KR101255762B1 - Preparation method for hydrogel assembly - Google Patents
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Abstract
본 발명은 사각형 또는 육각형의 폴리에틸렌글리콜 하이드로젤을 제조하는 단계; 상기 제조된 폴리에틸렌글리콜 하이드로젤을 미네랄 오일에 넣고 자성 교반기에서 교반하여 하이드로젤 조립체를 형성하는 단계; 및 상기 하이드로젤 조립체에 자외선을 조사하여 안정화시키는 단계;를 포함하는 하이드로젤 조립체의 제조방법에 관한 것으로, 생체 조직을 모방함에 있어서 3차원으로 마이크로 조직을 재현하는 도구로 활용될 수 있다.The present invention comprises the steps of preparing a polyethylene glycol hydrogel of a square or hexagon; Adding the prepared polyethylene glycol hydrogel to mineral oil and stirring in a magnetic stirrer to form a hydrogel assembly; And stabilizing the hydrogel assembly by irradiating ultraviolet rays. The hydrogel assembly may be used as a tool for reproducing microstructure in three dimensions in mimicking living tissue.
Description
본 발명은 폴리에틸렌글리콜 하이드로젤 조립체의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유중수 계면에서의 표면장력을 이용하여 일정 형태의 하이드로젤을 조립하기 위해 자성 교반기에서 교반 속도와 시간을 조절하고, 자외선 처리로 하이드로젤 조립체의 기계적 물성을 안정화시키고 3차원으로 마이크로 조직을 재현하여 생체조직을 모방하는 하이드로젤 조립체의 제조방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for producing a polyethylene glycol hydrogel assembly, and more particularly, to control the stirring speed and time in a magnetic stirrer to assemble a hydrogel of a certain type using the surface tension at the water-in-oil interface, UV The present invention relates to a method for producing a hydrogel assembly that mimics a living tissue by stabilizing mechanical properties of the hydrogel assembly and reproducing microstructure in three dimensions.
3차원 폴리머 구조를 갖는 하이드로젤은 세포의 사멸이나 단백질의 탈수 및 변성을 최소화하고, 전체 생물학적 기능을 수행할 수 있도록 도움을 주는 생리적 조건에 가까운 환경을 제공할 수 있다. 높은 수분 함량, 친수성, 및 생체적합성 때문에 하이드로젤 중에서 폴리에틸렌글리콜(PEG)에 기반을 둔 하이드로젤이 바이오센서에 대한 생물학 및 의학, 약물 전달 장치, 조직 엔지니어링 및 세포 이식 분야에서 널리 이용되어 왔다. 폴리에틸렌글리콜 하이드로젤의 물리적 특징들은 PEG의 분자량이 다양하여 쉽게 제어될 수 있고, 폴리에틸렌글리콜 하이드로젤의 투명성은 바이오센서 용도에 이용할 때 다양한 검출 설계에 적합하다. Hydrogel having a three-dimensional polymer structure can provide a close to physiological conditions that help to minimize cell death or protein dehydration and denaturation, and perform the entire biological function. Hydrogels based on polyethyleneglycol (PEG) in hydrogels have been widely used in the fields of biology and medicine, drug delivery devices, tissue engineering and cell transplantation for biosensors due to their high water content, hydrophilicity, and biocompatibility. The physical characteristics of polyethylene glycol hydrogels can be easily controlled by varying the molecular weight of PEG, and the transparency of polyethylene glycol hydrogels is suitable for various detection designs when used in biosensor applications.
그러나 폴리에틸렌글리콜 하이드로젤을 정밀하게 조절하여 원하는 형태의 하이드로젤 조립체를 형성하도록 조절하기 어려웠으며, 사람이 직업 손으로 실시하는 문제가 있었다.
However, it was difficult to control the polyethylene glycol hydrogel precisely to form a hydrogel assembly of a desired form, and there was a problem that a person performed by a professional hand.
본 발명은 생체 조직을 모방함에 있어서 3차원으로 마이크로 조직을 재현하는 하이드로젤 조립체의 제조방법을 제공하는 것이다.
The present invention provides a method for producing a hydrogel assembly that reproduces microstructure in three dimensions in mimicking living tissue.
본 발명은, 사각형 또는 육각형의 폴리에틸렌글리콜 하이드로젤을 제조하는 단계; 상기 제조된 폴리에틸렌글리콜 하이드로젤을 미네랄 오일에 넣고 자성 교반기에서 교반하여 하이드로젤 조립체를 형성하는 단계; 및 상기 하이드로젤 조립체에 자외선을 조사하여 안정화시키는 단계;를 포함하는 하이드로젤 조립체의 제조방법을 제공한다.
The present invention comprises the steps of preparing a polyethylene glycol hydrogel of a square or hexagon; Adding the prepared polyethylene glycol hydrogel to mineral oil and stirring in a magnetic stirrer to form a hydrogel assembly; And stabilizing the hydrogel assembly by irradiating ultraviolet rays.
본 발명의 하이드로젤 조립체의 제조방법은, 하이드로젤 조립체의 형태를 조절하여 일정한 형태의 조립체를 일정 비율로 제조할 수 있는 방법을 제공하고, 특히 본 발명이 육각형 하이드로젤의 조립에 사용될 경우 기계적 물성이 우수하고 산과 알카리 등의 외부 환경의 급변에 대응할 수 있는 능력이 뛰어난 시트처럼 넓게 퍼진 하이드로젤 조립체로서 3차원 마이크로 조직을 재현하여 생체 조직을 모방에 적합한 특성을 제공할 수 있다.
