KR101253269B1 - 액정을 이용하는 올리고뉴클레오타이드 혼성화 및 단백질 상호반응 디스플레이용 광학 셀 - Google Patents

액정을 이용하는 올리고뉴클레오타이드 혼성화 및 단백질 상호반응 디스플레이용 광학 셀 Download PDF

Info

Publication number
KR101253269B1
KR101253269B1 KR1020100047625A KR20100047625A KR101253269B1 KR 101253269 B1 KR101253269 B1 KR 101253269B1 KR 1020100047625 A KR1020100047625 A KR 1020100047625A KR 20100047625 A KR20100047625 A KR 20100047625A KR 101253269 B1 KR101253269 B1 KR 101253269B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
substrate
liquid crystal
dna
present
optical cell
Prior art date
Application number
KR1020100047625A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20110128034A (ko
Inventor
장창현
Original Assignee
가천대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가천대학교 산학협력단 filed Critical 가천대학교 산학협력단
Priority to KR1020100047625A priority Critical patent/KR101253269B1/ko
Publication of KR20110128034A publication Critical patent/KR20110128034A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101253269B1 publication Critical patent/KR101253269B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5302—Apparatus specially adapted for immunological test procedures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures

Abstract

본 발명은 (a) 연속된 사인파형(sinusoidal wave) 표면을 포함하는 기판(substrate); (b) 상기 기판의 표면에 결합되어 있는 복수의 올리고뉴클레오타이드 또는 단백질; 및 (c) 액정(liquid crystal)을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 혼성화 또는 단백질 상호반응 디스플레이용 광학 셀(optical cell)에 관한 것이다. 본 발명은 나노구조의 파형 특성을 정량적으로 조절함으로써 다양한 바이오 물질(예컨대, 단백질, DNA, RNA, 효소, 바이러스 또는 박테리아)의 검출에 있어서 범용적으로 수행할 수 있는 방법이다. 본 발명은 올리고뉴클레오타이드 혼성화 또는 단백질 상호작용을 검출하는데 있어서 복잡한 기계사용 및 노동력을 필요로 하지 않는 장점이 있다. 또한, 본 발명은 액정을 이용하는 바이오칩 또는 바이오 센서와 같은 분야에 있어서 기초적인 자료를 제공한다.

