KR101256943B1 - P５ peptide having antialgae activity against organism induced red tide and the use of the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 적조 방제 활성을 갖는 항적조 펩타이드 P5에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명에 의한 항적조 펩타이드는 적조 유발 조류에 대하여 탁월한 항적조 활성을 나타내고, 유익한 조류에는 독성이 없으며, 자연 분해가 가능하므로 해양 생태계에 안전하고 유용하게 사용될 수 있다. The present invention relates to a tide peptide P5 having a red tide control activity, and more specifically, the tide peptide according to the present invention exhibits excellent tide activity against red tide-inducing algae, and is not toxic to beneficial algae, and can be naturally degraded. Therefore, it can be used safely and usefully in marine ecosystems.
Description
본 발명은 적조 생물의 생육을 저해하는 활성을 갖는 항적조 펩타이드 및 이를 함유하는 적조 방제용 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to an anti-red tide peptide having an activity of inhibiting the growth of red tide organisms and a composition for controlling red tide containing the same.
적조란(Red tides 또는 Harmful Algal Blooms) 바다에 사는 플랑크톤이 대량 번식하여 바닷물 색깔을 갈색이나 빨간색으로 변색시키며 생태계를 파괴시키는 현상이다. 적조생물의 종류는 전 세계적으로 200종이 넘고 우리나라 연안에서 나타나는 적조생물은 40종 여종이다. 적조로 인한 피해는 크게 두 가지로 나룰 수 있는데 첫째는 어패류의 대량폐사나 인명피해이고, 또 하나는 관광산업의 피해이다. 구체적으로 살펴보면, 적조생물이 독성이 있는 유독성일 경우 어폐류들이 먹이를 잡기 위하여 물을 빨아들이는 과정에서 유독성 적조생물을 먹으면 독소에 중독이 되고 결국 죽게 된다. 적조생물이 대량으로 번식한 뒤 질소, 인 등 영양염류를 다 써 버리면 일시에 죽어 해저에 가라앉게 되는데 이때 세균들이 이들을 분해하며 이 분해과정에서 세균들이 산소를 모두 써버리고 결국 해저는 무산소 상태가 되는데 운동성이 크게 떨어지는 패류들은 질식하여 죽게 된다. 또한, 적조는 주로 수온이 높고 바람이 세지 않은 늦봄과 여름에 자주 발생한다. 이 시기는 많은 관광객들이 해변을 찾아 수영을 하거나 구경을 하는 때인데 관광객들이 수영할 때 독성 적조생물이 들어 있는 물을 마시고 죽거나 마비가 될 수 있어 미국과 스페인, 이탈리아 등 많은 유럽 국가들은 해수욕장을 폐쇄하므로 관광수입에 막대한 피해를 준다. 우리나라의 경우 남해안의 넓은 해역에서 발생하며 남해안에서 일어나던 적조가 동해, 서해안에서도 발생하고 있다. 특히 서해안의 경우 1993년부터 천수만에서, 1995년부터는 전북연안에서 적조가 해마다 반복적으로 발생하고 있는데 1998년부터는 유해성 적조가 대규모로 발생하고 있다.
Red tides (Red tides or Harmful Algal Blooms) Plankton that lives in the oceans reproduces in large quantities, discoloring the water color to brown or red and destroying the ecosystem. There are more than 200 species of red tide creatures around the world, and about 40 species of red tide creatures appear off the coast of Korea. The damage caused by the red tide can be divided into two categories: firstly, large-scale death or damage of fish and shellfish, and second, damage to the tourism industry. Specifically, if the red tide is toxic and toxic, fish and fish eat poisonous red tide in the process of sucking water to catch food, and the poisoning of the toxin eventually occurs. When the red tide breeds in large quantities and consumes nutrients such as nitrogen and phosphorus, they die at once and sink to the seabed. At this time, the bacteria break down them, and during this decomposition, the bacteria use up all of the oxygen and the bottom becomes anoxic. Shellfish that are highly motile will suffocate and die. Red tide also occurs frequently in late spring and summer, when the water temperature is high and not windy. This is the time when many tourists go swimming or watching the beach. When swimming, many European countries such as the United States, Spain, and Italy shut down the beach because they can drink water containing toxic red tide and die or become paralyzed. As a result, tourism damages are enormous. In Korea, it occurs in a large area of the south coast Red tide that occurred on the south coast occurs on the east and west coasts. In particular, in the west coast, red tide has been generated annually in Cheonsu Bay since 1993 and Chonbuk coast since 1995. Since 1998, red tide has been occurring in large quantities.
씨. 폴리크리코이데스 종은 푸에르토 리코(Puert) 연안에서 처음 발견되었으며(Margalef, 1961), 이후 북미 대서양 연안의 뉴저지주 바메가트(Bamegat)만과 미국 캘리포티아 연안에서 적조를 유발한 C. heterolobatum(Silva, 1967)과 같은 종으로 간주되고 있다. 이 종은 일본의 하리마 나다(Harima Nada)와 구주의 야츠시로(Yatsushiro)만에서 적조를 일으켜 수산피해를 일으킨 이래(Yuki and Yoshimatsu, 1989), 일본 중부와 서부 연안에서도 적조를 일으켰다고 보고되었다(Fukuyo et al., 1990). 최근 캐나다(Whyte et al., 2000), 멕시코의 캘리포니아만(Gulf of California)(Carate Lizarraga et al., 2000), 및 중남미의 구아테말라(Guatemala)의 태평양 연안에서도 적조를 일으킨다고 보고되었다. 또한 와편모조류에 속하는 피. 미니멈(P. minimum), 및 피. 미캔스(P. micans)와 침편모조강에 속하는 에이치. 아카쉬우(H. akshiwo), 샤또넬라 에스피(Chattonella sp.) 및 씨. 마리나(C. marina) 역시 적조를 유발한다고 알려져 있다. 샤또넬라 에스피(Chattonella sp.)의 경우 적조생물밀도가 50 이상일 때, 반경 2 ~ 5Km 수역에 걸쳐 발생하고 어업피해가 우려되어 적조주의보가 발령되며, 적조생물밀도가 100 이상일 때에는 반경 5Km이상 수역에 발생하여 상당한 어업피해가 예상되어 적조경보가 발령된다.
Seed. Polycricoides was first discovered on the coast of Puerto Rico (Margalef, 1961), and then on C. heterolobatum (Silva), which caused red tide in the Bay of Bayegat, New Jersey, and the coast of California, USA. , 1967). This species has been reported to have caused red tide in Harima Nada and Japan's Yatsushiro Bay, where it caused fisheries damage (Yuki and Yoshimatsu, 1989), as well as in central and western Japan. (Fukuyo et al., 1990). It has recently been reported to cause red tide in Canada (Whyte et al., 2000), the Gulf of California in Mexico (Carate Lizarraga et al., 2000), and the Pacific coast of Guatemala in Latin America. Blood also belonging to coccyx. Minimum (P. minimum), and f. H. belonging to P. micans and needle-jointed steel. H. akshiwo , Chattonella sp .) and seeds. Marina ( C. marina ) is also known to cause red tide. Chattonella Esp In case of sp .), when the red tide density is over 50, it occurs over the 2 ~ 5Km radius of water, and the red tide advisory is issued due to fear of fishery damage. A red tide alarm is issued as expected.
