KR101256037B1 - 이중질량분석기를 이용한 소변중 Ｌｙｓｏ－Ｇｂ3의 분석 방법 및 이를 이용한 파브리병 진단 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 전자분무이온화로 연결되는 액체크로마토그래피-이중질량분석기(HPLC ESI MS/MS)를 이용한 소변 중의 Lyso-Gb3(Lyso-globotriaosylsphingosine)의 분석방법 및 상기 분석방법을 이용한 소변으로부터의 파브리병 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명의 HPLC ESI MS/MS를 이용하면 시료의 간단한 전처리, 높은 특이성, 감도, 재현성 및 빠른 분석 속도로 시료로부터 Lyso-Gb3를 분석할 수 있으며, 분석된 Lyso-Gb3의 존재 유무 및 검출량에 따라 파브리병을 손쉽게 진단할 수 있다.

Description

이중질량분석기를 이용한 소변중 Ｌｙｓｏ－Ｇｂ3의 분석 방법 및 이를 이용한 파브리병 진단 방법 {Analytical Method of Lyso-globotriaosylsphingosine in Urine by LC-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry and Diagnostic Method of Fabry Disease using the method}

본 발명은 Lyso-Gb3 분석 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 이중질량분석기를 이용한 Lyso-Gb3 분석 방법에 에 관한 것이다.

파브리병(Fabry disease)은 X-염색체 연관 희귀 유전 질환으로 리소좀에 있는 효소인 a-갈락토시다아제 A(a-Galactosidase A, α-GAL or GLA; EC 3.2.1.22)의 결함으로 인해 글라이코스핑고리피드(Glycosphingolipids), 글로보트리아오실세라마이드(Globotriaosylceramide, Gb3), 라이소-글로보트리아오실 스핑고신(Lyso-globotriaosyl sphingosine, lyso-Gb3)이 축척되는 지질 축척 질환이다(비특허문헌 1, 2). X-염색체 이상 질환으로서 파브리병 환자는 대부분 남자(hemizygotes)이고 여자는 임상증상을 거의 나타내지 않거나 보인자(heterozygotes)이다(비특허문헌 3,4).

X-염색체 연관성으로 유전되고 소아 후기나 청소년기의 젊은 남자에서 운동이나 온도변화에 의해 야기된 사지의 심한 통증, 발작으로 발현되며, 열, 발한 감소, 특징적인 피부 병변으로 작고 검붉은 혈관 확장이 군집되어 하복부, 둔부, 음낭에 혈관각화종(angiokeratoma)이 나타난다(비특허문헌 2,5). 다른 증상들로는 관절통, 지속발기증, 비후성심근염, 승모판폐쇄부전, 설사, 체중감소, 사지의 체온감각 이상(추위) 등이 있다. 이중 뇌 신장혈관을 포함한 심혈관계 침범은 40세 전 후에 사망하는 원인이 되며, 뇌 혈관질환이 중요한 원인이 된다(비특허문헌 2,6,7). 그로 인한 치료 방법으로 투석과 신장 이식은 경과를 호전시키는 치료 방법 중 하나로 시행되고 있으며, 통증의 경감은 디페닐하이단토인(diphenylhydantoin)이나 카바마제핀(carbamazepine)의 예방적 투여가 도움이 된다(비특허문헌 2,6,7). 하지만 이 두 가지 예방적 투여 방법 중 디페닐하이단토인의 장기적 투여로 인한 부작용 때문에 카바마제핀이 선호되고 있다. 보편적인 파브리병 환자의 치료방법으로 유전자 재조합 a-갈락토시다아제 A(a-galactosidase A, Fabrazyme)를 이용한 ERT (Enzyme replacement therapy) 효소 대치 요법이 치료 방법으로 사용되고 있다(비특허문헌 11,12,13).

생물학적 시료 중의 lyso-Gb3의 정량, 정성 분석에서 어려운 점은 도 1에서 보는 바와 같이 분자구조 자체가 가지고 있는 복잡성으로 인해 물리 화학적 성질이 매우 복잡하여 이의 분석은 매우 까다롭고, 스핑고신(sphingosine) 염기(긴 사슬 염기) 구조가 이 물질의 정량의 어려움을 더해주고 있다(비특허문헌 14).

1963년 파브리병과 스핑고지질증(sphingolipidosis)과의 관계가 처음 소개가 되었으며(비특허문헌 15), 그 후에 파브리병과 a-갈락토시다아제 A와의 관계는 1996년 논문에서 발표 되었다(비특허문헌 16).