The manufacturing method of the hydrogel assembly of the present invention provides a method of manufacturing a certain type of assembly in a certain ratio by adjusting the shape of the hydrogel assembly, and in particular when the present invention is used for the assembly of the hexagonal hydrogel mechanical properties This sheet is a hydrogel assembly that spreads like a sheet and has excellent ability to cope with the sudden change of external environment such as acid and alkali, so that it can provide three-dimensional microstructure to provide characteristics suitable for mimicking biological tissue.
도 1은 본 발명의 하이드로젤 조립체를 제조하는 공정의 개략도이다.
도 2는 제조예 1에서 얻어진 하이드로젤 조립체에 대한 사진으로, A는 선형 하이드로젤 조립체중 하나이고, B는 가지형 하이드로젤 조립체중 하나이며, C는 무작위형 하이드로젤 조립체중 하나이다. 사진의 스케일 바는 500 ㎛이다.
도 3은 제조예 1에서 교반속도를 100 ~ 400 rpm 변화시키면서, 80초 동안 자성 교반기로 교반했을 때의 각각의 선형, 가지형 및 무작위형 하이드로젤 조립체의 생성비율을 나타낸 그래프이다.
도 4는 제조예 1에서 교반속도를 300 rpm으로 고정하고, 교반시간을 10 ~ 120 초로 변화시키면서 자성 교반기로 교반했을 때의 각각의 선형, 가지형 및 무작위형 하이드로젤 조립체의 생성비율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 제조예 2에서 얻어진 하이드로젤 조립체에 대한 사진으로, A는 밀집형 하이드로젤 조립체중 하나이고, B는 무작위형 하이드로젤 조립체중 하나이다. 사진의 스케일 바는 500 ㎛이다.
도 6은 제조예 2에서 교반속도를 100 ~ 400 rpm 변화시키면서, 80초 동안 자성 교반기로 교반했을 때의 각각의 밀집형 및 무작위형 하이드로젤 조립체의 생성비율을 나타낸 그래프이다.
도 7은 제조예 2에서 교반속도를 300 rpm으로 고정하고, 교반시간을 10 ~ 120 초로 변화시키면서 자성 교반기로 교반했을 때의 각각의 밀집형 및 무작위형 하이드로젤 조립체의 생성비율을 나타낸 그래프이다.
도 8은 제조예 3의 라이브데드 어세이에서 위상차 현미경 사진을 나타낸 것으로, A는 1차 자외선 처리한 후의 단위 하이드로젤의 사진이고, B는 2차 자외선 처리한 후의 하이드로젤 조립체의 사진으로, 각각의 스케일 바는 500 ㎛ 이다.
도 9는 제조예 3의 라이브데드 어세이에서 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.1 is a schematic diagram of a process for making a hydrogel assembly of the present invention.
2 is a photograph of the hydrogel assembly obtained in Preparation Example 1, where A is one of the linear hydrogel assemblies, B is one of the branched hydrogel assemblies, and C is one of the random hydrogel assemblies. The scale bar in the picture is 500 μm.
Figure 3 is a graph showing the production rate of each linear, branched and random hydrogel assembly when stirred with a magnetic stirrer for 80 seconds while varying the stirring speed in Preparation Example 1 100 ~ 400 rpm.
4 is a graph showing the production rate of each linear, branched and random hydrogel assembly when the stirring speed was fixed at 300 rpm in Preparation Example 1 and stirred with a magnetic stirrer while changing the stirring time to 10 to 120 seconds. to be.
Figure 5 is a photograph of the hydrogel assembly obtained in Preparation Example 2, A is one of the dense hydrogel assembly, B is one of the random hydrogel assembly. The scale bar in the picture is 500 μm.
Figure 6 is a graph showing the production rate of each dense and random hydrogel assembly when stirred with a magnetic stirrer for 80 seconds while varying the stirring speed in Preparation Example 2 to 100 ~ 400 rpm.
7 is a graph showing the production rate of each of the dense and random hydrogel assembly when the stirring speed was fixed to 300 rpm in the preparation example 2, and stirred with a magnetic stirrer while changing the stirring time to 10 ~ 120 seconds.
8 is a phase contrast micrograph in the live dead assay of Preparation Example 3, A is a photograph of the unit hydrogel after the first ultraviolet treatment, B is a photograph of the hydrogel assembly after the second ultraviolet treatment, respectively The scale bar of is 500 micrometers.
9 is a graph showing cell viability in the live dead assay of Preparation Example 3.
본 발명의 하이드로젤 조립체의 제조방법은, 사각형 또는 육각형의 폴리에틸렌글리콜 하이드로젤을 제조하는 단계; 상기 제조된 폴리에틸렌글리콜 하이드로젤을 미네랄 오일에 넣고 자성 교반기에서 교반하여 하이드로젤 조립체를 형성하는 단계; 및 상기 하이드로젤 조립체에 자외선을 조사하여 안정화시키는 단계;를 포함한다.Method for producing a hydrogel assembly of the present invention, the step of preparing a polyethylene glycol hydrogel of the square or hexagon; Adding the prepared polyethylene glycol hydrogel to mineral oil and stirring in a magnetic stirrer to form a hydrogel assembly; And stabilizing the ultraviolet light by irradiating the hydrogel assembly.
