. Luciferase and β-galactosidase enzyme activities were analyzed in cell lysates. Relative luciferase activity (RLA) was calculated by normalizing to β-galactosidase activity. The value means the mean value ± standard error (n = 3). * p <0.05; ** p <0.01. D, RAW264.7 cells were pretreated with SFN (10 and 20 μM) for 1 hour and then further treated with LPS (5 ng / ml) for 6 hours. The levels of COX-2 and actin protein were analyzed in cell lysates using immunoblotting. Veh, control.
2 shows that SFN inhibits ligand-independent activation of TLR4. As indicated, a luciferase reporter plasmid comprising an NF-κB binding site (2 ×) or an IRF3 binding site (IFN-β PRDIII-I) (C) and a continuously activated TLR4 (CD4-TLR4) or WT TLR4 Expression plasmid was transfected into 293T cells (A and B) or RAW264.7 cells (C). After 24 hours, SFN (10 and 20 μM) was treated with cells for an additional 8 hours and RLA was measured. The value means the mean value ± standard error (n = 3). Veh, control; * p <0.05; ** p <0.01.
FIG. 3 shows that SFN inhibits NF-κB activation induced by MyD88 and IKKβ but does not inhibit IRF3 activation induced by TRIF and TBK1. As indicated, transfect the 293T cells with a luciferase reporter plasmid comprising an NF-κB binding site (2 ×) or an IRF3 binding site (IFN-β PRDIII-I) and an expression plasmid of MyD88, IKKβ, TRIF or TBK1. Sean. SFN (10 and 20 μM) were treated with cells for an additional 8 hours and RLA was measured. The value means the mean value ± standard error (n = 3). Veh, control; * p <0.05; ** p <0.01.
4 shows that SFN inhibits oligomerization of TLR4. Ba / F3 cells expressing A, Flag-TLR4, GFP-TLR4, MD-2, CD14, and NF-κB reporter genes were pretreated with SFN (10 and 20 μM) for 1 hour and then LPS (50 ng / ml). Was further treated for 20 minutes. Cells were then immunoprecipitated with anti-Flag antibody and immunoblotted with anti-GFP (top panel) and anti-Flag (bottom panel). B, another batch of Ba / F3 cells were pretreated with SFN (10 and 20 μM) for 1 hour and then further treated with LPS (1 ng / ml) for 8 hours. Luciferase enzyme activity was measured in cell lysates. 293T cells transfected with C, HA- and Flag-ΔTLR4 were further treated with SFN (10 and 20 μM) for 8 hours. Cells were then immunoprecipitated with anti-HA antibody and immunoblotted with anti-Flag (top panel) and anti-HA (bottom panel). 293T cells transfected with D, Flag-ΔTLR4 and NF-κB reporter gene were further treated with SFN (10 and 20 μM) for 8 hours. The value means the mean value ± standard error (n = 3). Veh, control; * p <0.05; ** p <0.01.
5 shows that thiol donors block the inhibitory effect of SFN on TLR4 oligomerization and NF-κB activation. In Ba / F3 cells expressing the A, Flag-TLR4, GFP-TLR4, MD-2, CD14, and NF-κB reporter genes, SFN (20 μM) is absent or present in DTT (300 μM) or NAC (2 mM). After treatment for 1 hour under LPS (50 ng / ml) was further treated for 20 minutes. Cells were then immunoprecipitated with anti-Flag antibody and immunoblotted with anti-GFP or anti-Flag. B, another batch of Ba / F3 cells were treated as described in FIG. 5A followed by additional treatment with LPS (1 ng / ml) for 8 hours. Luciferase enzyme activity was measured in cell lysates. The value means the mean value ± standard error (n = 3). Veh, control; ** p <0.01.
6 is a result showing the effect of parthenolide and ethacrynic acid on LPS-induced oligomerization of TLR4. Parthenolide (Par; 5 and 10 μM) to Ba / F3 cells expressing luciferase reporter genes comprising A and C, Flag-TLR4, GFP-TLR4, MD-2, CD14 and NF-κB binding sites and Ethacrynic acid (EA; 50 and 100 μM) was pretreated for 1 hour followed by additional treatment with LPS (50 ng / ml) for 20 minutes. Cells were then immunoprecipitated with anti-Flag antibody and immunoblotted with anti-GFP (top panel) and anti-Flag (bottom panel). B and D, different batches of Ba / F3 cells were pretreated with Par (5 and 10 μM) and EA (50 and 100 μM) and then further treated with LPS (1 ng / ml) for 8 hours. Luciferase enzyme activity was measured in cell lysates. The value means the mean value ± standard error (n = 3). Veh, control; * p <0.05; ** p <0.01.
7 is a result showing that the inhibitory effect of SFN on TLR4-dependent signaling is observed in Nrf2-KO cells as well as WT cells. MEFs isolated from A, WT or Nrf2-KO mice were transfected with the luciferase reporter gene containing the NF-κB binding site. Cells were pretreated with SFN (20 μM) for 1 hour and then further treated with LPS (100 ng / ml) for 8 hours. Luciferase enzyme activity was measured in cell lysates. The value means the mean value ± standard error (n = 3). MEFs isolated from B, WT or Nrf2-KO mice were pretreated with SFN (10 and 20 μM) for 1 hour and then further treated with LPS (1 μg / ml) for 15 minutes. The levels of phospho-Ser 473 -Akt ( p -Akt) and Akt protein were analyzed in cell lysates using immunoblotting. Expression plasmids of the luciferase reporter gene, including TLR4 (ΔTLR4) and NF-κB binding sites, which were constantly activated in C, WT or Nrf2-KO MEFs, were transfected. Cells were further treated with SFN (20 μM) for 9 hours and then luciferase enzyme activity was measured in cell lysates. The value means the mean value ± standard error (n = 3). Veh, control; *** p <0.001.
8 shows that SFN blocks LPS-induced production of inflammatory cytokines such as TNF-α, IL-1β and IL-6 in mice. Mice were orally administered SFN (25 mg / kg) for 24 hours and 1 hour before challenged with LPS (7.5 mg / kg, intraperitoneal injection). Two hours after LPS treatment, serum samples were obtained. Serum concentrations of TNF-α, IL-1β and IL-6 were measured using specific ELISA. The value means the mean value ± standard error (n = 3-4). PBS was used as a vehicle (vehicle). * p <0.05; *** p <0.001.
9 shows results that SFN reduces skin inflammation induced by LPS infusion in mice. SFN (10 and 30 mg / kg) or indomethacin (INDO; 3 mg / kg) LPS (50 μg / 25 μl in PBS) in the middle of the right ear of the mouse 24 and 1 hour before and 6 hours after intradermal injection ) Was administered orally. A, LPS was injected 24 hours after weighing both ears. The untreated left ear was used for standardization of individual variations and the ratio of right ear to left ear was presented as ear swelling values. The value means the mean value ± standard error (n = 3-5). * p <0.05; ** p <0.01. B, after weighing, the biopsy tissue was fixed and subjected to H & E staining for histological examination. Representative pictures are presented. Veh, control.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실시예Example

실험재료 및 실험방법Materials and Experiments

동물animal

동물 관리 및 연구 프로토콜은 아모레퍼시픽 R&D 센터 또는 광주과기원의 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 지침서에 따라 실시하였다. 마우스는 Orient Bio(Seoul, South Korea)로부터 구입하였으며 실험 전에 최소 1주일 동안 동물 시설에서 특이 병원체-부재 조건 하에서 순응시켰다. 마우스를 40-60%의 상대적 습도로 조절된 사육실에서 23±3℃ 온도로 사육하였다. 빛을 12시간의 빛 및 12시간의 암 사이클로 자동 조절하였다.
Animal care and research protocols were conducted in accordance with the guidelines of the AMOREPACIFIC R & D Center or the Institutional Animal Care and Use Committee of Gwangju Institute of Technology. Mice were purchased from Orient Bio (Seoul, South Korea) and acclimated under specific pathogen-free conditions in animal facilities for at least 1 week prior to experiment. Mice were housed at 23 ± 3 ° C. in a breeding room adjusted to a relative humidity of 40-60%. The light was automatically adjusted to 12 hours of light and 12 hours of dark cycle.

시약reagent

SFN을 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 정제된 LPS를 List Biological Laboratory(Campbell, CA)에서 구입하여 엔도톡신-부재 물에 용해시켰다. IRAK-1에 대한 항체를 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)로부터 구입하였다. COX-2에 대한 항체를 Cayman Chemical(Ann Arbor, MI)로부터 구입하였다. 특별하게 언급되지 않는 한, 다른 모든 시약은 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다.
SFN was purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo.). Purified LPS was purchased from List Biological Laboratory (Campbell, CA) and dissolved in endotoxin-free water. Antibodies to IRAK-1 were purchased from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Antibodies to COX-2 were purchased from Cayman Chemical (Ann Arbor, MI). Unless otherwise noted, all other reagents were purchased from Sigma-Aldrich.