현재까지, 파브리병에 관련하여 정확하고 엄격한 관련성을 가지는 견실한 생체지표자(biomarker)는 발견되지 않았다. 하지만 최근 보고에서 혈장 중 lyso-Gb3와 관련하여 새로운 생체표지자가 소개 되었다(비특허문헌 14). 따라서, 새로이 소개된 생체표지자로서 파브리병에 관련한 lyso-Gb3의 분석이 급속히 바뀌는 검열 및 정확한 검진, 진단을 위한 분석 방법으로 개발하는 것이 필수로 여겨지고 있다.

lyso-Gb3의 관한 연구는 계속 되었고, 발표 이후 처음으로 파브리병과 lyso-Gb3와의 관계가 주목받기 시작하였으며(비특허문헌 14), 그에 따른 분석법이 개발되었다(비특허문헌 17-21). 2008년 처음으로 HPLC-UV 형광물질 유도체를 이용하여 혈장에서 lyso-Gb3를 분석하였다(비특허문헌 22,23). 하지만 그에 따른 감도가 좋지 못하였으며, 그 후 2009년 세포 배양을 통해 처음으로 HPTLC, QTOF-APCI(Quadrupole time-of-flight - Atmospheric pressure chemical ionization)/ MS를 이용한 lyso-Gb3의 분석을 시작하였다(비특허문헌 24). 그 결과 HPLC-UV를 이용하였을 때 보다 감도와 피크를 확연히 구별할 수 있었다. 그 밖에도 2010년 환자 시료의 간편화를 위한 소변에서의 분석이 시도 되었다(비특허문헌 25). 소변에서는 혈장 보다 감도와 lyso-Gb3의 측정양이 많지 않은 단점을 가지고 있었지만, 혈장보다 소변이 시료를 처리하기 간편하다는 장점을 가지고 있었다. 또한 아직까지 혈청에서의 lyso-Gb3의 분석법은 개발 되지 않은 상태이다.

최근 2011년 보고되어 있는 lyso-Gb3의 분석방법은 혈장에서 Liquid Chromatography Quadrupole time-of-flight mass spectrometer(LC-QTOF Synapt MS) system을 이용하여 분석을 하였다(비특허문헌 24). 하지만 분석을 하기 위한 전처리의 방법으로 제단백, pH 조절, 특별한 카트리지를 사용하는 등 SPE(solid phase extraction)는 적지 않은 비용과 많은 노동력과 시간이 걸린다는 단점이 있었다(비특허문헌 22,24).

본 발명자들은 lyso-Gb3의 전처리 방법으로 많은 비용, 시간, 노동력을 요구하는 SPE를 사용하지 않고 직접 희석 및 제단백을 한 후 전자분무이온화(Electrospary Ionization)로 연결되는 액체크로마토그래피-이중질량분석기(Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometer)를 이용하여 현재까지 전혀 보고된 바 없는 새로운 분석법을 개발하고자 하였다.

ESI-LC-MS/MS를 이용한 lyso-Gb3의 소변과 혈청에서의 분석은 국내ㅇ국외에서 처음 시도된 분석법으로서 소변과 혈청 시료 중의 lyso-Gb3를 직접 추출한 후 분석함으로서 기존의 SPE를 사용했을 때 보다 우수한 감도, 높은 특이성 그리고 좋은 재현성을 가지고 있으며, 무엇보다도 간략해진 전처리 방법과 빠른 분석시간이 장점이라 할 수 있다. 또한 LLE(liquid-liquid-extraction), 유도체화 등의 복잡한 전처리가 없으므로 노동력, 시간, 비용 등을 절약 할 수 있었다.

본 발명자들은 lyso-Gb3의 정량 및 정성분석의 중요한 기술적 진보를 보여 줌으로써 새로운 분석법의 유용성을 입증하였으며, 파브리병의 생체표지자로서의 입증은 물론, 향후 이 분석법을 이용하여 파브리병 환자 및 희귀 유전성대사질환 환자의 모니터링과 진단 및 임상에 유용할 것으로 사료된다.

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본 발명은 이중질량분석기를 이용한 소변 중의 Lyso-Gb3 분석 방법 및 이 분석 방법을 이용한 환자 소변으로부터의 파브리병 진단 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 전자분무이온화로 연결되는 액체크로마토그래피-이중질량분석기(HPLC ESI MS/MS)를 이용한 소변 중의 Lyso-Gb3(Lyso-globotriaosylsphingosine)의 분석방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 분석방법을 이용한 환자 소변으로부터의 파브리병 진단 방법을 제공한다.

본 발명에 사용되는 전자분무이온화로 연결되는 액체크로마코그래피-이중질량분석기는 Liquid Chromatography - Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry로서, 이하 'HPLC ESI MS/MS'라고 약칭한다.

또한, 본 발명에서 라이소-글로보트리아오실스핑고신(Lyso-globotriaosylsphingosine)은 'Lyso-Gb3'라고 약칭한다.

본 발명의 HPLC ESI MS/MS를 이용한 분석방법에 있어서, 상기 액체크로마토그래피(HPLC)는 다음의 조건으로 실행하는 것이 바람직하다.