본 발명에서 상기 사각형 또는 육각형의 폴리에틸렌글리콜 하이드로젤을 제조하는 단계는, 폴리에틸렌글리콜 함유 전구용액을 제조하는 단계; 및 상기 전구용액을 사각형 또는 육각형의 포토마스크를 사이에 두고 자외선 광원에 노출시켜 라디칼 중합을 유도하는 단계;를 포함하는 것이 바람직하다.In the present invention, the step of preparing the rectangular or hexagonal polyethylene glycol hydrogel, preparing a polyethylene glycol-containing precursor solution; And inducing radical polymerization by exposing the precursor solution to an ultraviolet light source with a square or hexagonal photomask interposed therebetween.
상기 폴리에틸렌글리콜 함유 전구용액은 증류수 또는 완충용액 중에서 선택된 어느 하나의 용매에 폴리에틸렌글리콜을 첨가하여 제조하는 것이 바람직하다. 예를 들어 PBS를 사용하여 고형의 폴리에틸렌글리콜-디메타크릴레이트를 용해시켜 제조할 수 있다.The polyethylene glycol-containing precursor solution is preferably prepared by adding polyethylene glycol to any one solvent selected from distilled water or a buffer solution. For example, it can be prepared by dissolving solid polyethylene glycol-dimethacrylate using PBS.
상기 폴리에틸렌글리콜은 적당한 수분 함량 및 격자사이즈를 갖는 하이드로젤을 형성하기 위하여, 용매 100 중량부에 대하여 30 내지 60 중량부로 포함되는 것이 바람직하다.The polyethylene glycol is preferably included in 30 to 60 parts by weight based on 100 parts by weight of the solvent in order to form a hydrogel having a suitable moisture content and lattice size.
또한 상기 폴리에틸렌글리콜의 광중합을 유도하기 위해 광개시제를 추가로 포함할 수 있고, 그 함량은 폴리에틸렌글리콜 1 중량부에 대하여 0.001 내지 0.02 중량부의 광개시제를 포함하는 것이 바람직하다. 광개시제로는 2,2-디메톡시-2-페닐아세토페논 (2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone, DMPA), 2-히드록시-2-메틸프로피오페논(2-hydroxy-2-methylpropipphenone, HOMPP) 및 어가큐어 2959(Irgacure 2959) 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다. 상기 어가큐어 2959는 2-하이드록시-1-[4-(하이드록시에톡시)페닐]-2-메틸-1-프로파논(2-Hydroxy-1-[4-(hydroxyethoxy)phenyl]-2-methyl-1-propanone)이다.In addition, in order to induce photopolymerization of the polyethylene glycol may further include a photoinitiator, the content is preferably included from 0.001 to 0.02 parts by weight of the photoinitiator with respect to 1 part by weight of polyethylene glycol. Photoinitiators include 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA), 2-hydroxy-2-methylpropiophenone (2-hydroxy-2-methylpropipphenone, HOMPP ) And Acuracure 2959 may be used. The acurure 2959 is 2-hydroxy-1- [4- (hydroxyethoxy) phenyl] -2-methyl-1-propaneone (2-Hydroxy-1- [4- (hydroxyethoxy) phenyl] -2- methyl-1-propanone).
본 발명에서 상기 하이드로젤 조립체를 형성하는 단계는, 상기 제조된 사각형 또는 육각형의 폴리에틸렌글리콜 하이드로젤을 함유하는 전구용액을 미네랄 오일에 넣고 자성 교반기에서 교반하는 것으로, 폴리에틸렌글리콜 하이드로젤을 함유하는 전구용액과 미네랄 오일은 1 : 50 ~ 1 : 500 부피비, 바람직하게는 1 : 100 ~ 1 : 400 부피비인 것이 W/O(유중수) 유수계면에서 표면장력에 의해 하이드로젤을 조립하는데에 바람직하다.Forming the hydrogel assembly in the present invention, the precursor solution containing the prepared polyethylene glycol hydrogel of the square or hexagon is put into the mineral oil and stirred in a magnetic stirrer, the precursor solution containing polyethylene glycol hydrogel And mineral oil is preferably 1:50 to 1: 500 by volume, preferably 1: 100 to 1: 400 by volume, to assemble the hydrogel by surface tension in the W / O (water-in-oil) water interface.
상기 자성 교반기에서 교반시간은 40 ~ 300 초, 바람직하게는 80 ~ 200 초, 더욱 바람직하게는 100 ~ 150 초인 것이 바람직하다. 상기 교반시간이 너무 짧으면 선형 및 가지형 하이드로젤 조립체의 비율이 낮고, 무작위형 하이드로젤 조립체의 비율이 원하는 것보다 높을 수 있고, 상기 교반시간을 더 이상 늘리더라도 시간에 비례해서 선형 및 가지형의 비율이 증대되지 않는다.In the magnetic stirrer, the stirring time is 40 to 300 seconds, preferably 80 to 200 seconds, more preferably 100 to 150 seconds. If the stirring time is too short, the proportion of the linear and branched hydrogel assembly is low, the proportion of the random hydrogel assembly may be higher than desired, and the linear and branched proportional to the time even if the stirring time is further increased. The ratio is not increased.