세포배양Cell culture

RAW264.7 세포(마우스 단핵구 세포주, ATCC TIB-71) 및 293T 세포[인간 배아신장세포; Daniel Hwang 박사(미국 Western Human Nutrition Research Center, USDA)로부터 제공받음]를 10%(v/v) 열-불활성화된 FBS(HyClone, Logan, UT), 100 U/ml 페니실린 및 100 mg/ml 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM에서 배양하였다. 이전에 기술된 바와 같이(15), TLR4(Flag-태깅 또는 GFP-태깅), CD(cluster of differentiation) 14, 백혈구 Ag 96(MD-2; Flag-태깅) 및 NF-κB 루시퍼라제 리포터 유전자를 발현하는 IL-3-의존성 마우스 프로-B 세포주인 Ba/F3 세포[Kensuke Miyake 박사(Division of Infectious Genetics, Institute of Medical Science, University of Tokyo, Tokyo, Japan)로부터 제공]를 배양하였다. 야생형 및 nrf2-파괴된 유전형(16)의 13.5일 마우스 배아로부터 배아 섬유아세포를 10% FBS 및 항생제를 포함하는 IMDM(Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 유지하였다(17). 세포를 37℃, 5% CO2/공기 환경에서 유지하였다.
RAW264.7 cells (mouse monocyte cell line, ATCC TIB-71) and 293T cells [human embryonic kidney cell; Dr. Daniel Hwang (provided by the Western Human Nutrition Research Center, USDA) received 10% (v / v) heat-inactivated FBS (HyClone, Logan, UT), 100 U / ml penicillin and 100 mg / ml streptoto Cultured in DMEM containing mycin. As previously described (15), TLR4 (Flag-tagged or GFP-tagged), cluster of differentiation (CD) 14, leukocyte Ag 96 (MD-2; Flag-tagged) and NF-κB luciferase reporter genes were Ba / F3 cells, which express IL-3-dependent mouse pro-B cell lines (provided by Kensuke Miyake, Ph.D., provided by Division of Infectious Genetics, Institute of Medical Science, University of Tokyo, Tokyo, Japan), were cultured. Embryonic fibroblasts were maintained in IMDM (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) Containing 10% FBS and antibiotics from 13.5 day mouse embryos of wild type and nrf2- disrupted genotype 16 (17). Cells were maintained at 37 ° C., 5% CO 2 / air environment.

플라스미드Plasmid

Frank Mercurio(Signal Pharmaceuticals, San Diego, CA)가 NF-κB(23)-루시퍼라제 리포터 컨스트럭트를 제공하였다. 친절하게도 K. Fitzgerald(University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA)가 IFN-β-양성 조절 도메인 III-I(PRDIII-I)-루시퍼라제 리포터 플라스미드 및 WT TBK1 발현 플라스미드를 제공하였다. 열충격단백질 70-β-갈락토시다제 리포터 플라스미드는 R. Modlin(University of California, Los Angeles, CA)로부터 얻었다. 항상 발현하는(constitutively active) 키메릭 CD4-TLR4를 C. A. Janeway, Jr.(Yale University, New Haven, CT)로부터 얻었다. WT TLR4 발현 플라스미드는 A. Hajjar(University of Washington, Seattle, WA)로부터 얻었다. 야생형 MyD88는 J. Tschopp(University of Lausanne, Lausanne, Switzerland)으로부터 얻었다. TRIF 발현 플라스미드는 S. Akira(Osaka University, Osaka, Japan)로부터 얻었다. WT IKKβ는 M. Karin(University of California, San Diego, CA)으로부터 얻었다. 트랜스펙션을 위해, EndoFree Plasmid Maxi 키트(Qiagen, Chatsworth, CA)를 이용하여 모든 DNA 컨스트럭트를 대규모로 제조하였다.
Frank Mercurio (Signal Pharmaceuticals, San Diego, Calif.) Provided an NF-κB (23) -luciferase reporter construct. Kindly, K. Fitzgerald (University of Massachusetts Medical School, Worcester, Mass.) Provided IFN-β-positive regulatory domain III-I (PRDIII-I) -luciferase reporter plasmid and WT TBK1 expression plasmid. The heat shock protein 70-β-galactosidase reporter plasmid was obtained from R. Modlin (University of California, Los Angeles, CA). Constitutively active chimeric CD4-TLR4 was obtained from CA Janeway, Jr. (Yale University, New Haven, CT). WT TLR4 expression plasmids were obtained from A. Hajjar (University of Washington, Seattle, WA). Wild type MyD88 was obtained from J. Tschopp (University of Lausanne, Lausanne, Switzerland). TRIF expression plasmids were obtained from S. Akira (Osaka University, Osaka, Japan). WT IKKβ was obtained from M. Karin (University of California, San Diego, Calif.). For transfection, all DNA constructs were made on a large scale using EndoFree Plasmid Maxi kit (Qiagen, Chatsworth, Calif.).

트랜스펙션 및 루시퍼라제 어세이Transfection and Luciferase Assays

제조자의 지시에 따라 SuperFect 트랜스펙션 시약(Qiagen, Valencia, CA)을 이용하여 루시퍼라제 플라스미드 및 다양한 시그널링 구성성분들의 발현 플라스미드를 RAW264.7 또는 293T 세포에 트랜스펙션시켰다. 열충격단백질 70-β-갈락토시다제 리포터 플라스미드를 내적 대조군으로 공동-트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션된 플라스미드의 총량을 상응하는 공벡터로 보완함으로써 동일화하였다. 제조자의 지시에 따라 루시퍼라제 어세이 시스템 및 β-갈락토시다제 효소 시스템(Promega, Madison, WI)을 이용하여 루시퍼라제 및 β-갈락토시다제 효소 활성을 결정하였다. 상대적인 루시퍼라제 활성을 결정하기 위해, 루시퍼라제 활성을 β-갈락토시다제 활성에 의해 표준화하였다.
Luciferase plasmids and expression plasmids of various signaling components were transfected into RAW264.7 or 293T cells using SuperFect transfection reagent (Qiagen, Valencia, CA) according to the manufacturer's instructions. The heat shock protein 70-β-galactosidase reporter plasmid was co-transfected as an internal control. The total amount of transfected plasmids was identified by complementation with the corresponding empty vector. Luciferase and β-galactosidase enzyme activities were determined using a luciferase assay system and a β-galactosidase enzyme system (Promega, Madison, Wis.) According to the manufacturer's instructions. To determine relative luciferase activity, luciferase activity was normalized by β-galactosidase activity.

면역블롯팅Immunoblotting

동일한 양의 세포 추출물을 SDS-PAGE에서 분리하여 폴리비닐리덴 다이플루오라이드 막에 전기적으로 옮겼다. 막을 일차항체로 블롯팅한 후 HRP-컨쥬게이션된 이차항체(Amersham Biosciences, Arlington Heights, IL)로 반응시켰다. 검출된 밴드를 증가된 화학발광 시스템(Amersham Biosciences)을 이용하여 시각화하였다.
Equal amounts of cell extracts were separated on SDS-PAGE and transferred electrically to polyvinylidene difluoride membranes. Membranes were blotted with primary antibodies and then reacted with HRP-conjugated secondary antibodies (Amersham Biosciences, Arlington Heights, IL). The detected bands were visualized using an increased chemiluminescence system (Amersham Biosciences).

면역침전Immune precipitation

Flag-TLR4, GFP-TLR4, CD14 및 MD-2를 안정적으로 발현하는 Ba/F3 세포 및 TLR4의 절단된(truncated) 형태로 지속적인 활성을 가진 헤마글루티닌(HA)-ΔTLR4 및 Flag-ΔTLR4(18)로 트랜스펙션된 293T 세포로부터 단백질 추출물을 제조하였다. Ba/F3 세포용해물 및 293T 세포용해물로부터 추출한 상층액을 각각 단일클론 항-Flag 항체(Sigma-Aldrich) 및 항-HA(Roche, Mannheim, Germany)와 4시간동안 반응시킨 후, 70 ㎕의 50% 단백질 A-아가로오스(Amersham Biosciences)와 4℃에서 하룻밤 동안 흔들면서 반응시켰다. 용해 완충액으로 네 번에 걸쳐서 세척한 후, 면역 복합체를 Laemmli 샘플 용액에 수용화하였다. 수용화된 면역 복합체를 SDS-PAGE로 분리하였다. Ba/F3 세포 용해물의 경우, 막을 항-Flag 항체 및 래빗 항-GFP 항체로 면역블롯팅하였으며, 293T 세포 용해물의 경우 막을 항-Flag 항체 및 항-HA 항체로 면역블롯팅하였다.
Ba / F3 cells stably expressing Flag-TLR4, GFP-TLR4, CD14 and MD-2 and hemagglutinin (HA) -ΔTLR4 and Flag-ΔTLR4 with persistent activity in truncated forms of TLR4 ( Protein extracts were prepared from 293T cells transfected with 18). The supernatant extracted from Ba / F3 lysate and 293T lysate was reacted with monoclonal anti-Flag antibody (Sigma-Aldrich) and anti-HA (Roche, Mannheim, Germany) for 4 hours, and then 70 μl of 50% protein A-Agarose (Amersham Biosciences) was reacted with shaking at 4 ° C. overnight. After washing four times with lysis buffer, immune complexes were solubilized in Laemmli sample solution. Receptive immune complexes were separated by SDS-PAGE. For Ba / F3 cell lysates, membranes were immunoblotted with anti-Flag antibodies and rabbit anti-GFP antibodies, and for 293T cell lysates, membranes were immunoblotted with anti-Flag antibodies and anti-HA antibodies.