(1) 이동상 조성 : 이동상 A (포름산이 첨가된 50% 미만의 아세토니트릴), 이동상 B (포름산이 첨가된 100% 아세토니트릴);

(2) 이동상의 농도구배 조건 :

- 시작 ~ 0.1분 : 이동상 B 20% 유지

- 0.1분 ~ 1분 : 이동상 B 20%에서 90%로 증가

- 1분 ~ 2분 : 이동상 B 90% 유지

- 2분 ~ 5분 : 이동상 B 90%에서 20%로 감소

(3) 이동상 속도 : 200 ㎕ - 1 ml/min.

상기 HPLC 조건에 있어서, 이동상 A는 0.1% 포름산이 첨가된 5% 아세토니트릴이고, 이동상 B는 0.1% 포름산이 첨가된 100% 아세토니트릴이 될 수 있다.

또한, 상기 조건에 더하여, 하기 컬럼 조건이 추가될 수 있다.

(4) 컬럼 : 입자 사이즈 2.6 ㎛, 5.0 mm i.d. x 2.10 mm, C₁₈

(5) 컬럼 오븐 온도 : 25-35℃

또한, 본 발명의 HPLC ESI MS/MS를 이용한 분석방법에 있어서, 상기 전자분무이온화로 연결되는 이중질량분석기(ESI MS/MS)는 다음의 이온화 조건으로 실행하는 것이 바람직하다.

(1) 소스(source) 온도 : 600 - 700℃

(2) 이온 분무 전압 : 5,000 - 6000 V

(3) 이온화 방법 : 양이온 모드에서의 전자분무 이온화법

(4) 내부 표준물질 : DMS (N,N-Dimethyl-D-erythro-sphingosine)

(5) MRM(multiple reaction monitering) 정량 분석에 사용된 lyso-Gb3에 선택성을 가진 이온 : 선구이온(Q1) - m/z 786.6, 생성이온(Q3) - m/z 282.4

(6) MRM 정량 분석에 사용된 내부표준물질인 DMS에 선택성을 가진 이온 : 선구이온(Q1) - m/z 328.5, 생성이온(Q3) - m/z 280.0

상기 ESI MS/MS 실행 조건에서, 보다 바람직하게는 소스 온도는 650℃, 이온 분무 전압은 5,400 V이다.

또한, 본 발명의 HPLC ESI MS/MS를 이용한 분석방법에 있어서, 상기 전자분무이온화로 연결되는 이중질량분석기(ESI MS/MS)는 다음의 질량분석기(MS/MS) 조건으로 실행하는 것이 바람직하다.

(1) 사용 가스

- Neulizer gas(CAD gas) : 질소 4 psi

- Curtain gas : 질소 20 psi

- Auxiliary gas : 질소 60 psi

- Collision gas : 질소 60 psi

(2) 전기 조건 및 전압 파라미터

- DP(Declustering potential) : lyso-Gb3 (DP:126), DMS (DP:41)

- CE(Collision energy) : lyso-Gb3 (CE:49), DMS (DP:23)

- CXP(Collision exit potential) : lyso-Gb3 (CXP:16), DMS (CXP:8)

- EP(Entrance potential) : lyso-Gb3 (EP:10), DMS (EP:10)

본 발명에 있어서, 분석에 사용하는 시료인 소변은 다음의 전처리 과정을 수행한 후 HPLC ESI MS/MS에서 분석하는 것이 바람직하다.

(1) 소변에 내부표준용액(N,N-Dimethyl-D-erythro-sphingosine)을 혼합하는 단계;

(2) 상기 단계 1의 혼합액에 아세토니트릴을 첨가하여 제단백을 실시하는 단계;

(3) 상기 단계 2의 제단백 액을 볼텍싱하여 상층액을 분리하여 소변 전처리액을 준비하는 단계.

또한, 본 발명은 상기에 기재된 HPLC ESI MS/MS를 이용하여 환자 소변으로부터 파브리병을 진단하는 방법을 제공한다.

HPLC ESI MS/MS를 이용하는 분석 조건 및 환자 소변의 전처리 과정은 상기에 기재한 바와 같으므로 중복성을 피하기 위해 기재를 생략한다.

본 발명의 HPLC ESI MS/MS를 이용하여 환자 소변을 분석하게 되면 Lyso-Gb3를 검출할 수 있는데, 상기 분석방법을 수행하면 Lyso-Gb3는 0.25 ng/ml 이상일때 모두 검출되어, 파브리병으로 진단할 수 있다. 바람직하게는 Lyso-Gb3의 농도값이0.25 - 25 ng/ml의 농도 범위일 때 보다 정확하게 파브리병으로 진단할 수 있다.