현재까지 적조를 예방하거나 적조로 인한 피해를 줄이기 위한 여러 가지 방법들이 연구되었다. 화학약품을 뿌리거나 초음파 분쇄기, 오존 발생기, 원심분리기를 사용하여 화학적, 물리적으로 적조생물을 없애는 방법이 있다. 또한 점토를 이용하여 적조 원인생물을 흡착시켜 바닥으로 침전시키는 방법도 개발되었다. 그러나 이런 방법들은 생태계에 또 다른 악영향을 미칠 수 있으며, 광범위한 적조 발생해역에서 이용되기에는 많은 문제점이 있다. 현재 적조 원인생물을 제거하는 생물학적 방법도 연구가 진행되고 있다. 이것은 생태계 내에서 피식자-포식자 관계를 이용해 원하지 않는 생물을 제거하는 방법이다. 그러나, 이 방법은 생태계의 먹이 사슬을 변화시켜 또 다른 문제점을 야기할 수도 있을 것이다. 또 다른 분야에서는 해양박테리아가 분비하는 물질에 의한 적조생물을 죽이는 방법도 활발히 연구되고 있다. 최근에는 단백질 합성저해제, 세포벽 저해제 및 세포막에 작용을 하는 항생제들을 사용하여 적조생물을 방제하는 시도를 하고 있다. 또는 이러한 물질들을 모델로 하여 인위적으로 저분자 물질들을 유기합성을 하여 생산하기도 하는데 이는 바다에서 분해가 되지 않고 축적되어 결국 농업부분에서 사용되는 농약에 의해 야기되는 문제점들처럼 해양 생태계나 바다에서 생산되는 먹거리들을 통해 인체에까지 축적될 것이다. To date, several methods have been studied to prevent red tide or reduce damage caused by red tide. Spraying chemicals, using ultrasonic grinder, ozone generator, or centrifugal separator to remove red tide organisms chemically and physically. Also, clay was used to adsorb red tide causative organisms and settle to the bottom. However, these methods can have another adverse effect on the ecosystem, and there are many problems to be used in a wide range of red tides. Currently, biological methods for removing red tide causative organisms are also being studied. This is how the predator-predator relationship is used to eliminate unwanted organisms within the ecosystem. However, this method may change the food chain of the ecosystem and cause other problems. In another field, methods for killing red tide by marine bacteria are also being actively studied. Recently, attempts have been made to control red tide organisms using protein synthesis inhibitors, cell wall inhibitors, and antibiotics that act on cell membranes. Alternatively, these materials can be modeled to produce artificially low-molecular substances that are organically synthesized, which are not decomposed in the sea and eventually accumulate in the marine ecosystem or in the sea, such as those caused by pesticides used in agriculture. Will accumulate in the human body.
이러한 문제점들을 고려해볼 때 자연분해가 가능하며 인체나 자연 생태계에 무해한 항적조제로써 사용될 수 있는 것이 펩타이드나 단백질제제이다. 이들은 또한 유전자 조작을 통하여 대량 발현하여 생산단가를 줄일 수 있을 뿐만 아니라 적조생물에 특이하게 부착하는 박테리아나 바이러스의 표면에 펩타이드를 발현하여 항적조 활성을 나타나게 할 수도 있을 것이다.
Considering these problems, it is possible to decompose naturally and to be used as a pharmaceutical preparation that is harmless to the human body or the natural ecosystem. They will also be able to reduce the production cost by mass expression through genetic manipulation, as well as express peptide activity on the surface of bacteria or viruses that specifically attach to red tide organisms.
현재까지 벌독으로부터 정제된 양친매성 알파 나선구조를 가지는 항균 펩타이드인 메스토파란 비(Mastoparan B)가 적조생물인 알렉산드리움 타마렌스(Alexandrium tamarense)와 샤토넬라 카테나튬(Chattonella catenatum)에 대해 살조효과를 확인된 바 있다. 그러나 이 펩타이드는 낮은 농도에서 세포독성이 높게 나타나는 것으로 보고되어 있다.
To date, the antimicrobial peptide, Mastoparan B, which has an amphiphilic alpha-helix structure purified from bee venom, has confirmed the effects of algae on Alexandrium tamarense and Chattonella catenatum , which are red tide organisms. It has been. However, the peptides have been reported to show high cytotoxicity at low concentrations.
세크로핀(Cecropin) 계열의 양친매성 펩타이드는 초파리에서 처음 발견되었고, 그 후 누에 번데기 및 돼지의 작은 창자에서도 발견되었는데, 세크로핀 A(Cecropin A)는 항균활성은 높으나 항진균 및 항암활성은 미미한 것으로 보고되었으며(Boman, H. G. and Hultmark, D., Annu . Rev . Microbiol., 1987, 41, 103), 또한 마가이닌 2(Magainin 2) 펩타이드는 세포독성이 없으면서 항균활성과 함께 항진균, 항암 및 항-원생생물 효과가 있다고 알려져 있다(Zasloff, M., Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 1987, 84, 5449). 아울러, 이러한 두 펩타이드의 일부 서열들을 재조합시킨 접합 펩타이드(conjugation peptide)를 제조하여 항균, 항진균 또는 항암 활성이 탁월한 새로운 합성 펩타이드(CA-MA 펩타이드)를 제조할 수 있음이 알려져 있다(Chan, H. C., et al., FEBS Lett., 1989, 259, 103; Wade, D., et al., Int. J. Pept . Prot . Res ., 1992, 40, 429). 이러한, CA-MA 펩타이드는 박테리아에 대하여 항생활성을 가지고 것으로 보고되었다. 상기 양전하성 펩타이드는 음전하를 띠는 박테리아의 세포막에 전기적인 상호작용에 의하여 결합하고 친수성과 소수성의 아미노산에 의해 양친매성 나선 구조를 가지게 세포막에 구멍을 뚫어 막전위를 변화시키거나 세포막을 파괴하여 항균활성을 가진다.
Cecropin family amphiphilic peptides were first discovered in fruit flies, and later in silkworm pupa and small intestines of pigs. Cecropin A has high antibacterial activity but little antifungal and anticancer activity. are reported to be (Boman, HG and Hultmark, D. , Annu. Rev. Microbiol., 1987, 41, 103), also Mark coix seed 2 (Magainin 2) peptides eopeumyeonseo cytotoxicity antifungal with antibacterial activity, anti-cancer and anti- Probiotic effects are known (Zasloff, M., Proc . Natl . Acad. Sci . USA , 1987, 84, 5449). In addition, it is known that a conjugation peptide (comjugation peptide) by recombining some sequences of these two peptides can be prepared to produce a new synthetic peptide (CA-MA peptide) having excellent antibacterial, antifungal or anticancer activity (Chan, HC, et al., FEBS Lett ., 1989, 259, 103; Wade, D., et al., Int. J. Pept . Prot . Res ., 1992, 40, 429). These CA-MA peptides have been reported to have antibiotics against bacteria. The positively charged peptide binds to the cell membrane of a negatively charged bacterium by an electrical interaction and punctures the cell membrane to have an amphiphilic helix structure by hydrophilic and hydrophobic amino acids to change the membrane potential or to destroy the cell membrane. Has
이에, 본 발명자들은 항적조 활성을 나타내고, 유익한 조류에 대한 독성이 없으며, 자연 분해가 가능한 항적조제를 개발하고자 예의 노력한 결과, 항균 효과가 알려진 CA-MA(Cecropin A - Magainin 2) 펩타이드의 아미노산 중 하나 또는 그 이상을 치환하여 양전하와 소수성 영역이 증가된 P5 펩타이드를 제작하여, 적조생물 및 유익한 규조류의 배양에 첨가하여, P5 펩타이드의 적조생물에 한정적인 항적조 활성을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have made efforts to develop a wake preparation that exhibits wake tide activity, is not toxic to beneficial algae, and is naturally degradable. As a result, the antimicrobial effect of CA-MA ( C ecropin A - Ma gainin 2) peptide is known. The present invention provides a P5 peptide having increased positive charge and hydrophobic region by substituting one or more amino acids, and is added to the culture of red tide and beneficial diatoms to confirm the anti-tide activity specific to the red tide of the P5 peptide. Was completed.