TLR4 인-솔루션 절단 및 마이크로-액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법 분석TLR4 in-solution cleavage and micro-liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis

정제된 인간 TLR4(27-631 아미노산) 또는 마우스 TLR4(26-629 아미노산)의 세포외 도메인을 J.-O. Lee(Korea Advanced Institute of Science and Technology, Daejeon, Korea; 19, 20)로부터 얻었으며, 인-솔루션 절단(In-solution digestion) 및 마이크로-액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS) 분석 전에 2 ㎍의 각 단백질을 SFN(100 μM)과 37℃에서 한 시간 동안 반응시켰다. 다양한 절단 위치를 가진 펩타이드들을 생산하기 위해, 키모트립신 및 트립신을 이용하여 인-솔루션 절단을 실시하였다. SFN-변형된 TLR4의 세포외 도메인을 키모트립신을 포함하는 절단 완충액[100 mM Tris-HCl(pH 7.8) 및 10 mM CaCl2; 1:50의 효소 대 기질 비]에서 37℃로 12시간 동안 절단하였다. 키모트립신을 열 변성시킨 후, 키모트립신-처리된 시료들의 분취액을 트립신으로 37℃로 12시간 동안 추가적으로 절단(1:50의 효소 대 기질 비)하였다. 90% 포름산(5%의 최종 농도)를 첨가하여 단백질 절단을 최종적으로 중단시켰다. 키모트립신-처리된 시료 또는 키모트립신/트립신-처리된 시료로 마이크로-LC-MS/MS 분석을 실시하였다. 인간 및 마우스 TLR4 서열을 포함하는 homemade 단백질 데이터베이스에 대한 TurboSequest를 이용하여 MS/MS 스펙트라를 조사하였다. 조사 결과를 필터하기 위해 Bioworks version 3.1을 이용하였으며, 다른 전하 상태의 펩타이드에 대해 다음의 Xcorr 값 및 필터 기준(filtering criteria)이 적용되었다: 1가(singly charged) 펩타이드의 경우, 1.8; 2가 펩타이드의 경우, 2.5; 3가 펩타이드의 경우, 3.5; 및 모든 전하 상태의 ΔCn 펩타이드의 경우, 0.08.
The extracellular domain of purified human TLR4 (27-631 amino acids) or mouse TLR4 (26-629 amino acids) was determined using J.-O. Obtained from Lee (Korea Advanced Institute of Science and Technology, Daejeon, Korea; 19, 20), In-solution digestion and micro-liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS / MS) analysis Previously, 2 μg of each protein was reacted with SFN (100 μM) at 37 ° C. for one hour. In-solution cleavage was performed with chymotrypsin and trypsin to produce peptides with various cleavage sites. The extracellular domain of SFN-modified TLR4 was digested with cleavage buffer containing chymotrypsin [100 mM Tris-HCl (pH 7.8) and 10 mM CaCl 2 ; Enzyme to substrate ratio of 1:50] at 37 ° C. for 12 hours. After thermodenatured chymotrypsin, aliquots of chymotrypsin-treated samples were further cleaved with trypsin at 37 ° C. for 12 hours (enzyme to substrate ratio of 1:50). Protein cleavage was finally stopped by adding 90% formic acid (final concentration of 5%). Micro-LC-MS / MS analysis was performed with chymotrypsin-treated samples or chymotrypsin / trypsin-treated samples. MS / MS spectra were investigated using TurboSequest against a homemade protein database containing human and mouse TLR4 sequences. Bioworks version 3.1 was used to filter the findings, and the following Xcorr values and filtering criteria were applied for peptides of different charge states: 1.8 for single charged peptides; 2.5 for a bivalent peptide; For trivalent peptides, 3.5; And 0.08 for ΔCn peptide in all charge states.

혈청 사이토카인의 분석Analysis of Serum Cytokines

암컷 C57BL/6 마우스에 LPS(7.5 mg/kg)를 복강 내 주사하기 24시간 및 1시간전에 대조군(vehicle; PBS) 또는 SFN(25 mg/kg)을 구강을 통해 투여하였다. LPS 주사 2시간 후 혈액을 눈뒤 출혈(retro-orbital bleeding)을 통해 수득하여 상온에서 응고시켰다. 혈청을 원심분리로 분리하고 분석 전까지 -80℃에 저장하였다. 사이토카인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 농도를 제조자의 지시에 따라 각 사이토카인에 특이적인 Quantikine ELISA 키트(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 이용하여 측정하였다.
Female C57BL / 6 mice were administered orally with a control vehicle (PBS) or SFN (25 mg / kg) 24 and 1 hour prior to intraperitoneal injection of LPS (7.5 mg / kg). Two hours after LPS injection, blood was obtained through retro-orbital bleeding and coagulated at room temperature. Serum was separated by centrifugation and stored at −80 ° C. until analysis. The concentrations of cytokines TNF-α, IL-1β and IL-6 were measured using a Quantikine ELISA kit (R & D Systems, Minneapolis, MN) specific for each cytokine according to the manufacturer's instructions.

인 비보 피부 염증 실험In vivo skin inflammation experiment

암컷 BALB/c 마우스의 오른쪽 귀 중앙에 LPS(50 ㎍/25 ㎕ in PBS)를 피내 주사 24시간 및 1시간 전, 및 6시간 후에 대조군(3% DMSO를 포함한 PBS) 또는 SFN(10 및 30 mg/kg) 또는 인도메타신(3 mg/kg)을 구강으로 투여하였다. LPS-유도된 염증 및 부종의 평가하기 위해, LPS를 주사하고 24시간 후에 양쪽 귀의 6-mm 생시료를 수득하여 무게를 측정하였다. 비-처리된 왼쪽 귀를 개개의 변이의 표준화를 위해 이용하였고 왼쪽 귀에 대한 오른쪽 귀의 비를 귀 부종값(ear swelling values)으로 제시하였다. 무게를 측정한 후, 생체검사 조직(biopsy tissues)을 고정하고 처리군에 대해 알지 못하는 조직학자에 의해 조직학적 조사를 위한 H&E 염색을 실시하였다.
Controls (PBS with 3% DMSO) or SFN (10 and 30 mg) 24 hours and 1 hour before and 6 hours after intradermal injection of LPS (50 μg / 25 μl in PBS) in the center of the right ear of female BALB / c mice / kg) or indomethacin (3 mg / kg) was administered orally. To assess LPS-induced inflammation and edema, 24 hours after injection of LPS, 6-mm raw samples of both ears were obtained and weighed. The untreated left ear was used for standardization of individual variations and the ratio of right ear to left ear was presented as ear swelling values. After weighing, biopsy tissues were fixed and H & E stained for histological examination by histologists unknown to the treatment group.

통계 분석Statistical analysis

면역블롯 데이터를 세 번 이상의 독립적인 실험들로부터 도출된 대표적인 도면과 함께 제시하였다. 다른 데이터는 평균값 ± 표준오차로 표현하였다. 그룹들 간의 차이는 Student t 검정(p < 0.05인 경우, 유의적으로 평가함)으로 분석하였다.
Immunoblot data is presented along with representative figures derived from three or more independent experiments. Other data are expressed as mean ± standard error. Differences between groups were analyzed by the Student t test (significantly assessed when p <0.05).

실험결과Experiment result

SFN은 TLR4의 리간드-의존성 및 -비의존성 활성화를 억제한다SFN Inhibits Ligand-Dependent and -Independent Activation of TLR4

SFN이 TLR4 활성화를 조절하는 지 여부를 조사하기 위해, 대식세포(RAW264.7)세포를 SFN의 존재 하에서 대표적인 TLR4 아고니스트인 LPS로 자극시킨 후, 다운스트림 시그널링 분자의 활성화 및 염증 유전자의 발현을 조사하였다.To investigate whether SFN regulates TLR4 activation, macrophages (RAW264.7) cells are stimulated with LPS, a representative TLR4 agonist in the presence of SFN, followed by activation of downstream signaling molecules and expression of inflammatory genes. Investigate.

리간드에 의한 TLR4의 활성화는 MyD88의 회귀를 야기하는데, MyD88은 IRAK-4 및 IRAK-1과 복합체를 형성하여 IRAK-1의 인산화 및 분해를 초래한다. 따라서, IRAK-1 분해는 TLR4 활성화의 초기 이벤트에 대한 표지들(readouts) 중 하나이다. 대식세포에서 SFN은 LPS에 의해 유도된 IRAK-1 분해를 차단하였다(도 1A). 또한, NF-κB 결합 위치 또는 IRF3 결합위치(IFN-β PRDIII-I)를 포함하는 루시퍼라제 리포터 유전자를 이용한 리포터 어세이(도 1B-1C)에 의해 확인된 바와 같이, SFN은 LPS-유도된 전사인자들[예컨대, NF-κB 및 IFN 조절 인자 3(IRF3)]의 활성화를 억제하였다. 또한, LPS-유도된 COX-2 발현이 SFN에 의해 감소되었다(도 1D). 상술한 결과들은 SFN이 리간드-유도된 TLR4의 활성화를 억제한다는 것을 보여주었다.Activation of TLR4 by the ligand causes regression of MyD88, which MyD88 complexes with IRAK-4 and IRAK-1 resulting in phosphorylation and degradation of IRAK-1. Thus, IRAK-1 degradation is one of the readouts for early events of TLR4 activation. SFNs in macrophages blocked IRAK-1 degradation induced by LPS (FIG. 1A). In addition, SFN is LPS-induced, as confirmed by the reporter assay (FIG. 1B-1C) using a luciferase reporter gene comprising an NF-κB binding site or an IRF3 binding site (IFN-β PRDIII-I). The activation of transcription factors (eg, NF-κB and IFN regulatory factor 3 (IRF3)) was inhibited. In addition, LPS-induced COX-2 expression was reduced by SFN (FIG. 1D). The above results showed that SFN inhibits the activation of ligand-induced TLR4.

TLR4의 세포외 도메인의 CD4 대체는 리간드 없이 지속적으로 NF-κB를 활성화시켰으며(21), 야생형 TLR4의 과다발현을 통해 세포내 시그널링 경로를 활성화시키기 위한 리간드가 필요하지 않게 되었다. 따라서, 본 발명자들은 SFN이 TLR4의 리간드-비의존성 활성화를 억제할 수 있는 지 여부를 결정하기 위해 SFN의 존재 하에서 CD4-TLR4 또는 TLR4(WT)으로 자극된 TLR4 시그널링의 활성화를 조사하였다. SFN은 293T 세포에서 지속적으로 활성화된 TLR4(CD4-TLR4) 또는 TLR4(WT)의 과다발현에 의해 유도된 NF-κB 활성화를 억제하였다(도 2A-2B). 또한, CD4-TLR4에 의해 유도된 IRF3 활성화가 RAW264.7 세포에서 SFN에 의해 감소되었다(도 2C).CD4 replacement of the extracellular domain of TLR4 continued to activate NF-κB without ligand (21) and eliminated the need for ligands to activate intracellular signaling pathways through overexpression of wild type TLR4. Thus, we investigated the activation of TLR4 signaling stimulated with CD4-TLR4 or TLR4 (WT) in the presence of SFN to determine whether SFN can inhibit ligand-independent activation of TLR4. SFN inhibited NF-κB activation induced by overexpression of persistently activated TLR4 (CD4-TLR4) or TLR4 (WT) in 293T cells (FIGS. 2A-2B). In addition, IRF3 activation induced by CD4-TLR4 was reduced by SFN in RAW264.7 cells (FIG. 2C).