본 발명은 시료의 긴 전처리 단계(SPE, LLE 등) 없이 임상시료인 소변을 7분 내외로 아주 짧고 간결하며, 분석시간이 5분으로 획기적으로 짧다는 점과 모든 전처리 과정이 작은 스케일로 시행된다는 장점이 있으며, LC-MS/MS 분석 방법을 수행함으로써 높은 특이성, 감도, 재현성 및 빠른 분석 속도로 Lyso-Gb3를 분석할 수 있다. 실제 임상시료에 응용한 결과에서도 파브리병 환자의 소변으로부터 정상인과는 달리 Lyso-Gb3를 특이적으로 검출함으로써 파브리병을 손쉽고 정확하게 진단할 수 있다.

도 1은 본 발명의 분석방법으로 검출하기 위한 lyso-Gb3(A) 및 내부표준물질인 N,N-디메틸-D-에리스로-스핑고신(B)의 화학식 구조이다.
도 2는 본 발명의 분석방법을 수행하기 위해 소변 샘플을 전처리하는 단계를 나타낸 과정도이다.
도 3은 MS/MS 조건 최적화 실험을 통해 LC-MS/MS에서 MRM 모드로 정량하여 찾아낸 lyso-Gb3(A) 및 내부표준물질 DMS(B)의 선구이온과 생성이온의 검출세기를 나타낸 그래프이다.
도 4는 HPLC 조건 최적화 실험을 통해 찾아낸 lyso-Gb3(A) 및 내부표준물질 DMS(B)의 이동상 유량을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 분석방법을 사용하여 직선성을 검증한 결과로서, 소변에서 분석한 lyso-Gb3의 검량선이다.
도 6은 본 발명의 분석방법을 사용하여 소변에서의 최저검출한계(LOD : A)와 최저정량한계(LOQ : B)를 검증한 결과이다.
도 7은 본 발명의 분석방법을 사용하여 정상인 소변(A)과 파브리 환자 소변(B)에서 lyso-Gb3를 검출한 결과이다.

이하, 구체적인 실시예를 통하여 본 발명에 대해서 보다 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

제조예 1. 실험재료의 준비

<1-1> 표준 용액 및 분석용 시료의 조제

연구에 사용한 lyso-Gb3 표준품과 내부표준 물질인 N,N-Dimethyl- D-erythro-sphingosine(DMS)은 Matreya (PA, USA)에서 구입하여 사용하였다(도 1에 물질의 화학구조 기재).

이동상 제조에 사용된 아세토니트릴, 증류수는 HPLC 용이며 Fisher Scientific Co.(USA)에서 구입하여 사용하였으며, 포름산(formic acid)은 WAKO hemical(German)에서 구입하여 사용하였다. 그 외 사용된 여러 용매들은 HPLC용 이며 Fisher Scientific Co.(USA)에서 구입하여 사용하였다.

Stock solution 제조시 표준품으로는 lyso-Gb3 (1 mg/mL, 1000ppm)과 내부표준물질로는 DMS (5 mg/mL, 5000ppm) 을 dimethylsulfoxide(DMSO)에 녹여 조제하여 사용하였다. 각 working solution으로는 표준품 lyso-Gb3와 내부표준물질의 혼합 용액을 사용하였고 lyso-Gb3는 (0.5 mg/mL, 500ppm) 아세토니트릴 : 물 (50:50)에 녹여 제조한 후, 사용하기 전까지 냉동 보관 (-20℃) 하였으며, 그 이하의 농도는 모두 아세토니트릴 : 물 (50:50)에 희석하여 사용하였다. 내부표준물질은 1 mg/mL(1000ppm)으로 아세토니트릴에 녹여 Stock solution 을 제조한 후, 냉동보관 하였다. 그 이하의 농도는 모두 아세토니트릴에 희석하여 사용하였다.

소변 검량선에 사용한 표준용액을 만들기 위해 표준품 lyso-Gb3 (1000 ng/mL)를 희석하여 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100 ng/mL의 표준용액을 조제 하였다. 조제된 표준용액을 정상 소변 100 μL에 각각 25 μL씩 spike하여 최종 농도가 0.25,　0.5,　1.25,　2.5,　5,　12.5,　25 ng/mL 의 농도가 되도록 7 개의 검량선용 표준용액을 제조 하였다. 내부표준 용액은 stock solution (1000 ng/mL)을 10 ng/mL의 농도로 희석하여 사용하였다.

<1-2> 임상 시료의 준비

정상인과 파브리병 환자의 소변 시료를 원심분리 한 후 얻은 액의 상층액을 취한 소변 검체로 하였으며, 남은 소변 시료는 -20℃에 보관 하다가 분석 전에 꺼내어 실온에 방치하여 해동하였다.

파브리병 환자의 소변 100 μL를 분취하여 1.5 mL 에펜도프 튜브에 옮기고 내부표준용액(200 ng/mL)을 10 μL 첨가하였다. 아세토니트릴을 25 μL 첨가한 후 제단백을 실시하였다. 제단백 후 볼텍싱 믹서에서 12000rpm으로 5분간 원심 분리하여 상층액 80 μL를 2 mL HPLC 바이알에 옮겨 담았다. 이중에서 용액의 10 μL를 시료 분석에 사용하였다(도 2).

