KR101251217B1 - Method for the transdifferentiation of mesenchymal stem cells into endodermal cell - Google Patents
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Abstract
본 발명은 중간엽 줄기세포를 단일세포(single cell)로 분리하고, 분리한 단일세포 집단으로부터 구체(sphere)를 형성하는 단계를 포함하는, 중간엽 줄기세포에서 내배엽성 세포로의 분화를 유도하는 교차 분화 방법을 제공한다. 상기한 본 발명에 의하면, 중배엽성 세포인 다양한 중간엽 줄기세포들로부터 완벽한 기능을 하는 간세포 또는 췌장세포를 포함한 내배엽성 세포로의 분화를 유도할 수 있는 이점이 있다.The present invention comprises the steps of separating the mesenchymal stem cells into single cells and forming spheres from the isolated single cell population, inducing differentiation of mesenchymal stem cells into endoderm cells. Provide a cross differentiation method. According to the present invention described above, there is an advantage that can induce differentiation into endoderm cells, including hepatocytes or pancreatic cells that function perfectly from various mesenchymal stem cells that are mesodermal cells.
Description
본 발명은 중간엽 줄기세포의 내배엽성 세포로의 교차 분화(transdifferentiation) 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게 본 발명은 완벽한 기능을 하는 간세포 등 내배엽성 세포 생산을 위해, 구체 형성을 통해 중배엽성 유래 세포인 중간엽 줄기세포로부터 내배엽성 세포로의 분화를 유도하는 방법 및 이를 이용한 세포치료제 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a method of crossdifferentiation of mesenchymal stem cells into endoderm cells. More specifically, the present invention provides methods for inducing differentiation of mesenchymal stem cells, which are mesodermal-derived cells from endoderm cells, into endoderm cells through the formation of spheres, and cell therapy compositions using the same, for the production of endoderm cells such as hepatocytes, which function perfectly. It is about.
성체줄기세포의 하나인 중간엽 줄기세포는 성체의 골수, 제대혈을 포함한 말초혈액, 근육, 지방조직 등에서 분리되며 연구 결과에 의하면 중간엽 줄기세포가 중배엽성 유래의 연골, 뼈, 지방세포로도 분화할 수 있고 이들 중배엽성 조직외에도 외배엽성의 신경세포 및 내배엽성의 간장세포로도 분화한다는 사실들이 확인되었다.Mesenchymal stem cells, one of the adult stem cells, are isolated from adult bone marrow, peripheral blood including cord blood, muscle, and adipose tissue. According to the research results, mesenchymal stem cells can differentiate into mesodermal-derived cartilage, bone, and fat cells. In addition to these mesodermal tissues, it has been confirmed that they differentiate into ectoderm neurons and endoderm hepatic cells.
이러한 제대 유래 줄기세포를 포함한 중간엽 줄기세포는 배아줄기세포에 반해, 윤리적인 문제 및 면역 거부반응 없이 세포치료제로써 이용할 수 있기에, 여러 질환에 대한 세포치료제 개발을 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. Since the mesenchymal stem cells including the umbilical cord-derived stem cells can be used as a cell therapy without ethical problems and immune rejection, as compared to embryonic stem cells, research for the development of cell therapy for various diseases is being actively conducted.
하지만, 중간엽 줄기세포는 그 유래가 중배엽성 세포이기 때문에, 간질환, 췌장질환을 포함한 내배엽성 세포 유래 장기의 질환 치료를 위하여, 중간엽 줄기세포로부터 간세포, 췌장 세포를 생산하기 위해서는 중배엽성 세포인 중간엽 줄기세포를 내배엽성 세포로 유도하는 교차분화(transdifferentiation)가 선행되어야 한다. 그러나, 중간엽 줄기세포를 이용하여, 간세포 또는 췌장세포 등 내배엽성 세포를 분화 유도하는데에 이러한 과정이 생략되어 있어, 일부 간세포 및 췌장세포의 특성을 가지고는 있지만, 완벽한 기능을 하는 기능성 간세포 및 췌장세포의 분화 유도를 할 수 없는 문제점이 있다.However, since mesenchymal stem cells are derived from mesodermal cells, mesenchymal cells are used to produce hepatocytes and pancreatic cells from mesenchymal stem cells for the treatment of diseases of endoderm-derived organs including liver diseases and pancreatic diseases. Transdifferentiation that induces mesenchymal stem cells into endoderm cells should be preceded. However, this process is omitted to induce differentiation of endoderm cells such as hepatocytes or pancreatic cells by using mesenchymal stem cells, and although these have characteristics of some hepatocytes and pancreatic cells, functional hepatocytes and pancreas that function perfectly. There is a problem that can not induce differentiation of cells.
한편, 내배엽성 유래 세포 중, 간은 다른 기관에 비해 현저하게 높은 재생능력을 갖는다. 그러나 간질환 환자들에게 일반적으로 행해지는 현재의 간 이식 시술은 면역거부반응, 공여자의 희소성 그리고 높은 수술비용 등의 많은 문제점으로 인해 그 수혜자가 극히 제한적이다. 최근 이러한 문제점을 극복하기 위하여, 간 이식의 대체물(alternative source)로 떠오르는 것이 줄기세포를 이용하여 분화시킨 간세포의 이식이다. 줄기세포의 경우 무한 증식능력을 갖기 때문에 그 분화 기작이 규명된다면 세포 대체 치료법 (cell replacement therapy)의 무한한 소스가 될 것이며, 따라서 설치류 배아 줄기세포로부터 간세포를 분화시키는 기작을 규명하려는 많은 연구가 이루어지고 있으나 그 결과는 만족스럽지 못한 실정이다. On the other hand, among the endoderm-derived cells, the liver has a significantly higher regenerative capacity than other organs. However, current liver transplantation procedures, which are commonly performed in patients with liver disease, are extremely limited in their beneficiaries due to many problems such as immunorejection, scarcity of donors, and high surgical costs. In order to overcome these problems in recent years, emerging as an alternative source of liver transplantation is transplantation of hepatocytes differentiated using stem cells. Stem cells have infinite proliferative capacity, so if the differentiation mechanism is identified, it will be an infinite source of cell replacement therapy. Therefore, much research has been made to identify the mechanism of differentiating liver cells from rodent embryonic stem cells. But the result is not satisfactory.