상기 자성 교반기에서 교반속도는 300 ~ 900 rpm, 바람직하게는 400 ~ 600 rpm인 것이다. 상기 교반속도가 느리면 교반시간을 늘리더라도 선형 및 가지형 하이드로젤 조립체의 비율이 낮고, 무작위형 하이드로젤 조립체의 비율이 높으며, 상기 교반속도가 너무 빠르면 하이드로젤에 가해지는 응력이 높아 하이드로젤의 격자 사이즈가 너무 수축되거나 하이드로젤이 깨질 수 있다. 또한 자성교반기로 일정하게 교반하지 않고 손으로 마이크로 피펫 등으로 직접 교반하는 경우 교반속도가 직선운동의 경우 6 cm/sec, 회전운동의 경우 200 rpm을 넘기 어렵고, 특히 교반속도가 일정하지 않기 때문에 일정한 크기의 하이드로젤 조립체를 얻기 어렵고, 제조시마다 원하는 형태의 하이드로젤 조립체를 얻는 것이 불가능하다.In the magnetic stirrer, the stirring speed is 300 to 900 rpm, preferably 400 to 600 rpm. If the stirring speed is slow, the ratio of linear and branched hydrogel assemblies is low even if the stirring time is increased, the ratio of random hydrogel assemblies is high, and if the stirring speed is too fast, the stress applied to the hydrogel is high and the lattice of the hydrogel is high. The size may shrink too much or the hydrogel may break. In addition, when stirring directly with a micro pipette, etc., without stirring constantly with a magnetic stirrer, the stirring speed is difficult to exceed 6 cm / sec in the case of linear motion and 200 rpm in the case of rotary motion, and in particular, the stirring speed is not constant. It is difficult to obtain a hydrogel assembly of size and it is impossible to obtain a hydrogel assembly of the desired form every production.
본 발명에서 특히 바람직하게는 자성 교반기로 400 ~ 500 rpm의 교반속도로 100 ~ 140 초동안 교반하는 경우 선형 및 가지형 하이드로젤 조립체의 비율을 가장 높게 제조할 수 있다.Particularly preferred in the present invention, when the magnetic stirrer is stirred for 100 to 140 seconds at a stirring speed of 400 to 500 rpm, the ratio of the linear and branched hydrogel assemblies may be the highest.
본 발명에서 하나의 단위 폴리에틸렌글리콜 하이드로젤이 사각형인 경우, 상기 하이드로젤 조립체의 형태는 선형, 가지형 및 무작위형으로 형성될 수 있다. 선형은 하나의 단위 하이드로젤이 2 내지 20 개, 바람직하게는 3 내지 15개, 더욱 바람직하게는 4 내지 12개가 선형으로 결합되어 조립체를 형성한 것이고(도 2의 A), 가지형은 하나의 단위 하이드로젤이 4 내지 30 개, 바람직하게는 6 내지 25 개, 더욱 바람직하게는 8 내지 20 개가 하나 이상의 꺽임을 가진체 결합되어 조립체를 형성한 것이고(도 2의 B), 무작위형은 하나의 단위 하이드로젤이 5 내지 30 개가 선형이나 가지형이 아닌 상태로 응집되어 조립체를 형성한 것이다(도 2의 C).In the present invention, when one unit of polyethylene glycol hydrogel has a quadrangular shape, the hydrogel assembly may be formed in a linear, branched and random form. Linear is a unit hydrogel having 2 to 20, preferably 3 to 15, more preferably 4 to 12 linearly bonded to form an assembly (A in FIG. 2), the branch is one Four to thirty unit hydrogels, preferably six to twenty, more preferably eight to twenty, are joined together to form one or more breaks to form an assembly (FIG. 2B), with a random 5 to 30 unit hydrogels are aggregated in a linear or non-branched state to form an assembly (FIG. 2C).
본 발명에서 하나의 단위 폴리에틸렌글리콜 하이드로젤이 사각형인 경우 선형 하이드로젤 조립체는 갯수 비율로 20 % 이상, 바람직하게는 22 ~ 30 %를 차지하고, 선형 및 가지형을 합한 비율이 40 ~ 60 %, 바람직하게는 45 ~ 60 %, 더욱 바람직하게는 50 ~ 60 %를 차지한다.In the present invention, when one unit of polyethylene glycol hydrogel has a rectangular shape, the linear hydrogel assembly occupies 20% or more, preferably 22 to 30% by number, and the ratio of linear and branched is 40 to 60%, preferably Preferably from 45 to 60%, more preferably from 50 to 60%.
본 발명에서 하나의 단위 폴리에틸렌글리콜 하이드로젤이 육각형인 경우, 상기 하이드로젤 조립체는 밀집형 또는 무작위형으로 형성될 수 있다. 밀집형은 하나의 단위 하이드로젤이 7 내지 50 개, 바람직하게는 11 ~ 40개가 육각형의 모서리 둘레로 다른 하이드로젤이 모두 결합한 중심 하이드로젤이 하나 이상 형성된 것이고(도 5의 A), 무작위형은 3 ~ 20 개의 하이드로젤이 중심 하이드로젤이 없이 길이 방향으로 결합된 것이다(도 5의 B).In the present invention, when one unit polyethylene glycol hydrogel is hexagonal, the hydrogel assembly may be formed in a dense or random form. Dense type is one unit hydrogel of 7 to 50, preferably 11 to 40 is formed at least one central hydrogel combined with all other hydrogel around the corner of the hexagon (Fig. 5A), random type 3 to 20 hydrogels are combined in the longitudinal direction without the central hydrogel (FIG. 5B).