실험예 1. 분석조건의 설정

<1-1> HPLC 분석조건

HPLC는 시세이도사(Shiseido corporation, Tokyo, Japan)의 LC-3133 Nonspace Auto Smpler, 3101 Pump를 사용하였다. 이 시스템은 컬럼 오븐(column oven), 바이너리 펌프(binary pump), 랙 체인져(rack changer)가 장착된 시스템을 사용하였다. 컬럼은 Phenomenex Kinetex (particle size 2.6 ㅅm, 5.0 mm i.d. x 2.10 mm, C₁₈)을 사용하였으며, 컬럼 오븐 온도는 30℃로 일정하게 유지하였다. Lyso-Gb3의 가장 적절한 이동상 조건으로 이동상 A는 0.1% 포름산, 5% 아세토니트릴 이동상 B는 0.1% 포름산을 사용하였고 빠른 농도구배 조건으로 분석하였다.

<1-2> MS / MS 의 분석조건

lyso-Gb3의 분석은 API 4000 (Applied Biosystems, MDS Sciex) MS/MS (AB, Foster city, CA, USA)으로 구성된 LC-MS/MS를 사용하였다. 질소는 순도(99.999%)를 사용하였다. 순도(99.999%)의 질소는 질량분석기 내에서 Nebulizer, Curtain, Auxiliary, Collision gas 등으로 사용되었다.

각 부분에 필요한 가스의 압력 및 양, 전기적인 파라미터는 다음과 같다. CAD gas, Curtain gas, Ion source gas 1 및 2로서 초고순도 질소를 각각 4, 20, 60, 60 psi로 하였다. 질량분석기내 전기 조건은 Declustering potential(DP), Collision energy (CE), Collision exit potential(CXP), Entrance potentail(EP)가 있으며 lyso-Gb3의 voltage는 DP:126, CE:49, CXP:16, EP:10이며, 내부표준물질 DMS의 voltage는 DP:41, CE:23, CXP:8, EP:10이다.

이온화 효율을 높이기 위해 source temperature는 650℃로 높였으며, Ion spray voltage는 5400V 로 설정하였다. 이온화 방법으로는 양이온 모드에서 전자분무 이온화법 (electrospary ionization)을 채택하였고 정량을 위해 Multiple reaction monitoring mode (MRM mode)를 사용하였다. MRM을 위해 사용된 lyso-Gb3의 Q1 이온은 m/z 786.6 , Q3 이온은 m/z 282.4이며, DMS의 Q1 이온은 m/z 328.5, Q3 이온은 m/z 280.0를 사용하였고 분해능(resolution)은 기본모드(unit mode)로 하였으며, 데이터 처리장치로는 AB Sciex Analyst(ver 2.0)를 사용하였다.

실험예 2. 분석 조건의 최적화

<2-1> MS / MS 조건 최적화

최근 보고되어 있는 lyso-Gb3의 분석방법은 2010년도에 발표한 논문이 있으며 UPLC-QTOF Synapt MS system(Waters)을 이용하여 분석을 하였다. 하지만 분석을 하기 위한 전처리의 방법으로 제단백, pH 조절, 카트리지를 사용하는 SPE는 적지 않은 비용과 많은 노동력과 시간이 걸린다는 단점이 있었다.

본 연구에서는 lyso-Gb3의 전처리 방법으로 많은 비용, 시간, 노동력을 요구하는 SPE 방법을 사용하지 않고 직접 희석 및 제단백을 한 후 ESI(전자분무이온화)으로 연결되는 LC-MS/MS를 이용하였으며. 이로 인해 소변에서 0.25 ng/mL 이상이면 충분히 데이터를 산출 할 수 있는 높은 감도를 보이는 분석법을 개발하였다.

질량분석기 내에서 source temperature, nebulizer gas, curtain gas, collision gas 등 온도와 gas 조건 등을 검출감도가 최대가 되도록 수동으로 최적화 하였다. 질량분석기내 전기 조건은 DP, CE, CXP, EP에서 선구이온과 생성이온(fragmentation parents ion, product ion)의 검출세기가 최고가 되도록 Auto-infusion quantitative optimization을 이용하였다. 선구이온과 생성이온을 찾는 수는 5개로 설정하여 그중 가장 검출세기가 큰 이온을 선택하도록 프로그램화 하였고, 그 결과 생성이온으로 m/z 786.6에서 m/z 282.4, 264.4, 84, 96, 60이 검출 되었고, 그 중 m/z 282.4에서 검출세기가 가장 강하게 보였다.

내부표준물질의 선구이온과 생성이온을 찾는 수는 5개로 설정하여 그 중 가장 검출세기가 큰 이온을 선택하도록 프로그램화 하였고, 그 결과 생성이온으로 m/z 328.5에서 m/z 310.0, 280.0, 110, 84, 82가 검출 되었고, 그 중 m/z 310.0에서 검출세기가 가장 강하게 보였다. 하지만 m/z 310.0 Ion은 Water(H₂O Mass-18)의 값이어서 m/z 280.0을 선택하였다.