본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 완벽한 기능을 할 수 있는 내배엽성 유래 간세포 등의 생산을 위하여, 제대 유래 줄기세포를 포함한 중배엽성 세포인 중간엽 줄기세포로부터 내배엽성 세포로의 교차 분화 방법을 제공하는 것이다.The present invention has been made to solve the problems of the prior art, an object of the present invention for the production of endoderm-derived stem cells and the like, which can function perfectly, mesenchymal stem cells including umbilical stem-derived stem cells It is to provide a method of cross differentiation from cells to endoderm cells.
또한, 본 발명의 다른 목적은 중간엽 줄기세포로부터 내배엽성 세포로의 분화를 유도하는 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for inducing differentiation from mesenchymal stem cells to endoderm cells.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 생산된 내배엽성 세포를 포함하는 간질환 또는 췌장질환을 포함한 내배엽성 세포 유래 장기의 질환 치료용 세포치료제 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a cell therapy composition for treating diseases of endoderm cell-derived organs, including liver disease or pancreatic disease, including endoderm cells produced by the above method.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 중간엽 줄기세포를 단일세포(single cell)로 분리하고, 분리한 단일세포 집단으로부터 구체(sphere)를 형성하는 단계를 포함하는, 중간엽 줄기세포에서 내배엽성 세포로의 분화를 유도하는 교차 분화 방법을 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention comprises the steps of separating the mesenchymal stem cells into single cells, and forming a sphere from the isolated single cell population, endoderm in the mesenchymal stem cells Provided are cross-differentiation methods that induce differentiation into sex cells.
본 발명에 있어서, 상기 '구체 (sphere)'는 줄기세포의 분화 초기에 줄기세포들이 뭉쳐 동그란 공 모양의 세포덩어리인 응집체를 의미한다.In the present invention, the 'sphere' refers to agglomerates in which stem cells are clustered in a round ball-shaped cell cluster at the beginning of differentiation of stem cells.
본 발명의 분화 방법에 있어서, 줄기세포로부터의 구체의 형성은 일반적으로 사용되는 공지의 부유 응집배양법, 현적 (hanging drop) 배양법 및 영양세포(feeder)를 이용한 공배양법 (co-incubation method) 등을 통해 당업자에게 잘 알려진 방법을 통해 이루어질 수 있다. In the differentiation method of the present invention, the formation of spheres from stem cells may be carried out using a known floating flocculation method, a hanging drop culture method, a co-incubation method using a feeder, or the like. Through the method well known to those skilled in the art.
바람직하게는 상기 구체 형성 방법은 DMEM-로우 글루코즈(DMEM-low glucose) 배지에 B27을 첨가하고 배양하여 구체를 형성하는 것을 특징으로 한다. 이 때 부유 배양(suspension culture)를 할 경우, 인접한 세포들 사이에 활발한 상호작용으로 인해 세포의 분화 유도에 이점이 있다. 상기 DMEM-로우 글루코즈(DMEM-low glucose) 배지는 바람직하게는 5-10mM의 포도당을 함유하며, 더욱 바람직하게는 7-8mM의 포도당을 함유한다. 또한, 바람직하게 B27은 0.5 - 1%로 첨가된다.
Preferably, the method for forming a sphere is characterized in that to form a sphere by adding B27 to the culture DMEM-low glucose (DMEM-low glucose) medium. In this case, suspension culture has an advantage in inducing differentiation of cells due to active interaction between adjacent cells. The DMEM-low glucose medium preferably contains 5-10 mM glucose, more preferably 7-8 mM glucose. Also preferably B27 is added at 0.5-1%.
본 발명에 있어서, 상기 구체에 오카다산(okadaic acid; OA)을 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이런 구성에 의해 중간엽 줄기세포에서 내배엽성 세포로의 분화를 촉진할 수 있다. In the present invention, the sphere may further comprise the step of treating the okadaic acid (okadaic acid; OA). This configuration can promote differentiation of mesenchymal stem cells into endoderm cells.
바람직하게는 미분화 줄기세포를 1-3일간 배양하여 구체를 형성한 후, 여기에 오카다산을 1-3일간 처리하여 줄기세포를 분화하는 방법을 제공한다. 더욱 바람직하게는 미분화 줄기세포를 1일간 배양하여 구체를 형성한 후, 여기에 오카다산을 2일간 처리하여 줄기세포를 분화하는 방법을 제공한다. 상기 방법에서 오카다산은 배양액에 1-15nM의 농도, 바람직하게는 5nM 농도로 첨가하는 것이 바람직하다.
Preferably, after culturing the undifferentiated stem cells for 1-3 days to form a sphere, it provides a method for differentiating stem cells by treating 1-3 days of the okadaic acid. More preferably, after culturing the undifferentiated stem cells for 1 day to form a sphere, it provides a method for differentiating stem cells by treating the okadaic acid for 2 days. In the above method, the okadaic acid is preferably added to the culture at a concentration of 1-15 nM, preferably 5 nM.
