KR101258611B1 - An isolated protein comprising north American type PRRSV antigen and European type PRRSV antigen and use thereof - Google Patents
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Abstract
북미형 PRRSV 항원과 유럽형 PRRSV 항원을 포함하는 융합 PRRSV 항원 및 그를 이용하는 방법을 제공한다.Provided are a fused PRRSV antigen comprising a North American PRRSV antigen and a European PRRSV antigen and a method of using the same.
Description
본 발명은 PRRSV 항원 및 그를 이용하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a PRRSV antigen and a method of using the same.
돼지생식기호흡기증후군 바이러스 (Porcine reproductive respiratory syndrome virus: PRRSV)는 외피가 있는 단일가닥 양성 센스 RNA 바이러스로서, 니도비랄레스 (Nidovirales) 목, 아르테리비리다에 (Arteriviridae) 과, 아르테리바이러스 (Arterivirus) 속에 속한다. PRRSV는 최근 발생된 병원체로서, 모돈의 유산, 사산, 및 태아의 폐렴 및 형성 부전, 분만율 저하, 성장률 저하, 그 외 2차적인 세균 감염 및 모든 연령의 돼지에서 호흡기 질환을 유발하여, 국내 및 국외의 양돈 산업에 심각한 피해를 주고 있는 전염성 질병이다. 국내에서 1993년에 최초로 분리 및 보고된 PRRSV는 대식세포 내에서 선호적으로 증식한다. 그 발병 형태는 생식기형, 호흡기형, 및 혼합형으로서, 일차적으로 돼지에서 돼지로 전염되며, 분변, 요 (urine), 유 (milk)를 통해서 초유 항체가 수유되지 않은 새끼 돼지에게 전염될 수 있고, 또한 주사 바늘, 곤충 및 공기에 의한 전염될 수도 있다.Porcine reproductive respiratory syndrome virus (PRRSV) is an enveloped, single-strand-positive sense RNA virus, from the genus Nidovirales, Arteriviridae, and Arterivirus. Belong. PRRSV is a recently developed pathogen that causes sow sowing, stillbirth and fetal pneumonia and hypoplasia, lowering of delivery rate, lowered growth rate, secondary bacterial infection and respiratory diseases in pigs of all ages, Is a contagious disease that is seriously affecting the pig industry. In Korea, the first isolated and reported PRRSV in 1993 proliferated preferentially in macrophages. The onset is genital, respiratory, and mixed, primarily transmitted from pigs to pigs, can be transmitted to piglets not fed with colostral antibodies through feces, urine, milk, It may also be transmitted by needles, insects and air.
PRRSV는 동시대에 지정학적 위치에 따라서 유전학적으로 매우 다양한 스트레인이 존재한다. 두 종류의 주요 유전자형은 유럽형 (genotype 1)과 북미형 (genotype 2)이 있으며, 이들은 게놈 수준 측면에 있어서 40%의 뉴클레오티드 상이성을 나타낸다. 우리나라에 주로 발생하고 있는 스트레인은 VR2332로 밝혀진 바 있다. 연구 결과에 따르면, 북미형 PRRSV가 한국 양돈가에 퍼진 이후 계속 진화하고 있어, 지정학적인 영향에 의해 PRRSV의 유전자의 변성이 발생한 것으로 예측되고 있다.PRRSV has a genetically diverse range of strains, depending on geographical location at the same time. The two major genotypes are the European (genotype 1) and the North American (genotype 2), which show 40% nucleotide phase heterogeneity in terms of genome level. The strain that is mainly occurring in Korea has been identified as VR2332. According to the results of the study, the North American type PRRSV has been evolving since it spread to Korean pig farmers, and it is predicted that genetic modification of PRRSV is caused by geopolitical influence.
PRRSV의 전체 게놈 크기는 15kb이며, 하부게놈 mRNA가 서로 오버랩되어있는 9개의 해독틀 (open reading frame:ORF) (ORF 1a, 1b, 2a, 2b, 3-7)을 갖는다. ORF 1a와 1b는 복제 관련 비구조 단백질이고 ORF 2-7은 GP2a, GP2b, GP3, GP4, GP5, 막/매트릭스 (M) 단백질 및 뉴클레오캡시드 (N) 단백질로서 구조 단백질을 구성한다. 이 중 주요 구조 단백질은 N 단백질, M 단백질 및 일차 외피 (envelope) 당단백질인 GP5이다. 이 중 GP5 (ORF 5) 단백질은 감염시 숙주 내에서 중화 항체를 유도할 수 있는 것으로 알려진 가장 풍부하게 존재하는 단백질이다.The entire genome size of PRRSV is 15 kb and has nine open reading frames (ORFs) (ORFs 1a, 1b, 2a, 2b, 3-7) in which the lower genomic mRNAs overlap each other. ORFs 1a and 1b are replication related nonstructural proteins and ORF 2-7 constitutes structural proteins as GP2a, GP2b, GP3, GP4, GP5, membrane / matrix (M) protein and nucleocapsid (N) protein. The major structural proteins are the N protein, the M protein, and the GP5, the primary envelope glycoprotein. The GP5 (ORF 5) protein is the most abundant protein known to be capable of inducing neutralizing antibodies in the host during infection.
종래 PRRSV 감염 여부를 진단하는 방법으로는, 돼지로부터 분리된 시료 중에서 PRRSV 항원 또는 그에 결합하는 항체의 존재를 검출하는 방법이 알려져 있다. 예를 들면, 미국특허 제6806086호에는 생물학적 시료 중의 Lelystad 제를 특이적으로 인식하는 항체를 검출하기 위한 키트로서, 바이러스, 단백질, 폴리펩티드, 및 펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 항원 및 항체 검출 수단을 포함하고, 상기 항원은 돼지의 혈청 항체와 면역 반응성이 있고, 상기 혈청 항체는 a) 1991년 6월 5일 기탁된 수탁번호 I-1102로 프랑스 파리 소재의 파스퇴르 연구소에 기탁된 바이러스에 실질적으로 대응되는 바이러스 (계대 수준 3, 역가 104.8 TCID50/ml) 2ml를 무특정병원균 (specific pathogen free) 돼지에 비강내 접종하고, b) 25 내지 33일 후 접종된 돼지로부터 혈청 항체를 수집하는 것에 의하여 얻어진 것인 키트가 개시되어 있다.
As a conventional method for diagnosing PRRSV infection, a method of detecting the presence of a PRRSV antigen or an antibody binding thereto in a sample isolated from pigs is known. For example, US Pat. No. 6,060,86 is a kit for detecting an antibody that specifically recognizes a Lelystad agent in a biological sample, comprising an antigen and antibody detection means selected from the group consisting of viruses, proteins, polypeptides, and peptides. The antigen is immunoreactive with a serum antibody of a pig, and the serum antibody is a) a virus substantially corresponding to a virus deposited at the Institute of Pasteur, Paris, Accession No. 1-1102, deposited on June 5, 1991. (Passage level 3, titer 10 4.8 TCID 50 / ml) obtained by intranasal inoculation of 2 ml of specific pathogen free pigs, and b) collecting serum antibodies from inoculated pigs after 25 to 33 days Phosphorus kits are disclosed.
따라서, 이상과 같은 선행기술에 의하더라도, 북미형 및 유럽형 PRRSV를 동시에 높은 민감도로 검출할 수 있는 PRRSV의 검출방법이 요구되고 있다. Therefore, even with the prior art as described above, there is a need for a method of detecting PRRSV capable of simultaneously detecting North American and European PRRSVs with high sensitivity.
일 양상은 북미형 및 유럽형 PRRSV 항원을 포함하는 분리된 단백질을 제공하는 것이다.One aspect is to provide isolated proteins comprising North American and European PRRSV antigens.
다른 양상은 상기 분리된 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.Another aspect is to provide a method for producing the isolated protein.
다른 양상은 시료 중의 항-PRRSV 항체를 효율적으로 검출하는 방법을 제공하는 것이다.Another aspect is to provide a method for efficiently detecting anti-PRRSV antibodies in a sample.
다른 양상은 상기 분리된 단백질에 결합하는 항체를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.Another aspect is to provide a method of producing an antibody that binds to said isolated protein.
다른 양상은 시료 중의 PRRSV 항원을 효율적으로 검출하는 방법을 제공하는 것이다.Another aspect is to provide a method for efficiently detecting PRRSV antigen in a sample.
다른 양상은 시료 중의 PRRSV를 검출하기 위한 키트를 제공하는 것이다.Another aspect is to provide a kit for detecting PRRSV in a sample.