본 발명의 목적은 우수한 항적조 활성을 갖는 P5 펩타이드, 이의 제조방법 및 상기 펩타이드를 함유하는 항적조용 조성물을 제공하는 것이다.
It is an object of the present invention to provide a P5 peptide having excellent banding activity, a preparation method thereof and a composition for banding containing the peptide.
본 발명은 항적조 활성을 갖는, 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 P5 펩타이드를 제공한다.The present invention provides a P5 peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, which has a tide activity.
또한, 본 발명은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 P5 펩타이드의 제조방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing a P5 peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
아울러, 본 발명은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 P5 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 적조 방제용 조성물을 제공한다.
In addition, the present invention provides a composition for controlling red tide containing a P5 peptide having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 as an active ingredient.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 서열번호 2로 기재되는 P5 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항적조용 조성물은 적조유발 해조류에 탁월한 항조류 작용을 나타내었으며, 유익한 조류에 대해서는 항적조 활성을 나타내지 않으므로 해양 생태계에 안전한 항적조제로써 유용하게 사용될 수 있다.
As described above, the anti-algae composition containing the P5 peptide described in SEQ ID NO: 2 of the present invention as an active ingredient exhibited excellent anti-algae action against red algae-induced algae, and thus did not show anti-algae activity against beneficial algae. It can be usefully used as a safe wake preparation for the ecosystem.
도 1은 씨. 폴리크리코이데스(C. polykrikoides)에 대한 CA-MA와 P5 펩타이드의 항적조 활성을 현미경으로 관찰한 그림이다:
A: 펩타이드를 처리하지 않은 대조군;
B: CA-MA 펩타이드 64 μM을 처리한 군; 및
C: P5 펩타이드 8 μM을 처리한 군.
도 2는 씨. 마리나(C. marina)와 에이치. 아카쉬우(H. akashiwo)에 대한 CA-MA와 P5 펩타이드의 항적조 활성을 현미경으로 관찰한 그림이다:
도 2의 A는 씨. 마리나(C. marina) 에 대한 항적조 활성을 현미경으로 관찰한 그림이다;
1: P5 펩타이드 2μM을 처리한 군;
도 2의 B는 에이치. 아카쉬우(H. akashiwo)에 대한 항적조 활성을 현미경으로 관찰한 그림이다; 및
2: CA-MA 펩타이드 4 μM을 처리한 군.
도 3은 에스. 코스타툼(S. costatum)에 대한 본 발명의 CA-MA와 P5 펩타이드의 영향을 보여주는 그림이다:
A: 펩타이드를 처리하지 않은 대조군;
B: CA-MA 펩타이드 32 μM을 처리한 군; 및
C: P5 펩타이드 256 μM을 처리한 군.1 is seed. The microscopic observation of the activity of CA-MA and P5 peptides against C. polykrikoides :
A: control group not treated with peptide;
B: group treated with 64 μM of CA-MA peptide; And
C: group treated with 8 μM P5 peptide.
2 is seed. C. marina and H. Microscopic observations of the activity of CA-MA and P5 peptides against H. akashiwo :
2 is seed. Microscopic observation of wake activity on C. marina ;
1: group treated with 2 μM of P5 peptide;
2B is H. FIG. Microscopic observation of the activity of tide activity against H. akashiwo ; And
2: group treated with 4 μM of CA-MA peptide.
3 is S. Figure shows the effect of CA-MA and P5 peptides of the invention on S. costatum :
A: control group not treated with peptide;
B: group treated with 32 μM of CA-MA peptide; And
C: group treated with 256 μM of P5 peptide.
이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.
Hereinafter, terms used in the present invention will be described.
'적조 방제'란 항적제, 적조 방지, 살조 및 항조류 등의 여러가지 용어로 사용되며, 적조를 일으키는 조류(algae)의 생장을 억제하거나, 사멸시키거나, 운동성을 억제하는 등 조류의 증식을 막아 적조를 일으키는 현상을 제거하는 것을 의미한다. 또한, 보다 넓게는 적조를 일으키는 원인 조류를 사멸시키거나 생육을 억제한다는 의미도 포함한다.The term 'red tide control' is used in various terms such as drops, red tide prevention, algae and algae, and prevents the growth of algae such as inhibiting the growth of algae causing red tide, killing or inhibiting motility. It means to remove the phenomenon causing red tide. In addition, it also includes the meaning of killing or inhibiting growth of algae causing red tide.
'양친매성 펩타이드(amphipathic peptide)'은 친수성 및 소수성 지역이 혼재하고 펩타이드를 의미한다. 특히, 이러한 성질로 인해 친수성 부분은 물과 같은 극성 용매에 노출되도록 외부에 위치하고 소수성 부분은 단백질 내부에 위치하여 나선형 구조를 이룰 수 있는 펩타이드를 의미한다.
Amphipathic peptide (amphipathic peptide) refers to a peptide with a mixture of hydrophilic and hydrophobic regions. In particular, due to this property, the hydrophilic portion refers to a peptide that is externally exposed to a polar solvent such as water and the hydrophobic portion is located inside the protein to form a helical structure.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 항적조 활성을 갖는, 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 P5 펩타이드를 제공한다.The present invention provides a P5 peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, which has a tide activity.
본 발명의 P5 펩타이드는 세크로핀(Cecropin A, CA)과 마가이닌(Magainin 2, MA)을 접합시켜 제조한 서열번호 1로 기재되는 CA-MA(Cecropin A - Magainin 2) 펩타이드의 아미노산 중 하나 또는 그 이상을 치환하여 양전하와 소수성 영역이 증가된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. P5 peptide of the present invention is an amino acid of CA-MA ( C ecropin A - Ma gainin 2) peptide described in SEQ ID NO: 1 prepared by conjugating cecropin (Cecropin A, CA) and magainin (
구체적으로, 본 발명의 P5 펩타이드는 친화성 나선모양을 가진 CA(Cecropin A)의 1-8 아미노산 부위와 MA(Magainin 2)의 1-12 아미노산 부위를 접합한 서열번호 1로 기재되는 CA-MA 펩타이드의 하인즈 부위(hinge region)와 하나 또는 그 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하여 양전하와 소수성 영역이 증가된 합성 펩타이드인 것이 바람직하며, 서열번호 1로 기재되는 CA-MA 펩타이드의 하인즈 부위에 존재하는 글리신-이소루이신-글리신을 각각 프롤린으로 치환하고 4번째 류신, 8번째 이소루이신, 14번째 류신, 15번째 히스티딘 각각을 라이신으로, 5번째 페닐알라닌과 6번째 라이신, 12번째 라이신, 13번째 페닐알라닌, 16번째 세린, 17번째 알라닌, 20번째 페닐알라닌을 류신으로 치환하여 제조된 서열번호 2로 기재되는 펩타이드인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. Specifically, the P5 peptide of the present invention is CA-MA described by SEQ ID NO: 1 conjugating the 1-8 amino acid region of CA (Cecropin A) having an affinity spiral shape and the 1-12 amino acid region of MA (Magainin 2) It is preferable that the peptide is a synthetic peptide in which the positive charge and the hydrophobic region are increased by substituting the Hinge region and one or more amino acids with other amino acids, and are present in the Heinz region of the CA-MA peptide represented by SEQ ID NO: 1. Glycine-Isoleucine-Glycine is replaced with proline, respectively, and the fourth leucine, the eighth isoleucine, the 14th leucine, and the 15th histidine are lysine, the fifth phenylalanine, the sixth lysine, the 12th lysine, and the 13th phenylalanine. Most preferably, the peptide set forth in SEQ ID NO: 2 prepared by substituting leucine for the 16th serine, the 17th alanine, and the 20th phenylalanine. No.