본 발명에서, 상기 '중간엽 줄기세포'는 이에 한정되는 것은 아니나 골수, 제대혈을 포함한 말초혈액, 근육 및 지방조직 등에서 분리되는 것을 포함한다. 바람직하게는 제대 유래 중간엽 줄기세포이다. 상기 제대혈 줄기세포는, 다른 배아 줄기세포처럼 인체 내에서 기형종이나 기형암을 발생시킬 가능성이 없다는 장점이 있으므로 대중화 요법에 유리하다.In the present invention, the mesenchymal stem cells include, but are not limited to, isolated from bone marrow, peripheral blood including umbilical cord blood, muscle and adipose tissue. Preferably the umbilical cord-derived mesenchymal stem cells. The cord blood stem cells, like other embryonic stem cells, have the advantage that there is no possibility of generating teratoma or teratoma in the human body, which is advantageous for popularization therapy.
본 발명에서, 상기 ‘내배엽 세포’는 완전 내배엽 (definitive endoderm, DE) 세포를 의미한다. 완전 내배엽이란 분화 발달 과정에 따라 나누어지는 Visceral Endoderm, primitive endoderm, mesoendoderm 및 definitive endoderm의 하나로서 갑상선, 흉선, 췌장, 간, 폐, 호흡기관 및 소화기관의 내막으로 분화할 수 있는 내배엽 세포를 의미한다. 따라서, 본 발명의 내배엽 세포는 간세포나 인슐린을 생산하는 베타세포로 분화될 수 있다 (Wei Jiang,et al., Cell Research (2007) 17: 333-344).
In the present invention, the 'endoderm cells' refers to definitive endoderm (DE) cells. Complete endoderm is one of the Visceral Endoderm, Primitive Endoderm, Mesoendoderm and Definitive Endoderm, which are divided according to differentiation development process and are endoderm cells that can differentiate into the lining of the thyroid, thymus, pancreas, liver, lung, respiratory tract and digestive system. . Thus, the endoderm cells of the present invention can be differentiated into hepatocytes or beta cells that produce insulin (Wei Jiang, et al., Cell Research (2007) 17: 333-344).
본 발명은 또한 간세포 분화 제제를 첨가하고 배양하여 간세포로 분화하는 단계를 더 포함하는 방법을 제공한다. The invention also provides a method further comprising the step of adding and culturing the hepatocyte differentiation agent to differentiate into hepatocytes.
상기 '간세포 분화 제제'는 줄기세포의 분화에 의해 수득되는 내분비 세포를 간세포 및/또는 간세포 전구세포로 분화촉진하는 생물학적 또는 합성 화합물 (예로, 펩티드, 올리고당 등)을 의미한다. 예로, 간세포 계통 세포의 성장을 촉진할 수 있는 가용성 성장 인자 (펩티드 호르몬, 시토카인, 리간드-수용체 복합체 등)가 있다. 가용성성장 인자의 예로는 표피 성장 인자 (epidermal growth factor, 이하 "EGF"로 약칭함), 인슐린, 형질전환 성장인자 (transforming growth factor, 이하 "TGF"라 약칭함)-α, TGF-β, 섬유아세포 성장 인자 (fibroblastgrowth factor, 이하 "FGF"라 약칭함), 헤파린, 간세포 성장 인자 (hepatocyte growth factor, 이하 "HGF"로약칭함), 덱사메타존 (dexamethazone) 존재하의 온코스타틴 엠 (oncostatin M, 이하 "OSM"으로 약칭함), 인터류킨 (interleukin, 이하 "IL"이라 약칭함)-1, IL-6, 인슐린 유사 성장 인자 (insulin-like growth factor, 이하 "IGF"라 약칭함)-Ⅰ, IGF-Ⅱ, 헤파린-결합 성장 인자 (heparin-binding growth factor, 이하 "HBGF"라 약칭함)-1 및 글루카곤 (glucagon)이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 간세포 분화 제제로는 코르티코이드 (corticoid), 특히 당질코르티코이드 (glucocorticoid)가 있다. 상기 화합물은 스테로이드 또는 스테로이드 모방제 (steroid mimetic agents)로 중간대사, 특히 간의 글리코겐(glycogen) 축적 및 염증 억제에 영향을 미친다. 코르티솔 (cortisol)로 예시되는 천연 생성 호르몬 및 합성 글루코코르티코이드, 예컨대 덱사메타존 (dexamethazone) (미국 등록특허 US 3,007,923) 및 그 유도체, 프레드니손 (prednisone), 메틸프레드니손 (methylprednisone), 히드로코르티손 (hydrocortisone) 및 트리암시놀론(triamcinolone) (미국 등록특허 US 2,789,118) 및 그 유도체가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 다른 간세포 분화 제제로는 디메틸 설폭시드 (dimethyl sulfoxide, 이하 "DMSO"라 약칭함)와 같은 유기 용매로, 디메틸아세트아미드 (dimethylacetamide, 이하 "DMA"라 약칭함), 헥사메틸렌 비스아세트아미드(hexamethylene bisacetamide, 이하 "HMBA"로 약칭함)가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.The hepatocyte differentiation agent refers to a biological or synthetic compound (eg, peptide, oligosaccharide, etc.) that promotes differentiation of endocrine cells obtained by differentiation of stem cells into hepatocytes and / or hepatocyte progenitor cells. For example, there are soluble growth factors (peptide hormones, cytokines, ligand-receptor complexes, etc.) that can promote the growth of hepatocyte lineage cells. Examples of soluble growth factors include epidermal growth factor (hereinafter abbreviated as "EGF"), insulin, transforming growth factor (abbreviated as "TGF")-α, TGF-β, fiber Fibroblastgrowth factor (abbreviated as "FGF"), heparin, hepatocyte growth factor (abbreviated as "HGF"), oncostatin M in the presence of dexamethasone zone, Abbreviated as "OSM"), interleukin (abbreviated as "IL")-1, IL-6, insulin-like growth factor (hereinafter abbreviated as "IGF")-I, IGF-II, heparin-binding growth factor (hereinafter abbreviated as “HBGF”)-1 and glucagon are included, but are not limited thereto. Other hepatocyte differentiation agents include corticoids, in particular glucocorticoids. The compound is a steroid or steroid mimetic agents that affects metabolism, especially glycogen accumulation and inflammation inhibition in the liver. Naturally produced hormones and synthetic glucocorticoids exemplified by cortisol, such as dexamethasone (US Pat. No. 3,007,923) and derivatives thereof, prednisone, methylprednisone, hydrocortisone and Triamcinolone (US Pat. No. 2,789,118) and derivatives thereof may be included, but is not limited thereto. Another hepatocyte differentiation agent is an organic solvent such as dimethyl sulfoxide (hereinafter abbreviated as "DMSO"), dimethylacetamide (abbreviated as "DMA"), hexamethylene bisacetamide (hexamethylene) bisacetamide, hereafter abbreviated as "HMBA", but is not limited thereto.