본 발명의 일 양상은 서열번호 2의 아미노산 서열과 서열번호 4의 아미노산 서열이 융합된 분리된 단백질을 제공한다. 상기 서열번호 2의 아미노산 서열과 서열번호 4의 아미노산 서열은 링커 아미노산 서열에 의하여 연결된 것일 수 있다. 상기 분리된 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 링커 서열은 GS, GSGS 및 VE로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 융합은 서열번호 2의 아미노산 서열의 C 말단과 서열번호 4의 아미노산 서열의 N 말단이 융합된 것, 또는 그 반대의 배열로 융합된 것일 수 있다.
One aspect of the present invention provides an isolated protein in which the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 are fused. The amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 may be linked by a linker amino acid sequence. The isolated protein may be one having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. The linker sequence may be selected from the group consisting of GS, GSGS, and VE. The fusion may be a fusion of the C terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and the N terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, or vice versa.
본 발명의 다른 양상은 상기 분리된 단백질을 코딩하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 상기 분리된 핵산 분자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 갖는 것일 수 있다. 예를 들면, 서열번호 6의 염기서열을 갖는 것일 수 있다. Another aspect of the invention provides an isolated nucleic acid molecule encoding said isolated protein. The isolated nucleic acid molecule may have a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. For example, it may have a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6.
본 발명의 다른 양상은 상기 분리된 단백질을 생산하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 화학 합성, 반화학 합성 및 생물공학적 방법에 의하여 생산하는 방법 중 하나이상일 수 있다. Another aspect of the invention involves a method of producing the isolated protein. The method may be one or more of the methods produced by chemical synthesis, semichemical synthesis and biotechnological methods.
상기 방법은 예를 들면, 상기 핵산이 도입된 숙주세포를 배양하여 상기 단백질을 발현시키는 단계; 및 상기 발현된 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 분리된 단백질을 생산하는 방법일 수 있다. 상기 숙주세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들면, 상기 숙주세포는 대장균일 수 있다. 상기 핵산이 도입된 숙주세포를 배양하여 상기 단백질을 발현시키는 단계에 있어서, 핵산을 숙주세포로 도입하는 것, 숙주세포를 배양하는 것 및 단백질을 발현시키는 것은 당업계에 알려진 방법이 사용될 수 있다. 또한, 상기 발현된 단백질을 분리하는 단계는 당업계에 알려진 방법에 따라 수행될 수 있다.
The method may include, for example, culturing a host cell into which the nucleic acid is introduced to express the protein; And it may be a method of producing an isolated protein, comprising the step of separating the expressed protein. The host cell may be a prokaryotic or eukaryotic cell. For example, the host cell may be Escherichia coli. In the step of culturing the host cell into which the nucleic acid is introduced to express the protein, a method known in the art may be used to introduce the nucleic acid into the host cell, to culture the host cell, and to express the protein. In addition, the step of separating the expressed protein may be performed according to methods known in the art.
본 발명의 다른 양상은 상기한 바와 같은 단백질을 항-PRRSV 항체를 함유하는 것으로 의심되는 시료와 접촉시키는 단계; 상기 단백질과 항-PRRSV 항체의 복합체의 존재를 검출하는 단계 및 상기 복합체가 존재하는 것으로 검출된 경우, 상기 시료는 항-PRRSV 항체를 포함하는 것으로 결정하고, 상기 복합체가 존재하지 않는 것으로 검출된 경우, 상기 시료는 항-PRRSV 항체를 포함하지 않는 것으로 결정하는 단계를 포함하는, 시료 중의 항-PRRSV 항체를 검출하는 방법을 제공한다.Another aspect of the invention provides a method for preparing a protein comprising contacting a protein as described above with a sample suspected of containing an anti-PRRSV antibody; Detecting the presence of a complex of the protein and an anti-PRRSV antibody and if the complex is detected, the sample is determined to contain an anti-PRRSV antibody and if the complex is detected to be absent Providing a method of detecting an anti-PRRSV antibody in a sample, comprising determining that the sample does not comprise an anti-PRRSV antibody.
상기 방법은 상기한 바와 같은 단백질을 항-PRRSV 항체를 함유하는 것으로 의심되는 시료와 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 접촉은 액체 매질 중에서 상기 단백질과 시료를 혼합시키고 배양하는 것에 의하여 수행될 수 있다. 상기 액체 매질은 상기 단백질 및 항체를 불안정화시키지 않고 항원-항체 반응을 위한 매질을 제공할 수 있는 것이면 어느 것이나 포함된다. 예를 들면, 상기 액체 매질은 PBS 버퍼와 같은, 버퍼를 포함한다. 상기 접촉은 항원과 항체의 복합체를 형성시키기 위하여 당업계에 알려진 조건이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 접촉은 4 내지 37℃에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 접촉은 교반 또는 교반 없이 수행될 수 있다. The method comprises contacting a protein as described above with a sample suspected of containing an anti-PRRSV antibody. The contacting may be performed by mixing and incubating the protein with the sample in a liquid medium. The liquid medium includes anything that can provide a medium for antigen-antibody reactions without destabilizing the proteins and antibodies. For example, the liquid medium includes a buffer, such as a PBS buffer. The contact can be used conditions known in the art to form a complex of antigen and antibody. For example, the contact can be carried out at 4 to 37 ℃. In addition, the contact can be carried out with or without stirring.
상기 단백질은 고체 기판에 고정된 것일 수 있다. 상기 고체 기판은 웰, 플레이트 및 비드 형상으로부터 선택되는 하나 이상의 형상을 갖는 것일 수 있다. 상기 웰은 마이크로 웰일 수 있다. 상기 단백질의 고정화는 N 말단과 C 말단이 무작위적으로 상기 고체 기판의 표면에 고정화되어, 서열번호 1의 아미노산 서열과 서열번호 4의 아미노산 서열이 무작위적으로 외부로부터 노출된 것일 수 있다. 고정화 과정을 예를 들어 간단하게 설명하면, 유전자재조합기술을 이용하여 생산 정제된 PRRSV 항원 (US5C3+EU7TC2)을 탄산염완충액으로 적정 농도로 희석하고 96 마이크로웰 플레이트의 웰에 분주한 후 항온기에서 37℃로 항온 유지한다. 항원액을 흡입하고 단백질 안정제가 함유된 차단액을 분주한 후 항온기에서 25℃로 항온 유지한다. 차단액을 흡입한 후 진공건조기를 사용하여 건조한 후 은박포로 밀봉하여 보관한다. 상기 시료는 돼지 유래의 시료이면 어느 것이나 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 시료는 돼지 혈액, 혈청 또는 혈장일 수 있다.
The protein may be fixed to a solid substrate. The solid substrate may have one or more shapes selected from well, plate and bead shapes. The well may be a micro well. The immobilization of the protein may be one in which the N and C termini are randomly immobilized on the surface of the solid substrate, such that the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 are randomly exposed from the outside. For example, the immobilization process is briefly described. The purified PRRSV antigen (US5C3 + EU7TC2), produced using genetic recombination technology, is diluted to an appropriate concentration with a carbonate buffer solution and dispensed into a well of a 96 microwell plate, followed by 37 ° C in a thermostat. Keep constant temperature. The antigen solution is aspirated and the blocking solution containing protein stabilizer is dispensed and kept at 25 ° C. in a thermostat. After inhalation of the blocking solution, dry it using a vacuum dryer, and keep it sealed with a silver foil. The sample may include any sample derived from pigs. For example, the sample may be pig blood, serum or plasma.
상기 방법은 상기 단백질과 항-PRRSV 항체의 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 검출은 당업계에 알려진 항원-항체 복합체 검출방법이 사용될 수 있다. 상기 검출은 예를 들면, 전기적 방법, 분광학적 방법 또는 이들의 조합에 의하여 이루어지는 것일 수 있다. 또한, 상기 검출은 알려진 ELISA 분석 과정에 의하여 이루어지는 것일 수 있다. 검출가능한 표지로 표지된 항-돼지 항-PRRSV 항체를 상기 항체와 결합시키고, 결합된 산물의 상기 표지로부터 신호를 검출함으로써 이루어질 수 있다. 검출가능한 표지는 형광표지, 전기적 표지, 방사성 물질, 기질을 분광학적으로 분석가능한 물질로 전환시키는 활성을 가진 효소 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 효소는 알칼리포스파타제, 호스래디쉬퍼옥시다제 및 베타-갈락토시다제를 포함할 수 있다.
The method includes detecting the presence of a complex of the protein and anti-PRRSV antibody. The detection may be an antigen-antibody complex detection method known in the art. The detection may be made by, for example, an electrical method, a spectroscopic method, or a combination thereof. In addition, the detection may be made by a known ELISA analysis process. Anti-pig anti-PRRSV antibodies labeled with a detectable label can be made by binding to the antibody and detecting a signal from the label of the bound product. The detectable label can be a fluorescent label, an electrical label, a radioactive material, an enzyme having the activity of converting the substrate into a spectroscopically detectable material, or a combination thereof. The enzyme may include alkaline phosphatase, horseradish peroxidase and beta-galactosidase.