최종적으로 lyso-Gb3의 선구이온 (Parents ion)은 [M+H]⁺ m/z 786.6을 생성이온 m/z 282.4를 선택하였으며, 내부표준물질 DMS의 선구이온은 [M+H]⁺ m/z 328.5을 생성이온 m/z 280.0를 선택하여 MRM 방식으로 정량하였을 때 가장 좋은 검출 감도를 나타내었다(도 3).

<2-2> HPLC 조건 최적화

본 연구에서는 lyso-Gb3의 분석을 위하여 컬럼, 이동상(mobile phase), 빠른 농도구배 조건으로 최적화된 방법을 찾았다.

컬럼은 Phenomenex Kinetex (particle size 2.6 μm, 5.0 mm i.d. x 2.10 mm, C₁₈)을 사용하였으며, 컬럼 오븐 온도는 30℃로 일정하게 유지 하였으며, 빠른 peak의 머무름 시간을 얻기 위해서 역상(Reverse) 조건에서 개발하였으며 높은 압력에서도 내구성이 좋고 안전한 Phenomenex Kinetex 컬럼을 선택하였다.

이동상의 조성은 다음과 같다. 이동상 A는 0.1% 포름산, 5% 아세토니트릴 이동상 B는 0.1% 포름산으로 빠른 농도구배 조건을 잡아 분석하였다. 빠른 농도구배 조건의 초기 0.1분까지는 이동상 B를 20%로 유지하며, 1 분 까지 급격히 이동상 B를 90%로 바꾸어 주었다. 그리고 2 분까지 유지시켜 준 후 펌프에 안정화를 위하여 2.1 분부터 5 분까지 초기 조건인 이동상 B를 20%로 바꾸어 주었다. 총 분석시간은 5 분이었으며, 이동상의 유량은 분당 300 ㅅL/min로 흘려주었을 때 가장 좋은 peak를 얻을 수 있었다(도 4).

<2-3> 시료 전처리 최적화

질량분석기(MS/MS) 조건, 컬럼 조건, 이동상 조건, 빠른 농도구배 조건 선택이 최적화를 확립한 후 그 다음 중요한 과정으로 실제 임상시료인 사람의 소변 중에서 lyso-Gb3을 추출하는 전처리 과정을 개발하였다.

본 연구에서는 lyso-Gb3의 전처리 방법으로 많은 비용, 시간, 노동력을 요구하는 SPE, LLE, 유도체화 등의 복잡한 전처리 방법을 사용하지 않고 직접 희석 및 제단백을 한 후 ESI-MS/MS로 연결되는 LC-MS/MS를 이용하여, 우수한 감도, 높은 특이성 그리고 좋은 재현성을 가지고 있으며, 무엇보다도 간략해진 전처리 방법과 빠른 분석시간이 장점이라 할 수 있고, 복잡한 전처리 없이 노동력, 시간, 비용 등을 절약 할 수 있었다.

본 연구에서는 파브리병(Fabry diseases)환자의 소변 시료를 원심분리 한 후 얻은 액의 상층액을 취한 소변을 검체로 하였으며, 이후 소변시료는 -20℃에 보관 하다가 분석 전에 꺼내어 실온에 방치하여 해동하였다.

파브리병(Fabry diseases)환자의 소변 100μL를 분취하여 1.5mL 에펜도프 튜브에 옮기고 내부표준용액을 10μL 첨가하였다. 아세토니트릴을 25 μL 첨가한 후 제단백을 실시하였다. 제단백 후 볼텍스 믹서에서 12000 rpm(5min)으로 원심분리하여 상층액 80 μL를 2 mL HPLC 바이알에 옮겨 담았다. 이렇게 얻어진 추출 시료는 최저정량한계 0.25 ng/mL을 확보 할 수 있었으며, 좋은 직선성 및 정밀성 정확성을 얻을 수 있었다(도 4, 도 5).

실험예 3. 분석법의 검증( Validation )

본 연구에서는 특이성, 직선성(linearity), 정량한계(LOD, LOQ), 정밀성 (precision), 정확성(accuracy) 등의 항목으로 분석법 검증(validation)을 실시하였다.

<3-1> 직선성( linearity )

lyso-Gb3의 표준용액을 소변에서 최저정량한계(LOQ) 0.25 ng/mL로부터 25 ng/mL까지 제조하였으며, 각 표준용액을 분석 한 후 얻은 크로마토그램에서 내부표준용액의 피크면적에 대한 각 성분들의 피크 면적비를 가지고 검량선을 작성하였다. 각 검량선의 상관계수(R², coefficient of correlation)를 구하였다. 검량선의 농도의 허용범위는 이론치를 기준으로 역으로 계산하였을 때 정확성이 최저 정량한계에서는 ± 20% 이내여야 하며 나머지 농도에서는 ± 15% 이내여야 한다.