또한, 본 발명에 따라 제조된 내배엽 전구세포(SOX17+)는 종래 알려진 방법(Evert Kroon, et al., NATURE BIOTECHNOLOGY (2008); 26_4_443)에 따라 레티노산과 니코틴산을 포함하는 배양액에서 배양함으로써 내분비세포를 거쳐 베타세포로 분화될 수 있다. 분화된 베타세포는 인슐린을 분비할 수 있으므로 당뇨병 치료를 위한 세포 치료제로 사용될 수 있을 것이다.
In addition, the endoderm progenitor cells (SOX17 +) prepared according to the present invention are cultured in a culture medium containing retinoic acid and nicotinic acid according to a conventionally known method (Evert Kroon, et al., NATURE BIOTECHNOLOGY (2008); 26_4_443) through endocrine cells Can be differentiated into beta cells. Differentiated beta cells can secrete insulin and thus could be used as cell therapy for the treatment of diabetes.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 중간엽 줄기세포로부터 형성된 구체에 오카다산(okadaic acid; OA)을 처리하는 단계를 포함하는, 중간엽 줄기세포에서 내배엽성 세포로의 분화를 촉진하는 방법을 제공한다.According to another aspect of the invention, the present invention comprises the step of treating the okadaic acid (OA) to spheres formed from mesenchymal stem cells, a method for promoting differentiation of mesenchymal stem cells into endoderm cells To provide.
바람직하게는 상기 오카다산(okadaic acid; OA)을 배양액에 1-15nM의 농도로 1-3일간 처리하여 내배엽성 세포로의 분화를 촉진하는 방법을 제공한다. 더욱 바람직하게는 상기 오카다산을 5nM로 처리한 후 추가로 2일간 배양한다.
Preferably, the okadaic acid (OA) is treated in a culture solution at a concentration of 1-15 nM for 1-3 days to provide a method for promoting differentiation into endoderm cells. More preferably, after treatment with 5 nM of the okadaic acid is incubated for an additional 2 days.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 DMEM-로우 글루코즈(DMEM-low glucose) 배지에 B27을 첨가한 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포에서 내배엽성 세포로의 분화를 유도하는 조성물을 제공한다. 상기 DMEM-로우 글루코즈(DMEM-low glucose) 배지는 바람직하게는 5-10mM의 포도당을 함유하며, 더욱 바람직하게는 7-8mM의 포도당을 함유한다. 또한, 바람직하게 B27은 0.5 - 1%로 첨가된다. According to another aspect of the present invention, the present invention provides a composition for inducing differentiation of mesenchymal stem cells into endoderm cells, characterized in that B27 is added to DMEM-low glucose medium. . The DMEM-low glucose medium preferably contains 5-10 mM glucose, more preferably 7-8 mM glucose. Also preferably B27 is added at 0.5-1%.
바람직하게는 상기 배지는 오카다산(okadaic acid; OA)를 더 포함한다. 상기 오카다산에 의해 내배엽성 세포로의 분화가 촉진된다. 오카다산은 단백질 포스파타제 2A(protein phosphatase: PP2A) 억제제로 c-myc의 분해를 억제하여 안정성을 증가시킨다고 보고되었으나(Yeh E et al. Nat Cell Biol 2004,6:308-318), 중간엽 줄기세포의 분화와 관련하여 알려진 바는 없다.
Preferably, the medium further includes okadaic acid (OA). The okadaic acid promotes differentiation into endoderm cells. Okadaic acid, a protein phosphatase (PP2A) inhibitor, has been reported to increase stability by inhibiting c-myc degradation (Yeh E et al. Nat Cell Biol 2004, 6: 308-318). Nothing is known about the differentiation.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 분화 방법에 의해 분화된, 세포, 이의 자손, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 내배엽성 세포 유래 장기의 질환 치료를 위한 세포 치료제 조성물을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a cell therapeutic composition for treating a disease of an endoderm cell-derived organ comprising a cell, a progeny thereof, or a mixture thereof differentiated by the differentiation method.
본 발명에 있어서, 이에 한정되는 것은 아니나 내배엽 세포는 간질환 또는 췌장질환 치료용 세포 치료제 조성물을 제공한다.In the present invention, but not limited to endoderm cells provides a cell therapeutic composition for treating liver disease or pancreatic disease.