상기 방법은 상기 복합체가 존재하는 것으로 검출된 경우, 상기 시료는 항-PRRSV 항체를 포함하는 것으로 결정하고, 상기 복합체가 존재하지 않는 것으로 검출된 경우, 상기 시료는 항-PRRSV 항체를 포함하지 않는 것으로 결정하는 단계를 포함한다. 상기 PRRSV는 북미형 및 유럽형인 것일 수 있다. 상기 북미형은 VR2332 균주이고 유럽형은 Lelystad 균주일 수 있다.
The method determines that the sample contains an anti-PRRSV antibody when the complex is detected, and wherein the sample does not contain an anti-PRRSV antibody when it is detected that the complex is not present. Determining. The PRRSV may be of North American type and European type. The North American type may be a VR2332 strain and the European type may be a Lelystad strain.
본 발명의 다른 양상은 상기한 바와 같은 단백질을 인간이 아닌 포유류 동물에게 투여하는 단계; 및 상기 동물로부터 상기 단백질에 결합하는 항체를 분리하는 단계를 포함하는, 항체를 생산하는 방법을 제공한다.Another aspect of the invention comprises the steps of administering a protein as described above to a non-human mammalian animal; And separating the antibody which binds to the protein from the animal.
상기 방법은 상기한 바와 같은 단백질을 인간이 아닌 포유류 동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 동물은 당업계에서 항체 생산에 사용되는 동물일 수 있다. 예를 들면, 생쥐, 토끼, 양, 돼지 또는 소일 수 있다. 상기 투여는 동물에서 항체를 생산하는 당업계에 알려진 투여 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 동물에서 면역반응을 유도하기 충분한 양을 동물에게 투여하고, 2주 후에 부스트 투여하는 것일 수 있다. The method comprises administering a protein as described above to a non-human mammalian animal. The animal may be an animal used for antibody production in the art. For example, it can be a mouse, rabbit, sheep, pig or cow. Such administration can be used administration methods known in the art for producing antibodies in an animal. For example, the animals may be administered with an amount sufficient to induce an immune response, followed by boost administration two weeks later.
상기 방법은 상기 동물로부터 상기 단백질에 결합하는 항체를 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 분리는 당업계에 알려진 항체 분리 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 단백질을 리간드로 사용하거나 상기 항체에 특이적으로 결합하는 항체를 리간드로 사용한 친화성 크로마토그래피가 사용될 수 있다. The method may comprise the step of isolating an antibody that binds to the protein from the animal. The separation can be used for antibody separation methods known in the art. For example, affinity chromatography using the protein as a ligand or an antibody that specifically binds to the antibody may be used.
상기 방법에 의하면, 서열번호 2의 아미노산 서열에 결합하는 항체와 서열번호 4의 아미노산 서열에 결합하는 항체를 포함하는 다클론 항체를 얻을 수 있다.
According to the above method, a polyclonal antibody comprising an antibody binding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and an antibody binding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 can be obtained.
본 발명의 다른 양상은 상기 항체를 생산하는 방법에 따라 얻어진 항체와 PRRSV 항원을 함유하는 것으로 의심되는 시료를 접촉시키는 단계; 상기 항체와 PRRSV 항원의 복합체를 검출하는 단계; 및 상기 복합체가 존재하는 것으로 검출된 경우, 상기 시료는 PRRSV 항원을 포함하는 것으로 결정하고, 상기 복합체가 존재하지 않는 것으로 검출된 경우, 상기 시료는 PRRSV 항원을 포함하지 않는 것으로 결정하는 단계를 포함하는, 시료 중의 PRRSV 항원을 검출하는 방법을 제공한다. Another aspect of the invention comprises the steps of contacting a sample suspected of containing a PRRSV antigen with an antibody obtained according to the method for producing the antibody; Detecting a complex of the antibody with a PRRSV antigen; And if it is detected that the complex is present, the sample is determined to contain a PRRSV antigen, and if it is detected that the complex is not present, determining that the sample does not contain a PRRSV antigen. And a method for detecting PRRSV antigen in a sample.
상기 방법은 상기 항체를 생산하는 방법에 따라 얻어진 항체와 PRRSV 항원을 함유하는 것으로 의심되는 시료를 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 접촉은 액체 매질 중에서 상기 단백질과 시료를 혼합시키고 배양하는 것에 의하여 수행될 수 있다. 상기 액체 매질은 상기 단백질 및 항체를 불안정화시키지 않고 항원-항체 반응을 위한 매질을 제공할 수 있는 것이면 어느 것이나 포함된다. 예를 들면, 상기 액체 매질은 PBS 버퍼와 같은, 버퍼를 포함한다. 상기 접촉은 항원과 항원의 복합체를 형성시키기 위하여 당업계에 알려진 조건이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 접촉은 4 내지 37℃에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 접촉은 교반 또는 교반 없이 수행될 수 있다. The method includes contacting a sample suspected of containing a PRRSV antigen with an antibody obtained according to the method for producing the antibody. The contacting may be performed by mixing and incubating the protein with the sample in a liquid medium. The liquid medium includes anything that can provide a medium for antigen-antibody reactions without destabilizing the proteins and antibodies. For example, the liquid medium includes a buffer, such as a PBS buffer. The contact can be used conditions known in the art to form an antigen and a complex of antigens. For example, the contact can be carried out at 4 to 37 ℃. In addition, the contact can be carried out with or without stirring.
상기 항체는 고체 기판에 고정된 것일 수 있다. 상기 고체 기판은 웰, 플레이트 및 비드 형상으로부터 선택되는 하나 이상의 형상을 갖는 것일 수 있다. 상기 웰은 마이크로 웰일 수 있다. 상기 시료는 돼지 유래의 시료이면 어느 것이나 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 시료는 돼지 혈액, 혈청 또는 혈장일 수 있다.The antibody may be immobilized on a solid substrate. The solid substrate may have one or more shapes selected from well, plate and bead shapes. The well may be a micro well. The sample may include any sample derived from pigs. For example, the sample may be pig blood, serum or plasma.
상기 방법은 상기 항체와 PRRSV 항원의 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 검출은 당업계에 알려진 항원-항체 복합체 검출방법이 사용될 수 있다. 상기 검출은 예를 들면, 전기적 방법, 분광학적 방법 또는 이들의 조합에 의하여 이루어지는 것일 수 있다. 또한, 상기 검출은 알려진 ELISA 분석 과정에 의하여 이루어지는 것일 수 있다. 검출가능한 표지로 표지된 항-PRRSV를 상기 항원과 결합시키고, 결합된 산물의 상기 표지로부터 신호를 검출함으로써 이루어질 수 있다. 검출가능한 표지는 형광표지, 전기적 표지, 방사성 물질, 기질을 분광학적으로 분석가능한 물질로 전환시키는 활성을 가진 효소 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 효소는 알칼리포스파타제, 호스래디쉬퍼옥시다제 및 베타-갈락토시다제를 포함할 수 있다.The method includes detecting the presence of a complex of the antibody and a PRRSV antigen. The detection may be an antigen-antibody complex detection method known in the art. The detection may be made by, for example, an electrical method, a spectroscopic method, or a combination thereof. In addition, the detection may be made by a known ELISA analysis process. Anti-PRRSV labeled with a detectable label can be combined with the antigen and detecting a signal from the label of the bound product. The detectable label can be a fluorescent label, an electrical label, a radioactive material, an enzyme having the activity of converting the substrate into a spectroscopically detectable material, or a combination thereof. The enzyme may include alkaline phosphatase, horseradish peroxidase and beta-galactosidase.
상기 방법은 상기 복합체가 존재하는 것으로 검출된 경우, 상기 시료는 PRRSV 항원을 포함하는 것으로 결정하고, 상기 복합체가 존재하지 않는 것으로 검출된 경우, 상기 시료는 PRRSV 항원을 포함하지 않는 것으로 결정하는 단계를 포함한다. 상기 PRRSV는 북미형 및 유럽형인 것일 수 있다. 상기 북미형은 VR2332 균주이고 유럽형은 Lelystad 균주일 수 있다.
The method determines that the sample contains a PRRSV antigen when it is detected that the complex is present and determines that the sample does not contain a PRRSV antigen when it is detected that the complex is not present. Include. The PRRSV may be of North American type and European type. The North American type may be a VR2332 strain and the European type may be a Lelystad strain.