본 발명의 P5 펩타이드는 씨. 폴리크리코이데스(C. polykrikoides), 씨. 마리나(C. marina)와 에이치. 아카쉬우(H. akashiwo)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 적조유발 해조류에 대하여 항적조 활성을 갖는 것이 바람직하며, 에스. 코스타튬(S. costatum)에 대하여 항적조 활성을 나타내지 않는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.The P5 peptide of the present invention is seed. C. polykrikoides , C. C. marina and H. It is preferable to have anti-algae activity against at least one red-induced algae selected from the group consisting of H. akashiwo , S. akashiwo . It is preferable not to exhibit the tide activity against costium ( S. costatum ), but is not limited thereto.
본 발명의 구체적이 실시예에서, 서열번호 1로 기재되는 CA-MA 펩타이드의 하인즈 부위에 존재하는 글리신-이소루이신-글리신을 각각 프롤린으로 치환하고 4번째 류신, 8번째 이소루이신, 14번째 류신, 15번째 히스티딘 각각을 라이신으로, 5번째 페닐알라닌과 6번째 라이신, 12번째 라이신, 13번째 페닐알라닌, 16번째 세린, 17번째 알라닌, 20번째 페닐알라닌을 류신으로 치환하여 제조된 서열번호 2로 기재되는 펩타이드를 제조하였다. 이와 같이 제조된 본 발명의 펩타이드를 분리·정제하고 그 순도를 확인한 결과 95% 이상의 순도를 나타내었으며, MALDI(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization) 질량 분석법을 이용하여 얻은 분자량이 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 분자량과 일치하는 것을 확인하였다(표 1 참조).In a specific embodiment of the present invention, glycine-isoleucine-glycine present in the Heinz site of the CA-MA peptide set forth in SEQ ID NO: 1 is replaced with proline and the fourth leucine, the eighth isoleucine, and the fourteenth Leucine, each of the 15th histidines with lysine, the 5th phenylalanine and the 6th lysine, the 12th lysine, the 13th phenylalanine, the 16th serine, the 17th alanine, and the 20th phenylalanine, prepared by substituting SEQ ID NO: 2 Peptides were prepared. As a result of separating and purifying the prepared peptide of the present invention and confirming its purity, the purity was over 95%, and the molecular weight obtained by using a matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry was calculated from the amino acid sequence. Was confirmed to match (see Table 1).
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명에 따른 P5 펩타이드가 CA-MA 펩타이드 보다 뛰어난 항적조 활성을 갖는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 적조생물에 대한 상기 두 종류의 펩타이드의 50% 생육 저해농도(50% of inhibitory concentration, IC50)를 측정하였다. 그 결과, 실험에 사용된 씨. 폴리크리코이데스(C. polykrikoides), 에이치. 아카쉬우(H. akashiwo), 샤또넬라 에스피(Chattonella sp), 씨. 마리나(C. marina), 피. 미니멈(P. minimum), 피. 미캔스(P. micans), 및 에스. 코스타튬(S. costatum) 적조생물에 대하여, CA-MA 펩타이드에 비하여 P5 펩타이드는 보다 낮은 농도에서 조류의 생육을 저해하는 것을 확인할 수 있었다(표 2 참조). 즉, P5 펩타이드는 CA-MA에 비하여 우수한 항적조 활성을 갖고 있음을 확인할 수 있었다.In addition, in a specific embodiment of the present invention, in order to confirm whether the P5 peptide according to the present invention has superior anti-tidal activity than the CA-MA peptide, the present inventors have inhibited the growth of 50% of the two types of peptides against red tide. The concentration (50% of inhibitory concentration, IC 50 ) was measured. As a result, seeds used in the experiment. C. polykrikoides , H. H. akashiwo and Chattonella sp ), seed. C. marina , blood. P ( minimum ), p. P. micans , and S. For S. costatum red tide, P5 peptides were found to inhibit algal growth at lower concentrations compared to CA-MA peptides (see Table 2). In other words, it was confirmed that the P5 peptide has superior anti-tanking activity compared to CA-MA.
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명에 따른 P5 펩타이드의 셀룰로우스(celluose) 세포벽을 가지고 있는 씨. 폴리크리코이데스(C. polykrikoides)에 대한 항적조 활성을 관찰하였다. 배양된 씨. 폴리크리코이데스의 배지에, CA-MA 펩타이드와 P5 펩타이드를 첨가하여 24시간 배양한 후 관찰한 결과, 64 μM CA-MA 펩타이드를 처리한 군에 비하여, 8 μM의 P5 펩타이드를 처리한 군에서 씨. 폴리크리코이데스의 외형 및 소기관들의 형태가 더욱 많이 사라지는 것을 관찰할 수 있었다(도 1 참조).In addition, in a specific embodiment of the present invention, a seed having a cellulose cell wall of the P5 peptide according to the present invention. A tide activity against C. polykrikoides was observed. Cultured seeds. As a result of culturing for 24 hours after adding CA-MA peptide and P5 peptide to the polycricoides medium, the group treated with 8 μM P5 peptide compared to the group treated with 64 μM CA-MA peptide Seed. It was observed that the appearance of polycrycoides and the shape of organelles disappeared more (see FIG. 1).
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, P5 펩타이드의 셀룰로우스 세포벽을 갖고 있지 않은 씨. 마리나(C. marina) 및 에이치. 아카쉬우(H. akashiwo)에 대한 항적조 활성을 관찰하였다. 씨. 마리나에는 P5 펩타이드를 2 μM 처리하였으며, 에이치. 아카쉬우(H. akashiwo)에는 CA-MA 펩타이드를 4 μM 처리하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, CA-MA 펩타이드를 처리한 에이치. 아카쉬우에 비하여, 낮은 농도로 처리한 P5 펩타이드에서 씨. 마리나의 외형 및 소기관들의 형태가 더욱 많이 무너지는 것을 관찰할 수 있었다(도 2 참조).Also in a specific embodiment of the invention, seeds that do not have the cellulose cell wall of the P5 peptide. Marina (C. marina) and HI. A tide activity against A. akashiwo was observed. Seed. Marina was treated with 2 μM P5 peptide, H. A. akashiwo was treated with 4 μM of CA-MA peptide. As a result, as shown in Figure 2, H-treated with CA-MA peptide. Seed from P5 peptides treated at lower concentrations compared to Akash. The appearance of the marina and the shape of the organelles could be observed more collapse (see Figure 2).
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명에 따른 P5 펩타이드를 유익한 규조류에 처리하여, 이의 항적조 활성이 적조생물에 한정되는 것임을 확인하고자 하였다. 에스. 코스타튬을 배양한 후, CA-MA 펩타이드(32 μM) 및 P5 펩타이드(256 μM)를 처리한 후, 광학현미경으로 관찰한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 배양 후 24시간 내지 72시간의 변화에도 상기 규조류의 변화가 관찰되지 않았다(도 3 참조).In addition, in a specific embodiment of the present invention, by treating the beneficial diatoms with the P5 peptide according to the present invention, it was intended to confirm that its antimicrobial activity is limited to red tide organisms. s. After culturing the Costatium, after treatment with CA-MA peptide (32 μM) and P5 peptide (256 μM), and observed with an optical microscope, as shown in Figure 3, the change from 24 hours to 72 hours after culture No change of the diatoms was observed (see FIG. 3).