본 발명은 바람직하게는 급성, 만성 또는 유전적간 기능 손상의 치료에 필요한 간기능 회복을 위한 치료용 조성물, 더욱 바람직하게는 유전적 간 기능 손상을 위한 치료용 조성물을 제공한다.The present invention preferably provides a therapeutic composition for restoring liver function required for the treatment of acute, chronic or genetic liver damage, more preferably a therapeutic composition for genetic liver damage.
본 발명의 간 기능 손상에는 간염, C형 간염(hepatitis C), 유육종증, 약물 알레르기, 지방간, 알코올성 간 질환, 간암, 간경변증, 임신 중독증, 비호지킨 림프종, 라이 증후군, 기타 신생아 황달, 가와사끼병, 루푸스, 칸디다증, 말라리아, 렙토스피라증, 뎅기열, 간흡충증, 급성 간경화, 만성 간경화, 선천성 대사 이상(inheritedmetabolic diseases), 및 담관질환(bile duct disease) 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 보다 구체적으로, 상기 선천성 대사 이상(inherited metabolic diseases)에는 윌슨병(wilson disease), 타이로신혈증 (tyrosinemia), 혈색소침착증(hemochromatosis), 당원병(glycogen storage disease)를 포함되나 이에 한정되지 않으며, 상기 담관질환(bile duct disease)에는 담도폐쇄(biliary atresia), 원발성 담즙성 경화(primary biliary cirrhosis(PBC)), 원발성 경화성 담관염(primary sclerosing cholangitis (PSC))이 포함되나 이에 한정되지 않는다. Liver function impairment of the present invention includes hepatitis, hepatitis C, sarcoidosis, drug allergy, fatty liver, alcoholic liver disease, liver cancer, cirrhosis, pregnancy addiction, non-Hodgkin's lymphoma, Reye's syndrome, other neonatal jaundice, Kawasaki disease, lupus , Candidiasis, malaria, leptospirosis, dengue fever, hepatomegaly, acute cirrhosis, chronic cirrhosis, inheritedmetabolic diseases, and bile duct disease, and the like. More specifically, the inherited metabolic diseases include, but are not limited to, Wilson disease, tyrosinemia, hemochromatosis, glycogen storage disease, and the bile ducts. Bile duct disease includes, but is not limited to, biliary atresia, primary biliary cirrhosis (PBC), and primary sclerosing cholangitis (PSC).
본 발명의 치료용 조성물은 투여 방식에 따라 허용 가능한 담체를 포함하여 적절한 제제로 제조될 수 있다. 담체(들)는 제형의 다른 성분들과 양립하고, 이것의 수용자에게 무해해야 한다는 점에서 허용될 수 있어야 한다. 투여 방식에 적합한 제제는 공지되어 있으며 전형적으로 막을 통과하는, 이동을 용이하게 하는 제제를 포함할 수 있다. The therapeutic composition of the present invention may be prepared in a suitable formulation including an acceptable carrier depending on the mode of administration. The carrier (s) must be acceptable in that it is compatible with the other ingredients of the formulation and should be harmless to its recipients. Formulations suitable for the mode of administration are known and may comprise agents that facilitate movement, typically through the membrane.
또한, 본 발명의 치료용 조성물은 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구용 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제 또는 동결건조제제, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽 또는 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. In addition, the therapeutic composition of the present invention can be used in the form of a general pharmaceutical formulation. Parenteral preparations may be prepared in the form of sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions or lyophilized preparations, oral administration in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups or wafers. It can be prepared in unit dosage ampoules or in multiple dosage forms.
또한, 본 발명의 치료용 조성물은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 결합체, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 또는 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. In addition, the therapeutic composition of the present invention may be administered with a pharmaceutically acceptable carrier. For example, in the case of oral administration, a binder, a lubricant, a disintegrant, an excipient, a solubilizer, a dispersant, a stabilizer, a suspending agent, a coloring agent, or a flavoring agent may be used, and in the case of an injection, a buffer, a preservative, a painless agent, a soluble agent may be used. Topical agents, isotonic agents, stabilizers and the like may be used in combination, and for topical administration, bases, excipients, lubricants, preservatives, and the like may be used, but are not limited thereto.
또한, 본 발명의 치료용 조성물을 이용하여 급성, 만성 또는 유전적 간 기능 손상을 치료하는 방법은 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질이 도입되는 일반적 경로를 통하여 투여하는 것을 포함할 수 있다. 상기 투여방법으로는 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내투여,폐내 투여 및 직장 내 투여가 있으나, 이에 제한되지 않는다. 그러나 경구 투여시, 세포가 소화될 수 있으므로 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서 분해되는 것을 보호하기 위해 제형화 하는 것이 바람직하다. In addition, the method of treating acute, chronic or genetic liver damage using the therapeutic composition of the present invention may include administration through a general route of introducing a predetermined substance to the patient in an appropriate manner. The administration method may include, but is not limited to, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, nasal administration, pulmonary administration, and rectal administration. However, upon oral administration, the cells may be digested so that the oral composition is preferably formulated to coat the active agent or protect it from degradation in the stomach.