본 발명에서 하나의 단위 폴리에틸렌글리콜 하이드로젤이 육각형인 경우, 밀집형 하이드로젤 조립체는 갯수 비율로 30 ~ 60 %, 바람직하게는 40 ~ 60 %를 차지한다. 특히 하이드로젤이 육각형이면서 밀집형인 하이드로젤 조립체는 물리적으로 힘을 가했을 때 구조를 유지할 수 있는 기계적 물성이 뛰어나고, 또한 세포 배양시 산이나 알카리 이온에 의해 영향을 받을 수 있는 표면적이 다른 형태에 비해 가장 좁기 때문에 산 및 알카리 안정성이 뛰어나다. In the present invention, when one unit polyethylene glycol hydrogel is hexagonal, the dense hydrogel assembly occupies 30 to 60%, preferably 40 to 60% in number ratio. Particularly, the hydrogel assembly with hexagonal and dense hydrogel has excellent mechanical properties to maintain the structure when physical force is applied, and the surface area which can be affected by acid or alkali ions in cell culture is the most compared with other forms. Because of its narrowness, it has excellent acid and alkali stability.
본 발명의 하이드로젤 조립체의 제조과정에서 하이드로젤에 세포를 접종하여 하이드로젤 조립체를 세포배양의 매트릭스로 활용할 수 있다. 이를 위하여 본 발명은, 폴리에틸렌글리콜 함유 전구용액을 제조하는 단계; 상기 전구용액에 세포를 접종하는 단계; 상기 세포가 접종된 전구용액을 사각형 또는 육각형의 포토마스크를 사이에 두고 자외선 광원에 노출시켜 라디칼 중합을 유도하는 단계; 상기 라디칼 중합으로 형성된 사각형 또는 육각형의 폴리에틸렌글리콜 하이드로젤을 포함하는 전구용액을 미네랄 오일에 넣고 자성 교반기에서 교반하여 하이드로젤 조립체를 형성하는 단계; 및 상기 하이드로젤 조립체에 자외선을 조사하여 안정화시키는 단계;를 포함한다.
Inoculating the cells into the hydrogel in the manufacturing process of the hydrogel assembly of the present invention can utilize the hydrogel assembly as a cell culture matrix. To this end, the present invention comprises the steps of preparing a polyethylene glycol-containing precursor solution; Inoculating the precursor solution with the cells; Inducing radical polymerization by exposing the precursor solution inoculated with the cells to an ultraviolet light source with a square or hexagonal photomask interposed therebetween; Adding a precursor solution containing a rectangular or hexagonal polyethylene glycol hydrogel formed by the radical polymerization into a mineral oil and stirring the mixture with a magnetic stirrer to form a hydrogel assembly; And stabilizing the ultraviolet light by irradiating the hydrogel assembly.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 참조하여 더욱 구체적으로 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to the following examples. However, the following examples are provided only to aid understanding of the present invention, and the scope of the present invention is not limited to the following examples.
제조예Manufacturing example 1: 사각형 1: square 하이드로젤을Hydrogel 이용한 Used 하이드로젤Hydrogel 조립체의 제조 Manufacture of assembly
도 1의 본 발명의 하이드로젤 조립체 제조과정에 대한 개략도와 같이 하이드로젤 조립체를 제조하였다.Hydrogel assembly was prepared as a schematic diagram of the hydrogel assembly manufacturing process of the present invention of FIG.
폴리에틸렌글리콜-디메타크릴레이트(분자량 700)을 PBS(0.1M, pH7.4)에서 용해시켜 50 (w/v)% 용액을 제조하고, 광중합을 개시하기 위해 1 중량%의 HOMPP를 PEG 용액에 첨가하여 전구용액을 제조하였다.Polyethyleneglycol-dimethacrylate (molecular weight 700) was dissolved in PBS (0.1M, pH7.4) to prepare a 50 (w / v)% solution, and 1 wt% HOMPP was added to the PEG solution to initiate photopolymerization. Was added to prepare a precursor solution.
얇은 필름의 포토마스크는 사각형 모양(500 x 500 ㎛)으로 오토캐드 소프트웨어를 사용하여 미리 디자인하여 준비하였다. Thin film photomasks were rectangular in shape (500 x 500 μm) predesigned and prepared using AutoCAD software.
두 개의 슬라이드 글래스는 모두 자외선에 노출하기전에 옥타데실 트리ㅣ클로로실란(OTS) 처리하여 슬라이드 글래스가 전구용액과 잘 떨어지기 쉬운 소수성 표면을 갖도록 해주고, 상기 전구용액 40 ㎕를 슬라이드 글래스 위에 떨어뜨리고 두 개의 스페이서 글래스(두께 140 ㎛)를 사이에 넣고 용액위에 슬라이드 글라스로 덮었다. 덮어진 슬라이드 글래스는 전구용액을 글래스 위에 균일하게 분포하게 하는 역할을 한다. 얇은 필름의 포토마스크는 슬라이드 글래스의 맨 위쪽에 위치하여 놓아두고, 자외선(365nm, 300 mW/cm2, EFOS Ultracure 100ss Plus, UV spot lamp, Missisauga, Ontario, Canada)에 2초간 노출시켰다. 자외선에 노출된 전구용액은 교차결합반응을 겪게 되며, 물과 같은 통상의 PEG 용매에서 불용성 상태가 된다. 포토리소그라피를 통해 전구용액을 젤로 제조한 후, 두 개의 슬라이드 글래스와 글래스 스페이서를 제거했다.Both slide glasses were treated with octadecyl trichlorochlorosilane (OTS) prior to exposure to UV light to ensure that the slide glass had a hydrophobic surface that could be easily separated from the precursor solution. 40 μl of the precursor solution was dropped onto the slide glass. Two spacer glasses (140 μm thick) were sandwiched and covered with slide glass over the solution. The covered slide glass serves to evenly distribute the precursor solution onto the glass. The thin film photomask was placed on top of the slide glass and exposed to ultraviolet light (365 nm, 300 mW / cm 2 , EFOS Ultracure 100ss Plus, UV spot lamp, Missisauga, Ontario, Canada) for 2 seconds. The precursor solution exposed to ultraviolet light undergoes a crosslinking reaction and becomes insoluble in conventional PEG solvents such as water. After the precursor solution was made into gel through photolithography, two slide glasses and glass spacers were removed.