직선성 ( Linearity ) 검증 결과

lyso-Gb3을 LC-ESI/MS/MS 방법을 사용하여 분석법의 대한 검증을 실시한 결과는 다음과 같다.

소변에서 검량선을 그리기 위한 농도로 0.25, 0.5, 1.25, 2.5, 5, 12.5, 25 ng/mL 로 농도의 범위를 설정하였다. 각 lyso-Gb3의 회귀직선은 y = 0.0302x + 0.000137 (r²=0.9998) 으로써 좋은 직선성(Linearity)을 나타내고 있다(도 5).

이때의 가중치는 1/x를 사용하였다. 검량선 농도를 이론치와 비교하여 역으로 계산 하였을 때 정확성은 소변에서 91.20 ~ 112.49로 모두 ㅁ 15% 이내로 나타내었다. 일간 검량선의 재현성 또한 변동계수 15% 이내로 모두 우수한 직선성을 나타내었다(도 5).

<3-2> 정밀성( precision ) 및 정확성( accuracy )

정밀성은 하나의 균질화된 시료로부터 취한 여러 개의 등분체로 반복 분석하였을 때 분석 물질에 대한 개개 측정치의 근접성을 의미한다. 정확성은 분석물질의 농도에 대한 분석법에 의해 얻어진 평균 시험결과의 근접성을 의미한다. 정밀성과 정확성을 확보하기 위하여 소변에서 7 가지의 서로 다른 농도(0.25,　0.5,　1.25,　2.5,　5,　12.5,　25 ng/mL)에서 하루에 3번 시행하여 일내(intra-day) 정밀성과 정확성을 구하고 3일 간 실험을 행하여 일간(inter-day) 정밀성과 정확성을 구하였다.

정밀성의 허용범위는 변동계수(C.V.; coefficient of variation)가 15% 이하이고, 정량한계에서는 20% 이하이어야 한다. 정확성의 허용범위는 이론치의 ± 15% 이내여야 하며, 최저정량한계에서는 ± 20% 이내여야 한다.

정밀성( Precision ), 정확성( Accuracy ) 검증결과

lyso-Gb3에 대해 정밀성과 정확성 검토한 결과 우수한 결과를 나타내었다.

소변에서 정밀성 시험에서 일내(Intra-day) 정밀성에서 변동계수(C.V., %)는 0.95%에서 12.90%이하, 일간(Inter-day) 정밀성에서 변동계수(C.V., %)는 1.32%에서 5.39%이하였다. 이 결과는 정량한계에서 정밀성은 변동계수(C.V., %) 20% 이내, 이론치의 ± 15% 이내의 허용범위를 만족하였다. 또한 정확성 시험에서 일내(Intra-day) 정확성에서 91.2%에서 114.4%이하, 일간(Inter-day) 정확성에서 94.7%에서 112.5%이하였다. 이 결과는 정량한계에서 정확성은 20% 이내 이론치의 ± 15% 이내의 허용범위를 만족하였다.

또한 이를 토대로 QC sample 에서도 적용해 보았다.

소변에서 총 9번에 QC sample을 분석하였으며, 정밀성 시험에서 변동계수(C.V., %)는 4.70%에서 8.97%이하, 정확성 시험에서 92.40%에서 106.27%이하 였다. 이 결과는 정량한계에서 정확성은 20% 이내 이론치의 ±15% 이내의 허용범위를 만족하였다.

<3-3> 최저검출한계, 최저정량한계( LOD , LOQ )

최저검출한계(LOD)는 검출 할 수 있는 가장 낮은 농도를 의미 한며, 최저정량한계(LOQ)는 정량을 할 수 있는 가장 낮은 농도를 의미한다. 최저검출한계는 크로마토그램(chromatogram)에서 신호대 잡음비(S/N ratio)를 3 이상으로 하고 정밀성이 20% 이하이고 정확성이 80~120%인 조건을 만족하는 농도로 하여 소변에서 0.1 ng/mL로 정하였다. 최저정량한계는 크로마토그램(chromatogram)에서 신호대 잡음비(S/N ratio)를 10 이상으로 하고 정밀성이 20% 이하이고 정확성이 80~120%인 조건을 만족하는 농도로 하여 소변에서 0.25 ng/mL로 정하였다. 도 6에서 나타난 바와 같이 미량의 주입량으로도 충분한 감도를 확보할 수 있었다.

실험예 4. 임상시료의 응용

위에서 확립, 개발된 분석방법은 특이성, 직선성, 정확성, 정밀성 및 감도 등에 대한 검증이 확립 되었으므로, 임상시료인 파브리병 환자의 소변, 혈청 시료 분석과 파브리병 생쥐에서 응용하여 파브리병 진단에 응용하였다.