본 발명의 다른 양상은 상기한 바와 같은 분리된 단백질을 포함하는, 시료 중의 PRRSV를 검출하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 상기 분리된 단백질과 항-PRRSV 항체의 복합체를 검출할 수 있는 시약을 더 포함할 수 있다. 상기 시약은 검출가능한 표지로 표지된 항-돼지 항-PRRSV 항체일 수 있다. 검출가능한 표지는 형광표지, 전기적 표지, 방사성 물질, 기질을 분광학적으로 분석가능한 물질로 전환시키는 활성을 가진 효소 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 효소는 알칼리포스파타제, 호스래디쉬퍼옥시다제 및 베타-갈락토시다제를 포함할 수 있다. 상기 PRRSV는 북미형 및 유럽형인 것일 수 있다. 상기 북미형은 VR2332 균주이고 유럽형은 Lelystad 균주일 수 있다. 상기 키트는 표준 대조군, 희석제 및 버퍼로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상을 포함할 수 있다. Another aspect of the invention provides a kit for detecting PRRSV in a sample comprising the isolated protein as described above. The kit may further comprise a reagent for detecting a complex of the isolated protein and anti-PRRSV antibody. The reagent may be an anti-pig anti-PRRSV antibody labeled with a detectable label. The detectable label can be a fluorescent label, an electrical label, a radioactive material, an enzyme having the activity of converting the substrate into a spectroscopically detectable material, or a combination thereof. The enzyme may include alkaline phosphatase, horseradish peroxidase and beta-galactosidase. The PRRSV may be of North American type and European type. The North American type may be a VR2332 strain and the European type may be a Lelystad strain. The kit may comprise one or more selected from the group consisting of standard controls, diluents and buffers.
본 발명의 다른 양상은 상기 항체 생산 방법에 따라 얻어진 항체를 포함하는, 시료 중의 PRRSV를 검출하기 위한 키트를 제공한다. 상기 항체는 서열번호 2의 아미노산 서열에 결합하는 항체 및 서열번호 4의 아미노산 서열에 결합하는 항체를 모두 포함하는 항체 풀일 수 있다.
Another aspect of the present invention provides a kit for detecting PRRSV in a sample comprising the antibody obtained according to the above antibody production method. The antibody may be an antibody pool including both an antibody binding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and an antibody binding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
본 발명의 분리된 단백질에 의하면, 북미형 및 유럽형 항-PRRSV 항체에 모두 결합할 수 있어, 시료 중의 북미형 및 유럽형 PRRSV를 모두 검출하는데 사용될 수 있다. The isolated protein of the present invention can bind to both North American and European anti-PRRSV antibodies and can be used to detect both North American and European PRRSV in a sample.
본 발명의 분리된 단백질을 생산하는 방법에 의하면, 상기 분리된 단백질을 효율적으로 생산할 수 있다.According to the method for producing an isolated protein of the present invention, the isolated protein can be efficiently produced.
본 발명의 시료 중의 항-PRRSV 항체를 검출하는 방법에 의하면, 시료 중의 항-PRRSV 항체를 높은 민감도와 정확도로 검출할 수 있다. According to the method for detecting the anti-PRRSV antibody in the sample of the present invention, the anti-PRRSV antibody in the sample can be detected with high sensitivity and accuracy.
본 발명의 항체를 생산하는 방법에 의하면, 북미형 및 유럽형 PRRSV 모두에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 효율적으로 생산할 수 있다.According to the method for producing the antibody of the present invention, it is possible to efficiently produce an antibody that can specifically bind to both North American and European PRRSV.
본 발명의 시료 중의 PRRSV 항원을 검출하는 방법에 의하면, 시료 중의 PRRSV 항원을 효율적으로 검출할 수 있다.According to the method of detecting PRRSV antigen in the sample of this invention, the PRRSV antigen in a sample can be detected efficiently.
본 발명의 시료 중의 PRRSV를 검출하기 위한 키트에 의하면, 시료 중의 PRRSV를 효율적으로 검출하는데 사용될 수 있다.According to the kit for detecting PRRSV in a sample of the present invention, it can be used to efficiently detect PRRSV in a sample.
도 1은 발현 벡터의 제한효소 지도를 나타내는 도면이다.
도 2는 형질전환 세포로부터 분리된 벡터로부터 유래된 재조합 US5C3+EU7TC2 항원의 유전자를 나타내는 도면이다.
도 3은 형질전환된 균주로부터 발현된 단백질에 대한 SDS-PAGE (좌측) 및 웨스턴 블롯팅 (우측) 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 재조합 US5C3+EU7TC2 항원에 대한 토끼 폴리클론 항체의 SDS-PAGE (좌측) 및 웨스턴 블롯 (우측) 결과를 나타내는 도면이다. 1 is a diagram showing a restriction map of an expression vector.
FIG. 2 shows genes of recombinant US5C3 + EU7TC2 antigens derived from vectors isolated from transformed cells. FIG.
3 shows SDS-PAGE (left) and western blotting (right) results for proteins expressed from transformed strains.
4 shows the SDS-PAGE (left) and western blot (right) results of rabbit polyclonal antibodies against recombinant US5C3 + EU7TC2 antigen.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, these examples are for illustrative purposes only and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예Example 1: 서열번호 1 1: SEQ ID NO: 1 의of 아미노산 서열을 갖는 항원의 제조 Preparation of Antigens Having Amino Acid Sequences
본 실시예에서는 북미형 PRRSV의 ORF5의 아미노산 단편과 유럽형 PRRSV의 ORF7의 단편이 융합된 분리된 단백질을 제조하였다. 북미형 PRRSV의 ORF5의 아미노산 단편은 북미형 타입: CP626-2 균주의 ORF5의 138 내지 185 아미노산 잔기로 구성되며 US5C3라고도 한다. 유럽형 PRRSV의 ORF7의 단편은 유럽형: EU-유사 바이러스의 ORF7의 1 내지 103 잔기로 구성되며 EU7TC2라고도 한다.
In this example, an isolated protein was prepared in which the amino acid fragment of ORF5 of North American PRRSV and the fragment of ORF7 of European PRRSV were fused. The amino acid fragment of ORF5 of North American PRRSV consists of 138-185 amino acid residues of ORF5 of North American type: CP626-2 strain and is also referred to as US5C3. A fragment of ORF7 of European PRRSV consists of 1 to 103 residues of ORF7 of European type: EU-like virus, also referred to as EU7TC2.
(1) 유전자의 증폭(1) gene amplification
먼저, 바이러스로부터 주형 DNA를 추출하였다. 구체적으로, (주)녹십자수의약품 (한국, 용인)으로부터 분양받는 주형 RNA를 이용하였다 (바이러스명 North American Type : CP626-2 strain, EU Type: EU-like virus). First, template DNA was extracted from the virus. Specifically, a template RNA distributed from Green Cross Co., Ltd. (Yongin, Korea) was used (virus name North American Type: CP626-2 strain, EU Type: EU-like virus).
다음으로, 상기 주형 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하고, 얻어진 증폭산물을 이용하여 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 항원의 발현을 위한 발현벡터 제조하였다. Next, PCR was performed using the template DNA as a template, and an expression vector for expression of an antigen having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 was prepared using the obtained amplification product.
먼저, 각 US5C3 및 EU7TC2 항원을 코딩하는 유전자는 PRRSV RNA을 주형으로 하여 RT-PCR을 수행하여 획득하였다. PCR을 수행하기 위해 다음의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하였으며, 이들은 유전자은행 (Accession No. US:EF536003, EU:M96262)에서 정보를 얻어 작성하였다 (표 1).First, genes encoding US5C3 and EU7TC2 antigens were obtained by performing RT-PCR using PRRSV RNA as a template. The following oligonucleotide primers were used to perform PCR, which were prepared by obtaining information from the GenBank (Accession No. US: EF536003, EU: M96262) (Table 1).