Description

액정을 이용하는 올리고뉴클레오타이드 혼성화 및 단백질 상호반응 디스플레이용 광학 셀{Optical Cell Displaying Oligonucleotides Hybridization and Proteins Interaction Using Liquid Crystal}
본 발명은 액정을 이용하는 올리고뉴클레오타이드 혼성화 및 단백질 상호반응 디스플레이용 광학 셀 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
액정(Liquid crystalline) 물질은 다양한 탐지 응용분야에 있어서 매우 큰 잠재성을 가지고 있다. 액정의 배향적인 특성은 나노 구조의 표면에서의 생물학적 결합을 광학적 결과물로 증폭 및 도입시킬 수 있다.1-3 또한, 서브마이크로미터 스파셜 솔루션(submicrometer spatial resolution)을 이용하여 표면에서의 리셉터-매개 단백질 결합을 이미지화 하는데 이용될 수 있다.4,5 이러한 방법은 효소적 또는 형광성 레이블의 이용을 필요로 하지 않기 때문에 잠재적으로 유용하며, 이러한 레이블은 표면-기반 분석에 있어서 매우 복잡하고, 높은 멀티플렉싱 수준을 억제한다.6,7 또한, 이러한 방법은 복잡한 기구8 및 노동 기술9의 이용을 필요로 하지 않는다. 그러므로, 액정 기반 방법들은 간단한 어세이(assay) 장치 제조에 이용될 수 있으며, 이러한 장치들은 실험실 외부에서 보다 쉬운 방법으로 시료를 평가할 수 있다.
상호 표면에서 액정 및 분자들간 발생하는 상호작용의 다양한 메커니즘들은 이미 보고 되었다. 이러한 예들은 나노미터-규모 표면 토포그래피(topography), 액정 배향에 대한 전자적 이중층의 커플링11-13 및 상호 표면에서 액정과 생체분자간의 입체 상호작용14-16의 마스킹(masking)을 포함한다. 표면상에서 생체분자 상호작용들을 탐침하기 위하여 액정을 이용하는 접근법은 완만히 증착된 금 필름상에서 SAMs(self-assembled monolayers)의 나노미터-크기 구조를 이용한 것이다.1,10 결합된 단백질이 없는 경우, 탄성 에너지(elastic energy)를 최소화시키기 위하여 표면상에서의 액정은 일정하게 배열한다.1,10 그러나, 표면 토포그래피를 덮어버리는 단백질들이 결합하자 마자 액정은 비-획일적으로 배열한다.1,10
또한, 액정과 분자 표면간의 정전기적 상호작용에 대한 연구는 이미 보고 되었다.11-13 예를 들면, 계면에서 화학적 및 생물학적 종류를 증폭시키기 위하여 액정을 이용하는 경우, 액정에 전해질 첨가뿐 만 아니라 표면에서 이온화 그룹들은 액정의 유용한 배열 움직임을 이끈다.12 이러한 연구들은 액정의 배향 움직임상에서 전기적 이중층의 역할에 대하여 기술하고 있다. 또한, 수용성-액정 인터페이스에서 흡수된 액정과 표면 분자들, 그리고 액정과 표면 활성 물질들간의 정전기적 상호작용들은 액정의 배열 변환을 일으키는 것으로 보고되었다.14,16
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 보다 특이적으로 올리고뉴클레오타이드 혼성화 또는 단백질 상호반응을 검출할 수 있는 검출 장치를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 연속된 사인파형(sinusoidal wave) 표면을 포함하는 기판 표면에 검출하고자 하는 타겟 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오타이드를 결합시킨 후, 타겟 올리고뉴클레오타이드가 포함된 시료와 혼합시키고, 그 다음 상기 기판에 액정을 주입한 다음 기판에 빛을 조사하는 경우, 기판 표면에 결합된 올리고뉴클레오타이드와 특이적으로 결합된 타겟 올리고뉴클레오타이드 혼성화를 광학적으로 손쉽게 디스플레이할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 연속된 사인파형 기판 표면 및 액정을 이용하여 광학적으로 DNA 혼성화 또는 단백질 상호반응을 디스플레이할 수 있는 광학 셀(optical cell)을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 연속된 사인파형 기판 표면 및 액정을 이용하여 광학적으로 DNA 혼성화 또는 단백질 상호반응을 디스플레이할 수 있는 광학 셀 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 연속된 사인파형(sinusoidal wave) 표면을 포함하는 기판(substrate); (b) 상기 기판의 표면에 결합되어 있는 복수의 올리고뉴클레오타이드 또는 단백질; 및 (c) 액정(liquid crystal)을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 혼성화 또는 단백질 상호반응 디스플레이용 광학 셀(optical cell)을 제공한다.
본 발명자들은 보다 특이적으로 올리고뉴클레오타이드 혼성화 또는 단백질 상호반응을 검출할 수 있는 검출 장치를 개발하고자 노력하였으며, 그 결과, 연속된 사인파형(sinusoidal wave) 표면을 포함하는 기판 표면에 검출하고자 하는 타겟 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오타이드를 결합시킨 후, 타겟 올리고뉴클레오타이드가 포함된 시료와 혼합시키고, 그 다음 상기 기판에 액정을 주입한 다음 기판에 빛을 조사하는 경우, 기판 표면에 결합된 올리고뉴클레오타이드와 특이적으로 결합된 타겟 올리고뉴클레오타이드 혼성화를 광학적으로 손쉽게 디스플레이가 가능하다는 것을 편광현미경으로 확인하였다.
본 발명은 올리고뉴클레오타이드 혼성화 또는 단백질 상호반응 검출 디스플레이용 광학 셀에 관한 것이다.
본 발명은 타겟 올리고뉴클레오타이드 서열과 연속된 사인파형을 가지는 기판상에 결합된 타겟 올리고뉴클레오타이드 서열에 상보적인 올리고뉴클레오타이드와의 혼성화를 액정을 이용하여 타겟 올리고뉴클레오타이드를 간단하고 빠른 시간내에 광학적으로 검출할 수 있는 장점을 가지고 있다.
본 발명의 명세서에서 표현 “연속된 사인파형(sinusoidal wave)”은 균일하고 일정한 진폭과 파장 가진 사인파 형태를 의미하며, 본 발명에서 연속된 사인파형을 가지는 기판 표면은 본 발명 도 2에 나타내었다.
본 발명에서의 연속된 사인파형 기판의 표면 제조 방법은 다음과 같다:
(a) 탄성력을 지니는 고분자 기질의 표면에 산화막을 형성시키는 단계; (b) 산화막이 형성된 탄성력을 지니는 고분자 기질을 원통형의 지지체 상에 구부려(bending) 상기 기질을 스트레칭(stretching)시키는 단계; (c) 상기 스트레칭된 탄성력을 지니는 고분자 기질을 원통형의 지지체로부터 해리(releasing)시키는 단계; 및 (d) 상기 연속된 사인파형 표면을 가지는 탄성력을 지니는 고분자 기질을 기판에 프린팅하는 단계.
또한, 본 발명에서의 연속된 사인파형 기판의 표면은 대한민국 특허출원번호 제10-2009-0041696호를 참조로 하여 제조할 수 있다.
액정을 이용하여 바이오칩 또는 바이오센서를 구현하는데 있어서, 나노구조의 파형 특성을 정량적으로 조절하는 것은 매우 중요한 기술 중에 하나이다. 바람직하게는, 본 발명에서의 연속된 사인파형 표면을 가지는 기판은 검출하고자 하는 타겟 물질들(예컨대, 단백질, DNA, RNA, 효소, 바이러스, 또는 박테리아)의 크기에 따라 사인파형의 나노구조 표면의 파장과 파고를 정량적으로 조절될 수 있다.
상기 사인파 형태를 가지는 기판은 탄성력을 지니는 고분자 기질을 이용하여 제조될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 탄성력을 지니는 고분자 기질은 실리콘 중합체 또는 공중합체, 에폭시 중합체 또는 공중합체, 또는 아크릴 중합체 또는 공중합체이다.
본 발명에서 이용되는 탄성력을 지니는 고분자 기질은 중합체이며, 이는 선형 또는 분쇄형 백본을 가질 수 있고, 교차결합 또는 비교차결합된 중합체이다.
본 발명에서 이용될 수 있는 에폭시 중합체는 에폭시기로 알려져 있는 3-멤버 환형 에테르기의 존재에 의해 특징 지워진다. 예를 들어, 비스페놀 A의 다이글라이시딜 에테르 등이 본 발명에 이용될 수 있다.
본 발명에서 이용될 수 있는 실리콘 탄성체는, 클로로실란(예컨대, 메틸클로로실란, 에틸클로로실란 및 페닐클롤로실란) 등과 같은 전구체로부터 형성되는 중합체이다. 특히 바람직한 실리콘 중합체는 폴리다이메틸실론산(PDMS)이다. 예시적인 폴리다이메틸 실론산 중합체는 (주)다우 케미컬에서 Sylgard 상표명으로 판매되는 것이며, 특히 Sylgard 182, Sylgard 184 및 Sylgard 186이 적합하다.
탄성기질 표면 상에 산화막을 형성시키는 방법은 당업계에 공지된 어떠한 프로토콜에 따라 실시하여도 무방하다. 바람직하게는, 상기 산화막은 산소 플라즈마를 이용하여 형성된다.
본 발명에서 이용하는 기판은 유리(SiO2)로 제조되는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 제1중합체가 코팅된 기판이며, 보다 더 바람직하게는 제2중합체가 코팅된 후 제1중합체가 코팅된 기판이며, 가장 바람직하게는 제2중합체 및 제1중합체로 코팅된 된 후 그 표면에 고상기질이 증착된 기판이다.