상술한 결과들을 통해, SFN이 TLR4의 리간드-의존성 및 리간드-비의존성 활성화를 억제할 수 있다는 것을 알 수 있었다. 더 나아가, 상술한 결과들은 SFN의 억제 타겟이 리간드와 수용체 간의 상호작용 부위가 아닐 수 있다는 것을 의미한다.
From the above results, it was found that SFN can inhibit ligand-dependent and ligand-independent activation of TLR4. Furthermore, the results described above mean that the inhibitory target of SFN may not be the site of interaction between the ligand and the receptor.

SFN은 다운스트림 시그널링의 MyD88- 및 IKKβ-유도된 활성화를 억제하지만, TRIF- 및 TBK1-유도된 활성화를 억제하지 않는다SFN inhibits MyD88- and IKKβ-induced activation of downstream signaling but does not inhibit TRIF- and TBK1-induced activation

TLR4 시그널링 경로에서 SFN의 항-염증 타겟을 동정하기 위해, 본 발명자들은 SFN에 의해 영향받는 다운스트림 시그널링 분자를 조사하였다. 일반적으로, TLR4 시그널링 경로는 MyD88-의존성 경로와 TRIF-의존성 경로로 구성된다. TLR4의 MyD88 경로는 IKKβ 복합체의 활성화를 통해 NF-κB의 활성화를 야기하는 반면에, TLR4의 TRIF 경로는 TBK1/IKKε의 활성화를 통해 IRF3의 활성화를 초래한다. SFN이 MyD88-의존성 경로 또는 TRIF-의존성 경로에 영향을 미치는 지 여부를 확인하기 위해, 293T 세포에 각각 MyD88 경로의 NF-κB 리포터 유전자 및 TRIF 경로의 IRF3 리포터 유전자와 융합된 시그널링 구성성분을 트랜스펙션시켰다. SFN은 293T 세포에서 MyD88 또는 IKKβ의 과다발현에 의해 유도된 NF-κB의 활성화를 차단하였는데(도 3A-3B), 이는 SFN의 타겟이 MyD88 경로에 존재한다는 것을 의미한다. SFN이 IKKβ의 키나제 활성 및 NF-κB의 DNA 결합능을 직접적으로 억제한다는 것이 보고되었다(2). 따라서, 상술한 결과들은 MyD88- 또는 IKKβ-유도된 NF-κB의 활성화에 대한 SFN의 억제 활성을 의미할 수 있다.To identify anti-inflammatory targets of SFN in the TLR4 signaling pathway, we examined downstream signaling molecules affected by SFN. In general, the TLR4 signaling pathway consists of a MyD88-dependent pathway and a TRIF-dependent pathway. The MyD88 pathway of TLR4 leads to the activation of NF-κB through the activation of the IKKβ complex, while the TRIF pathway of TLR4 leads to the activation of IRF3 through the activation of TBK1 / IKKε. To determine whether SFN affects MyD88-dependent or TRIF-dependent pathways, 293T cells were transfected with signaling components fused with the NF-κB reporter gene of the MyD88 pathway and the IRF3 reporter gene of the TRIF pathway, respectively. Sean. SFN blocked the activation of NF-κB induced by overexpression of MyD88 or IKKβ in 293T cells (Figures 3A-3B), indicating that the target of SFN is in the MyD88 pathway. It has been reported that SFN directly inhibits the kinase activity of IKKβ and the DNA binding capacity of NF-κB (2). Therefore, the above results may refer to the inhibitory activity of SFN on the activation of MyD88- or IKKβ-induced NF-κB.

이와 대조적으로, SFN은 TRIF의 과다발현에 의해 유도된 IRF3의 활성화를 억제하지 못 했다(도 3C). 더 나아가, SFN은 TRIF의 다운스트림에 존재하는 키나제인 TBK1에 의해 유도된 IRF3의 활성화를 억제하지 않았다(도 3D). 상술한 결과들은 SFN의 타겟이 TRIF 또는 TRIF의 다운스트림 시그널링 구성성분이 아니라는 것을 의미한다. 비록 SFN이 TRIF- 및 TBK1-유도된 IRF3 활성화를 억제하지 않을 지라도, SFN은 TLR4 리간드(예: LPS)- 및 TLR4(CD4-TLR4)-유도된 IFR3의 활성화를 억제할 수 있었다(도 1C 및 도 2C). 따라서, 상술한 결과는 SFN이 IKKβ 및 NF-κB 이외에도 TRIF의 업스트림에 존재하는 다른 억제 타겟을 가질 수 있다는 것을 의미하며, 예를 들어 SFN의 또 다른 억제 타겟은 수용체 레벨에서의 타겟일 수 있다.
In contrast, SFN did not inhibit the activation of IRF3 induced by overexpression of TRIF (FIG. 3C). Furthermore, SFN did not inhibit the activation of IRF3 induced by TBK1, a kinase present downstream of TRIF (FIG. 3D). The above results mean that the target of the SFN is not TRIF or a downstream signaling component of TRIF. Although SFN did not inhibit TRIF- and TBK1-induced IRF3 activation, SFN could inhibit the activation of TLR4 ligands (eg LPS)-and TLR4 (CD4-TLR4) -induced IFR3 (FIG. 1C and 2C). Thus, the above results indicate that SFN may have other inhibitory targets present upstream of TRIF in addition to IKKβ and NF-κB, for example another inhibitory target of SFN may be a target at the receptor level.

SFN은 티올-의존적으로 TLR의 올리고머화를 억제한다SFN inhibits thiol-dependent oligomerization of TLRs

수용체 올리고머화는 TLR4의 활성화 및 세포내 시그널링 경로를 유도하는 개시 단계들 중 하나이다(15, 22). TLR4의 올리고머화는 세포외 자극들을 세포내 시그널링 이벤트로 전달하는 다운스트림 시그널링 분자들의 통합(association)을 위한 세포질 플랫폼을 제공한다. 따라서, 본 발명자들은 SFN이 TLR4의 올리고머화에 어떠한 영향을 미치는 지 조사하기 위해 Flag-TLR4 및 GFP-TLR4 모두를 안정적으로 발현하는 BaF3 세포를 이용한 면역침전 연구를 실시하였다. LPS 자극 후, GFP-TLR4를 Flag-TLR4와 공동-면역침전시켰는데, 그 결과 Flag-TLR4와 GFP-TLR4의 결합(association)을 통해 올리고머를 형성하였다. SFN은 LPS-유도된 Flag-TLR4와 GFP-TLR4의 결합을 약화시켰는데, 이는 SFN이 TLR4의 리간드-유도된 올리고머화를 억제하였다는 것을 의미한다(도 4A). 또한, NF-κB 활성화 상에 SFN의 억제 효과는 동일한 Ba/F3 세포에서도 관찰되었다(도 4B).Receptor oligomerization is one of the initiating steps leading to activation of TLR4 and intracellular signaling pathways (15, 22). Oligomerization of TLR4 provides a cytoplasmic platform for the association of downstream signaling molecules that deliver extracellular stimuli into intracellular signaling events. Therefore, we conducted an immunoprecipitation study using BaF3 cells stably expressing both Flag-TLR4 and GFP-TLR4 to examine how SFN affects oligomerization of TLR4. After LPS stimulation, GFP-TLR4 co-immunoprecipitated with Flag-TLR4, resulting in oligomer formation through association of Flag-TLR4 with GFP-TLR4. SFN attenuated the binding of LPS-induced Flag-TLR4 and GFP-TLR4, meaning that SFN inhibited ligand-induced oligomerization of TLR4 (FIG. 4A). In addition, the inhibitory effect of SFN on NF-κB activation was also observed in the same Ba / F3 cells (FIG. 4B).

본 발명자들은 SFN이 TLR4의 리간드-비의존성 올리고머화를 억제하는 지 여부는 추가적으로 조사하기 위해 지속적인 활성을 가지고 리간드 자극 없이 올리고머를 형성할 수 있는 HA-태깅된 또는 Flag-태깅된 절단형 TLR4(ΔTLR4)(18)를 이용한 면역침전 어세이를 실시하였다. SFN은 ΔTLR4에 의해 유도된 TLR4 올리고머화 및 NF-κB 활성화를 억제하였다(도 4C-4D). 상술한 결과들은 SFN이 TLR4의 리간드-의존성 및 리간드-비의존성 올리고머화 모두를 억제한다는 것을 보여줬다. 더 나아가, 상술한 결과들은 SFN에 의한 NF-κB 활성화의 약화는 NF-κB의 직접적인 억제 외에도 수용체 올리고머화 상에 억제 효과를 초래한다는 것을 의미한다.In order to further investigate whether SFN inhibits ligand-independent oligomerization of TLR4, we have HA-tagged or flag-tagged truncated TLR4 (ΔTLR4) that can form oligomers with sustained activity and without ligand stimulation. (18) was used for immunoprecipitation assay. SFN inhibited TLR4 oligomerization and NF-κB activation induced by ΔTLR4 (FIGS. 4C-4D). The above results showed that SFN inhibits both ligand-dependent and ligand-independent oligomerization of TLR4. Furthermore, the above results indicate that attenuation of NF-κB activation by SFN results in an inhibitory effect on receptor oligomerization in addition to direct inhibition of NF-κB.