따라서, 본 발명에 따른 P5 펩타이드는 유해한 적조생물에 대하여 항적조 활성을 가지고 있으며, 이러한 항적조 활성은 낮은 농도에서도 유효하게 작용되며, 보다 구체적으로 셀룰로우스 세포벽이 없는 적조생물부터, 셀룰로우스 세포벽을 갖는 적조생물에까지 항적조 활성을 보이며, 유익한 규조류에는 영향을 미치지 않기 때문에, P5 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 조성물을 항적조제로써 유용하게 사용될 수 있다.
Therefore, the P5 peptide according to the present invention has anti-algal activity against harmful red algae, and this active algae activity is effective even at low concentrations, and more specifically from red algae without cellulose cell wall, cellulose. Since it shows anti-tide activity even to red tide organisms having cell walls, and does not affect beneficial diatoms, a composition containing P5 peptide as an active ingredient can be usefully used as a drop preparation.
또한, 본 발명은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 P5 펩타이드의 제조방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing a P5 peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
본 발명의 P5 펩타이드는 세크로핀(Cecropin A, CA)과 마가이닌(Magainin 2, MA)을 접합시켜 제조한 서열번호 1로 기재되는 CA-MA 펩타이드의 아미노산 중 하나 또는 그 이상을 치환하여 양전하와 소수성 영역이 증가된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. P5 peptide of the present invention is positively charged by substituting one or more amino acids of the CA-MA peptide of SEQ ID NO: 1 prepared by conjugating Cecropin (Cecropin A, CA) and magainin (
구체적으로, 본 발명의 P5 펩타이드의 제조방법에 있어서, 친화성 나선모양을 가진 CA(Cecropin A)의 1-8 아미노산 부위와 MA(Magainin 2)의 1-12 아미노산 부위를 접합한 서열번호 1로 기재되는 CA-MA 펩타이드의 하인즈 부위(hinge region)와 하나 또는 그 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하여 양전하와 소수성 영역이 증가된 합성 펩타이드인 것이 바람직하며, 서열번호 1로 기재되는 CA-MA 펩타이드의 하인즈 부위에 존재하는 글리신-이소루이신-글리신을 각각 프롤린으로 치환하고 4번째 류신, 8번째 이소루이신, 14번째 류신, 15번째 히스티딘 각각을 라이신으로, 5번째 페닐알라닌과 6번째 라이신, 12번째 라이신, 13번째 페닐알라닌, 16번째 세린, 17번째 알라닌, 20번째 페닐알라닌을 류신으로 치환하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. Specifically, in the method for preparing the P5 peptide of the present invention, SEQ ID NO: 1 is obtained by conjugating 1-8 amino acid sites of CA (Cecropin A) having an affinity spiral shape and 1-12 amino acid sites of MA (Magainin 2). It is preferable that it is a synthetic peptide in which the positive region and the hydrophobic region are increased by replacing the HEINZ region and one or more amino acids of the CA-MA peptide described with other amino acids, and the CA-MA peptide of SEQ ID NO: 1 Glycine-isoleucine-glycine in the Heinz site was replaced with proline, respectively, and the fourth leucine, the eighth isoleucine, the 14th leucine, and the 15th histidine were lysine, the fifth phenylalanine and the sixth lysine, and the twelfth. Preferably, but not limited to, lysine, thirteenth phenylalanine, sixteenth serine, seventeenth alanine, and twentieth phenylalanine with leucine.
본 발명의 구체적인 실시예에서 확인할 수 있듯이, 상기와 같은 단계를 포함하는 제조단계에 의해서 서열번호 1로 기재되는 CA-MA 펩타이드의 아미노산을 치환하여 제조된 서열번호 2로 기재되는 P5 펩타이드는 적조 유발 조류에 대하여 우수한 항적조 활성을 보였다.
As can be seen in a specific embodiment of the present invention, the P5 peptide described in SEQ ID NO: 2 prepared by substituting the amino acid of the CA-MA peptide described in SEQ ID NO: 1 by the preparation step comprising the above step causes red tide It showed excellent wake tide activity against algae.
아울러, 본 발명은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 P5 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 적조 방제용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for controlling red tide containing a P5 peptide having an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 as an active ingredient.
본 발명의 P5 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 적조 방제용 조성물은 세크로핀(Cecropin A, CA)과 마가이닌(Magainin 2, MA)을 접합시켜 제조한 서열번호 1로 기재되는 CA-MA 펩타이드의 아미노산 중 하나 또는 그 이상을 치환하여 양전하와 소수성 영역이 증가된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. Red tide control composition containing the P5 peptide of the present invention as an active ingredient of the CA-MA peptide described in SEQ ID NO: 1 prepared by conjugating cecropin (Cecropin A, CA) and magainin (
구체적으로, 본 발명의 P5 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 적조 방제용 조성물은에 있어서, P5 펩타이드는 친화성 나선모양을 가진 CA(Cecropin A)의 1-8 아미노산 부위와 MA(Magainin 2)의 1-12 아미노산 부위를 접합한 서열번호 1로 기재되는 CA-MA 펩타이드의 하인즈 부위(hinge region)와 하나 또는 그 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하여 양전하와 소수성 영역이 증가된 합성 펩타이드인 것이 바람직하며, 서열번호 1로 기재되는 CA-MA 펩타이드의 하인즈 부위에 존재하는 글리신-이소루이신-글리신을 각각 프롤린으로 치환하고 4번째 류신, 8번째 이소루이신, 14번째 류신, 15번째 히스티딘 각각을 라이신으로, 5번째 페닐알라닌과 6번째 라이신, 12번째 라이신, 13번째 페닐알라닌, 16번째 세린, 17번째 알라닌, 20번째 페닐알라닌을 류신으로 치환하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. Specifically, in the composition for red tide control containing the P5 peptide of the present invention as an active ingredient, the P5 peptide is 1-8 amino acid region of CA (Cecropin A) having an affinity spiral shape and 1 of MA (Magainin 2). It is preferred that the peptide is a synthetic peptide having increased positive charge and hydrophobic region by replacing the HEINZ region and one or more amino acids of the CA-MA peptide described in SEQ ID NO: 1 conjugated with a -12 amino acid region, Glycine-isoleucine-glycine in the Heinz site of the CA-MA peptide set forth in SEQ ID NO: 1 was replaced with proline, respectively, and the fourth leucine, the eighth isoleucine, the 14th leucine, and the 15th histidine were each lysine. Replacing the fifth phenylalanine and the sixth lysine, the 12th lysine, the 13th phenylalanine, the 16th serine, the 17th alanine and the 20th phenylalanine with leucine It is preferable to include, but is not limited thereto.
상기 본 발명의 P5 펩타이드는 씨. 폴리크리코이데스(C. polykrikoides), 씨. 마리나(C. marina)와 에이치. 아카쉬우(H. akashiwo)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 적조유발 해조류에 대하여 항적조 활성을 갖는 것이 바람직하며, 에스. 코스타튬(S. costatum)에 대하여 항적조 활성을 나타내지 않는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.The P5 peptide of the present invention is seed. C. polykrikoides , C. C. marina and H. It is preferable to have anti-algae activity against at least one red-induced algae selected from the group consisting of H. akashiwo , S. akashiwo . It is preferable not to exhibit the tide activity against costium ( S. costatum ), but is not limited thereto.
상기 적조 방제용 조성물에 추가될 수 있는 성분으로는 이미 적조 방제용으로 사용하고 있는 황토가 바람직하다. 그러나 이에 한정되지 않고 본 발명의 적조 방제용 펩타이드를 해양에 적절히 분산 또는 중합체에 적절히 섞어진 상태로 분산시킴으로써 그 효과를 증진시킬 수 있는 것은 무엇이나 조성물에 추가될 수 있을 것이다.