바람직하게는, 상기 기판 표면에 코팅된 제1중합체는 다음과 같은 단량체로 구성된 중합체이다: 아크릴산, 아크릴로니트릴, 알릴아민, 메타크릴산, 아킬 아크릴레이트, 알킬 메타크릴레이트, 폴리디메틸 실록산의 메타트릴레이트, 에틸렌, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, (에테르) 우레탄, 우레탄, 폴리우레탄 아크릴레이트, 비닐 클로라이드, 비닐 알코올, 말레산 무수물, 셀룰로오스 클로라이드, 비닐 알코올, 셀룰로오스 니트레이트, 카복시 메틸 셀룰로오스, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 프로필렌, 에스테르, 카보네이트, 에테르, 부텐, 말레산, 플루오로폴리머 모노머 단위, 젤라틴, 엘라스틴, 멜라민, 설폰, 생물학적 폴리머 모노머 단위, 부틸 메타크릴레이트, 하이드록시에틸 메타크릴레이트, 폴리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 폴리프로필렌 글리콜 디글라이시달 에테르, 폴리프로필렌 글리콜 디글라이시딜 에테르, N-아크릴옥시석니너마이드, 글라이시딜 메타크릴레이트, 헥사메틸렌 디이소시아네이트, 아크로레인, 글리세롤 모노메타클리레이트, 헤파린 메타크릴레이트, 메타크릴로일에틸 포스포릴콜린, 부틸 아크릴레이트, 폴리에틸렌 글리콜 모노메타크릴레이트, 이소부틸 메타크릴레이트, 사이클로헥실 메타크릴레이트, 에틸 아크릴레이트, 2-하이드록시에틸 아크릴레이트, 2-에틸헥실 메타크릴레이트, 에틸 메타크릴레이트, 메틸 아크릴레이트, 헥사데실 메타크릴레이트, 옥타데실 메타크릴레이트, 스틸렌, 메틸 스틸렌, 비닐 톨루엔, 터트-부틸 아크릴레이트, n-비닐 피롤리돈, 글리코라이드, 락타이드, 부티로락톤, 카프로락톤, 하이드록시알카노에이트, 3-하이드록시부티레이트, 4-하이드록시부티레이트, 3-하이드록시발러레이트 및 3-하이드록시헥사노에이트를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용하는 제1중합체는 폴리우레탄 아크릴레이트이다.
본 발명에서 상기 제2중합체는 기판과 제1중합체 사이의 접착을 향상시키기 위하여 코팅되며, 바람직하게는, 상기 제2중합체는 치환 또는 비치환된 알킬기를 포함하는 중합체(예컨대, 소수성 표면을 갖는 폴리스틸렌)를 포함하고 구조는 상기 제1중합체와 동일하다.
본 발명에서의 기판은 고상기질을 추가적을 포함한다.
본 발명에서 이용될 수 있는 고상 기질은 표면 특성에 무관하게 어떠한 것도 이용 가능하다. 예를 들어, 고상 기질은, 금속(예컨대, 금, 금과 구리의 합금, 알루미눔), 금속 옥사이드, 세라믹, 석영, 실리콘, 반도체, Si/SiO2 웨이퍼, 게르마늄, 갈륨 아르세나이드, 카본, 탄소나노튜브, 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴아미드), 세파로스, 아가로스 및 콜로이드를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 고상 기질로서 이용될 수 있는 금속은 특별하게 제한되지 않으며, 당업계에서 이용되는 어떠한 금속도 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 이용되는 금속 고상 기질은 표면의 형상, 크기 및 화학적 조성은 특별히 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “금속 고상 기질”은 금속, 금속 옥사이드 및 합금의 기질을 모두 포괄하는 의미를 갖는다. 예를 들어, 본 발명에서 이용될 수 있는 금속 고상 기질은, 금, 은, 동, 백금, 알루미늄, 상기 금속의 합금(예컨대, 금과 구리의 합금) 또는 금속 옥사이드 기판을 포함한다. 금속 고상 기질은 금속으로 이루어진 고상 기질뿐만 아니라, 금속이 표면 코팅된 기판도 포함한다.
가장 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 고상 기질은 금(Au)이다.
상기 고상기질이 증착된 기판의 표면에는 올리고뉴클레오타이드 또는 단백질이 결합되어 있다.
바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오타이드의 길이는 6 내지 100 염기이고, 보다 바람직하게는 8 내지 60 염기이고, 보다 더 바람직하게는 10 내 40 염기이다.
본 발명에서 상기 고상기질에 결합된 올리고뉴클레오타이드 또는 단백질은 바람직하게는 기판상의 고상 기질에 공유결합 되기 위하여 추가적인 작용기성(functionality)을 갖는다. 상기 추가적 작용기성은 올리고뉴클레오타이드 또는 단백질의 말단에 위치한다.
보다 바람직하게는, 상기 고상기질에 결합된 올리고뉴클레오타이드 또는 단백질은 말단에 티올기 또는 아민기가 결합되어 있다.
보다 더 바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오타이드에서의 추가적 작용기성은 5’ 말단에 위치하며, 5’ 말단 작용기에 이어 3’-방향쪽으로 바람직하게는 알킬기, 예컨대 탄소수 1-20의 알킬기(바람직하게는 탄소수 4-8의 알킬기)가 위치한다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 고상기질에 결합된 올리고뉴클레오타이드는“5’-SH(또는 NH2)-탄소수 1-20의 알킬기-올리고뉴클레오타이드-3’” 구조를 가지며, 보다 바람직하게는 “5’-SH(또는 NH2)-(CH2)4-8-올리고뉴클레오타이드-3’” 구조를 갖는다.
상기 기판 표면에 결합된 올리고뉴클레오타이드는 검출하고자하는 타겟 올리고뉴클레오타이드와의 상보성은 바람직하게는 약 70% 이상의 상보성을 의미하고, 보다 바람직하게는 약 80% 이상의 상보성을 의미하며, 보다 더 바람직하게는 약 90% 이상의 상보성을 의미하고, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 상보성을 의미한다.
본 발명에서 검출하고자하는 타겟 올리고뉴클레오타이드는 DNA 또는 mRNA이며, 바람직하게는 DNA 올리고뉴클레오타이드이다.
또한, 상기 단백질에서의 추가적 작용기성은 바람직하게는 알킬기, 예컨대 탄소수 1-20의 알킬기(바람직하게는 탄소수 4-8의 알킬기)를 포함한다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 고상기질에 결합된 단백질은 “SH(또는 NH2)-탄소수 1-20의 알킬기-CO-NH-단백질” 구조를 가지며, 보다 바람직하게는 “SH(또는 NH2)-(CH2)4-8-CO-NH-단백질” 구조를 갖는다.
본 발명에서 고상기질이 증착된 기판의 표면에는 단백질이 결합되어 있으며, 상기 단백질은 타겟 바이오물질에 친화도를 가져 포획할 수 있는 포획제이다.
본 명세서에서 용어 “포획제”는 분석하고자 하는 효소를 포획하여 고정화(immobilization)시키는 물질을 의미한다. 포획제는 분석하고자 하는 효소에 대하여 결합 친화성이 있는 물질이면 어떠한 것도 가능하며, 분석하고자 하는 효소에 대하여 특이성이 있는 물질 또는 특이성이 없는 물질로 가능하고, 바람직하게는 친화성과 특이성을 모두 가지는 물질이다. 포획제의 비-제한적 예는 항체, 수용체(receptor), 스트렙타비딘(또는 아비딘), 압타머(aptamer), 렉틴, DNA, RNA, 리간드, 조효소(coenzyme), 무기이온, 효소보조인자(cofactor), 당, 지질 또는 기질(substrate)을 포함한다. 바람직하게는, 포획제는 항체, 스트렙타비딘(또는 아비딘) 및 압타머이고, 보다 바람직하게는 항체이며, 보다 더 바람직하게는 효소에 대하여 결합능 및 특이성을 모두 갖는 항체이며, 가장 바람직하게는 효소에 대하여 결합능 및 특이성을 모두 갖는 단일클론 항체이다.
상기 포획제로서 항체가 이용되는 경우에는, 검출항체는 포획제로서의 항체와 다른 에피토프에 작용하는 항체이어야 한다.
효소-특이 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991); 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 효소 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 고상 기질 상에 결합된 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드는 자가-조립 단일막(self assembled monolayer) 형태로 존재한다. 바람직하게는 고상 기질 상에 형성된 자가-조립 단일막의 두께는 0.8-2 nm이며, 보다 바람직 하게는 0.9-1.3 nm의 두께를 갖는다.
본 발명에 적용되는 시료는 특별하게 제한되지 않으며, 바이러스, 박테리아, 세포 또는 조직-유래 추출물, 파쇄물(lysate) 또는 정제물, 혈액, 혈장, 혈청, 림프, 골수액, 타액, 안구액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 관절액, 흉선액, 복수 또는 양막액을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명에 적용되는 시료는 바이러스, 박테리아, 세포 또는 조직-유래 추출물, 파쇄물(lysate) 또는 정제물, 혈액, 혈장, 혈청 또는 림프이며, 가장 바람직하게는, 바이러스, 박테리아, 세포 또는 조직-유래 추출물이다.
일반적으로 서모트로픽(themotropic)액정은 액정물질들의 상(phase)과 전기적인 힘이 가해졌을 때 발생하는 상 구조의 변화에 따라 스메크틱(smectic)액정, 네바틱액정 및 콜레스테릭 액정으로 분류된다.
스메크틱 액정은 가늘고 긴 분자가 일정 방향으로 배열되어 층상 구조를 이루고 있다. 따라서, 층 사이의 결합력이 약해서 층 사이에 유동성을 갖으며 액정중에서 분자 배열의 규칙성이 가장 높고, 고체 결정에 가까운 성질을 갖는다.
네마틱 액정은 분자가 일정 방향으로 배열되어 있지만 스메크틱 액정처럼 층상 구조는 아니며 스메크틱 액정과 같이 2차원적인 결정성을 갖고 있는 것이 아니라 1차원의 결정성을 가지고 있다. 각 분자는 장축 방향으로 자유롭게 움직일 수 있으므로 스메크틱 액정에 비해 점성이 작아 흐르기 쉽다. 또한, 전기장이나 자기장, 게다가 표면력 등으로 분자 방향을 일정하게 정돈하기 쉬우므로 표시 소자에 많이 이용된다.