그 다음, 500 ㎛의 사각형 하이드로젤을 포함하는 전구용액 40 ㎕을 10mL의 미네랄 오일을 함유한 페트리디쉬로 옮겼다.Then, 40 μl of the precursor solution containing the 500 μm square hydrogel was transferred to Petri dishes containing 10 mL of mineral oil.
상기 사각형 단위 하이드로젤은 자성 교반 바이오리엑터 시스템 안에서 소수성 미네랄 오일 상 위에 조립시켰다. 하이드로젤의 조립을 위해 교반속도를 100 ~ 400 rpm, 교반시간을 10 ~ 120 초로 변화시키면서 하이드로겔 조립체의 얻었다. 하이드로젤 조립체를 제조한 후, 조립체를 형성하지 않은 단위 하이드로젤과 미네랄 오일을 페트리디쉬로부터 완벽하게 제거하고, 남은 하이드로젤 조립체를 제조예 1과 같은 자외선 광원에 1초 노출시켜 하이드로젤 조립체를 안정화 시켰다.The square unit hydrogels were assembled on a hydrophobic mineral oil phase in a magnetic stirred bioreactor system. Hydrogel assembly was obtained while changing the stirring speed to 100 to 400 rpm and the stirring time to 10 to 120 seconds for assembling the hydrogel. After preparing the hydrogel assembly, the unit hydrogel and the mineral oil which did not form the assembly were completely removed from the petri dish, and the remaining hydrogel assembly was exposed to the ultraviolet light source as in Preparation Example 1 for 1 second to stabilize the hydrogel assembly. I was.
도 2의 A는 제조예를 통해 얻은 선형 하이드로젤 조립체중 하나이고, B는 가지형 하이드로젤 조립체중 하나이며, C는 무작위형 하이드로젤 조립체중 하나이다.FIG. 2A is one of the linear hydrogel assemblies obtained through the preparation, B is one of the branched hydrogel assemblies, and C is one of the random hydrogel assemblies.
도 3은 교반속도를 100 ~ 400 rpm 변화시키면서, 80초 동안 자성 교반기로 교반했을 때의 각각의 선형, 가지형 및 무작위형 하이드로젤 조립체의 생성비율을 나타낸 그래프이다. 교반속도가 증가할 수록 선형, 또는 선형과 가지형의 비율이 증가하고, 무작위형의 비율이 감소하였다.Figure 3 is a graph showing the production rate of each linear, branched and random hydrogel assembly when stirred with a magnetic stirrer for 80 seconds while varying the
도 4는 교반속도를 300 rpm으로 고정하고, 교반시간을 10 ~ 120 초로 변화시키면서 자성 교반기로 교반했을 때의 각각의 선형, 가지형 및 무작위형 하이드로젤 조립체의 생성비율을 나타낸 그래프이다. 교반시간이 증가할 수록 선형, 또는 선형과 가지형의 비율이 증가하고, 무작위형의 비율이 감소하였다. 특히 80초 이상 교반했을 때는 그 보다 짧게 교반했을 때보다 선형 하이드로젤 조립체의 비율이 통계적으로 유의하게 상승하였음을 확인할 수 있었다.
4 is a graph showing the production rate of each linear, branched and random hydrogel assembly when the stirring speed was fixed at 300 rpm and the stirring time was changed to 10 to 120 seconds with a magnetic stirrer. As the agitation time increased, the linear or linear-to-branched ratio increased and the random ratio decreased. In particular, when stirring for more than 80 seconds, it was confirmed that the proportion of the linear hydrogel assembly was significantly increased than when stirring shorter than that.
제조예Manufacturing example 2: 육각형 2: hexagon 하이드로젤을Hydrogel 이용한 Used 하이드로젤Hydrogel 조립체의 제조 Manufacture of assembly
한 모서리가 500 ㎛인 육각형 모양의 포토마스크를 사용한 것을 제외하고 제조예 1과 동일하게 육각형 하이드로젤 조립체를 제조하고, 조립체를 형성하지 않은 단위 하이드로젤과 미네랄 오일을 페트리디쉬로부터 완벽하게 제거하고, 남은 하이드로젤 조립체를 제조예 1과 같은 자외선 광원에 1초 노출시켜 하이드로젤 조립체를 안정화 시켰다.A hexagonal hydrogel assembly was prepared in the same manner as in Preparation Example 1 except that a hexagonal photomask having a corner of 500 μm was used, and the unit hydrogel and mineral oil that did not form the assembly were completely removed from the petri dish, The remaining hydrogel assembly was exposed to an ultraviolet light source as in Preparation Example 1 for 1 second to stabilize the hydrogel assembly.
도 5의 A는 제조예를 통해 얻은 밀집형 하이드로젤 조립체중 하나이고, B는 무작위형 하이드로젤 조립체중 하나이다.5A is one of the dense hydrogel assemblies obtained through the preparation, and B is one of the random hydrogel assemblies.