SFN은 단백질 내의 설프하이드릴 모이어티와 상호작용한다는 것이 잘 알려져 있기 때문에(23), 본 발명자들은 SFN이 TLR4 단백질 내의 시스테인들과 상호작용하는 지 여부를 조사하였다. SFN을 정제된 인간 TLR4의 세포외 도메인(27-631 아미노산) 또는 마우스 TLR4의 세포외 도메인(26-629 아미노산)과 반응시켜 마이크로-LC-MS/MS 분석을 이용하여 어덕트(adducts)의 형성을 조사하였다. SFN은 각 세포외 도메인에 존재하는 16개의 시스테인들 중 인간 TLR4의 88, 192, 246, 281, 340, 506, 542 및 609번째 시스테인 및 마우스 TLR4의 87, 164, 245, 280, 504, 549 및 606번째 시스테인과 어덕트를 형성하였다(표 1). 상술한 시스테인들 중, 인간 TLR4의 88, 192, 246, 340, 506 및 542번째 시스테인 및 마우스 TLR4의 164, 245, 504 및 549번째 시스테인은 자유 시스테인이고 다른 시스테인들은 다이설파이드 결합을 이루고 있다. 상술한 결과들은 SFN이 TLR4의 세포외 도메인 상의 시스테인 잔기들과 결합할 수 있다는 것을 보여줬다. 본 발명자들은 SFN에 의한 TLR4 올리고머화의 억제가 설프하이드릴 그룹과의 반응성에 의존적인지 여부를 조사하였다. 티올 도우너인 DTT 또는 N-아세틸-L-시스테인(NAC)의 처리는 TLR4 올리고머화 및 NF-κB 활성화 상에 SFN의 억제 효과를 차단하였다(도 5). 상술한 결과는 TLR4 활성화 상에 SFN의 억제 효과가 설프하이드릴 모이어티에 대한 반응성에 기인한다는 것을 의미한다. 일치된 결과로, 다른 티올-반응성 화합물인 파테놀리드(parthenolide; 5 및 10 μM)도 LPS-유도된 TLR4 올리고머화 및 NF-κB 활성화를 현저하게 감소시켰다(도 6A-6B). 에타크린산(ethacrynic acid, EA)은 상대적으로 높은 농도인 50 및 100 μM에서 LPS-유도된 TLR4 올리고머화를 약하게 약화시킨 반명에, 동일한 농도에서 NF-κB 활성화를 뚜렷하게 감소시켰다(도 6C-6D).Since it is well known that SFN interacts with the sulfhydryl moiety in the protein (23), we investigated whether SFN interacts with cysteines in the TLR4 protein. SFN is reacted with purified extracellular domain (27-631 amino acids) of mouse TLR4 or extracellular domain of mouse TLR4 (26-629 amino acids) to form adducts using micro-LC-MS / MS analysis Was investigated. SFN is the 88, 192, 246, 281, 340, 506, 542 and 609th cysteine of human TLR4 out of the 16 cysteines present in each extracellular domain and 87, 164, 245, 280, 504, 549 and mouse TLR4; Adducts were formed with the 606th cysteine (Table 1). Of the cysteines described above, the 88, 192, 246, 340, 506 and 542 th cysteine of human TLR4 and the 164, 245, 504 and 549 th cysteine of mouse TLR4 are free cysteines and other cysteines form disulfide bonds. The above results showed that SFN can bind cysteine residues on the extracellular domain of TLR4. We investigated whether inhibition of TLR4 oligomerization by SFN is dependent on reactivity with sulfhydryl groups. Treatment with thiol donors DTT or N-acetyl-L-cysteine (NAC) blocked the inhibitory effect of SFN on TLR4 oligomerization and NF-κB activation (FIG. 5). The above results indicate that the inhibitory effect of SFN on TLR4 activation is due to its reactivity to sulfhydryl moieties. In agreement, another thiol-reactive compound, parthenolide (5 and 10 μM), also significantly reduced LPS-induced TLR4 oligomerization and NF-κB activation (FIGS. 6A-6B). Ethacrynic acid (EA) significantly reduced NF-κB activation at the same concentrations, while weakly attenuating LPS-induced TLR4 oligomerization at relatively high concentrations of 50 and 100 μM (FIGS. 6C-6D). ).

SFN은 TLR4 세포외 도메인에 존재하는 시스테인과 어덕트를 형성한다.SFN forms an adduct with cysteines present in the TLR4 extracellular domain. 시료sample 결합 위치Combined position XcorrXcorr ΔCnΔCn 전하 상태Charge state 인간 TLR4Human TLR4 Cys88Cys88 4.0874.087 0.670.67 +2+2 Cys192Cys192 3.18733.1873 0.77250.7725 +2+2 Cys246Cys246 4.58034.5803 0.77520.7752 +3+3 Cys281Cys281 3.95853.9585 0.84890.8489 +2+2 Cys340Cys340 3.60123.6012 0.66990.6699 +2+2 Cys506Cys506 3.27173.2717 0.85290.8529 +2+2 Cys542Cys542 2.66852.6685 0.5640.564 +2+2 Cys609Cys609 2.97412.9741 0.62630.6263 +2+2 Mouse TLR4Mouse TLR4 Cys87Cys87 4.59864.5986 0.7040.704 +3+3 Cys164Cys164 2.95262.9526 0.82350.8235 +2+2 Cys245Cys245 3.05173.0517 0.74910.7491 +2+2 Cys280Cys280 4.89844.8984 0.7360.736 +3+3 Cys504Cys504 3.6543.654 0.63140.6314 +2+2 Cys549Cys549 3.25683.2568 0.71030.7103 +2+2 Cys606Cys606 3.7173.717 0.62360.6236 +2+2

SFN은 항산화제 및 제II상 해독 효소들을 유도하는 keap-1/Nrf2 경로를 활성화시키는 것으로 잘 알려져 있다. Nrf2가 TLR4-의존성 시그널링 상에 SFN의 억제 효능에 포함되어 있는 지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 야생형 또는 Nrf2-넉아웃(KO) 마우스로부터 유래한 마우스 배아 섬유아세포(MEFs)에서 TLR4-의존성 시그널링 상에 SFN의 효과를 분석하였다. LPS-유도된 NF-κB 활성화 및 Akt 인산화 상에 SFN의 억제 효과가 야생형 MEFs 뿐만 아니라 Nrf2-KO MEFs에서 유사한 정도로 관찰되었다(도 7A-7B). 또한, SFN은 야생형 MEFs 및 Nrf2-KO MEFs 모두에서 항상 활성을 지니는 TLR4-유도된 NF-κB 활성화를 유사한 정도로 억제하였다(도 7C). 상술한 결과들은 Nrf2의 KO가 TLR4-의존성 시그널링 상에 SFN의 억제 효과를 차단하지 않는다는 것을 나타낸다.SFN is well known to activate the keap-1 / Nrf2 pathway leading to antioxidant and phase II detoxifying enzymes. To investigate whether Nrf2 is involved in the inhibitory potency of SFN on TLR4-dependent signaling, we determined TLR4-dependent in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) derived from wild-type or Nrf2-knockout (KO) mice. The effect of SFN on signaling was analyzed. Inhibitory effects of SFN on LPS-induced NF-κB activation and Akt phosphorylation were observed to a similar extent in Nrf2-KO MEFs as well as wild-type MEFs (FIGS. 7A-7B). In addition, SFN inhibited to a similar extent TLR4-induced NF-κB activation, which is always active in both wild-type MEFs and Nrf2-KO MEFs (FIG. 7C). The above results indicate that KO of Nrf2 does not block the inhibitory effect of SFN on TLR4-dependent signaling.

종합해 보면, 본 발명자들의 결과들은 SFN이 TLR4의 올리고머화를 티올-의존적으로 억제하고, 이는 다운스트림 시그널링 경로의 활성화 및 타겟 유전자 발현 상에 감소를 초래한다는 것을 증명하였다.
Taken together, our results demonstrate that SFN inhibits oligomerization of TLR4 thiol-dependently, leading to a decrease in activation of downstream signaling pathways and target gene expression.

SFN은 염증 동물 모델에서 LPS-유도된 염증을 인 비보에서 약화시킨다SFN attenuates in vivo the LPS-induced inflammation in an inflammatory animal model

SFN이 인 비보 LPS 시그널링 상에서 유사한 억제 효과를 나타내는 지 여부를 조사하기 위해, SFN 처리되거나 또는 처리되지 않은 마우스에 LPS를 주입한 후, 사이토카인의 혈청 레벨을 측정하였다. 마우스에 LPS를 처리한 경우, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 같은 염증성 사이토카인의 혈청 레벨이 현저하게 증가된 반면에, 마우스에 SFN을 경구 투여한 경우에는 증가된 사이토카인의 생산이 크게 감소되었다(도 8). LPS 시그널링 상에 SFN의 인 비보 억제 효과를 다시 한번 검증하기 위해, 본 발명자들은 LPS-유도된 피부 염증 동물 모델을 이용하였다. 피부 염증은 마우스 오른쪽 귀의 중앙에 LPS를 피내 주입하여 유도하고 24시간 후, LPS-유도된 염증 및 부종의 평가를 위해 귀를 수득하여 조사하였다. 증가된 귀 무게에서 볼 수 있듯이, LPS 주입은 귀 부종을 유도하였다. 하지만, SFN의 경구 투여는 귀 부종 및 무게를 감소시켰다(도 9A). 조직학적 분석을 통해, LPS가 주입된 귀는 중간 정도의 피부 염증 및 심각한 부종을 나타냈으며 SFN이 처리된 귀는 최소한 내지 약한 피부 염증 및 최소한의 부종을 나타냈다(도 9B). LPS-유도된 귀 피부 염증에 대한 SFN의 보호 효과는 잘 알려진 비-스테로이드계 항-염증 약물인 인도메타신(양성 대조군)의 효과만큼 아주 강력하였다. 상술한 결과들을 종합해 보면, SFN에 의한 TLR4 시그널링의 차단은 염증성 사이토카인의 감소된 생산을 초래하였으며, 실험적 염증 동물 모델에서 피부 염증 및 부종의 감소를 인 비보에서 야기하였다.
To investigate whether SFN exhibited similar inhibitory effects on in vivo LPS signaling, serum levels of cytokines were measured after LPS injection into mice treated with or without SFN. When mice were treated with LPS, serum levels of inflammatory cytokines such as TNF-α, IL-1β, and IL-6 were markedly increased, whereas increased oral cytokine production was observed with oral administration of SFN to mice. It was greatly reduced (FIG. 8). To once again validate the in vivo inhibitory effect of SFN on LPS signaling, we used an LPS-derived skin inflammation animal model. Skin inflammation was induced by intradermal injection of LPS in the middle of the right ear of the mouse and examined 24 hours after the ear was obtained for evaluation of LPS-induced inflammation and edema. As can be seen from the increased ear weight, LPS injection induced ear edema. However, oral administration of SFN reduced ear edema and weight (FIG. 9A). Histological analysis showed that the ears injected with LPS showed moderate skin irritation and severe edema, while the SFN treated ears showed at least to mild skin irritation and minimal edema (FIG. 9B). The protective effect of SFN against LPS-induced ear skin inflammation was just as strong as that of indomethacin (positive control), a well-known non-steroidal anti-inflammatory drug. Taken together, the blockade of TLR4 signaling by SFN resulted in reduced production of inflammatory cytokines and in vivo reduced skin inflammation and edema in experimental inflammatory animal models.