콜레스테릭 액정은 어떤 층 속에서는 일정한 방향을 갖지만, 옆의 층마다 조금씩 방향이 틀어져 나선 구조를 이루고 있다. 콜레스테롤 화합물에서 많이 발견되므로 콜레스테릭이라고 명명하는데, 이 나선의 회전 폭에 따라 액정이 띠는 색채는 온도, 힘, 전기장, 자기장의 작용을 받아 크게 변한다. 콜레스테릭 액정은 이 성질을 이용해서 여러 분야에서 널리 이용된다.
본 발명에서는 나노표면지형 및 화학적물성에 의하여 액정 분자의 배열이 전환되는 특성을 이용한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용하는 액정은 네마틱 액정이며, 보다 바람직하게는 4-시아노-4’펜틸비페닐(4-cyano-4’-pentylbiphenyl), 4-시아노-4’헥실비페닐(4-cyano-4’hexylbiphenyl), 4-시아노-4’헵틸비페닐(4-cyano-4'-heptylbiphenyl), 4-시아노-4’옥틸비페닐(4-cyano-4'octylbiphenyl), 4-시아노-4’노닐비페닐(4-cyano-4'nonylbiphenyl), 4-시아노-4’데실비페닐(4-cyano-4'decylbiphenyl), 4-시아노-4’언더데실비페닐(4-cyano-4'underdecylbiphenyl) 또는 4-시아노-4’도데실비페닐(4-cyano-4'dodecylbiphenyl)이며, 보다 더 바람직하게는 4-시아노-4’펜틸비페닐(4-cyano-4’-pentylbiphenyl) 또는 4-시아노-4’헥실비페닐(4-cyano-4’hexylbiphenyl)이고, 보다 바람직하게는 4-시아노-4’펜틸비페닐, 4-시아노-4’헥실비페닐 또는 4-시아노-4’헵틸비페닐이고, 가장 바람직하게는 4-시아노-4’펜틸비페닐이다.
본 발명은 상기 올리고뉴클레오타이드 또는 단백질이 결합된 기판(제1기판)외에 추가적인 제2기판을 포함하는 것이 바람직하다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 제1기판과 제2기판을 서로 마주보게 정렬하고 기판 끈에 필름 스페이서(spacer)를 삽입하여 제1기판과 제2기판사이에 일정한 간격을 유지하고 있으며, 상기 제1기판과 제2기판사이에 액정을 주입하여 제조된 광학 셀이다.
바람직하게는, 상기 제1기판과 제2기판과의 간격은 5-100 ㎛이며, 보다 바람직하게는 7-15 ㎛이고, 보다 더 바람직하게는 10-14 ㎛이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 (a) 연속된 사인파형(sinusoidal wave) 표면을 포함하는 제1기판(substrate); (b) 상기 기판의 표면에 결합되어 있는 복수의 올리고뉴클레오타이드 또는 단백질; (c) 액정(liquid crystal); 및 (d) 제2기판을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 단백질 혼성화 디스플레이용 광학 셀(optical cell)을 제공한다.
본 발명에서 제2기판은 옥틸트리클로로실란(Octyltrichlorosilane)으로 코팅된 유리 현미경 슬라이드가 바람직하다.
상기 제2기판 표면에 옥틸트리클로로실란(Octyltrichlorosilane)을 코팅하는 경우, 옥틸트리클로로실란의 알킬그룹 사이에 액정이 끼어들어감으로써 액정의 수직 배열을 형성시키게 되고, 제1기판으로 액정이 옮겨감에 따라 점차적으로 액정배열의 전이가 일어남으로써 바람직한 액정 이미지를 획득할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 단계를 포함하고, 액정(liquid crystal)을 이용하는 올리고뉴클레오타이드 혼성화 또는 단백질 상호반응 디스플레이용 광학 셀(optical cell) 제조방법을 제공한다: (a) 연속된 파형(wavy) 표면을 포함하는 기판(substrate)을 제조하는 단계; (b) 상기 기판의 표면에 올리고뉴클레오타이드 또는 단백질을 결합시키는 단계; 및 (c) 상기 기판상에 액정을 주입하여 광학 셀을 제조하는 단계.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 제1기판과 제2기판을 결합시키는 단계를 추가적으로 포함한다. 따라서, 상기 (c) 단계에서의 액정은 제1기판에 제2기판을 덮은 후 주입하는 것이 바람직하다. 보다 구체적으로는, 본 발명에서 상기 (c) 단계는 제1기판과 제2기판을 서로 마주보게 정렬하고 기판 끈에 필름 스페이서(spacer)를 삽입한 후 제1기판과 제2기판사이에 일정한 간격을 유지시고, 상기 제1기판과 제2기판사이에 액정을 주입하는 단계를 포함한다.
본 발명은 상기 광학 셀에 대한 제조방법에 관한 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 연속된 사인파형 기판 표면 및 액정을 이용하여 광학적으로 DNA 혼성화 또는 단백질 상호반응을 디스플레이할 수 있는 광학 셀을 제공한다.
(ⅱ) 본 발명은 나노구조의 파형 특성을 정량적으로 조절함으로써 다양한 바이오 물질(예컨대, 단백질, DNA, RNA, 효소, 바이러스 또는 박테리아)의 검출에 있어서 범용적으로 수행할 수 있는 방법이다.
(ⅲ) 본 발명은 올리고뉴클레오타이드 혼성화 또는 단백질 상호반응을 검출하는데 있어서 복잡한 기계사용 및 노동력을 필요로 하지 않는 장점이 있다.
(ⅵ) 또한, 본 발명은 액정-기반을 이용하는 바이오칩 또는 바이오 센서와 같은 분야에 있어서 기초적인 자료를 제공한다.
도 1은 본 발명에서 사인파(sinusoidal waves)의 평행적 배열을 가지는 폴리머 기질를 제조 과정의 대략적인 모식도 표현한 것이다.
도 2는 본 발명에서 표면의 1차원(1D) 파형 특성들을 나타내는 단면 라인 프로파일을 가지는 PUA 표면상에서 파형 나노구조의 태핑-모드(tapping-mode) 원자현미경(AFM) 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에서 네마틱 5CB 필름의 다양한 광학적 이미지(직교 편광판)들을 나타낸 것이다. 패널 A는 사인파 평행 배열을 가지는 폴리머 기질상에 증착된 금 필름에 형성된 C6SH/HS-DNA SAM과 접촉시킨 네마틱 5CB의 필름 광학적 이미지이다. C6SH/HS-DNA로 데코레이션된 표면을 1 μM의 비상보적인 DNA을 포함하는 TBS 수용액(패널 B), TBS 수용액(패널 B) 및 1 μM의 상보적 DNA를 포함하는 TBS 수용액에 4시간 동안 각각 담근 후의 네마틱 5CB의 필름 광학적 이미지들이다. 맨 위(45°, 0°)에 표시한 샘플의 배향은 라인 패턴 방향과 각 편광판과의 각이다. 각각의 이미지의 수평 크기는 3.2 mm이다.
도 4는 본 발명에서 C6SH/HS-DNA SAMs를 포함하는 기판 표면의 다양한 원자현미경 이미지를 나타낸 것이다. 패널 A는 인큐베이션에 앞서 평편한 금 표면에 형성된 C6SH/HS-DNA SAMs의 원자현미경 이미지를 나타낸 것이며, 패널 B는 1 μM의 비상보적인 DNA을 포함하는 TBS 수용액과 인큐베이션시킨 후의 원자현미경 이미지이다. 또한, 패널 C는 아무것도 포함되지 않은 TBS 수용액과 인큐베이션시킨 후C6SH/HS-DNA SAMs의 원자현미경 이미지이고, 패널 D는 1 μM의 상보적 DNA를 포함하는 TBS 수용액과 인큐베이션시킨 후 C6SH/HS-DNA SAMs의 원자현미경 이미지이다.
도 5는 본 발명에서 연속된 사인파형을 포함하는 기판에 결합된 올리고뉴클레오타이와 타겟 올리고뉴클레오타이드가 혼성화 되었을때와 안되었을 때의 광학적 액정 양태 및 원리를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
다른 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) 부 또는 %, 고체/액체는 (중량/부피) 부 또는 %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) 부 또는 %이다.
재료 및 방법
1. 재료
International Advanced Materials(NewYork, NY)사로부터 티타늄(Titanium; 99.999%) 및 금 (99.999%)을 구입하였다. 유리 현미경 슬라이드는 Fisher Scientific(Pittsburgh, PA)로부터 구입한 프리미엄급 슬라이드인 Fisher’s Finest이다. BDH사에 의하여 제조된 네마틱(nematic) 액정 5CB (4-cyano-4’-pentylbiphenyl)을 EM Industries사(Hawthorne, NY)로부터 구입하였다. OTS (Octyltrichlorosilane), 헥사네티올(hexanetiol), PBS (phosphate buffered saline) 및 TBS(tris buffered saline)는 Sigma-Aldrich사에서 구입하였다. 티올유도화 DNA 인식 단편(5’-HS-(CH2)6-CAG-CAC-GTT-AGA-GTT-CGATAA-GCG-GTA-AGG-3’(HS-DNA)), 상보적 DNA 단편(5’-CCT-TACCGC-TTA-TCG-AAC-TCT-AAC-GTG-CTG-3’(cDNA)) 및 비-상보적 DNA 단편(5’-CAG-CAC-GTT-AGA-GTT-CGA-TAA-GCG-GTA-AGG-3’)는 제노텍(Genotech, 대한민국)으로부터 구입하였다. DNA 인식 단편의 5’ 말단은 5’-티올-변형 C6로 변형시켰다. 사용에 앞서, 역상 2원 구배 추출 HPLC를 이용하여 단편을 정제하였다. 모든 수용액은 Milli-Q 워터 퓨리피케이션 시스템(Milli-Q water purification system; Millipore, Bedford, MA)을 이용하여 고 순도 탈이온수(18 MΩ cm)로 제조하였다.