도 6은 교반속도를 100 ~ 400 rpm 변화시키면서, 80초 동안 자성 교반기로 교반했을 때의 각각의 밀집형 및 무작위형 하이드로젤 조립체의 생성비율을 나타낸 그래프이다. 교반속도가 증가할 수록 밀집형의 비율이 증가하였고, 무작위형의 비율은 감소하였다. 특히 300 rpm 에서는 그 보나 낮은 교반속도에 비해 밀집형의 비율이 현저히 증가하여 39% 이었고, 교반속도를 400 rpm으로 증가시켜도 밀집형의 비율이 더 높아지지는 않았다.Figure 6 is a graph showing the production rate of each dense and random hydrogel assembly when stirred with a magnetic stirrer for 80 seconds while varying the
도 7는 교반속도를 300 rpm으로 고정하고, 교반시간을 10 ~ 120 초로 변화시키면서 자성 교반기로 교반했을 때의 각각의 밀집형 및 무작위형 하이드로젤 조립체의 생성비율을 나타낸 그래프이다. 교반시간이 증가할 수록 밀집형의 비율이 증가하고, 무작위형의 비율이 감소하였다. 특히 40초 이상 교반했을 때는 그 보다 짧게 교반했을 때보다 밀집형 하이드로젤 조립체의 갯수 비율이 30 %로서 통계적으로 유의하게 상승하였고, 80초 이상 교반하였을 때에는 더욱더 상승하여 갯수 비율이 39%에 달하였으며, 교반시간을 증대시켜도 더 이상 밀집형의 비율이 증가되지는 않았다.
7 is a graph showing the production rate of each of the dense and random hydrogel assemblies when the stirring speed was fixed at 300 rpm and the stirring time was changed to 10 to 120 seconds with a magnetic stirrer. As the agitation time increased, the proportion of dense type increased and the proportion of random type decreased. In particular, when the mixture was stirred for 40 seconds or more, the number ratio of the dense hydrogel assembly was 30%, which was statistically significantly increased, and when the mixture was stirred for 80 seconds or more, the number ratio was 39%. Increasing the stirring time did not increase the density ratio anymore.
제조예Manufacturing example 3: 세포를 함유한 3: containing cells 하이드로젤Hydrogel 조립체의 제조 Manufacture of assembly
NIH-3T3 마우스 섬유아 세포는 DulbeccoModified Eagle Media 과 10% Fetal Bovine Serum, 1% penicillin-streptomycin로 humidified incubator (5% CO2,37℃)에서 배양하였다.NIH-3T3 mouse fibroblasts were cultured in a humidified incubator (5% CO2, 37 ° C) with DulbeccoModified Eagle Media, 10% Fetal Bovine Serum, and 1% penicillin-streptomycin.
상기 세포배양액을 세포 농도 1 x 107 cell/ml로 제조예 1의 전구용액에 50 중량% 첨가하고 교반하였다. 세포를 함유한 전구용액으로부터 포토리소그라피를 통해 단위 하이드로젤을 얻는 과정은 제조예 1과 동일하고, 얻어진 세포 함유 하이드로젤을 포함한 전구용액 40 ㎕을 10mL의 미네랄 오일을 함유한 페트리디쉬로 옮기고, 상기 자성 교반 바이오리엑터 시스템 안에서 300 rpm으로 80 초 동안 소수성 미네랄 오일 상 위에 조립시켰다. 조립 후 조립체를 형성하지 않은 단위 하이드로젤과 미네랄 오일을 페트리디쉬로부터 완벽하게 제거하고, 남은 하이드로젤 조립체를 제조예 1과 같은 자외선 광원에 1초 노출시켜 하이드로젤 조립체를 안정화 시켰다.
50% by weight of the cell culture solution was added to the precursor solution of Preparation Example 1 at a cell concentration of 1 × 10 7 cells / ml and stirred. The procedure of obtaining a unit hydrogel from the precursor solution containing the cells through photolithography was the same as in Preparation Example 1, and transferred 40 µl of the precursor solution containing the obtained cell-containing hydrogel to a petri dish containing 10 mL of mineral oil. Assembled on hydrophobic mineral oil phase for 80 seconds at 300 rpm in a magnetic stirred bioreactor system. After assembly, the unit hydrogel and the mineral oil, which did not form an assembly, were completely removed from the petri dish, and the remaining hydrogel assembly was exposed to an ultraviolet light source as in Preparation Example 1 for 1 second to stabilize the hydrogel assembly.
제조예 3에서 첫번째 자외선 처리 후 단위 하이드로젤과 두번째 자외선 처리 후 하이드로젤 조립체의 세포의 생존률은 calcein AM(녹색, 살아있는 세포)과 ethidium homodimer (적색, 죽은 세포)로 라이브데드 어세이를 사용하여 분석하였다. In Preparation Example 3, the cell viability of the unit hydrogel after the first UV treatment and the hydrogel assembly after the second UV treatment was analyzed using a live dead assay with calcein AM (green, living cells) and ethidium homodimer (red, dead cells). It was.
라이브데드 어세이 용액은 (2 L calcein AM and 0.5 L ethidium homodimer in 1 mL phosphate buffered saline) 세포를 포함한 조립된 하이드로젤이 있는 페트리디쉬 안으로 주입하고 10분동안 37 ℃인큐베이터 상태로 놔두었다. 10분 동안 인큐베이션 한뒤에 위상차 이미지를 위해 라이브데드 어세이 용액을 완벽하게 제거하였다. The Live Dead Assay solution was injected into Petri dishes with assembled hydrogel containing cells (2 L calcein AM and 0.5 L ethidium homodimer in 1 mL phosphate buffered saline) and left incubated for 10 min at 37 ° C. After incubation for 10 minutes, the Live Dead Assay solution was completely removed for phase contrast images.