As a component that can be added to the composition for controlling red tide, ocher already used for red tide control is preferable. However, the present invention is not limited thereto, and the red tide control peptide of the present invention may be added to the composition as long as it can enhance the effect by dispersing it in an appropriate state in the ocean or in an appropriate mixture with the polymer.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples and Experimental Examples.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
However, the following Examples and Experimental Examples are merely illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following Examples and Experimental Examples.
<실시예 1> 펩타이드의 합성 및 분리정제Example 1 Synthesis and Separation of Peptides
본 발명자들은 서열번호 2로 기재되는 본 발명의 P5 항적조 펩타이드를 합성하기 위하여, 세크로핀 에이(cecropin A)의 1 ~ 8 잔기와 마가이닌2(magainin 2)의 1-12 기를 접합하여 만든 CA-MA 펩타이드를 치환하여 라이신과 류신이 풍부한 펩타이드인 P5를 제조하였다(표1). The present inventors made by conjugating 1 to 8 residues of cecropin A and 1-12 groups of
본 발명의 P5 항적조 펩타이드는 서열번호 1로 기재되는 CA-MA 펩타이드의 하인즈 부위에 존재하는 글리신-이소루이신-글리신(Glycine-Isoleucine-Glycine)을 각각 프롤린(Proline)으로 치환하고 4번째 류신(Leucine), 8번째 이소루이신(Isoleucine), 14번째 류신(Leucine), 15번째 히스티딘(Histidine) 각각을 라이신(Lysine)으로, 5번째 페닐알라닌(Phenylalanine)과 6번째 라이신(Lysine), 12번째 라이신(Lysine), 13번째 페닐알라닌(Phenylalanine), 16번째 세린(Serine), 17번째 알라닌(Alanine), 20번째 페닐알라닌(Phenylalanine)을 류신(Leucine)으로 치환하여 제조하였다.The P5 locus peptide of the present invention substitutes proline for glycine-isosolecin-glycine, which is present at the Heinz site of the CA-MA peptide set forth in SEQ ID NO: 1, respectively, with proline. Leucine, 8th Isoleucine, 14th Leucine, 15th Histidine, Lysine, 5th Phenylalanine and 6th Lysine, 12th Lysine (Lysine), 13th phenylalanine (Phenylalanine), 16th serine (Serine), 17th alanine (Alanine), 20th phenylalanine (Phenylalanine) was prepared by replacing with leucine (Leucine).
펩타이드의 합성은 Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)를 아미노기 보호 용기로 이용하는 메리필드(Merrifield)의 액상 고상법을 사용하여 합성하였다. 본 발명의 펩타이드에서 카르복실말단이 -NH2 형태인 펩타이드는 링크 아미드 MBHA-레진(Rink Amide MBHA-Resin)을 출발물질로 사용하였다. Fmoc-아미노산의 커플링(coupling)에 의한 펩타이드 체인(chain)의 연장은 N-하이드록시벤조-트리아졸-디사이클로-헥시카르보이미드법(N-hydroxybenzo triazole-dicyclo-hexycarbodiimide)(HOBt-DCC)에 의하여 수행하였다. 각 펩타이드 아미노 말단의 Fmoc-아미노산을 커플링시킨 후, 20% 피페리딘/디메틸 포마마이드(piperidine/Dimethyl formamide, 이하 ‘DMF’라 약칭함) 용액으로 Fmoc기를 제거하고 DMP 및 디클로로메탄(dichoromethane, DCM)으로 여러 번 씻어준 다음 질소 가스로 건조시켰다. 건조시킨 레진에 트리플루오로아세틱산:페놀:티오아니졸:물:트리이소프로필실란(trifluoroacetic acid(TFA) : phenol : thioanisole : H2O : triisopropylsilane = 85: 5: 5: 2.5: 2.5(vol./vol.)) 용액을 첨가하고 4시간 동안 반응시켜 보호기를 제거하고, 레진으로부터 펩타이드를 분리시켰다. 그 뒤, 차가운 디에틸 에테르(diethyl ether)로 30분 동안 반응시킨 뒤, 원심분리기로 펩타이드를 침전시키고, 다시 디에틸 에테르로 침전된 펩타이드를 한번 더 씻어준 뒤 침전시킨 다음 공기 중에 건조시켰다. 상기 방법으로 얻은 크루드(crude)한 형태의 펩타이드를 pH 8인 암모늄 바이카보네이트(ammonium bicarbonate)에 녹여 아세토니트릴을 그레디언트(gradient)로하여 정제형 역상 HPLC 컬럼(reverse phase-HPLC column)(Delta Pak, C18 300Å, 19.0 mm × 30 cm, Waters)으로 정제하였다. 정제된 합성 펩타이드를 에드만 디그래데이션(Edman degradation)방법으로 아미노산 분석기(Hitachi 8500 A)로 아미노산의 조성을 측정하고, MALDI(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization) 질량 분석법을 이용하여 펩타이드의 분자량을 측정하였다.Peptide was synthesized using the liquid phase solidification method of Merrifield using Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl) as an amino group protective container. The carboxyl terminus of the peptide of the present invention is -NH 2 Peptide in form was used as a starting material Link Amide MBHA-Resin (Rink Amide MBHA-Resin). The extension of the peptide chain by coupling of Fmoc-amino acids is based on the N-hydroxybenzo triazole-dicyclo-hexycarbodiimide (HOBt-DCC). ). After coupling the Fmoc-amino acid of each peptide amino terminal, the Fmoc group was removed with 20% piperidine / dimethyl formamide (hereinafter abbreviated as 'DMF') solution, and DMP and dichoromethane, DCM) several times and dried with nitrogen gas. Trifluoroacetic acid: phenol: thioanisole: water: trifluoroacetic acid (TFA): phenol: thioanisole: H 2 O: triisopropylsilane = 85: 5: 5: 2.5: 2.5 (vol / vol.)) solution was added and reacted for 4 hours to remove the protecting group and to separate the peptide from the resin. Subsequently, after reacting with cold diethyl ether for 30 minutes, the peptide was precipitated by centrifugation. The peptide precipitated with diethyl ether was washed once more, precipitated, and dried in air. Crude form of the peptide obtained by the above method was dissolved in ammonium bicarbonate (pH 8) and acetonitrile was used as a gradient (reverse phase-HPLC column) (Delta Pak) , C 18 300 mm 3, 19.0 mm x 30 cm, Waters). The amino acid composition was measured by the amino acid analyzer (Hitachi 8500 A) by the Edman degradation method of the purified synthetic peptide, and the molecular weight of the peptide was measured by using the Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) mass spectrometry. .
그 결과, 본 발명에서 합성한 CA-MA와 P5 펩타이드는 95% 이상의 순도를 나타내었으며, MALDI 질량 분석법(Hill, et al ., Rapid Commun . Mass Spectrometry, 1991, 5, 395)을 이용하여 얻은 분자량이 아미노산 서열로부터 계산하여 얻은 분자량과 일치하므로 서열번호 2로 기재되는 정확한 아미노산 서열을 가지는 펩타이드가 합성되었음을 확인하였다.
As a result, the CA-MA and P5 peptides synthesized in the present invention showed a purity of 95% or more, and MALDI mass spectrometry (Hill, et al., Rapid Commun . Mass Spectrometry , 1991, 5, 395) was confirmed that the peptide having the correct amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 because the molecular weight obtained from the amino acid sequence is consistent with the obtained molecular weight.