폴리머 박막의 버클링 공정
실록산염 레진(siloxane base resin)과 가교제(10:1 중량비)를 혼합하여 평판 PDMS (polydimethylsiloxane; Sylgard 184; Dow Corning) 기판을 제조하고, 폴리스티렌 페트리 디쉬(지름 10 cm)에 주조하였다. 제조된 주조물은 혼합물로부터 공기방울을 제거하기 위하여 낮은 압력하에 놓은 후 60℃에서 하룻밤 경화시켰다. 그 다음, PDMS를 2.5cm x 6.5 cm 크기의 판으로 자르고 기질 표면에 얇은 실리카-유사 필름을 제조하기 위하여 20 sccm 유속으로 150에서 산소 플라즈마에 노출시켰다. 원통 표면 주위를 플라즈마로 처리된 PDMS로 둘러쌌다. 스트레인을 완화시키자 PDMS의 약한 층에서 사인파(sinusoidal wave) 패턴이 발생되었다.
폴리머 기판의 복제
피라냐(piranha)로 정화시킨 유리 기판을 톨루엔에 3 중량%로 포함된 폴리스티렌(Polystyrene: PS, Mn = 44,000)으로 스핀-코팅하고, 60℃에서 24시간 동안 오븐에서 구웠다. 유리 현미경 슬라이드와 PUA(poly(urethaneacrylate)) 필름사이의 접착을 향상시키기 위하여 500 nm 이하 두께를 가진 PS 층을 이용하였다. 그 다음, 2분 동안 2000 rpm에서 PS-코팅된 유리 기판을 PUA (polyurethane acrylate)액으로 스핀 코팅하였다. PDMS 몰드를 이용하여 PUA-코팅된 기판에 프린팅하고, UV(365-436 nm, 15 mW/cm2)에 2분간 노출시켜 폴리머화 하였다.
금 필름의 증착
액정과 같이 사용하기 위하여, 전자빔 증발기를 이용하여 회전판(planetaries) 상에 놓인 PUA 기판 표면을 200 두께의 반투명 금 필름으로 증착시켰다. 회전판상에서의 기판을 회전시킴으로써 특정한 입사(incidence) 방향 없이 금이 증착되도록 하였다. PUA 기판과 금 필름사이의 접착을 향상시키기 위하여 80 두께의 티타늄 층을 이용하였다. 금과 티타늄의 증착율은 0.2 /s이였다. 증착하는 동안 증발기의 압력은 5 x 10-7 Torr 이하로 유지하였다.
HS-DNA와 C6SH으로부터 SAMs(Self-Assembled Monolayers) 제조
실온에서 HS-DNA(1 μM 벌크 농도)이 포함된 1M KH2PO4수용액에 금으로 코팅된 폴리머 기판 표면을 담구어 기판 표면에 HS-DNA의 SAMs을 형성시켰다. 규정된 시간 동안 HS-DNA 액과 슬라이드를 인큐베이션시킨 후, 탈이온수(deionized water: DI water)로 린스하고, 질소(N2) 스트림하에서 건조시켰다. 실온에서 1 mM 헥산티올의 에탄성 용액에 담구어 슬라이드를 추가적으로 기능화(functionalization)시켰다. 헥산티올과 접촉시킨 슬라이드를 에탄올에서 완전히 린스시키고 사용하기 전에 질소 스트림하에서 건조시켰다.
DNA 혼성화
C6SH/HS-DNA으로 데코레션된 금 필름을 1 μM cDNA를 포함하는 10 mM TBS에서 인큐베이션시켰다. 실온에서 4시간 동안 인큐베이션을 실시하였다. 인큐베이션을 시킨 후, TBS와 에탄올에 연속적으로 기판을 린스하고 질소 스트림하에서 건조시켰다. 그 다음, 기판을 광학 셀로 제조하거나 AFM으로 특성화시켰다.
OTS (octyltrichlorosilane)-처리된 글라스 슬라이드 제조
OTS/n-헵탄(n-heptane) 액에 피란냐로 정화시킨 글라스 슬라이드를 30분 동안 담구었다. 메틸렌 클로라이드로 슬라이드를 린스하였고, 질소 스트림하에서 건조시켰다. 두개의 OTS 슬라이드 사이에 끼워진 5CB의 방향을 관찰을 통하여 OTS 슬라이드의 수직배향(homeotropic alignment)을 테스트하였다. 수직 배향을 나타내지 않는 슬라이드는 제거하였다.
광학 셀 제조
DNA로 데코레이션된 표면과 OTS로 처리된 유리 현미경 슬라이드를 결합하여 광학 셀을 제조하였다. 슬라이드를 서로 마주보게 정렬하고, 표면 끝에 필름 스페이서(12 ㎛이하의 두께)를 삽입하여 떨어뜨려 놓았다. 미니 바인더 클립을 이용하여 셀을 고정하였다. 따뜻한 플레이트에 셀들을 올려놓고 히트 건(heat gun)으로 40℃까지 가열하였다. 유리 주사기(syringe)에서 등방성 상(isotropic phase; > 35℃)까지 가열된 5CB를 광학 셀의 끝에 투여시켰다. 그 다음, 모세관 력(capillary force)을 이용하여 두 개의 표면 사이에 있는 공간으로 5CB를 흘러 들여보냈다. 1시간 이상 실온에서 천천히 셀을 냉각시켰다. 냉각시키자마자, 5CB는 등방성 상에서 네마틱(nematic) 상로 변하였다.
액정 텍스처(texture) 이미지화
네마틱 5CB로 채워진 광학 셀을 통하여 전달된 빛에 의하여 형성된 광학 텍스쳐(textures)를 편광 현미경(polarized light microscope; ECLIPSE LV100POL, Nikon, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰하였다. 직교 편광판(crossed polarizers)사이에 4개의 대물렌즈를 이용하여 이미지를 얻었다. 각각의 액정 셀의 광학적 양태 이미지를 편광 현미경이 부착된 디지탈 카메라(DS-2Mv, Nikon, Tokyo, Japan)를 이용하여 캡쳐하였다. 1600 x 1200 픽셀(pixels)의 해상도, x 1.00 및 1/10s 셔터 속도에서 이미지를 캡쳐하였다.
원자 현미경(Atomic Force Microscopy)
원자 현미경(NanoScope IIIa, Veeco Metrology, Santa Barbara, CA)을 이용하여 표면 처리 후의 PDMS와 PUA 기판의 표면 토폴로지(topology)를 나타내었다. 10개의 평행파(parallel wave)의 피크(peak)와 피크 및 피크와 드로프(trough)와의 거리 평균값을 가지고 버클링 패턴의 파장과 진폭을 각각 결정하였다. 또한, 원자현미경을 이용하여 C6SH/HS-DNA 및 혼성화된 DNA 표면의 이미지를 얻었다. 주위 조건(ambient condition)에서 평균 10 nm이하의 반경을 가지는 실리콘 팁을 이용하여 샘플을 이미지화하였다. 한 라인당 256 샘플 포인트로 1.0 Hz의 스캔 비율로 하여 이미지를 얻었다.
실험결과
폴리머 기판상에서의 버클화된 박막제조
폴리머 기판상에서 사인파의 평행 배열을 형성시키기 위한 모든 단계에 대한 개략적인 도면을 도 1에 나타내었다. 프리폴리머와 경화제(curing agent)를 혼합하여 제조된 평판 PDMS를 경화시키는 것으로부터 모든 공정을 시작하였다. 그 다음 PDMS 믹스쳐를 경화시켰다. 기판 표면상에 얇은 실리카 유사 필름을 발생시키기 위하여 굳어진 PDMS 슬랩(slab)을 산소 플라즈마에 노출시켰다. 원통의 표면 주위를 산소 플라즈마로 처리한 PDMS로 둘러쌌다. 스트레인이 완화되자, 스트레인에 수직 방향으로 PDMS의 약한 층 안으로 300 nm의 평균 파장과 6-9 nm의 평균 진폭을 가진 사인파 패턴이 발생되었다. 금 필름이 증착된 PUA 표면에 양각(relief) 구조를 복사하기 위하여 상기 패턴화된 PDMS를 이용하였다. 유리 현미경 슬라이드와 PUA 필름사이의 접착을 향상시키기 위하여, 피라냔으로 정화된 유리 기판 표면을 폴리스티렌(PS) 층으로 스핀 코팅한 후 오븐에서 구웠다. 그 다음 PS-코팅된 유리 기판 표면을 PUA 용액으로 스핀 코팅하였다. PDMS 몰드를 이용하여 PUA으로 코팅된 기판을 인쇄하였으며, UV 빛에 노출시켜 폴리머화 하였다. 마지막으로, 액정과 결합에 시키기 위해서, 전자빔 증발기를 이용하여 회전판에 놓여진 패턴화된 PUA 기판을 200 두께의 반투명 금 필름으로 증착하였다. 회전판을 회전시킴으로써, 기판 상에 금 필름이 특정 입사 방향성을 가지지 않도록 하였다.
본 연구자들은 태핑 모드 원자현미경(atomic force microscope: AFM)를 이용하여 표면 토포그래피의 파장 및 진폭을 측정하였다. 패턴화된 PUA 기판 이미지를 도 2에 나타내었다. 본 연구자들은 제조 조건을 다양화시킴으로써 파장(300-800 nm)과 진폭(10-70 nm)을 조절할 수 있음을 이미 보고 하였다. 파의 단면(Cross-sectional) 이미지는 전형적인 주기성과 진폭(거의 사인파)을 가지는 것으로 확인되었다. 본 연구에서 이용된 파장과 진폭은 각각 300 nm 및 10 nm 이었다. 이러한 패턴은 1 cm 이상 매우 잘 정렬되었다.
HS-DNA와 C6SH를 포함하는 혼합 SAMs상에서의 5CB 고정
본 연구자들은 패턴화된 기판상에서 C6SH/HS-DNA의 혼합된 SAMs를 도입하여 표면상에서 LC의 정열 특성에 대하여 조사하였다. HS-DNA 밀도가 낮은 표면 영역에서 네마틱 5CB은 라인 패턴 방향과 평행한 방향으로 일정한 배향으로 고정되어 있으며 기판 표면과 거의 평면에 가까운 방향을 나타낼 것이라고 예측되었다. 또한, 이러한 방식으로 형성된 혼합 SAMs는 표면의 나노미터 크기 토포그라피를 형성하여 표면-고정화된 HS-DNA와 cDNA의 혼성화를 감지할 수 있었다. 이러한 메커니즘은 LC를 이용하는 단백질 결합을 감지할 수 있는 것으로 이미 확인되었다.1,10 또한, 혼합된 HS-DNA와 하이드록시-말단을 가진 알칸티올의 혼합 SAM에서 단일 가닥 HS-DNA의 연장된 형태가 표면에 대한 cDNA의 비특이적인 흡착을 감소시킬 수 있다고 보고되었다.26 그러므로, C6SH와 HS-DNA를 포함하는 혼합 SAMs는 혼성화 효율의 증가시키는 장점을 추가적으로 제공할 것이다. HS-DNA의 수용액에 슬라이드를 담금으로써 금 필름상에 혼합된 C6SH/HS-DNA SAMs를 제조하였으며, C6SH를 포함하는 표면을 백-필링(back-filling)하였다. 에탄올에 대한 HS-DNA와 물에 대한 C6SH의 비용해성으로 인하여 HS-DNA와 C6SH의 순차적인 흡착이 필요로 하였다.