그 다음 두 번째 자외선에 의해 결합 뒤에 조립된 하이드로젤이 어떠한 물리적 손상 없이 마이크로 플레이트 안으로 쉽게 이동할 수 있었다. 위상차와 형광 이미지는 위상차현미경(Olympus IX71)과 Image J 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 모든 데이터는 최소 3번 실험하고 분석 데이터의 통계적 유의도(Student t-test, p value)로부터 얻었다.Then the hydrogel assembled after bonding by the second ultraviolet light could easily move into the microplate without any physical damage. Phase contrast and fluorescence images were analyzed using a phase contrast microscope (Olympus IX71) and Image J software. All data were tested at least three times and obtained from statistical significance (Student t-test, p value) of the analytical data.
상기 위상차 형광이미지를 도 8에 나타내었다. 살아있는 세포는 녹색, 죽은 세포는 적색으로 표시되었다. 또한 각각에서 세포생존율을 분석한 결과 1차 및 2차 자외선 처리를 통해 세포생존율이 어느 정도 저하되었으나, 자외선 처리하지 않은 대조군과의 차이는 20 % 미만이었고, 하이드로젤 조립체에서의 세포생존율은 70% 이상임을 확인할 수 있었다.The phase difference fluorescence image is shown in FIG. 8. Live cells are green and dead cells are red. In addition, as a result of analyzing the cell viability in each of the cells, the cell viability was decreased to some extent through the first and second UV treatment, but the difference from the control group without UV treatment was less than 20%, and the cell survival rate in the hydrogel assembly was 70%. It was confirmed that it is abnormal.
Claims (12)
상기 제조된 폴리에틸렌글리콜 하이드로젤을 미네랄 오일에 넣고 자성 교반기에서 교반하여 하이드로젤 조립체를 형성하는 단계; 및
상기 하이드로젤 조립체에 자외선을 조사하여 안정화시키는 단계;를 포함하는 하이드로젤 조립체의 제조방법.
Preparing a rectangular or hexagonal polyethylene glycol hydrogel;
Adding the prepared polyethylene glycol hydrogel to mineral oil and stirring in a magnetic stirrer to form a hydrogel assembly; And
And stabilizing the hydrogel assembly by irradiating UV rays.
폴리에틸렌글리콜 함유 전구용액을 제조하는 단계; 및
상기 전구용액을 사각형 또는 육각형의 포토마스크를 사이에 두고 자외선 광원에 노출시켜 라디칼 중합을 유도하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로젤 조립체의 제조방법.
According to claim 1, wherein the step of preparing a rectangular or hexagonal polyethylene glycol hydrogel,
Preparing a polyethylene glycol-containing precursor solution; And
And inducing radical polymerization by exposing the precursor solution to an ultraviolet light source with a rectangular or hexagonal photomask interposed therebetween.
The method of claim 2, wherein the polyethylene glycol-containing precursor solution is prepared by adding polyethylene glycol to any one solvent selected from distilled water or a buffer solution.
The method of claim 3, wherein the polyethylene glycol is 30 to 60 parts by weight based on 100 parts by weight of a solvent.
The method of claim 2, further comprising 0.001 to 0.02 parts by weight of a photoinitiator with respect to 1 part by weight of polyethylene glycol to induce photopolymerization of polyethylene glycol.
The photoinitiator of claim 5, wherein the photoinitiator is 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA), 2-hydroxy-2-methylpropiophenone (2-hydroxy). -2-methylpropipphenone, HOMPP) and 2-hydroxy-1- [4- (hydroxyethoxy) phenyl] -2-methyl-1-propanone (2-Hydroxy-1- [4- (hydroxyethoxy) phenyl] -2-methyl-1-propanone) is a method for producing a hydrogel assembly, characterized in that at least one selected from.
상기 제조된 사각형 또는 육각형의 폴리에틸렌글리콜 하이드로젤을 함유하는 전구용액을 미네랄 오일에 넣고 자성 교반기에서 교반하는 것으로, 폴리에틸렌글리콜 하이드로젤을 함유하는 전구용액과 미네랄 오일은 1 : 50 ~ 1 : 500 부피비인 것을 특징으로 하는 하이드로젤 조립체의 제조방법.
The method of claim 2, wherein forming the hydrogel assembly comprises:
The prepared solution containing the polyethylene glycol hydrogel of the square or hexagon prepared above was added to the mineral oil and stirred in a magnetic stirrer. Method for producing a hydrogel assembly, characterized in that.
The method of claim 7, wherein the stirring time in the magnetic stirrer is 40 to 300 seconds.
The method of claim 7 or 8, wherein the stirring speed in the magnetic stirrer is a method of producing a hydrogel assembly, characterized in that 300 ~ 900 rpm.
10. The method of claim 9, wherein the polyethylene glycol hydrogel is a square, the shape of the hydrogel assembly comprises a linear, branched and random form, the proportion of the number of linear of the shape of the hydrogel assembly is 20% or more Method for producing a hydrogel assembly.
The method of claim 10, wherein the proportion of the number of linear and branched sums in the form of the hydrogel assembly is 40 to 60%.
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