또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제 또는 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액 또는 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르2(예로, 올레인산에칠 등), 알코올류(예로, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜 또는 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제 (예로, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 (예로, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 치료용 조성물을 이용하여 급성, 만성 또는 유전적 간 기능 손상을 치료하는 방법은, 본 발명의 치료용 조성물을 약학적으로 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 상기 약학적 유효량은 질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 건강,성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법, 투여 횟수, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. In addition, the pharmaceutical composition may be administered by any device in which the active agent may migrate to the target cell. Preferred modes of administration and preparations are intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular or injectable. Injections include non-aqueous solvents such as aqueous solvents such as physiological saline solution or ring gel solution, vegetable oils, higher fatty acid esters 2 (e.g., oleic acid, etc.), and alcohols (e.g., ethanol, benzyl alcohol, propylene glycol or glycerin). Can be prepared using a stabilizer (eg, ascorbic acid, sodium bisulfite, sodium pyrosulfite, BHA, tocopherol, EDTA, etc.), emulsifiers, buffers for pH control, to prevent microbial growth Preservatives (eg, mercury phenyl nitrate, chimerosal, benzalkonium chloride, phenol, cresol, benzyl alcohol, and the like). Preferably, the method for treating acute, chronic or genetic liver damage using the therapeutic composition of the present invention comprises administering a therapeutically effective amount of the therapeutic composition of the present invention. The pharmaceutically effective amount is well known in the medical field, such as the type of disease, the age, weight, health, sex of the patient, sensitivity to the drug of the patient, route of administration, method of administration, frequency of administration, duration of treatment, combination or concurrent drug use. Depending on the factor, it can be readily determined by one skilled in the art.
한편, 본 발명의 투여량은 바람직하게는 사람 간의 1~4% mass에 해당하는107 ~1010 개의 세포이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
On the other hand, the dosage of the present invention is preferably 10 7-10 10 cells corresponding to 1-4% mass of the human liver. Administration may be administered once a day or may be divided several times. The dose is not intended to limit the scope of the invention in any way.
본 발명의 실시에 있어서, 줄기세포를 이용한 세포 배양 및 발생, 세포 생물학 실험의 일반적 방법에 대해 당업계의 표준적인 참고서적을 참조할 수 있다. 그 예로는, Guide to Techniques in Mouse Development (Wasserman등 편저, Academic Press, 1993); Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro (M. V. Wiles, Meth.Enzymol. 225:900, 1993); Manipulating the Mouse Embryo: A laboratory manual (Hogan 등 편저, ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1994); Embryonic Stem Cells (Turksen 편저, Humana Press, 2002)가 포함된다.
In the practice of the present invention, reference can be made to standard reference books in the art for cell culture and development using stem cells, and general methods of cell biology experiments. Examples include Guide to Techniques in Mouse Development (Wasserman et al., Academic Press, 1993); Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro (MV Wiles, Meth. Enzymol. 225: 900, 1993); Manipulating the Mouse Embryo: A laboratory manual (Hogan et al., ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1994); Embryonic Stem Cells (Turksen edit, Humana Press, 2002).
이하, 본 발명에 대해서 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.
본 발명은 제대로부터 추출한 중간엽 줄기세포(Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, UCDSCs)를 단일세포(single cell)로 분리하여, 분리한 단일세포 집단으로부터 구체(sphere)를 형성하여, 중배엽성의 제대 유래 줄기세포에서 내배엽성 세포로 분화 유도 하였으며, 형성된 구체에 세포의 발생과정에서 세포 증식 및 분화 조절에 관여하는 protein phosphatase 1 (PP1), protein phosphatase 2A (PP2A) 및 protein phosphatase 2B (PP2B)를 억제할 수 있는 오카다산 (okadaic acid (OA))를 처리하여, 내배엽성 세포로의 교차 분화를 촉진하는 단계로 구성된다. The present invention separates properly extracted Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (UCDSCs) into single cells, forms a sphere from the isolated single cell population, and derives from mesodermal umbilical cord Induced differentiation from stem cells to endoderm cells and inhibited protein phosphatase 1 (PP1), protein phosphatase 2A (PP2A) and protein phosphatase 2B (PP2B), which are involved in cell proliferation and differentiation during cell development Treatment with okadaic acid (OA) to promote cross differentiation into endoderm cells.
본 발명의 기술에서 사용된 제대 유래 중간엽 줄기세포는 분화를 유도하지 않았을 시 내배엽성 세포 분화에 절대적인 역할을 하는 유전자인 Foxa2 및 Sox17을 발현하지 않았으며 (도 1), Foxa2 및 Sox17 단백질 표지 인자 또한 발현하지 않고 있음을 확인하였다(도 2).Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells used in the technique of the present invention did not express Foxa2 and Sox17, genes that play an absolute role in endoderm cell differentiation without inducing differentiation (FIG. 1), and Foxa2 and Sox17 protein labeling factors. It was also confirmed that it did not express (Fig. 2).
본 발명에 있어서 사용한 내배엽성 세포 유도 방법은 제대 유래 중간엽 줄기세포를 단일 세포(single cell)로 분리하여, 구체(sphere)를 형성하는 것으로 구성된다(도 3). 단일세포의 제대 유래 중간엽 줄기세포를 DMEM-LG (DMEM low glucose) 배지에 1XB27을 첨가하여 배양시, 인접한 단일 세포의 제대 유래 줄기세포들이 모여 구체를 형성한다. 일반 부착 배양법(attached monolayer culture)와는 다르게 구체를 형성하여 부유 배양(suspension culture)을 할 경우에는 인접한 세포들 사이에 활발한 상호작용으로 인해 세포의 분화 유도에 이점이 있다. 이렇게 형성된 구체를 지속적으로 DMEM-LG + B27 배양액에 배양 시, 배양 3일 후에 분화를 유도하지 않은 제대 유래 중간엽 줄기세포에서는 발현하지 않았던 Foxa2 및 Sox17 유전자가 발현이 증가함을 확인하였다(도 4).The endoderm cell induction method used in the present invention consists of separating umbilical cord-derived mesenchymal stem cells into single cells to form a sphere (FIG. 3). When umbilical cord-derived mesenchymal stem cells of single cells are cultured by adding 1XB27 to DMEM-LG (DMEM low glucose) medium, umbilical stem-derived stem cells of adjacent single cells gather to form a sphere. Unlike in the attached monolayer culture, when the suspension is formed by forming a sphere, there is an advantage in inducing differentiation of cells due to the active interaction between adjacent cells. When the spheres thus formed were continuously cultured in DMEM-LG + B27 culture, it was confirmed that Foxa2 and Sox17 genes that were not expressed in umbilical cord-derived mesenchymal stem cells that did not induce differentiation after 3 days of culture were increased (FIG. 4). ).