<< 실험예Experimental Example 1> 1> 펩타이드의Peptide 항적조Trace 활성 측정 Active measurement
상기 <실시예 1>에서 합성한 모체 CA-MA와 P5 펩타이드의 항적조 활성을 측정하고자, 본 발명자들은 상기 두 펩타이드의 적조생물에 대한 50% 생육 저해농도를 측정하였다. 구체적으로, 항적조 활성을 측정하기 위한 적조생물로 한국해양미세조류은행에서 분양을 받은 씨. 폴리크리코이데스(C. polykrikoides), 에이치. 아카쉬우(H. akashiwo), 샤또넬라 에스피(Chattonella sp), 씨. 마리나(C. marina), 피. 미니멈(P. minimum), 피. 미캔스(P. micans), 및 에스. 코스타튬(S. costatum)을 사용하였다. 상기 각 조류를 F2 배지[150 ㎎ NaNO3, 8.69 ㎎ NaH2PO4·9H2O, 10 ㎎ ferric EDTA, 0.22 ㎎ MnCl2, 0.11 ㎎ CoCl2, 0.0196 ㎎ CuSO4·5H2O, ZnSO4·7H2O, 50 ㎎ Na2SiO3·9H2O, 0.012 ㎎ Na2MoO4·2H2O, 1 ㎍ Vitamine B12, 1 ㎍ Biotin, 0.2 ㎍ Thiamine·HCl / 1ℓ 필터된 해수]에서 배양조건 온도 22℃, 염분 34‰, 그리고 조도 3,000 럭스(lux)이었고, 14시간/10시간 명암 주기로 일정하게 두고 배양하였다. 전배양된 적조 생물 세포를 세포수 104/㎖의 농도로 희석하여 24 웰(well) 마이크로 타이트레이트 플레이트에 접종하였다. 상기 <실시예 1>에서 합성한 CA-MA와 P5 펩타이드를 256 μM/웰(well) 농도로부터 시작하여 1/2배씩 희석하여 상기 균주가 접종된 플레이트에 첨가하였다. 상기 언급한 배양조건과 동일한 조건에서 36시간 동안 배양하면서 6시간마다 적조생물의 수를 헤모사이토메터(hemocytometer)를 이용하여 측정하였다. 배양 24시간 후, 50% 생육 저해농도(50% of inhibitory concentration, 이하 ‘IC50’라 약칭함) 값을 결정하였다.In order to measure the activity of the parent CA-MA and P5 peptides synthesized in the <Example 1>, the present inventors measured the 50% growth inhibitory concentration of the red peptides of the two peptides. Specifically, seeds that have been sold by the Korea Maritime Microalgae Bank as red tide organisms to measure activity in wake tide. C. polykrikoides , H. H. akashiwo and Chattonella sp ), seed. C. marina , blood. P ( minimum ), p. P. micans , and S. Costatium ( S. costatum ) was used. Each of the algae in F2 medium [150 mg NaNO 3 , 8.69 mg NaH 2 PO 4 · 9H 2 O, 10 mg ferric EDTA, 0.22 mg MnCl 2 , 0.11 mg CoCl 2 , 0.0196 mg CuSO 4 · 5H 2 O, ZnSO 4 · 7H 2 O, 50 mg Na 2 SiO 3 · 9H 2 O, 0.012 mg Na 2 MoO 4 · 2H 2 O, 1 μg Vitamine B 12 , 1 μg Biotin, 0.2 μg ThiamineHCl / 1 L filtered seawater] The salinity was 34 ‰, and the illuminance was 3,000 lux, and the culture was carried out at constant intervals of 14 hours / 10 hours. Precultured red tide biological cells were diluted to a concentration of 10 4 / ml of cells and seeded in 24 well micro titrate plates. The CA-MA and P5 peptides synthesized in <Example 1> were added to the plate inoculated with the strain by diluting 1/2 fold starting from the concentration of 256 μM / well. The number of red tide organisms was measured every 6 hours using a hemocytometer while incubating for 36 hours under the same conditions as mentioned above. After 24 hours of culture, 50% of inhibitory concentration (hereinafter, abbreviated as IC 50 ) was determined.
그 결과, 모체 CA-MA 펩타이드에 비하여 P5 펩타이드가 적조 생물에 대하여 강한 항적조 활성을 나타내었다(표 2). 따라서, 본 발명의 <실시예 1>에서 제조한 P5 펩타이드는 항적조 활성이 뛰어난 펩타이드임을 확인할 수 있었다.
As a result, the P5 peptide showed stronger anti-tidal activity against red tide organisms compared to the parental CA-MA peptide (Table 2). Therefore, it was confirmed that the P5 peptide prepared in <Example 1> of the present invention was a peptide having excellent anti-tanking activity.
Red tide
(C. polykrikoides)Seed. Polycricoides
(C. polykrikoides)
<< 실험예Experimental Example 2> 2> 셀룰로우스Cellulose 세포벽이 있는 적조에 대한 For red tide with cell walls 항적조Trace 활성 관찰 Active observation
본 발명 펩타이드의 항적조 활성을 광학 현미경상으로 가시화하기 위하여, 셀룰로우스 세포벽을 가지고 있는 씨. 폴리크리코이데스(C. polykrikoides)를 상기 <실험예 1>에 사용한 F2 배지에 접종한 뒤 배양하였다. 배양된 적조생물을 104/㎖의 농도로 24웰 마이크로 타이트레이트 플레이트에 접종한 뒤 모체 CA-MA 펩타이드를 64 μM/웰(well)의 농도와 P5 펩타이드를 8 μM/웰(well) 농도로 상기 적조생물이 접종된 플레이트에 첨가하여 22℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 가시화하기 위하여 광학 현미경 상에서 관찰하여 그 결과를 도 1에 나타내었다.Seed having cellulose cell walls in order to visualize the tracing activity of the peptides of the invention on an optical microscope. C. polykrikoides was inoculated in F2 medium used in Experimental Example 1 and then cultured. The cultured red tide was inoculated into a 24-well micro titrate plate at a concentration of 10 4 / mL, followed by parental CA-MA peptide at 64 μM / well and P5 peptide at 8 μM / well. The red tide was added to the inoculated plate and incubated at 22 ° C. for 24 hours. After incubation, the result of observation on an optical microscope for visualization is shown in FIG. 1.
그 결과, 도 1에서 알 수 있듯이, 적조유발 생물인 씨. 폴리크리코이데스(C. polykrikoides)에 아무것도 처리하지 않은 경우(음성 대조군)에는 생물의 수가 유지되었고, 외형적 변화가 없었으며, 모체 CA-MA 펩타이드는 64 μM/웰의 농도로 처리하였을 때 적조생물의 외형적 변화를 보였다. 그러나, P5 펩타이드는 CA-MA 펩타이드보다 1/8배 낮은 농도인 8 μM/웰의 농도로 처리한 군에서 거의 모든 생물체에서 생물체 내의 물질이나 소기관들이 사라진 형태였다. 이로써, 본 발명의 P5 펩타이드는 모체 CA-MA 펩타이드에 비하여 낮은 농도에서 항적조 효과를 보이므로, P5 펩타이드를 항적조제로 유용하게 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
As a result, as can be seen in Figure 1, the seed is a red tide-inducing organism. When nothing was treated with C. polykrikoides (negative control), the number of organisms was maintained, there was no change in appearance, and parental CA-MA peptides were treated with red tide when treated at a concentration of 64 μM / well. The appearance of living things has changed. However, in the group treated with the concentration of 8 μM / well, which is 1/8 times lower than the CA-MA peptide, the P5 peptide had disappeared substances or organelles in almost all organisms. As a result, since the P5 peptide of the present invention exhibits anti-throttle effect at a lower concentration than the parent CA-MA peptide, it was confirmed that the P5 peptide can be usefully used as a anti-drop agent.