추가논의사항 Additional discussion

SFN은 항암 또는 항-염증 활성을 나타내기 위해 다양한 세포내 타겟을 가지는 것으로 알려져 왔다. SFN의 항-염증 활성은 NF-κB 활성화 상에 억제 효과로 부분적으로 설명되었다. SFN은 전립선 암세포주에서 NF-κB의 전사 활성, p65의 핵전이(nuclear translocation), IκBα의 분해 및 IKKβ 키나제 활성을 억제하였다(24). 브로콜리 식이된 동물의 심장 심실 및 신장 수질에서 NF-κB의 핵전이 감소가 보고되었다(6). SFN은 LPS-자극된 우대동맥 내피세포(ECs)에서 NF-κB 전이 및 IκBα 분해 모두를 억제한 반면에(5), SFN은 LPS-자극된 대식세포에서 NF-κB의 핵전이 및 IκBα의 분해를 방해하지 않고 NF-κB의 DNA 결합을 억제하였다(2). 비록 NF-κB 억제 기작이 세포/조직 및 자극에 따라 다양할 지라도, 상술한 결과들은 NF-κB의 활성화가 SFN에 의해 억제되었다는 것을 의미한다. 그럼에도 불구하고, 본 발명자들의 결과는 LPS, TLR4, MyD88 또는 IKKβ에 의해 유도된 NF-κB 활성화가 SFN에 의해 약화된다는 것을 일관되게 보여주었다. 본 연구에서 이용된 다양한 자극들에 상관없이 SFN에 의한 NF-κB의 하향조절은 TLR4 시그널링에서 NF-κB 활성화 상에 SFN의 억제 효과가 적어도 부분적으로는 IKKβ 및 NF-κB의 직접적인 억제에 기인할 수 있다는 것을 의미한다. 흥미롭게도, 본 발명자들의 결과는 SFN이 TRIF 및 TBK1 같은 다운스트림 분자들에 의해 유도된 IRF3 활성화를 억제하지 않는 반면에, LPS- 및 TLR4-유도된 IRF3 활성화를 억제하였다는 것을 보여줬다. 상술한 결과들은 SFN의 타겟이 IKKβ 및 NF-κB의 직접적인 억제 외에도 TRIF의 업스트림에 존재할 수 있다는 것을 의미한다. 이로 인해, 본 발명자들은 SFN이 수용체 올리고머화에 영향을 끼치는 지 여부를 신속하게 조사하였다. 본 발명자들의 결과는 SFN이 TLR4의 리간드-유도된 올리고머화 및 TLR4의 리간드-비의존적 올리고머화 모두를 억제한다는 것을 증명하였는데, 이는 TLR4 올리고머화가 SFN의 신규한 항-염증 타겟이라는 것을 의미한다. 수용체 올리고머화는 TLR 활성화의 개시 단계들 중 하나로, 이는 다운스트림 분자들의 활성화로 이어진다(15, 19, 25). TLR4는 TLR4와 상호작용하여 호모다이머를 형성한다(15, 22). TLR2는 리간드의 특성에 따라 TLR6 또는 TLR1과 결합하여 헤테로다이머를 형성한다(26, 27). TLR3 올리고머화는 dsRNA의 인식 및 이후 다운스트림 시그널링의 활성화를 필요로 한다(28, 29). TLR 모노머가 어느 정도 NF-κB 활성화를 유도할 수 있을 지라도, 올리고머화는 TLRs의 활성화를 최대화시킨다(22). 세포외 도메인이 CD4 또는 인테그린 사슬로 대체된 키메릭 TLRs의 강제된 올리고머화는 다운스트림 전사 인자의 리간드-비의존성 활성화를 초래하였다(21, 22). 따라서, 수용체 올리고머화는 TLRs의 최대 활성화를 유발하는 중요한 이벤트이다. 본 발명자들의 결과는 SFN이 TLR4 올리고머화를 억제하여 다운스트림 전사 인자들의 활성화 및 염증성 단백질의 발현을 감소시킨다는 것을 증명하였다. 더 나아가, 이는 수용체 올리고머화가 TLR 활성을 조절하는 효과적인 타겟일 수 있으며, TLR-관련된 염증성 질환들의 위험을 감소시키는 효율적인 타겟일 수 있다는 것을 의미한다. 비록 TLR4 올리고머화의 조절 및 이의 중요성은 이후 연구에서 인 비보로 추가적인 확인이 필요할 지라도, 본 발명자들의 인 비보 연구는 SFN의 구강 투여가 LPS-유도된 염증에 대한 보호 효과를 나타냈다는 것을 확인하였으며, 이는 TLR4 올리고머화 상에 SFN의 억제 효과가 인 비보에서 항-염증 반응을 중단시킬 수 있다는 것을 의미한다.SFN has been known to have various intracellular targets to exhibit anticancer or anti-inflammatory activity. The anti-inflammatory activity of SFN has been partly explained by its inhibitory effect on NF-κB activation. SFN inhibited the transcriptional activity of NF-κB, nuclear translocation of p65, degradation of IκBα and IKKβ kinase activity in prostate cancer cell lines (24). Reduced nuclear transfer of NF-κB has been reported in the ventricular and renal medulla of broccoli fed animals (6). SFN inhibited both NF-κB metastasis and IκBα degradation in LPS-stimulated right aortic endothelial cells (ECs) (5), whereas SFN inhibited nuclear transfer of NF-κB and degradation of IκBα in LPS-stimulated macrophages. DNA binding of NF-κB was inhibited without interfering with (2). Although the mechanism of NF-κB inhibition varies by cell / tissue and stimulus, the above results indicate that activation of NF-κB was inhibited by SFN. Nevertheless, our results consistently showed that NF-κB activation induced by LPS, TLR4, MyD88 or IKKβ was attenuated by SFN. Regardless of the various stimuli used in this study, downregulation of NF-κB by SFN was at least partially due to the direct inhibition of IKKβ and NF-κB by the inhibitory effect of SFN on NF-κB activation in TLR4 signaling. That means you can. Interestingly, our results showed that SFN did not inhibit IRF3 activation induced by downstream molecules such as TRIF and TBK1, whereas it inhibited LPS- and TLR4-induced IRF3 activation. The above results indicate that the target of SFN may be present upstream of TRIF in addition to direct inhibition of IKKβ and NF-κB. Because of this, we quickly investigated whether SFN influences receptor oligomerization. Our results demonstrated that SFN inhibits both ligand-induced oligomerization of TLR4 and ligand-independent oligomerization of TLR4, which means that TLR4 oligomerization is a novel anti-inflammatory target of SFN. Receptor oligomerization is one of the initiation steps of TLR activation, which leads to activation of downstream molecules (15, 19, 25). TLR4 interacts with TLR4 to form homodimers (15, 22). TLR2 binds to TLR6 or TLR1 depending on the nature of the ligand to form a heterodimer (26, 27). TLR3 oligomerization requires recognition of dsRNA and subsequent activation of downstream signaling (28, 29). Although TLR monomers may induce NF-κB activation to some extent, oligomerization maximizes the activation of TLRs (22). Forced oligomerization of chimeric TLRs with extracellular domains replaced with CD4 or integrin chains resulted in ligand-independent activation of downstream transcription factors (21, 22). Thus, receptor oligomerization is an important event that causes maximal activation of TLRs. Our results demonstrate that SFN inhibits TLR4 oligomerization to reduce activation of downstream transcription factors and expression of inflammatory proteins. Furthermore, this means that receptor oligomerization may be an effective target to modulate TLR activity and may be an efficient target to reduce the risk of TLR-related inflammatory diseases. Although the regulation of TLR4 oligomerization and its importance require further confirmation in vivo in future studies, our in vivo studies have shown that oral administration of SFN has shown a protective effect against LPS-induced inflammation, This means that the inhibitory effect of SFN on TLR4 oligomerization can disrupt the anti-inflammatory response in vivo .