이러한 표면상에서의 네마틱 5CB의 배향적 특성을 결정하기 위하여, 얇은 필름 스페이서(spacer)에 의해 분리된 2개의 표면을 포함하는 광학 셀을 제조하였다. 한쪽 표면은 금 필름 상에 형성된 혼합 C6SH/HS-DNA SAMs로 구성되었다. 다른 쪽 표면은 OTS (octyltrichlorosilane)로 기능화된 유리 현미경 슬라이드이다. OTS는 5CB의 수직 방향을 야기하는 것으로 알려졌다.1-3 두 표면 사이의 틈(cavity)안으로 증착된 액정(LC) 막의 두께는 12-13 ㎛로 측정되었다. 현미경 스테이지 상에서 교차 편광 사이에 광학 셀을 회전시킴으로써 광학 셀 안에서 5CB의 방향을 결정하였다. 현미경 스테이지 상에서의 샘플의 방향은 라인 패턴의 방향과 광학 현미경의 편광자(polarizer)사이의 각으로 결정하였다.
도 3a는 혼합된 C6SH/HS-DNA SAMs상에서 제공된 네마틱 5CB 필름의 광학적 양태를 나타낸 것이다. 5CB의 광학적 양태는 균일하고 단조로웠다. 이러한 결과는 혼합된 C6SH/HS-DNA SAM의 표면상에서의 액정이 균일하게 방향을 나타내고 있다는 것을 의미하였다. 4분파장판(quarter wave plate)을 이용하여, 라인 패턴의 방향과 평행한 방향에서 이러한 표면들 상에서의 정렬된 5CB를 나타내었다. 직교 편광자 사이에서 회전시키는 경우, 5CB의 광학적 모습은 다크와 브라이트 사이를 번갈아가며 나타내었다. 액정은 네마틱 상의 광학적 축이 편광자 또는 분석자와 일직선으로 정렬되는 경우 다크를 나타내었다.
이러한 결과를 기초로 하여, 본 연구자들은 패턴화된 PUA 기판에 증착된 금 필름상에 형성된 혼합 C6SH/HS-DNA SAM가 라인 패턴의 방향과 평행하는 방향에서 5CB의 네마틱 상(phase)의 ‘균일적’ 및 ‘평면적인’고정(anchoring)을 유도한다고 판단하였다.
DNA의 혼성화 후 5CB의 방향
마지막으로, 본 발명자들은 cDNA의 혼성화를 검출하기 위한 액정의 이용 가능성에 대하여 조사하였다. C6SH/HS-DNA를 SAMs상으로 도입시키고 HS-DNA와 cDNA의 혼성화를 조사하였다. 1 μM cDNA를 포함하는 TBS에서의 C6SH/HS-DNA-데코레이션된 표면을 인큐베이션시키는 경우 표면상에서 액정 고정의 비균일성을 유의적으로 증가시켰다(도 3d). 교차된 편광자사이에서의 샘플 회전은 샘플을 통하여 투과된 빛의 강도면에서 재생가능한 변화를 일으키지 못하였다. 이러한 결과는 표면-고정화된 HS-DNA와 cDNA의 특이적인 혼성화가 이방성(anisotropic) 표면 구조를 없애고 액정의 고정 변화를 균일에서 비균일로의 고정 전환을 유도시킨다는 본 연구의 가설과 일치한다.
상기 결과들이 유의적이라 할 지라도, 본 발명자들은 비특이적인 흡착이 표면 토포그라피를 덮어버리기 때문에 C6SH/HS-DNA으로 변형된 표면상에서의 비특이적인 흡착이 액정의 균일한 방향을 교란시킬 정도로 높았을 것이라는 의구심이 들었다. 이러한 가능성을 테스트하기 위하여, 본 연구자들은 다음과 같은 2개의 대조군 실험들을 실시하였다: C6SH/HS-DNA-데코레이션된 표면을 1 μM 비상보적인 DNA가 포함된 TBS 또는 오직 수용성 TBS와 함께 인큐베이션. 각각의 솔루션을 제거한 후, TBS, 탈이온수 및 에탄올로 표면을 각각 연속적으로 린스하고 질소 스트림하에서 건조시켰다. 도 3b 및 3c는 수용성 TBS와 1 μM 비상보적인 DNA가 포함된 TBS로에 각각 담금 후 회수한 C6SH/HS-DNA로 데코레이션된 표면상에 고정된 5CB의 광학적 양태를 각각 나타낸 것이다. 대조군 액과 접촉시킨 표면상에의 액정 광학적 양태가 불명확할 지라고, 대부분의 액정은 균일한 방향을 나타내었다. 그러므로, 본 연구자들은 연속적인 린스 후 C6SH/HS-DNA으로 데코레이션된 표면상에서의 비특이적인 흡착이 액정의 균일한 고정을 방해할 만큼 충분하지 못하다고 결론을 내렸다. 특이적인 DNA 상호작용이 액정의 비균일한 고정을 유발시킨다 하더라도, 이러한 결과들은 C6SH/HS-DNA으로 데코레이션된 표면에 대한 cDNA의 특이적인 결합에 대하여 얻은 결과와 현격한 대조를 이루고 있다. 이와 같은 결과는 액정이 DNA 혼성화를 광학적 신호로 특이적으로 증폭하고 변환시키는데 이용될 수 있음을 증명한 것이다.
C 6 SH/HS-DNA의 혼합된 모노레이어에 대한 DNA 혼성화의 토포그래피칼 분석
네마틱 5CB의 방향 전환이 DNA의 혼성화로 인한 것인지를 확인하기 위하여, 본 연구자들은 cDNA 용액과의 인큐베이션 전과 후에 있어서 혼합 C6SH/HS-DNA SAM의 나노미터 크기 토포그래피에 대한 변화를 측정하였다. 도 4a는 편평한 금 표면상에 형성되어진 혼합된 C6SH/HS-DNA SAM의 표면 토포그래피를 나타낸 것이다. 표면의 평균 러프니스(roughness)는 0.7 nm임을 단면의 조사를 통하여 밝혀내었다. 4시간 동안 1 μM 비상보적인 DNA 액과 표면을 인큐베이션시키는 경우, 작은 토포그래피 변화가 관찰되었다(도 4b). 또한, 본 연구자들은 표면의 토포그래피상에서 버퍼 물질의 영향에 대하여 테스트 하였다. 혼합된 C6SH/HS-DNA SAM 표면이 cDNA가 없는 TBS 버퍼 액에 넣었을 경우 지형면에서 유의적인 변화는 관찰되지 않았다(도 4c). 이와 대조적으로, 혼합된 C6SH/HS-DNA SAM 표면을 4시간 동안 1 μM 상보적인 DNA를 포함하는 액으로 넣는 경우 기판 지형에서 유의적인 변화가 나타났다(도 4d). 혼성화 시킨 후 표면의 평균 러프니스는 1.7 nm로 특정되었다. 도 4a와 4d와의 비교를 통하여, DNA 혼성화가 상보적인 DNA와 혼성화시키지 않았을 때 의 혼합된 C6SH/HS-DNA SAM 표면의 지형을 변화시킨다는 것을 AFM을 통해 명확히 나타내었다. 이러한 결과를 기초로 하여, 본 연구자들은 DNA 혼성화를 통하여 혼합 C6SH/HS-DNA SAM 표면의 이방성의 구조 제거가 이러한 표면상에서의 액정의 방향(균일한 평면에서 랜덤까지)을 전환시키는 것으로 확인되었다.
결론
본 연구의 결과는 나노구조 표면상에 화학적으로 고정된 DNA 필름상에서의 서모트로픽(thermotropic) 액정의 배향을 명확하게 나타내었다. 상기 표면에는 사인파의 평행적 정열을 가지는 폴리머 기판상에 증착된 금 필름이 포함되어 있었다. 표면상에 고정된 혼합 C6SH/HS-DNA SAMs은 HS-DNA 낮은 범위에서 액정의 균일 평면 고정을 일으켰다. cDNA와의 혼성화를 통한 증가된 표면에서는 표면상에서 액정의 비단일성을 유도시켰다. 이러한 표면들은 액정의 고정을 통하여 시각적 차이를 나타내었다. 액정 고정에서의 변화들은 AFM 관찰과 관련되어 있으며, 액정 배열의 변화가 표면상에서의 cDNA 결합에 의하여 유도되어지는 것으로 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
참조 문헌
1. V. K. Gupta, J. J. Skaife, T. B. Dubrovsky, N. L. Abbott, Science, 279, 2077 (1998).
2. M. L. Tingey, S. Wilyana, E. J. Snodgrass, N. L. Abbott, Langmuir, 20, 6818 (2004).
3. C. H. Jang, M. L. Tingey, N. L. Korpi, N. L. Abbott, J. Am. Chem. Soc., 127, 8912 (2005).
4. J. J. Skaife, N. L. Abbott, Langmuir, 16, 3529 (2000).
5. C. H. Jang, L. L. Cheng, C. W. Olsen, N. L. Abbott, Nano Lett, 6, 5, 1053 (2006).
6. U. B.Nielsen, M. H. Cardone, A. J Sinskey, G. MacBeath, P. K.Sorger, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100, 9330, (2003).
7. E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1998).
8. A. Pandey, M. Mann, Nature, 405, 837 (2000).
9. A. Venien, D. Levieux, E. J. Dufour, Colloid Interface Sci., 223, 215 (2000).
10. Y. Y. Luk, M. L. Tingey, D. J.Hall, B. A. Israel, C. J. Murphy, P. J. Bertics, N. L. Abbott, Langmuir, 19, 1671 (2003).
11. L. A. Tercero Espinoza, Y. Y. Luk, K. Schumann, B. A. Israel, N. L. Abbott, Langmuir, 20, 2375 (2004).
12. M. L. Tingey, Y. Y. Luk, N. L. Abbott, Adv. Mater., 14, 1224 (2002).
13. Y. Y. Luk, N. L. Abbott, Science, 301, 623 (2003).
14. J. J. Skaife, N. L. Abbott, Langmuir, 16, 3529 (2000).
15. D. L. Everitt, W. J. W. Miller, N. L. Abbott, X. D. Zhu, Phys. Rev. B, 62, 8, 4833 (2000).
16. J. Appl. Phys., 90, 7, 3291 (2001).