본 발명에 있어서 사용한 내배엽성 세포 유도 방법은 제대 유래 중간엽 줄기세포로부터 형성된 구체에 Okadaic acid (OA)를 처리함으로써, 내배엽성 세포 분화 유도에 중요한 역할을 하는 유전자의 발현을 증가 시키는 것으로 구성된다. 분화를 유도하지 않은 제대 유래 중간엽 줄기세포로부터 구체를 형성하여, 배양 1일째에 5nM, 10nM, 15nM 및 20nM OA를 각각 처리하여, 2일간 추가 배양시, 구체의 형태는 지속적으로 유지되는 동시에(도 5), 5nM OA를 처리했을 때, OA를 처리하지 않고 배양한 구체에 비하여, 내배엽성 세포 분화 유도에 중요한 역할을 하는 Foxa2 및 Sox17 유전자가 현저히 증가함을 확인하였다(도 6).
The endoderm cell induction method used in the present invention comprises treatment of Okadaic acid (OA) to spheres formed from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, thereby increasing the expression of genes that play an important role in inducing endothelial cell differentiation. Spheres were formed from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells that did not induce differentiation and were treated with 5 nM, 10 nM, 15 nM and 20 nM OA on the first day of cultivation. 5), when treated with 5nM OA, it was confirmed that significantly increased Foxa2 and Sox17 genes that play an important role in inducing endoderm cell differentiation compared to spheres cultured without OA (Fig. 6).
상술한 바와 같이, 본 발명에 의한 제대 유래 중간엽 줄기세포로부터 구체 형성을 통한 내배엽성 세포로의 교차 분화 유도 방법은 중배엽성 세포인 다양한 중간엽 줄기세포들로부터 완벽한 기능을 하는 간세포 또는 췌장세포를 포함한 내배엽성 세포로의 분화를 유도할 수 있는 효과를 도모할 수 있다.As described above, the method of inducing cross-differentiation from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells according to the present invention to endoderm cells through sphere formation is characterized in that hepatocytes or pancreatic cells functioning perfectly from various mesenchymal stem cells, which are mesodermal cells. The effect which can induce differentiation into endoderm containing cells can be aimed at.
즉 본 발명은 기능성을 지닌 진정한 내배엽성 유래 세포 분화 유도 방법 및 내배엽성 세포 유래 장기의 질환 치료를 위한 세포치료제 개발에 매우 유용한 발명이라 할 것이다.
That is, the present invention will be said to be a very useful invention in developing a method for inducing true endoderm-derived cell differentiation with a functional and cell therapy agent for treating diseases of endoderm-derived organs.
도 1은 제대 유래 중간엽 줄기세포의 유전자 발현 특성 분석에 관한 도면이다. 제대로부터 줄기세포를 분리 후, 4번째 계대와 5번째 계대의 세포의 전분화능 관련 유전자(nanog, oct4), 내배엽성 세포 관련 유전자(Brachyury, Mixl 1, Sox17, Foxa2) 및 외배엽성 세포 관련 유전자(pax6, sox1, nestin)의 발현을 확인한 결과, 내배엽성 세포의 특성을 대변하는 brachyury, foxa2 및 sox17은 발현하지 않고 있음을 확인하였다.
도 2는 제대 유래 중간엽 줄기세포의 단백질 표지 인자 발현 특성 분석에 관한 도면이다. 제대로부터 줄기세포를 분리 후, 4번째 계대와 5번째 계대의 세포의 내배엽성 세포 관련 단백질 표지 인자(Brachyury, foxa2 및 sox17)의 발현 양상 및 초기 간세포 관련 표지인자(AFP)의 발현 양상을 분석한 결과, 도 1의 유전자 분석 결과와 마찬가지로, 내배엽성 세포 관련 단백질 표지 인자 및 초기 간세포 관련 표지인자를 발현하지 않고 있음을 확인하였다.
도 3은 제대 유래 중간엽 줄기세포로부터 구체(sphere)를 형성하여 배양하는 방법에 관한 도면이다. 제대 유래 중간엽 줄기세포를 단일 세포(single cell)로 분리(A)하여, DMEM-low glucose (DMEM-LG)에 1X B27을 첨가하여 1일간 배양하여 구체를 형성하였고(B), 형성된 구체는 DMEM-LG + B27 배지에서 3일간 그 형태를 유지하여 배양됨을 확인하였다.
도 4는 제대 유래 중간엽 줄기세포로부터 형성된 구체의 배양 기간에 따른, 내배엽성 세포 관련 유전자(Brachyury, foxa2 및 sox17) 및 초기 간세포 분화 관련 유전자(Hnf4a, AFP, C/EBPβ, c-met, prox1, 및 ALB)의 발현 양상을 분석한 도면이다. 그 결과 구체 형성 후 3일째에 내배엽성 세포 분화에 절대적인 영향을 미치는 foxa2 및 sox17이 다른 배양기간에 비해 증가함을 확인하였다.