SFN은 설프하이드릴-변형 활성을 가져 단백질 내의 티올과 SFN의 이소티오시아네이트 모이어티 간의 반응을 통해 티오노아실 어덕트를 형성한다(23). SFN은 일시적으로 세포내 글루타티온 레벨을 고갈시키는 것으로 알려져 왔다(5). SFN은 Keap1 단백질 내의 여러 시스테인 잔기를 변형시켜 Nrf2 활성화를 조절한다(23). 본 발명의 LC-MS/MS 분석에 따르면, TLR4의 세포외 도메인 내의 시스테인 잔기들과반응한 SFN이 어덕트를 형성하고 티올 도우너가 SFN-유도된 수용체 올리고머화 및 NF-κB 활성화의 손상을 역전시켰기 때문에, TLR4 올리고머화 상에 SFN의 억제 효과는 티올 그룹과의 반응성에 의존적이다. 이는 설프하이드릴 모이어티에 대한 SFN의 반응성이 수용체 올리고머화의 억제에 기여하는 인자들 중 하나이고 TLR4의 설프하이드릴 잔기의 변형을 통해 TLR4의 활성을 조절할 수 있다는 것을 의미한다. 일관되게도, 파테놀리드 및 에타크린산 같은 다른 티올-반응성 화합물들도 LPS-유도된 TLR4 올리고머화 및 NF-κB 활성화를 억제할 수 있었다. 또한, 본 발명자들의 이전 연구 결과에 따르면, 티올 그룹과 반응하는 아우라노핀(auranofin) 및 시남알데하이드(cinnamaldehyde)도 TLR4 올리고머화를 억제할 수 있었다(30, 31). TLR4 올리고머화를 억제하는 효능은 화합물의 특성에 따라 다른 것처럼 보인다. 본 연구에서, 본 발명자들은 티올-반응성 화합물이 TLR4 세포외 도메인의 시스테인 잔기들과 반응하여 어덕트를 형성한다는 것을 새로이 규명하였다. 이는 티올 변형이 TLR4 올리고머화를 조절함으로써 항-염증 치료법 개발을 위한 신규한 전략일 수 있다는 것을 의미한다. TLR 리간드의 이용이 세포외 도메인의 올리고머화를 유도함으로써 세포내 도메인으로 어뎁터의 회귀 및 다운스트림 시그널 전달을 개시한다는 것이 잘 알려져 있다(15, 19, 25, 29). TLR4 세포외 도메인의 완전한 소실이 활성 결핍을 초래할 지라도(32), 일부 세포외 도메인을 가지는 절단된 TLR4는 항상 활성화되어 과다발현될 경우 자발적으로 올리고머를 형성하였다(18, 33). 이는 수용체 올리고머의 형성 및 다운스트림 시그널링의 활성화에 있어서 세포외 도메인이 중요한 기능을 가진다는 것을 의미한다. 또한, 세포가 화학물질에 노출되었을 때 막 수용체의 세포외 도메인이 화학물질이 세포내 세포질 소기관(compartment)과 만나기 전에 화학물질과 접촉하는 첫 번째 타겟일 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 SFN이 TLR4의 세포외 도메인을 변형시킬 수 있는 지 여부를 집중적으로 조사하였다. 본 발명자들의 결과는 SFN이 TLR4 세포외 도메인 내의 시스테인 잔기들과 반응하여 어덕트를 형성한다는 것을 규명하였다. 올리고머 형성 과정에서 시스테인의 기능이 무엇인지, 그리고 SFN에 의한 변형이 TLR4 올리고머화의 억제와 직접적으로 연결되어 있는 지는 추가적인 연구가 필요하다. 또한, SFN이 TLR4의 다른 도메인 또는 수용체 복합체 내의 다른 분자들을 변형시킬 수 있으며, 이러한 이벤트들이 TLR4 시그널링 상에 SFN의 억제 효과에 기여할 가능성도 배제할 수 없다. DTT 및 NAC를 이용한 실험에 있어서, 본 발명자들은 이러한 환원제들이 자체적으로 TLR4 올리고머화 및 시그널링에 영향을 끼치지 않는 농도를 이용하였다(결과를 보이지 않음). 따라서, 이들 환원제들은 TLR4 보다는 SFN과 반응함으로써 SFN의 억제 효과를 차단한 것으로 보인다. 박 등(19)은 TLR4의 올리고머화가 다이설파이드 결합보다는 오히려 수소 결합, 소수성 및 친수성 상호작용 같은 비공유성 상호작용에 매우 의존적이라는 것을 밝혔다. LPS는 MD-2에서 거대 소수성 포켓에 결합하고 두 TLR4-MD-2 복합체들의 이합체화(dimerization)를 직접적으로 매개한다. 소수성 R2 지질 사슬은 TLR4의 두 개의 페닐알라닌(F440 및 F463) 및 하나의 루이신(L444)과 상호작용한다. MD-2의 소수성 잔기들(V82, M85, L87, I124 및 F126)은 소수성 계면(hydrophobic interface)에 관여한다(support). MD-2의 G123, K125 및 R90, 그리고 LPS R2 사슬의 3-하이드록시 그룹은 각각 TLR4의 S416, N417, E439 및 Q436와 수소 결합을 형성한다. 또한, LPS 내 두 개의 포스페이트 그룹도 TLR4 및 MD2 내의 양성 전하를 띠는 잔기들의 클러스터와 이온성 상호작용하여 수용체 다중결합(multimerization)에 기여한다. 또한, TLR4는 수소 결합 및 소수성 상호작용을 통해 세포외 도메인 내 C-말단 도메인의 중심 부위에서 다른 TLR4와 접촉하여 직접적인 이합체화를 이룬다. LC-MS/MS 분석에 의해 확인된 바와 같이, SFN이 TLR4 내의 많은 시스테인 잔기들과 결합하기 때문에 SFN에 의한 TLR4의 변형은 LPS, MD-2 및 TLR4 다이머들 간의 상호작용 상에 심대한 방해를 초래하여 올리고머화의 차단을 유발할 수 있다.SFN has sulfhydryl-modifying activity to form thionoacyl adducts through a reaction between thiol in the protein and the isothiocyanate moiety of SFN (23). SFN has been known to temporarily deplete intracellular glutathione levels (5). SFN modulates several cysteine residues in the Keap1 protein to regulate Nrf2 activation (23). According to the LC-MS / MS analysis of the present invention, SFN reacted with cysteine residues in the extracellular domain of TLR4 form an adduct and the thiol donor reverses impairment of SFN-induced receptor oligomerization and NF-κB activation. As such, the inhibitory effect of SFN on TLR4 oligomerization is dependent on its reactivity with thiol groups. This means that the reactivity of SFN to the sulfhydryl moiety is one of the factors contributing to the inhibition of receptor oligomerization and can modulate the activity of TLR4 through modification of the sulfhydryl residues of TLR4. Consistently, other thiol-reactive compounds such as patenolide and ethacrynic acid could also inhibit LPS-induced TLR4 oligomerization and NF-κB activation. In addition, according to the results of previous studies by the inventors, auranofin and acinamaldehyde reacting with thiol groups were also able to inhibit TLR4 oligomerization (30, 31). The efficacy of inhibiting TLR4 oligomerization appears to vary depending on the nature of the compound. In this study, we newly identified that thiol-reactive compounds react with cysteine residues of the TLR4 extracellular domain to form adducts. This means that thiol modification may be a novel strategy for developing anti-inflammatory therapies by modulating TLR4 oligomerization. It is well known that the use of TLR ligands initiates oligomerization of the extracellular domain to initiate regression of the adapter and downstream signal transduction into the intracellular domain (15, 19, 25, 29). Although complete loss of the TLR4 extracellular domain results in a lack of activity (32), truncated TLR4 with some extracellular domains always activated and spontaneously formed oligomers when overexpressed (18, 33). This means that the extracellular domain has important functions in the formation of receptor oligomers and activation of downstream signaling. In addition, when cells are exposed to a chemical, the extracellular domain of the membrane receptor may be the first target to contact the chemical before the chemical encounters the intracellular cytoplasmic compartment. Therefore, the present inventors have concentrated on whether SFN can modify the extracellular domain of TLR4. The results of the inventors revealed that SFN reacts with cysteine residues in the TLR4 extracellular domain to form an adduct. Further studies are needed to determine what the function of cysteine is in the oligomer formation process and whether the modification by SFN is directly linked to the inhibition of TLR4 oligomerization. In addition, it is not possible to exclude the possibility that SFN may modify other domains of TLR4 or other molecules in the receptor complex, and these events contribute to the inhibitory effect of SFN on TLR4 signaling. In experiments with DTT and NAC, we used concentrations where these reducing agents did not affect TLR4 oligomerization and signaling on their own (results not shown). Thus, these reducing agents appear to block the inhibitory effect of SFN by reacting with SFN rather than TLR4. Park et al. (19) found that oligomerization of TLR4 is highly dependent on noncovalent interactions such as hydrogen bonding, hydrophobic and hydrophilic interactions rather than disulfide bonds. LPS binds to large hydrophobic pockets in MD-2 and directly mediates the dimerization of the two TLR4-MD-2 complexes. The hydrophobic R2 lipid chain interacts with two phenylalanines (F440 and F463) and one leucine (L444) of TLR4. Hydrophobic residues of MD-2 (V82, M85, L87, I124 and F126) support the hydrophobic interface. The 3-hydroxy groups of the G123, K125 and R90 of MD-2, and the LPS R2 chain form hydrogen bonds with S416, N417, E439 and Q436 of TLR4, respectively. In addition, two phosphate groups in the LPS also ionic interact with clusters of positively charged residues in TLR4 and MD2, contributing to receptor multimerization. In addition, TLR4 forms direct dimerization by contacting other TLR4 at the central site of the C-terminal domain in the extracellular domain through hydrogen bonding and hydrophobic interactions. As confirmed by LC-MS / MS analysis, modification of TLR4 by SFN causes significant interference on the interaction between LPS, MD-2 and TLR4 dimers, as SFN binds to many cysteine residues in TLR4. This can lead to blocking of oligomerization.