<< 실험예Experimental Example 3> 3> 셀룰로우스Cellulose 세포벽이 없는 적조에서의 In red tide without cell walls 항적조Trace 활성 관찰 Active observation
본 발명 펩타이드의 항적조 활성을 광학 현미경상으로 가시화하기 위하여, 셀룰로우스 세포벽을 가지고 있지 않은 씨. 마리나(C. marina)와 에이치. 아카쉬우(H. akashiwo)를 상기 <실험예 1>에 사용한 F2 배지에 접종한 뒤 배양하였다. 배양된 적조생물을 104/㎖의 농도로 24웰 마이크로 타이트레이트 플레이트에 접종한 뒤 모체 CA-MA 펩타이드를 4 μM/웰의 농도와 P5 펩타이드를 2 μM/웰 농도로 상기 적조생물이 접종된 플레이트에 각각 첨가하여 22℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 가시화하기 위하여 광학 현미경 상에서 관찰하여 그 결과를 도 2에 나타내었다.Seed without the cellulose cell wall in order to visualize the tracing activity of the peptides of the invention on an optical microscope. C. marina and H. Akashiwo ( H. akashiwo ) was inoculated in the F2 medium used in the <Experimental Example 1> and then cultured. The cultured red tide was inoculated into a 24-well micro titrate plate at a concentration of 10 4 / ml, and then the red tide was inoculated at a concentration of 4 μM / well for the parent CA-MA peptide and 2 μM / well for the P5 peptide. Each was added to the plates and incubated at 22 ° C. for 24 hours. After incubation, observation was carried out on an optical microscope for visualization, and the results are shown in FIG. 2.
그 결과, 셀룰로우스 세포벽을 가지고 있는 적조 생물에 비하여 셀룰로우스 세포벽을 가지고 있지 않은 씨. 마리나(C. marina)와 에이치. 아카쉬우(H. akashiwo)에서 더 낮은 농도의 펩타이드 처리에 의하여 적조가 억제됨을 확인할 수 있었다. 모체 CA-MA 펩타이드는 4 μM/웰의 농도로 처리하였을 때 적조생물의 외형적 변화를 보였고 P5 펩타이드는 2 μM/웰의 농도로 처리에서 거의 모든 생물체에서 생물체내의 물질이나 소기관들이 사라진 형태였다. 이로써 본 발명의 P5 펩타이드가 강력한 항적조 활성이 있음을 확인하였다(도 2).
The result is a seed that does not have a cellulose cell wall compared to a red tide organism that has a cellulose cell wall. C. marina and H. It was confirmed that red tide was suppressed by a lower concentration of peptide treatment in H. akashiwo . Maternal CA-MA peptide showed a change in the appearance of red tide when treated at 4 μM / well, while P5 peptide showed the disappearance of organisms and organelles in almost all organisms at 2 μM / well. This confirmed that the P5 peptide of the present invention has a strong wake tide activity (Fig. 2).
<< 실험예Experimental Example 4> 유익한 규조류에 대한 4> for beneficial diatoms 펩타이드의Peptide 항적조Trace 활성 관찰 Active observation
본 발명 펩타이드의 규조류에서의 영향을 광학 현미경상으로 가시화하기 위하여, 해양 생태계에 해로운 영향을 미치지 않는 규조류인 에스. 코스타튬(S. costatum)을 상기 <실험예 1>에 사용한 F2 배지에 접종한 뒤 배양하였다. 배양된 적조생물을 104/㎖의 농도로 24웰 마이크로 타이트레이트 플레이트에 접종한 뒤 모체 CA-MA 펩타이드를 32 μM/웰의 농도와 P5 펩타이드를 256 μM/웰 농도로 상기 적조생물이 접종된 플레이트에 첨가하여 22℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 가시화하기 위하여 광학 현미경 상에서 관찰하여 그 결과를 도 3에 나타내었다.In order to visualize the effects of the peptides of the present invention in diatoms on an optical microscope, S. diatoms, which do not deleteriously affect marine ecosystems. Costatium ( S. costatum ) was inoculated in the F2 medium used in the <Experimental Example 1> and then cultured. The cultured red tide was inoculated into a 24-well micro titrate plate at a concentration of 10 4 / ml, and then the red tide was inoculated at a concentration of 32 μM / well of the parent CA-MA peptide and 256 μM / well of the P5 peptide. Plates were added and incubated at 22 ° C. for 24 hours. After incubation, the result of observation on an optical microscope for visualization is shown in FIG. 3.
그 결과, 펩타이드와 규조류를 반응시킨 후 3일이 지나도 높은 농도의 펩타이드 특히 P5가 조류에 전혀 나쁜 영향을 미치지 않는 것을 확인할 수 있었다(도 3).
As a result, three days after the reaction of the peptide and the diatoms, it was confirmed that the high concentration of the peptide, particularly P5 does not adversely affect the algae (Fig. 3).
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 적조 방제 활성을 갖는 항적조 펩타이드 P5는 탁월한 항적조 활성을 나타내고 유익한 조류에는 독성이 없으며, 자연 분해가 가능하므로 해양 생태계에 안전하고 유용하게 사용될 수 있다.
As described above, the tide peptide P5 having the red tide control activity of the present invention exhibits excellent tide activity and is not toxic to beneficial algae, and can be safely and usefully used in marine ecosystems because of its natural degradation.
<110> Industry Academy Cooperation Foundation Chosun University
<120> P5 peptide having antialgae activity against organism induced red
tide and the use of the same
<130> 10p-07-51
<160> 2
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA-MA peptide made by fusing 1-8 amino acid of secropin A and
1-12 amino acid of magainin 2
<400> 1
Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gly Ile Gly Lys Phe Leu His Ser
1 5 10 15
Ala Lys Lys Phe
20
<210> 2
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide with increased + charge and hydrophobicity by
substituting amino acids of SEQ. ID. NO 1 with lysine and leucine
<400> 2
Lys Trp Lys Lys Leu Leu Lys Lys Pro Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys
1 5 10 15
Lys Leu
<110> Industry Academy Cooperation Foundation Chosun University
<120> P5 peptide having antialgae activity against organism induced red
tide and the use of the same
<130> 10p-07-51
<160> 2
<170> Kopatentin 1.71
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CA-MA peptide made by fusing 1-8 amino acid of secropin A and
1-12 amino acid of
Claims (8)
Red tide control composition containing a P5 peptide consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 as an active ingredient.
The method according to claim 1, wherein the P5 peptide is glycine-isoleucine-glycine in the Hinge region of the CA-MA (Cecropin A-Magainin 2) peptide set forth in SEQ ID NO: 1, respectively, to proline and , 4th leucine, 8th isoleucine, 14th leucine, 15th histidine, respectively, with lysine, 5th phenylalanine, 6th lysine, 12th lysine, 13th phenylalanine, 16th serine, 17th alanine, 20 A red tide control composition, wherein the first phenylalanine is substituted with leucine.
The method of claim 1, wherein the P5 peptide is seed. C. polykrikoides , C. C. marina and H. A composition for controlling red tide, characterized by having anti-algae activity against at least one red tide-induced algae selected from the group consisting of H. akashiwo .
The method of claim 1, wherein the P5 peptide is S. Red tide control composition characterized in that it does not show the activity of the bath tide against Costatium ( S. costatum ).
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|---|---|---|---|
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- 2010-08-18 KR KR1020100080012A patent/KR101256943B1/en not_active IP Right Cessation
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|---|
| Biochim Biophys Acta. 2003 Feb 21,1645(2):172-82. * |
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