Claims (10)

  1. (a) 실리콘 중합체 및 공중합체, 에폭시 중합체 및 공중합체, 그리고 아크릴 중합체 및 공중합체로 구성된 군으로부터 선택되는 탄성력을 지니는 고분자 기질의 스탬프를 이용하여 제조된 연속된 사인파형(sinusoidal wave) 표면을 포함하는 입사 방향성을 갖지 않는 금(Au) 필름이 표면에 증착되어 있는 중합체가 코팅된 기판(substrate); (b) 상기 기판의 표면에 증착된 금 필름 상에 티올기를 통해 결합되어 있는 복수의 올리고뉴클레오타이드; 및 (c) 액정(liquid crystal)을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 혼성화 디스플레이용 광학 셀(optical cell).
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 탄성력을 지니는 고분자 기질은 실리콘 중합체 또는 공중합체로 제조된 것을 특징으로 하는 광학 셀.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 액정은 네마틱(nematic) 액정인 것을 특징으로 하는 광학 셀.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 액정은 4-시아노-4’펜틸비페닐(4-cyano-4’-pentylbiphenyl), 4-시아노-4’헥실비페닐(4-cyano-4’hexylbiphenyl) 또는 4-시아노-4’헵틸비페닐(4-cyano-4'-heptylbiphenyl)인 것을 특징으로 하는 광학 셀.
  10. 다음을 단계를 포함하고, 액정(liquid crystal)을 이용하는 올리고뉴클레오타이드 혼성화 디스플레이용 광학 셀(optical cell) 제조방법:
    (a) 실리콘 중합체 및 공중합체, 에폭시 중합체 및 공중합체, 그리고 아크릴 중합체 및 공중합체로 구성된 군으로부터 선택되는 탄성력을 지니는 고분자 기질의 스탬프를 이용하여 제조된 연속된 파형(wavy) 표면을 포함하는 입사 방향성을 갖지 않는 금(Au) 필름이 표면에 증착되어 있는 중합체가 코팅된 기판(substrate)을 제조하는 단계;
    (b) 상기 기판의 표면에 증착된 금 필름 상에 복수의 올리고뉴클레오타이드를 티올기를 통해 결합시키는 단계; 및
    (c) 상기 기판 상에 액정을 주입하여 광학 셀을 제조하는 단계.
KR1020100047625A 2010-05-20 2010-05-20 액정을 이용하는 올리고뉴클레오타이드 혼성화 및 단백질 상호반응 디스플레이용 광학 셀 KR101253269B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100047625A KR101253269B1 (ko) 2010-05-20 2010-05-20 액정을 이용하는 올리고뉴클레오타이드 혼성화 및 단백질 상호반응 디스플레이용 광학 셀