SFN의 항-염증 활성은 종종 keap-1/Nrf2 경로의 활성화에 의해 설명된다. Lin 등(34)은 SFN이 Nrf2-의존적으로 염증 유전자들의 LPS-유도된 발현을 억제한다는 것을 보고하였다. 본 보고에 따르면, Nrf2-KO 마우스에서 TNF-α, IL-1β, COX-2 및 iNOS의 mRNA, 그리고 COX-2 및 iNOS의 단백질에 대한 SFN의 억제 효과가 차단되었다. 하지만, 비록 Nrf2-KO 대식세포에서 SFN의 억제효과의 정도가 야생형 세포에 비해 매우 작을지라도, IL-1β, PGE2 및 아질산염(nitrite)의 생산 상에 SFN의 억제 효과는 여전히 관찰되었다. 본 발명자들의 결과에 따르면, TLR4 시그널링 상에 SFN의 억제 효과가 야생형 MEFs 뿐만 아니라, Nrf2-KO MEFs에서도 여전히 관찰되었다. 이는 Nrf2 활성화 이외에도 다른 기작들이 TLR4-매개된 시그널링 상에 SFN의 항-염증 활성에 기능한다는 것을 의미한다. 상술한 결과들을 종합해 보면, 본 발명자들의 결과는 TLR4 올리고머화를 SFN의 항-염증 활성에 대한 신규한 분자 타겟으로 제시한다. TLR4는 폐혈증, 동맥경화증, 인슐린 저항성, 비만 및 암을 포함하는 다양한 염증 상태와 밀접하게 연관되어 있다. 따라서, SFN에 의한 TLR4 활성의 조절은 만성 질환들의 발병 상에 유익한 효능을 발휘할 수 있을 것이다.
Anti-inflammatory activity of SFN is often explained by activation of the keap-1 / Nrf2 pathway. Lin et al. (34) reported that SFN inhibits LPS-induced expression of inflammatory genes Nrf2-dependently. According to this report, the inhibitory effects of SFN on the mRNAs of TNF-α, IL-1β, COX-2 and iNOS, and proteins of COX-2 and iNOS were blocked in Nrf2-KO mice. However, although the extent of the inhibitory effect of SFN in Nrf2-KO macrophages was very small compared to wild type cells, the inhibitory effect of SFN was still observed on the production of IL-1β, PGE 2 and nitrite. According to our results, the inhibitory effect of SFN on TLR4 signaling was still observed in wild type MEFs as well as Nrf2-KO MEFs. This means that in addition to Nrf2 activation, other mechanisms function on the anti-inflammatory activity of SFN on TLR4-mediated signaling. Taken together, the results of the present inventors suggest that TLR4 oligomerization is a novel molecular target for the anti-inflammatory activity of SFN. TLR4 is closely associated with various inflammatory conditions, including pneumonia, atherosclerosis, insulin resistance, obesity and cancer. Thus, regulation of TLR4 activity by SFN may exert beneficial effects on the onset of chronic diseases.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명 의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and equivalents thereof.

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Claims (15)

다음 단계를 포함하는 TLR4(Toll-like receptor 4) 시그널링 억제제를 스크리닝 하는 방법:
(a) TLR4(Toll-like receptor 4) 또는 TLR4 세포외 도메인을 포함하는 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 시험물질이 TLR4의 세포외 도메인에 있는 시스테인 잔기에 공유결합하는 지 여부를 분석하는 단계를 포함하며, 상기 시험물질이 TLR4의 세포외 도메인에 있는 시스테인 잔기에 공유결합 하는 경우에는 TLR4 올리고머화를 억제하여 TLR4 시그널링 억제제로 판단한다.
A method for screening a Toll-like receptor 4 (TLR4) signaling inhibitor comprising the following steps:
(a) contacting a test substance with a cell comprising a TLR4 (Toll-like receptor 4) or a TLR4 extracellular domain; And
(b) analyzing whether the test substance covalently binds to a cysteine residue in the extracellular domain of TLR4, and when the test substance covalently binds to a cysteine residue in the extracellular domain of TLR4 Inhibits oligomerization to determine TLR4 signaling inhibitors.
제 1 항에 있어서, 상기 시험물질은 TLR4의 세포외 도메인에 존재하는 시스테인 잔기와 반응하여 어덕트(adducts)를 형성하는 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 1, wherein the test substance reacts with cysteine residues present in the extracellular domain of TLR4 to form adducts.
제 1 항에 있어서, 상기 시험물질에 의해 변형되는 TLR4 세포외 도메인의 시스테인 잔기는 인간 TLR4의 88, 192, 246, 281, 340, 506, 542 및 609번째 시스테인 잔기인 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 1, wherein the cysteine residues of the TLR4 extracellular domain modified by the test substance are 88, 192, 246, 281, 340, 506, 542, and 609th cysteine residues of human TLR4.
제 1 항에 있어서, 상기 시험물질은 티올-반응성(thiol-reactive) 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 1 wherein the test substance is a thiol-reactive compound.
제 4 항에 있어서, 상기 티올-반응성 화합물은 SFN인 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 4, wherein the thiol-reactive compound is SFN.
제 1 항에 있어서, 상기 시험물질은 리간드-의존성 및 리간드-비의존성 TLR4 올리고머화를 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 1, wherein the test substance inhibits ligand-dependent and ligand-independent TLR4 oligomerization.
제 1 항에 있어서, 상기 시험물질은 LPS(lipopolysaccharide)-, TLR4-, MyD88- 및 IKKβ(IκB kinase β)-유도된 NF-κB 활성화를 억제시키는 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 1, wherein the test substance inhibits lipopolysaccharide (LPS)-, TLR4-, MyD88-, and IκB kinase β-induced NF-κB activation.
제 1 항에 있어서, 상기 시험물질은 LPS- 및 TLR4-유도된 IRF3(interferon regulatory factor 3) 활성화를 억제시키는 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 1, wherein the test substance inhibits LPS- and TLR4-induced interferon regulatory factor 3 (IRF3) activation.
제 1 항에 있어서, 상기 시험물질은 친-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인의 생산을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 1, wherein the test substance reduces the production of pro-inflammatory cytokines.
제 9 항에 있어서, 상기 친-염증성 사이토카인은 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL(interleukin)-1β 또는 IL-6인 것을 특징으로 하는 방법.
10. The method of claim 9, wherein the pro-inflammatory cytokine is tumor necrosis factor-α, interleukin-1β, or IL-6.
제 1 항에 있어서, 상기 시험물질은 염증성 질환을 치료할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 1, wherein the test substance is capable of treating an inflammatory disease.
제 11 항에 있어서, 상기 염증성 질환은 천식, 습진, 건선, 알러지, 류마티스 관절염, 건선 관절염(psoriatic arthritis), 접촉성 피부염(contact dermatitis), 아토피성 피부염, 여드름, 아토피성 비염, 알레르기성 피부염, 만성 부비동염, 지루성 피부염(seborrheic dermatitis), 위염, 통풍, 통풍 관절염, 궤양, 만성 기관지염, 폐염증, 크론병, 궤양성 대장염, 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 패혈증, 맥관염, 활액낭염, 루프스, 류마티스 다발성 근육통, 측두 동맥염, 다발성 경화증, 고형암, 알쯔하이머병, 동맥경화증, 비만 또는 바이러스 감염인 것을 특징으로 하는 방법.
The method of claim 11, wherein the inflammatory disease is asthma, eczema, psoriasis, allergy, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, contact dermatitis, atopic dermatitis, acne, atopic rhinitis, allergic dermatitis, Chronic sinusitis, seborrheic dermatitis, gastritis, gout, gout arthritis, ulcers, chronic bronchitis, pneumonia, Crohn's disease, ulcerative colitis, ankylosing spondylitis, sepsis, vasculitis, bursitis, lupus, rheumatoid Muscle pain, temporal arteritis, multiple sclerosis, solid cancer, Alzheimer's disease, arteriosclerosis, obesity or viral infection.
다음 단계를 포함하는 TLR4(Toll-like receptor 4) 시그널링 억제제의 효능 증진제를 스크리닝 하는 방법:
(a) TLR4(Toll-like receptor 4) 또는 TLR4 세포외 도메인을 포함하는 세포에 TLR4 시그널링 억제제 및 시험물질을 접촉시키는 단계;
(b) 대조군으로서 TLR4 또는 TLR4 세포외 도메인을 포함하는 세포에 TLR4 시그널링 억제제를 접촉시키는 단계; 및
(c) 상기 단계 (a) 및 (b)에서 상기 TLR4 시그널링 억제제가 TLR4의 세포외 도메인에 있는 시스테인 잔기에 공유결합 하는 정도를 분석하는 단계를 포함하며, 상기 (a)에서 상기 TLR4 시그널링 억제제가 TLR4의 세포외 도메인에 있는 시스테인 잔기에 공유결합 하는 정도가 증가하는 경우에는 상기 시험물질은 TLR4 시그널링 억제제의 효능 증진제로 판단한다.
A method for screening a potentiator of a toll-like receptor 4 (TLR4) signaling inhibitor comprising the following steps:
(a) contacting a TLR4 signaling inhibitor and a test substance with a cell comprising a Toll-like receptor 4 (TLL4) or TLR4 extracellular domain;
(b) contacting a TLR4 signaling inhibitor with a cell comprising a TLR4 or TLR4 extracellular domain as a control; And
(c) analyzing the extent to which the TLR4 signaling inhibitor covalently binds to a cysteine residue in the extracellular domain of TLR4 in steps (a) and (b), wherein in step (a) the TLR4 signaling inhibitor is If the degree of covalent binding to cysteine residues in the extracellular domain of TLR4 increases, the test substance is considered to be an potentiator of the TLR4 signaling inhibitor.
제 13 항에 있어서, 상기 효능 증진제는 TLR4 시그널링 억제제의 염증성 질환 치료 효능을 증진시키는 것을 특징으로 하는 방법.
14. The method of claim 13, wherein said potentiator enhances the efficacy of treating a inflammatory disease of a TLR4 signaling inhibitor.
제 14 항에 있어서, 상기 염증성 질환은 천식, 습진, 건선, 알러지, 류마티스 관절염, 건선 관절염(psoriatic arthritis), 접촉성 피부염(contact dermatitis), 아토피성 피부염, 여드름, 아토피성 비염, 알레르기성 피부염, 만성 부비동염, 지루성 피부염(seborrheic dermatitis), 위염, 통풍, 통풍 관절염, 궤양, 만성 기관지염, 폐염증, 크론병, 궤양성 대장염, 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 패혈증, 맥관염, 활액낭염, 루프스, 류마티스 다발성 근육통, 측두 동맥염, 다발성 경화증, 고형암, 알쯔하이머병, 동맥경화증, 비만 또는 바이러스 감염인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 14, wherein the inflammatory disease is asthma, eczema, psoriasis, allergy, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, contact dermatitis, atopic dermatitis, acne, atopic rhinitis, allergic dermatitis, Chronic sinusitis, seborrheic dermatitis, gastritis, gout, gout arthritis, ulcers, chronic bronchitis, pneumonia, Crohn's disease, ulcerative colitis, ankylosing spondylitis, sepsis, vasculitis, bursitis, lupus, rheumatoid Muscle pain, temporal arteritis, multiple sclerosis, solid cancer, Alzheimer's disease, arteriosclerosis, obesity or viral infection.
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