US5C3 및 EU7TC2 항원 유전자 증폭을 위한 열순환 (thermocycle)은 열순환기 (Mycycler: BioRad)를 사용하여 (42℃, 30분)x1회, (94℃, 5분)x1회, (94℃, 1분, 45℃, 1분, 72℃, 1분)x 28회, (94℃, 1분, 60℃, 1분, 72℃, 10분)x 1회, 4℃, 16시간으로 수행하였다. PCR 증폭이 완전히 끝난 후, 1.5%의 아가로즈 겔을 만들어 PCR 산물 1㎕를 전기영동하여 항원 유전자의 크기를 확인하고 Gene clean Kit (MP biochemical, #1101-400, 프랑스)를 사용하여 증폭된 DNA를 추출하였다. 증폭된 DNA의 서열은 작업의 효율과 정확성을 기하기 위하여 전문업체 (Jenotech, Korea)에 DNA 서열분석 (sequencing)을 의뢰하여 확인하였다. 그 결과, 확인된 US5C3 유전자 및 EU7TC2 유전자는 각각 서열번호 3 및 5의 염기서열을 갖고, 이들의 코딩서열을 서열번호 2 및 4의 아미노산 서열을 각각 갖는 것을 확인하였다. Thermocycle for amplification of US5C3 and EU7TC2 antigen genes was (42 ° C., 30 minutes) × 1 time, (94 ° C., 5 minutes) × 1 time, (94 ° C., 1 minute) using a thermocycler (Mycycler: BioRad). , 45 ° C., 1 minute, 72 ° C., 1 minute) × 28 times, (94 ° C., 1 minute, 60 ° C., 1 minute, 72 ° C., 10 minutes) × 1 time, 4 ° C., 16 hours. After PCR amplification was complete, 1.5% agarose gel was prepared, and 1 µl of the PCR product was electrophoresed to determine the size of the antigen gene, and the DNA amplified using a Gene clean Kit (MP biochemical, # 1101-400, France). Was extracted. The sequence of the amplified DNA was confirmed by requesting DNA sequencing from a specialized company (Jenotech, Korea) to ensure the efficiency and accuracy of the work. As a result, the confirmed US5C3 gene and EU7TC2 gene had a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 and 5, respectively, and confirmed that their coding sequence has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and 4, respectively.
USS5C3 유전자와 EU7TC2 유전자의 융합을 위하여 대장균 발현 벡터인 pBM 벡터 (BioNote Inc., Korea)도 프라이머의 링커 부위에도 그 인지 부위가 존재하는 BamH I (NEB, #R0136S, USA) 및 SalI (NEB, #R0138S, USA)으로 절단하고, 그 산물을 아가로즈 겔에 전기영동하여 Gene Clean Kit (MP biochemical, #1101-400, 프랑스)를 이용해 추출해 놓았다.PBM vector (BioNote Inc., Korea), an E. coli expression vector for fusion of USS5C3 gene and EU7TC2 gene, also contains BamH I (NEB, # R0136S, USA) and SalI (NEB, # R0138S, USA) and the product was electrophoresed on agarose gel and extracted using Gene Clean Kit (MP biochemical, # 1101-400, France).
T4 DNA 리가제 (Roche, 10481220001, Germany)를 이용하여, 상기와 같이 증폭 및 추출된 삽입체 (insert)와 벡터를 16℃에서 밤새 연결 (ligation)시키고, 형질도입능 대장균 세포 (competent cell) (Top10F')에 형질전환시켰다. 도 1은 발현 벡터의 제한효소 지도를 나타내는 도면이다.Using T 4 DNA ligase (Roche, 10481220001, Germany), the amplified and extracted insert and the vector were ligation at 16 ° C. overnight, using transgenic E. coli cells. (Top10F '). 1 is a diagram showing a restriction map of an expression vector.
형질전환은 열충격 (heat-shock) 법을 이용하였으며, -70℃에 보관된 형질도입능 세포를 꺼내 얼음 위에서 해동시킨 후 연결체 (ligate) 5㎕를 넣고 약 3초간 조심스럽게 혼합한 후 얼음에서 30분간 정치시켰다. 반응물이 혼합된 형질도입능 세포의 튜브를 42℃의 항온 수조에 90초간 정치시킨 후 열충격을 주고 즉시 얼음에 넣어 주었다. LB 액체 배지를 1 ml 넣어주어 37℃, 1시간 인큐베이션 (incubation)을 시킨 후 선별마커 (selection marker)로 항생제 암피실린이 포함된 LB 아가 플레이트에 100 ㎕의 균액을 도말하고 밤새, 37℃ 조건으로 배양하였다.The transformation was performed using a heat-shock method, and the transgenic cells stored at −70 ° C. were taken out and thawed on ice. Then, 5 μl of the ligation was added and mixed carefully for about 3 seconds. It was left for 30 minutes. The tube of transduced cells mixed with the reactants was placed in a constant temperature water bath at 42 ° C. for 90 seconds, and then thermally shocked and immediately placed in ice. 1 ml of LB liquid medium was incubated at 37 ° C. for 1 hour, followed by 100 μl of bacterial solution on an LB agar plate containing antibiotic ampicillin as a selection marker, followed by incubation at 37 ° C. overnight. It was.
LB 아가 플레이트에 자란 콜로니를 액체 LB 배지에 접종하여 세포가 자랐을 때 Wizard Plus SV Minipreps Kit (Promega, #A1460, USA)를 이용해서 DNA를 추출하고, 추출한 DNA를 BamHI (NEB, #R0136S, USA) 및 Sal I (NEB, #R0138S, USA)로 절단하고 전기 영동하여 벡터에 각 항원 삽입체 (insert)가 연결되었는지를 확인하였다. 도 2는 형질전환 세포로부터 분리된 벡터로부터 유래된 재조합 US5C3+EU7TC2 항원의 유전자를 나타내는 도면이다. 도 2에서, M은 크기 마커 (Biorad 100bp ladder)이며, 레인 1은 pBM US5C3+EU7TC2를 BamHI/SalI 분해한 후 전기영동한 결과를 나타내는 것이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 465bp의 US5C3+EU7TC2 유전자를 확인하였다.
Colonies grown on LB agar plates were inoculated into liquid LB medium and cells were grown using the Wizard Plus SV Minipreps Kit (Promega, # A1460, USA). The extracted DNA was extracted from BamHI (NEB, # R0136S, USA). And Sal I (NEB, # R0138S, USA) and electrophoresis to confirm that each antigen insert was linked to the vector. FIG. 2 shows genes of recombinant US5C3 + EU7TC2 antigens derived from vectors isolated from transformed cells. FIG. In FIG. 2, M is a size marker (Biorad 100bp ladder), and
(2) 형질전환(2) transformation
서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 US5C3 및 EU7TC2의 융합 (US5C3+EU7TC2 항원) 유전자를 연결 확인용 세포 (ligation cell)로부터 추출하고, 추출된 DNA를 대장균 발현용 균주인 BL21에 형질 전환시켜서 US5C3+EU7TC2 항원을 발현하는 대장균을 얻었다.The US5C3 and EU7TC2 fusion (US5C3 + EU7TC2 antigen) genes having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 were extracted from the ligation cells, and the extracted DNA was transformed into BL21, which is an E. coli expression strain, to convert US5C3 + EU7TC2. Escherichia coli expressing the antigen was obtained.
유전자 재조합 US5C3+EU7TC2 항원을 발현하는 대장균 균주를 삼각 플라스크에 넣어 18시간 이상 진탕 배양하였다. 배양된 균주를 발효기에 접종하여 37℃에서 약 2시간 배양하고 균주가 증식하여 600nm에서 흡광도 값이 약 1.0 내외가 될 때까지 배양하였다. 균주가 흡광도 1.0 내외로 증식하였을 경우 IPTG를 2.5mM 되도록 첨가하여 추가로 약 5시간을 배양한 후 배양된 균주액을 회수하여 원심방법으로 균체를 회수하여 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯을 수행하여 발현된 유전자 재조합항원 (US5C3+EU7TC2: 50KDa)을 확인하였다. 도 3은 형질전환된 균주로부터 발현된 단백질에 대한 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅 결과를 나타내는 도면이다. 도 3에서 M은 크기 마커 (Biorad protein standard)이며, 레인1은 pBM US5C3+EU7TC2 유도 전이며, 레인2는 pBM US5C3+EU7TC2 유도 후를 나타낸다. US5C3+EU7TC2 항원 50KDa의 분자량을 갖는다.
E. coli strains expressing the recombinant US5C3 + EU7TC2 antigen were put in a Erlenmeyer flask and shaken for 18 hours or more. The cultured strains were inoculated in a fermentor and incubated at 37 ° C. for about 2 hours, and the strains were grown and cultured at 600 nm until the absorbance value was about 1.0. When the strains were propagated to absorbance of 1.0 or so, the addition of IPTG was added to 2.5mM, followed by incubation for about 5 hours, and the cultured strain solution was recovered. The cells were recovered by centrifugation, followed by SDS-PAGE and Western blot expression. Genetic recombinant antigen (US5C3 + EU7TC2: 50KDa) was identified. FIG. 3 shows SDS-PAGE and Western blotting results for proteins expressed from transformed strains. In FIG. 3, M is the size marker (Biorad protein standard),
(3) 유전자 재조합 항원의 제조(3) Preparation of Recombinant Antigen
유전자 재조합 US5C3+EU7TC2 항원을 발현하는 대장균 균주를 배양하여 회수한 균체를 초음파 파쇄기 (VCX750; Sonics&materials)로 처리하여 파쇄하고 8,000rpm, 20분, 4℃로 원심분리 (VS24SMTi ; vision science)하여 침전을 회수하였다. 항원이 함유된 침전을 6M 구아니딘 용액으로 용해하였다. DEAE-세파로즈 겔을 이용하여 이온교환 크로마토그래피 (ion exchange chromatography) 법으로 항원을 정제하였다. 즉, 용해된 봉입체 (inclusion body) 용액을 6M 구아니딘 용액으로 평형된 겔에 반응시키고 NaCl 구배를 실시하여 각 분획들을 SDS-PAGE 방법으로 분석하여 유전자 재조합 US5C3+EU7TC2 항원이 함유된 분획만을 선별하였다. 선별한 항원은 BCA법 (Pierce, USA)으로 정량하여 마이크로 웰에 흡착할 항원으로 사용하였다.