파브리병과 lyso-Gb3의 상관관계를 확인하기 위하여 개발된 분석법을 이용하여 소변시료에서 정상인 20명(n=20)과 파브리병 환자 15명(n=15)을 분석 하였다. 이를 정상인과 파브리병 환자의 lyso-Gb3의 농도를 크로마토그램으로 나타내었다.

분석결과 소변에서 정상인의 경우 lyso-Gb3는 전혀 나타나지 않는 것으로 확인 할 수 있었다. 하지만 파브리병 환자의 경우 정상인과는 달리 lyso-Gb3의 농도가 환자에서는 0.4 ~ 1.9 ng/mL 로 정량 가능하였다(도 7).

Claims (8)

1. 전자분무이온화로 연결되는 액체크로마토그래피-이중질량분석기(HPLC ESI MS/MS)를 이용한 소변 중의 Lyso-Gb3(Lyso-globotriaosylsphingosine)의 분석방법에 있어서,
   상기 소변은 다음의 전처리 과정을 수행한 후 액체크로마토그래피-이중질량분석기에서 분석하는 것을 특징으로 하는 소변 중의 Lyso-Gb3의 분석방법,
   (1) 소변에 내부표준용액(N,N-Dimethyl-D-erythro-sphingosine)을 혼합하는 단계;
   (2) 상기 단계 1의 혼합액에 아세토니트릴을 첨가하여 제단백을 실시하는 단계;
   (3) 상기 단계 2의 제단백 액을 볼텍싱하여 상층액을 분리하여 소변 전처리액을 준비하는 단계.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 액체크로마토그래피(HPLC)는 다음의 조건으로 실행하는 것을 특징으로 하는 소변 중의 Lyso-Gb3의 분석방법,
   (1) 이동상 조성 : 이동상 A (포름산이 첨가된 50% 미만의 아세토니트릴), 이동상 B (포름산이 첨가된 100% 아세토니트릴);
   (2) 이동상의 농도구배 조건 :
   - 시작 ~ 0.1분 : 이동상 B 20% 유지
   - 0.1분 ~ 1분 : 이동상 B 20%에서 90%로 증가
   - 1분 ~ 2분 : 이동상 B 90% 유지
   - 2분 ~ 5분 : 이동상 B 90%에서 20%로 감소
   (3) 이동상 속도 : 200 ㎕ - 1 ml/min.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 전자분무이온화로 연결되는 이중질량분석기(ESI MS/MS)는 다음의 이온화 조건으로 실행하는 것을 특징으로 하는 소변 중의 Lyso-Gb3의 분석방법,
   (1) 소스(source) 온도 : 600 - 700℃;
   (2) 이온 분무 전압 : 5,000 - 6000 V;
   (3) 이온화 방법 : 양이온 모드에서의 전자분무 이온화법;
   (4) 내부 표준물질 : DMS (N,N-Dimethyl-D-erythro-sphingosine);
   (5) MRM(multiple reaction monitering) 정량 분석에 사용된 lyso-Gb3에 선택성을 가진 이온 : 선구이온(Q1) - m/z 786.6, 생성이온(Q3) - m/z 282.4;
   (6) MRM 정량 분석에 사용된 내부표준물질인 DMS에 선택성을 가진 이온 : 선구이온(Q1) - m/z 328.5, 생성이온(Q3) - m/z 280.0.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 전자분무이온화로 연결되는 이중질량분석기(ESI MS/MS)는 다음의 질량분석기(MS/MS) 조건으로 실행하는 것을 특징으로 하는 소변 중의 Lyso-Gb3의 분석방법,
   (1) 사용 가스;
   - Neulizer gas(CAD gas) : 질소 4 psi
   - Curtain gas : 질소 20 psi
   - Auxiliary gas : 질소 60 psi
   - Collision gas : 질소 60 psi;
   (2) 전기 조건 및 전압 파라미터;
   - DP(Declustering potential) : lyso-Gb3 (DP:126), DMS (DP:41)
   - CE(Collision energy) : lyso-Gb3 (CE:49), DMS (DP:23)
   - CXP(Collision exit potential) : lyso-Gb3 (CXP:16), DMS (CXP:8)
   - EP(Entrance potential) : lyso-Gb3 (EP:10), DMS (EP:10).
5. 삭제
6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 하나의 분석방법을 이용한 인간을 제외한 대상자의 소변으로부터의 파브리병(Fabry Disease) 진단 방법.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 인간을 제외한 대상자의 소변을 분석하였을때, Lyso-Gb3가 0.25 ng/ml 이상 농도로 검출될 때 파브리병으로 진단하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 대상자의 소변으로부터의 파브리병 진단 방법.
8. 제 6 항에 있어서, 상기 Lyso-Gb3가 0.25 - 25 ng/ml의 농도 범위일 때 파브리병으로 진단하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 대상자의 소변으로부터의 파브리병 진단 방법.

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