도 5는 제대 유래 중간엽 줄기세포로부터 형성된 구체에 오카다산(okadaic acid (OA))를 농도별로 처리하였을때의 구체 형태를 보여주는 도면이다. 구체 형성 1일째에 5nM OA (A), 10nM OA (B), 15nM OA (C) 및 20nM OA (D)를 처리하여, 2일간 추가 배양시에도 구체의 형태가 계속 유지됨을 확인하였다.
도 6은 제대 유래 중간엽 줄기세포로부터 형성된 구체에 오카다산(okadaic acid (OA))를 처리한 구체의 전분화능 관련 유전자(oc4), 내배엽성 세포 관련 유전자(Brachyury, Mixl1, foxa2 및 sox17) 및 초기 간세포 분화 관련 유전자(Hnf4a, AFP, C/EBPβ, c-met, prox1, 및 ALB)의 발현 양상을 분석한 도면이다. 그 결과 5nM OA를 2일간 처리하였을 때, 내배엽성 세포 분화에 절대적인 영향을 미치는 foxa2 및 sox17이 현저하게 증가함을 확인할 수 있었다. 1 is a diagram of the gene expression characteristics analysis of umbilical cord mesenchymal stem cells. After the stem cells were properly separated, genes related to pluripotency (nanog, oct4), endoderm cell-related genes (Brachyury,
2 is a diagram of the protein labeling factor expression characteristics analysis of umbilical cord mesenchymal stem cells. After the stem cells were properly separated, the expression patterns of endoderm cell-associated protein markers (Brachyury, foxa2 and sox17) and early hepatocyte-associated markers (AFP) of the 4th and 5th passages were analyzed. As a result of the genetic analysis of FIG. 1, it was confirmed that the endoderm cell-associated protein labeling factor and the initial hepatocyte-related labeling factor were not expressed.
Figure 3 is a diagram of a method for forming and culturing spheres from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells. The umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were separated into single cells (A), and 1X B27 was added to DMEM-low glucose (DMEM-LG) and cultured for 1 day to form spheres (B). It was confirmed that the culture was maintained by maintaining the form in DMEM-LG + B27 medium for 3 days.
4 shows endoderm cell related genes (Brachyury, foxa2 and sox17) and early hepatocyte differentiation related genes (Hnf4a, AFP, C / EBPβ, c-met, prox1) according to the culture period of spheres formed from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells , And ALB) is a diagram analyzing the expression pattern. As a result, it was confirmed that foxa2 and sox17, which have an absolute effect on endoderm cell differentiation, increased more than other culture periods at 3 days after sphere formation.
Figure 5 is a view showing the specific shape when treated with concentration of okadaic acid (okadaic acid (OA)) to spheres formed from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells. On
Figure 6 shows the pluripotency-related genes (oc4), endoderm cell-related genes (Brachyury, Mixl1, foxa2 and sox17) of spheres treated with okadaic acid (OA) on spheres formed from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells; This is an analysis of the expression patterns of early hepatocyte differentiation related genes (Hnf4a, AFP, C / EBPβ, c-met, prox1, and ALB). As a result, when treated with 5nM OA for two days, it was confirmed that the foxa2 and sox17 significantly affects the endoderm cell differentiation.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예들은 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예들에 의하여 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples. However, the following examples illustrate the present invention, and the scope of the present invention is not limited by the following examples.
실시예 1: 제대 유래 중간엽 줄기세포의 구체 형성Example 1: Sphere Formation of Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells
부착배양(attached monolayer culture)한 제대 유래 중간엽 줄기세포에 0.5% 트립신(trypsin)을 처리하여, 단일 세포(single cell)로 분리한 후, 단일 세포 중간엽 줄기세포 집단을 부유 배양접시에 옮겨, DMEM low glucose (DMEM-LG, GIBCO에서 구입)에 1XB27 (GIBCO에서 구입)을 첨가한 배지에 1일간 배양하여, 구체(sphere) 형성을 유도 하였다.
After treatment with umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (attached monolayer culture) 0.5% trypsin, separated into single cells, the single cell mesenchymal stem cell population was transferred to a floating culture dish, Sphere formation was induced by incubating for 1 day in a medium containing 1 × B27 (purchased from GIBCO) to DMEM low glucose (purchased from DMEM-LG, GIBCO).
실시예 2: 제대 유래 중간엽 줄기세포로부터 형성된 구체의 배양 및 내배엽 분화 분석Example 2: Culture and endoderm differentiation analysis of spheres formed from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells
제대 유래 중간엽 줄기세포로부터 형성된 구체를 구체를 형성한 동일한 배지(DMEM-LG + B27)에 3일, 6일, 8일간 추가 배양하여, PCR을 통해 내배엽성 관련 유전자의 발현 양상을 분석하였다.
Spheres formed from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells were further cultured for 3 days, 6 days, and 8 days in the same medium (DMEM-LG + B27) forming spheres, and the expression patterns of endoderm-related genes were analyzed by PCR.
실시예 3: 제대 유래 중간엽 줄기세포로부터 형성된 구체의 내배엽성 분화 촉진Example 3: Promoting endoderm differentiation of spheres formed from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells
제대 유래 중간엽 줄기세포로부터 형성된 구체 형성 1일째에, 5nM 오카다산(okadaic acid (OA)), 10nM OA, 15nM 5A 및 20nM OA가 첨가된 DMEM-LG + B27 배지에 2일간 추가 배양하여, 제대 유래 중간엽 줄기세포의 내배엽으로의 분화를 촉진하였고, PCR을 통해 확인하였다.
On
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