Cells recovered by culturing E. coli strains expressing the recombinant US5C3 + EU7TC2 antigen were crushed by treatment with an ultrasonic crusher (VCX750; Sonics & materials) and centrifuged at 8,000 rpm, 20 minutes, and 4 ° C (VS24SMTi; vision science) to precipitate. Recovered. Antigen-containing precipitate was dissolved in 6M guanidine solution. Antigens were purified by ion exchange chromatography using DEAE-Sepharose gel. That is, the dissolved inclusion body solution was reacted to the gel equilibrated with 6M guanidine solution and subjected to NaCl gradient to analyze each fraction by SDS-PAGE method, and only fractions containing the recombinant US5C3 + EU7TC2 antigen were selected. The selected antigen was quantified by BCA method (Pierce, USA) and used as an antigen to be adsorbed to microwells.
실시예Example 2: 항원의 고정화 및 2: immobilization of antigen and PRRSVPRRSV 의 검출Detection
정제된 유전자재조합 US5C3+EU7TC2 항원 1-2㎕를 50mM 카르보네이트 완충액 (pH 9.6)에 희석시킨 후 96웰 ELISA 플레이트 (Costar, USA)에 100 ㎕씩 분주하고 37℃에서 2 내지 4 시간 동안 항원을 부착시켰다. 이때 항원은 이온결합, 수소결합 및 반데르발스 결합 등에 의하여 무작위적으로 고체 지지체에 부착한다. 1-2 μl of the purified recombinant US5C3 + EU7TC2 antigen was diluted in 50 mM carbonate buffer (pH 9.6), then 100 μl aliquoted in a 96 well ELISA plate (Costar, USA) and the antigen at 37 ° C. for 2-4 hours. Was attached. At this time, the antigen is randomly attached to the solid support by ionic bonds, hydrogen bonds and van der Waals bonds.
다음으로, 항원 용액을 제거한 후, 항원이 부착된 마이크로 플레이트의 웰에 다시 1% 스킴 밀크 (Sigma, USA)가 함유된 PBS 100 ㎕씩 분주하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 습도가 10% 미만인 건조기에서 4시간 동안 건조한 후 사용하였다.Next, after the antigen solution was removed, 100 μl of PBS containing 1% Scheme Milk (Sigma, USA) was again dispensed into the well of the microplate to which the antigen was attached, and incubated at 37 ° C. for 1 hour, followed by a humidity of 10 It was used after drying for 4 hours in a dryer of less than%.
실시예3Example 3 : : PRRSVPRRSV 의 검출Detection
유럽형 PRRSV에 대한 항체 양성 항혈청 10 검체, 북미형 PRRSV에 대한 항체 양성 항혈청 10 검체, PRRSV에 대한 항체 음성 혈청 10 검체를 이용하여 PRRSV 항체에 대한 검사를 효소면역측정법 (ELISA)을 이용하여 실시하였다.The test for PRRSV antibodies was carried out using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using 10 antibody positive antiserum 10 samples for European PRRSV, 10 antibody positive antiserum samples for North American PRRSV, and 10 antibody negative serum sera against PRRSV.
검체 희석용 튜브에 0.39㎖의 검체 희석액을 각 튜브에 분주한 다음, 3종의 항혈청 샘플을 검체 희석액이 들어있는 튜브에 10㎕씩 분주하여 40배 희석하였다. 이어 유전자 재조합 US5C3+EU7TC2 항원이 코팅되어 있는 플레이트에 희석한 혈청 샘플을 각 웰에 100㎕씩 분주하였다. 실온 (18 내지 25℃)에서 30분간 반응시킨 후 0.5% 트윈20이 함유된 PBS (pH 7.2) 용액으로 플레이트를 5회 세척한 후 염소-항-돼지 항체-HRP 접합체액을 플레이트 각 웰에 100㎕씩 넣고 실온 (18 내지 25℃)에서 30분간 반응시켰다. 반응이 끝난 다음 각 웰의 내용물을 흡입해 내고 0.5% 트윈20이 함유된 PBS (pH 7.2) 용액으로 5회 세척하고 0.002% 테트라메칠벤지딘 기질액을 모든 웰에 100㎕씩 넣고 빛을 차단한 후 15분간 실온 (18 내지 25℃)에서 반응시켜 색깔 변화를 관찰하였다. 반응 후 1노르말 황산을 첨가하고 흡광도계 (sunrise basic tecan)를 이용하여 검체의 흡광도를 측정하였다.0.39 ml of sample dilution was dispensed into each tube in a sample dilution tube, and then three antiserum samples were diluted 40-fold by dispensing 10 μl into a tube containing the sample dilution. Subsequently, 100 μl of serum samples diluted in the plate coated with the recombinant US5C3 + EU7TC2 antigen were dispensed into each well. After 30 minutes of reaction at room temperature (18-25 ° C.), the plate was washed 5 times with PBS (pH 7.2) solution containing 0.5% Tween 20, and then goat-anti-pig antibody-HRP conjugate was added to each plate 100 Μl was added and reacted at room temperature (18-25 ° C.) for 30 minutes. After the reaction, the contents of each well were aspirated, washed 5 times with 0.5% Tween20-containing PBS (pH 7.2) solution, and 100 μl of 0.002% tetramethylbenzidine substrate solution was added to all wells. The color change was observed by reacting at room temperature (18-25 degreeC) for 15 minutes. After the reaction, 1 normal sulfuric acid was added and the absorbance of the sample was measured by using an absorbometer (sunrise basic tecan).
효소면역측정법 (ELISA) 역가값은 S/P 값을 사용했으며, S/P 값은 다음과 같이 계산하였다.The enzyme immunoassay (ELISA) titer was calculated using the S / P value, and the S / P value was calculated as follows.
S/P 값이 0.4 이상이면 양성, 0.4 미만이면 음성으로 판정하였다. 검사 결과 유럽형 PRRSV에 대한 항체 양성 항혈청 검체 10 개체와 북미형 PRRSV에 대한 항체양성 항혈청 검체 10개체 모두 PRRSV 항체 양성으로 판정되었으며, PRRSV에 대한 항체 음성 혈청 10 검체는 모두 항체 음성으로 판정되었다 (표 2).Positive S / P values of 0.4 or greater were considered positive. As a result, all 10 antibody positive antiserum samples for European PRRSV and 10 antibody positive antiserum samples for North American PRRSV were positive for PRRSV antibody, and all 10 antibody negative serum sera against PRRSV were antibody negative (Table 2). ).
따라서, 본 발명에 사용된 정제된 유전자 재조합 US5C3+EU7TC2 항원은 유럽형 PRRSV에 대한 항체 양성 항혈청 검체와 북미형 PRRSV에 대한 항체 양성 항혈청 검체를 효율적으로 검출하는데 사용될 수 있었다.Thus, the purified genetically modified US5C3 + EU7TC2 antigen used in the present invention could be used to efficiently detect antibody positive antiserum samples for European PRRSV and antibody positive antiserum samples for North American PRRSV.