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100047625A KR101253269B1 (ko) 2010-05-20 2010-05-20 액정을 이용하는 올리고뉴클레오타이드 혼성화 및 단백질 상호반응 디스플레이용 광학 셀

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20110128034A KR20110128034A (ko) 2011-11-28
KR101253269B1 true KR101253269B1 (ko) 2013-04-10

Family

ID=45396447

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020100047625A KR101253269B1 (ko) 2010-05-20 2010-05-20 액정을 이용하는 올리고뉴클레오타이드 혼성화 및 단백질 상호반응 디스플레이용 광학 셀

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101253269B1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112816692A (zh) * 2019-11-18 2021-05-18 山东省分析测试中心 一种同时检测多种癌症标记物的液晶生物传感器及其制备与检测方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Langmuir. 2009. 25. 311-316 *
Langmuir. 2009. 25. 311-316*
논문 1: Bull. Korean Chem. Soc. *
논문 1: Bull. Korean Chem. Soc.*
논문 5: Langmuir *
논문 5: Langmuir*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20110128034A (ko) 2011-11-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Clare et al. Orientations of nematic liquid crystals on surfaces presenting controlled densities of peptides: amplification of protein− peptide binding events
JP4668911B2 (ja) アフィニティー・マイクロコンタクトプリントされた生体分子を検出するための液晶の使用
AU774638B2 (en) Method and apparatus for detection of microscopic pathogens
Chang et al. Grafting of poly (γ-benzyl-l-glutamate) on chemically modified silicon oxide surfaces
Akkahat et al. Development of a novel antifouling platform for biosensing probe immobilization from methacryloyloxyethyl phosphorylcholine-containing copolymer brushes
Awsiuk et al. Temperature-controlled orientation of proteins on temperature-responsive grafted polymer brushes: poly (butyl methacrylate) vs poly (butyl acrylate): morphology, wetting, and protein adsorption
Han et al. Label-free detection of viruses on a polymeric surface using liquid crystals
Park et al. Using liquid crystals to detect DNA hybridization on polymeric surfaces with continuous wavy features
Tingey et al. Imaging of affinity microcontact printed proteins by using liquid crystals
Chen et al. Fabrication of a highly dense line patterned polystyrene brush on silicon surfaces using very large scale integration processing
Park et al. Dual functional, polymeric self-assembled monolayers as a facile platform for construction of patterns of biomolecules
Kim et al. Rubbed films of functionalized bovine serum albumin as substrates for the imaging of protein–receptor interactions using liquid crystals
US6849321B2 (en) Surfaces with gradients in surface topography
Chen et al. pH-switchable optical properties of the one-dimensional periodic grating of tethered poly (2-dimethylaminoethyl methacrylate) brushes on a silicon surface
Choi et al. Phase separation of a mixed self-assembled monolayer prepared via a stepwise method
Xiu et al. Anti-fouling surfaces by combined molecular self-assembly and surface-initiated ATRP for micropatterning active proteins
Park et al. Development of reflective biosensor using fabrication of functionalized photonic nanocrystals
Yoon et al. Order− order and order− disorder transitions in thin films of an amphiphilic liquid crystalline diblock copolymer
KR101253269B1 (ko) 액정을 이용하는 올리고뉴클레오타이드 혼성화 및 단백질 상호반응 디스플레이용 광학 셀
Han et al. Measuring ligand–receptor binding events on polymeric surfaces with periodic wave patterns using liquid crystals
Kim et al. Diagnosis of tuberculosis using a liquid crystal-based optical sensor
JP2012246163A (ja) ナノ多孔質薄膜、およびその製造方法
EP1202062B1 (en) Patterned surfaces for bioconjugation and their preparation
EP1407816A1 (en) Method for arranging a polymer molecule
Lu et al. Fabrication of Ag nanorods on micropost array for a metal-enhanced fluorescence substrate with a high signal-to-background ratio

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160404

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170404

Year of fee payment: 5

LAPS Lapse due to unpaid annual fee