실시예Example 4: 4: PRRSVPRRSV 에 대한 For 폴리클론Polyclonal 항체의 생산 Production of antibodies
토끼 한 마리당 1 mg의 유전자 재조합 US5C3+EU7TC2 항원과 동량의 완전 프로인드 어주반트 (complete Freund's adjuvant)를 혼합하여 유제를 제조하고, 해당 유제를 토끼의 피하에 주사하여 면역시켰다. 면역은 1회당 1 mg의 상기 재조합 항원이 투여되도록 실시하고, 일주일 간격으로 5회 투여하였다. 최종 면역을 종료한지 1주일 후에 면역시킨 토끼의 전혈을 채집하고, 항혈청을 제조하였다. 상기 항혈청으로부터 폴리클론 항체는 다음과 같이 분리하였다. 먼저, 상기 토끼의 면역에 사용한 유전자 재조합 US5C3+EU7TC2 항원 단백질을 HiTrapTM NHS-activated column (Amersham Pharmacia)에 공유 결합에 의하여 고정화시켰다. 다음으로, 상기 재조합 항원이 고정화된 칼럼에 상기 항혈청을 로딩하여, 상기 재조합 항원과 폴리클론 항체 사이의 복합체를 형성시키고, 상기 복합체로부터 0.1M 글리신-HCl (pH 2.7)을 용출 용액으로 사용하여 상기 폴리클론 항체를 용출시켜, 폴리클론 항체를 얻었다 (도 4). 도 4는 재조합 US5C3+EU7TC2 항원에 대한 토끼 폴리클론 항체의 SDS-PAGE (좌측) 및 웨스턴 블롯 (우측) 결과를 나타내는 도면이다. 도 4에서, M은 마커이며, 레인1과 2는 각각 정제된 재조합 US5C3+EU7TC2 항원을 나타낸다. Emulsions were prepared by mixing 1 mg of the recombinant US5C3 + EU7TC2 antigen per rabbit in the same amount and complete Freund's adjuvant, and the emulsion was immunized by injection into the rabbit subcutaneously. Immunization was performed such that 1 mg of the recombinant antigen was administered once, and 5 times at weekly intervals. One week after the end of final immunization, whole blood of immunized rabbits was collected and antiserum was prepared. Polyclonal antibodies were isolated from the antisera as follows. First, the recombinant US5C3 + EU7TC2 antigen protein used for immunization of the rabbit was immobilized by covalent binding to a HiTrap ™ NHS-activated column (Amersham Pharmacia). Next, the antiserum is loaded onto a column immobilized with the recombinant antigen to form a complex between the recombinant antigen and a polyclonal antibody, and 0.1M glycine-HCl (pH 2.7) is used as the elution solution from the complex. Polyclonal antibody was eluted to obtain a polyclonal antibody (Fig. 4). 4 shows the SDS-PAGE (left) and western blot (right) results of rabbit polyclonal antibodies against recombinant US5C3 + EU7TC2 antigen. In Figure 4, M is a marker and
실시예Example 5: 5: PRRSVPRRSV 에 대한 For 폴리클론Polyclonal 항체를 사용한 With antibody PRRSVPRRSV 항원검출 실험 Antigen Detection Experiment
PRRSV 항원의 검출을 위하여 대상이 되는 돼지의 혈청을 샌드위치 효소면역 측정법에 이용하였다. 유럽형 PRRSV 양성 혈청, 북미형 PRRSV 양성 혈청, PRRSV 항원 음성 혈청과 항 PRRSV 폴리클론 항체에 호스래디쉬 퍼옥시다제를 결합시킨 접합체액을 동시에 항 PRRS 폴리클론 항체가 코팅된 플레이트에서 반응시켰다. 플레이트를 60분 동안 37℃에서 반응시키고, 반응이 끝난 후 각 웰의 내용물을 흡입해 내고 0.5% 트윈20이 함유된 PBS (pH 7.2) 용액으로 5회 세척하고 0.002% 테트라메틸벤지딘 기질액을 모든 웰에 100㎕씩 넣고 빛을 차단한 후 15분간 실온 (18 내지 25℃)에서 반응시켜 색깔 변화를 관찰하였다. 반응 후 1N 황산을 첨가하고 흡광도계 (sunrise basic tecan)를 이용하여 검체의 흡광도를 측정하였다.For detection of the PRRSV antigen, the serum of the target pig was used for the sandwich enzyme immunoassay. Conjugate fluids in which horseradish peroxidase was conjugated to European PRRSV positive serum, North American PRRSV positive serum, PRRSV antigen negative serum, and anti-PRRSV polyclonal antibody were simultaneously reacted on a plate coated with anti-PRRS polyclonal antibody. The plates were allowed to react at 37 ° C. for 60 minutes, after which the contents of each well were aspirated and washed 5 times with PBS (pH 7.2) solution containing 0.5% Tween20 and the 0.002% tetramethylbenzidine substrate solution 100 μl each well was added to block the light and reacted at room temperature (18-25 ° C.) for 15 minutes to observe color change. After the reaction, 1N sulfuric acid was added and the absorbance of the sample was measured by using an absorbometer (sunrise basic tecan).
효소면역측정법 (ELISA) 역가값은 S/P값을 사용했으며, S/P 값은 다음과 같이 계산하였다.The enzyme immunoassay (ELISA) titer was calculated using the S / P value, and the S / P value was calculated as follows.
S/P 값이 0.4 이상이면 양성, 0.4 미만이면 음성으로 판정하였다. 검사 결과 유럽형 PRRSV를 가지고 있는 혈청과 북미형 PRRSV를 가지고 있는 혈청은 PRRSV 양성으로 판정되었으며, PRRSV에 대한 음성 혈청은 음성으로 판정되었다(표 3).Positive S / P values of 0.4 or greater were considered positive. As a result of the test, serum with European PRRSV and serum with North American PRRSV were positive for PRRSV and negative for PRRSV was negative (Table 3).
따라서, 본 발명에 사용된 정제된 유전자 재조합 US5C3+EU7TC2에 대한 폴리클로날 항체는 유럽형 PRRSV에 대한 양성 혈청 검체와 북미형 PRRSV에 대한 양성 혈청 검체를 효율적으로 검출하는데 사용될 수 있었다.Therefore, the polyclonal antibodies against purified genetically recombinant US5C3 + EU7TC2 used in the present invention could be used to efficiently detect positive serum samples for European PRRSV and positive serum samples for North American PRRSV.
<110> Bionote, Inc. <120> An isolated protein comprising north Ameican type PRRSV antigen and European thpe PRRSV antigen and use thereof <130> PN091741 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antigen derived from a fusion of US5C3 and EU7TC2 <400> 1 Met Met Ser Trp Arg Tyr Ala Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe Leu Leu 1 5 10 15 Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile Ile Glu 20 25 30 Lys Arg Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu Lys Arg 35 40 45 Val Val Gly Ser Met Ala Gly Lys Asn Gln Ser Gln Lys Lys Lys Lys 50 55 60 Ser Thr Ala Pro Met Gly Asn Gly Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln 65 70 75 80 Leu Leu Gly Ala Met Ile Lys Ser Gln Arg Gln Gln Pro Arg Gly Gly 85 90 95 Gln Ala Lys Lys Lys Lys Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Ala 100 105 110 Glu Asp Asp Ile Arg His His Leu Thr Gln Thr Glu Arg Ser Leu Cys 115 120 125 Leu Gln Ser Ile Gln Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Ala Ser 130 135 140 Leu Ser Ser Ser Gly Lys Val Ser Phe Gln Val 145 150 155 <210> 2 <211> 50 <212> PRT <213> PRRSV VR2332 <400> 2 Met Met Ser Trp Arg Tyr Ala Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe Leu Leu 1 5 10 15 Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile Ile Glu 20 25 30 Lys Arg Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu Lys Arg 35 40 45 Val Val 50 <210> 3 <211> 150 <212> DNA <213> PRRSV VR2332 <400> 3 atgatgtcct ggcgctacgc atgtaccaga tataccaact ttcttctgga tactaagggt 60 agactctatc gttggcggtc gcctgtcatc atagagaaaa ggggcaaagt tgaggtcgaa 120 ggtcatctga tcgacctcaa aagagttgtg 150 <210> 4 <211> 103 <212> PRT <213> PRRSV Lelystad <400> 4 Met Ala Gly Lys Asn Gln Ser Gln Lys Lys Lys Lys Ser Thr Ala Pro 1 5 10 15 Met Gly Asn Gly Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Leu Leu Gly Ala 20 25 30 Met Ile Lys Ser Gln Arg Gln Gln Pro Arg Gly Gly Gln Ala Lys Lys 35 40 45 Lys Lys Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Ala Glu Asp Asp Ile 50 55 60 Arg His His Leu Thr Gln Thr Glu Arg Ser Leu Cys Leu Gln Ser Ile 65 70 75 80 Gln Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Ala Ser Leu Ser Ser Ser 85 90 95 Gly Lys Val Ser Phe Gln Val 100 <210> 5 <211> 309 <212> DNA <213> PRRSV Lelystad <400> 5 atggccggta aaaaccagag ccagaagaaa aagaaaagta cagctccgat ggggaatggc 60 cagccagtca atcaactgtg ccagttgctg ggtgcaatga taaagtccca gcgccagcaa 120 cctaggggag gacaggccaa aaagaaaaag cctgagaagc cacattttcc cctggctgct 180 gaagatgaca tccggcacca cctcacccag actgaacgct ccctctgctt gcaatcgatc 240 cagacggctt tcaatcaagg cgcaggaact gcgtcgcttt catccagcgg gaaggtcagt 300 tttcaggtt 309 <210> 6 <211> 465 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion gene <400> 6 atgatgtcct ggcgctacgc atgtaccaga tataccaact ttcttctgga tactaagggt 60 agactctatc gttggcggtc gcctgtcatc atagagaaaa ggggcaaagt tgaggtcgaa 120 ggtcatctga tcgacctcaa aagagttgtg ggatctatgg ccggtaaaaa ccagagccag 180 aagaaaaaga aaagtacagc tccgatgggg aatggccagc cagtcaatca actgtgccag 240 ttgctgggtg caatgataaa gtcccagcgc cagcaaccta ggggaggaca ggccaaaaag 300 aaaaagcctg agaagccaca ttttcccctg gctgctgaag atgacatccg gcaccacctc 360 acccagactg aacgctccct ctgcttgcaa tcgatccaga cggctttcaa tcaaggcgca 420 ggaactgcgt cgctttcatc cagcgggaag gtcagttttc aggtt 465 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer US5C3 F <400> 7 ggatccatga tgtcctggcg ctac 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer US5C3 R <400> 8 gtcgacttac acaactcttt tgag 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer EU7TC2 F <400> 9 ggatccatgg ccggtaaaaa ccag 24 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer EU7TC2 R <400> 10 gtcgacttaa acctgaaaac tgacctt 27 <110> Bionote, Inc. <120> An isolated protein comprising north Ameican type PRRSV antigen and European thpe PRRSV antigen and use <130> PN091741 <160> 10 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antigen derived from a fusion of US5C3 and EU7TC2 <400> 1 Met Met Ser Trp Arg Tyr Ala Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe Leu Leu 1 5 10 15 Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile Ile Glu 20 25 30 Lys Arg Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu Lys Arg 35 40 45 Val Val Gly Ser Met Ala Gly Lys Asn Gln Ser Gln Lys Lys Lys Lys 50 55 60 Ser Thr Ala Pro Met Gly Asn Gly Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln 65 70 75 80 Leu Leu Gly Ala Met Ile Lys Ser Gln Arg Gln Gln Pro Arg Gly Gly 85 90 95 Gln Ala Lys Lys Lys Lys Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Ala 100 105 110 Glu Asp Asp Ile Arg His His Leu Thr Gln Thr Glu Arg Ser Leu Cys 115 120 125 Leu Gln Ser Ile Gln Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Ala Ser 130 135 140 Leu Ser Ser Ser Gly Lys Val Ser Phe Gln Val 145 150 155 <210> 2 <211> 50 <212> PRT <213> PRRSV VR2332 <400> 2 Met Met Ser Trp Arg Tyr Ala Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe Leu Leu 1 5 10 15 Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile Ile Glu 20 25 30 Lys Arg Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu Lys Arg 35 40 45 Val Val 50 <210> 3 <211> 150 <212> DNA <213> PRRSV VR2332 <400> 3 atgatgtcct ggcgctacgc atgtaccaga tataccaact ttcttctgga tactaagggt 60 agactctatc gttggcggtc gcctgtcatc atagagaaaa ggggcaaagt tgaggtcgaa 120 ggtcatctga tcgacctcaa aagagttgtg 150 <210> 4 <211> 103 <212> PRT <213> PRRSV Lelystad <400> 4 Met Ala Gly Lys Asn Gln Ser Gln Lys Lys Lys Lys Ser Thr Ala Pro 1 5 10 15 Met Gly Asn Gly Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Leu Leu Gly Ala 20 25 30 Met Ile Lys Ser Gln Arg Gln Gln Pro Arg Gly Gly Gln Ala Lys Lys 35 40 45 Lys Lys Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Ala Glu Asp Asp Ile 50 55 60 Arg His His Leu Thr Gln Thr Glu Arg Ser Leu Cys Leu Gln Ser Ile 65 70 75 80 Gln Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Ala Ser Leu Ser Ser Ser 85 90 95 Gly Lys Val Ser Phe Gln Val 100 <210> 5 <211> 309 <212> DNA <213> PRRSV Lelystad <400> 5 atggccggta aaaaccagag ccagaagaaa aagaaaagta cagctccgat ggggaatggc 60 cagccagtca atcaactgtg ccagttgctg ggtgcaatga taaagtccca gcgccagcaa 120 cctaggggag gacaggccaa aaagaaaaag cctgagaagc cacattttcc cctggctgct 180 gaagatgaca tccggcacca cctcacccag actgaacgct ccctctgctt gcaatcgatc 240 cagacggctt tcaatcaagg cgcaggaact gcgtcgcttt catccagcgg gaaggtcagt 300 tttcaggtt 309 <210> 6 <211> 465 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion gene <400> 6 atgatgtcct ggcgctacgc atgtaccaga tataccaact ttcttctgga tactaagggt 60 agactctatc gttggcggtc gcctgtcatc atagagaaaa ggggcaaagt tgaggtcgaa 120 ggtcatctga tcgacctcaa aagagttgtg ggatctatgg ccggtaaaaa ccagagccag 180 aagaaaaaga aaagtacagc tccgatgggg aatggccagc cagtcaatca actgtgccag 240 ttgctgggtg caatgataaa gtcccagcgc cagcaaccta ggggaggaca ggccaaaaag 300 aaaaagcctg agaagccaca ttttcccctg gctgctgaag atgacatccg gcaccacctc 360 acccagactg aacgctccct ctgcttgcaa tcgatccaga cggctttcaa tcaaggcgca 420 ggaactgcgt cgctttcatc cagcgggaag gtcagttttc aggtt 465 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer US5C3 F <400> 7 ggatccatga tgtcctggcg ctac 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer US5C3 R <400> 8 gtcgacttac acaactcttt tgag 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer EU7TC2 F <400> 9 ggatccatgg ccggtaaaaa ccag 24 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer EU7TC2 R <400> 10 gtcgacttaa acctgaaaac tgacctt 27
Claims (15)
상기 발현된 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 분리된 단백질을 생산하는 방법.Culturing the host cell into which the nucleic acid according to claim 4 is introduced to express the protein; And
Isolating the expressed protein, the method of producing an isolated protein.
상기 단백질과 항-PRRSV 항체의 복합체의 존재를 검출하는 단계 및
상기 복합체가 존재하는 것으로 검출된 경우, 상기 시료는 항-PRRSV 항체를 포함하는 것으로 결정하고, 상기 복합체가 존재하지 않는 것으로 검출된 경우, 상기 시료는 항-PRRSV 항체를 포함하지 않는 것으로 결정하는 단계를 포함하는, 시료 중의 항-PRRSV 항체를 검출하는 방법.Contacting the protein according to any one of claims 1 to 3 with a sample suspected of containing an anti-PRRSV antibody;
Detecting the presence of a complex of said protein with an anti-PRRSV antibody and
If it is detected that the complex is present, the sample is determined to contain an anti-PRRSV antibody, and if it is detected that the complex is not present, determining that the sample does not contain an anti-PRRSV antibody A method for detecting an anti-PRRSV antibody in a sample comprising a.
상기 동물로부터 상기 단백질에 결합하는 항체를 분리하는 단계를 포함하는, 항체를 생산하는 방법.Administering the protein according to claim 1 to a mammalian animal which is not a human; And
Separating the antibody that binds to the protein from the animal.
상기 항체와 PRRSV 항원의 복합체를 검출하는 단계; 및
상기 복합체가 존재하는 것으로 검출된 경우, 상기 시료는 PRRSV 항원을 포함하는 것으로 결정하고, 상기 복합체가 존재하지 않는 것으로 검출된 경우, 상기 시료는 PRRSV 항원을 포함하지 않는 것으로 결정하는 단계를 포함하는, 시료 중의 PRRSV 항원을 검출하는 방법.Contacting the antibody obtained according to the method of claim 11 with a sample suspected of containing a PRRSV antigen;
Detecting a complex of the antibody with a PRRSV antigen; And
Determining that the sample contains a PRRSV antigen when the complex is present, and determining that the sample does not contain a PRRSV antigen when it is detected that the complex is not present. A method of detecting PRRSV antigen in a sample.
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KR20020015919A (en) * | 2000-08-23 | 2002-03-02 | 김현수 | A combined-antigen ELISA using the ORF5- and ORF7recombinant proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus |
US6592870B2 (en) * | 1996-12-30 | 2003-07-15 | Inmunologia Y Genetica Aplicada, S. A. | Method and kit using recombinant proteins in fusion of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and for diagnosis |
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2011
- 2011-01-07 KR KR1020110001916A patent/KR101258611B1/en active IP Right Grant
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