KR101247206B1 - Biosensor for detecting cadmium and the manufacturing method thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 카드뮴 검출용 바이오센서 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로, 대표적인 방사선 저항성 미생물인 데이노코커스 레디오듀란스(Deinococcus radiodurans)의 DR_0070 유전자의 프로모터를 포함하는 유전자 컨스트럭트, 상기 컨스트럭트로 형질전환된 세포를 포함하는 바이오센서, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 카드뮴 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바이오센서는 종래의 미생물 바이오센서에 비해 카드뮴에 대해 특이성과 감도가 매우 뛰어나므로, 카드뮴 검출 방법에 유용하게 이용될 수 있다. The present invention relates to a biosensor for detecting cadmium and a method for manufacturing the same, and specifically, a gene construct comprising a promoter of DR_0070 gene of Deinococcus radiodurans , a representative radiation-resistant microorganism, the construct The present invention relates to a biosensor comprising a tro-transformed cell, a manufacturing method thereof, and a cadmium detection method using the same. The biosensor of the present invention is very superior in specificity and sensitivity to cadmium compared to the conventional microbial biosensors, and thus may be usefully used in a cadmium detection method.
Description
본 발명은 카드뮴 검출용 바이오센서 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a biosensor for detecting cadmium and a method of manufacturing the same.
카드뮴(Cd2 +)은 도금이나 안료, 치료용 아말감, 비닐제작 등에 널리 사용되는 중금속 중 하나이다. 그러나 카드뮴의 생물학적 기능은 현재까지 알려진 바 없으며 심각한 세포손상을 유발하는 중금속이다. 카드뮴은 반응성 산소종의 생성을 유발하여 단백질과 세포막 지질의 산화(Manca et al., Toxicology, 67, 303-323, (1991)), 그리고 DNA 손상을 초래한다(Stohs S.J. et al., Free. Radic. Biol. Med., 18, 321-336(1995)). 또한 카드뮴은 DNA 교정작용 저해(Jin Y.H. et al., Nat. Genet., 34, 326-329, (2003)) 및 핵산과 단백질 합성을 저해하며(Mitra R.S., Appl. Environ. Microbiol., 47, 1012-1016, (1984)), 인체 내 축적 시에는 DNA 손상, 신경계 손상, 그리고 신장 독성 등의 증상을 나타내는 “이타이이타이”병을 유발시키는 원인으로 알려져 있다. 이와 같이 카드뮴은 낮은 농도에서도 생명체에 매우 해로운 중금속이므로 자연환경의 카드뮴 오염은 정밀하게 측정되고 규제되어 직접적 또는 먹이사슬을 통한 간접적 인체 내 축적을 예방해야 한다. Cadmium (Cd + 2) is one of the heavy metals which are widely used in plating or the pigment, for the treatment amalgam, vinyl production. However, the biological function of cadmium is unknown to date and is a heavy metal causing severe cell damage. Cadmium induces the production of reactive oxygen species, leading to oxidation of protein and membrane lipids (Manca et al., Toxicology, 67, 303-323, (1991)), and DNA damage (Stohs SJ et al., Free. Radic. Biol. Med., 18, 321-336 (1995). Cadmium also inhibits DNA correction (Jin YH et al., Nat. Genet., 34, 326-329, (2003)) and inhibits nucleic acid and protein synthesis (Mitra RS, Appl. Environ. Microbiol., 47, 1012-1016, (1984)), when accumulated in the human body, is known to cause "Itai-tai" disease, which causes symptoms such as DNA damage, nervous system damage, and kidney toxicity. Since cadmium is a heavy metal that is very harmful to life even at low concentrations, cadmium contamination in the natural environment should be precisely measured and regulated to prevent accumulation in the human body either directly or indirectly through the food chain.
카드뮴을 포함한 중금속의 농도 측정은 원자 흡수 분광법(cold vapour atomic absorption spectrometry), 자외선 및 가시광선 분광법(UV-visible spectrophotometry), 그리고 X-선 흡수 분광법(X-ray absorption spectroscopy) 등의 방법들이 이용되어왔다. 그러나 이들 기기 화학적 방법은 고가의 장비로 비용이 많이 드는 점과 복잡한 처리에 의해 시간이 오래 걸리고 실험실 내에서만 사용 가능하며 전문가가 아니면 활용이 용이하지 않는 점이 경제적 및 기술적 효과가 부각되지 않고 있는 실정이다. 그러므로 카드뮴을 보다 신속 간단하고 낮은 비용으로 정확하게 검출하는 기술의 개발은 경제적 및 환경 기술적 차원에서 매우 중요하다. 따라서 최근에는 기존 기술의 대안으로 특이성이 높고, 측정 비용이 저렴하고, 다루기 쉽고 이동 가능한 바이오센서를 개발하려 많은 연구가 진행되고 있다(Verma N. et al., Biometals, 18, 121-129, (2005)).
The concentration of heavy metals, including cadmium, can be measured using cold vapor atomic absorption spectrometry, UV-visible spectrophotometry, and X-ray absorption spectroscopy. come. However, these instrumental chemical methods are expensive and expensive, and they are time-consuming due to complicated processing, can be used only in the laboratory, and are not easy to use unless they are experts. . Therefore, the development of technology to detect cadmium more quickly, simply and at low cost is very important from an economic and environmental technical level. Recently, many studies have been conducted to develop biosensors with high specificity, low measurement cost, and easy to handle and move as an alternative to the existing technology (Verma N. et al., Biometals, 18, 121-129, ( 2005)).
바이오센서란 고정화된 생물학적 구성요소와 생화학적 신호를 정량화할 수 있는 전기적 신호로 전환해주는 변환기(transducer)로 이루어진 장치로서 다양한 환경 내에 있는 물질들을 저 농도에서 신속하고 정확하게 감지할 수 있는 분석기술이다. 바이오센서는 크게 단백질을 기초로 한 것과 세포를 기초로 한 방법으로 나누어지며, 생물학적 응용성과 선택성, 편리성 그리고 측정 감도 등의 관점에서 세포를 기초로 한 전세포 바이오센서(whole-cell biosensor)의 연구가 많이 이루어지고 있다. 전세포 바이오센서는 환경 오염물질로 인한 독성에 특이적으로 반응할 수 있는 프로모터와 β-갈락토시다제나 반딧불 루시퍼라제(firefly luciferase) 등의 리포터 시스템으로 구성된 유전공학적으로 변형된 재조합 세포를 이용하여 강, 호수, 및 상·하수원, 토양 등의 환경오염 측정에 응용될 수 있는 첨단 바이오 모니터링 기술이다. 카드뮴을 측정하는 대부분의 전세포 바이오센서는 주로 원핵 미생물을 사용한다. 그 예로는 포도상구균(Staphylococcus aureus)의 카드뮴 저항성 유전자 cadA의 프로모터와 반딧불 루시퍼라제를 결합한 재조합 플라스미드 형질 전환체(Tauriainen S. et al., Biosens. Bioelectron., 13, 931-938, (1998)), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)의 카드뮴 저항성을 조절하는 cadR 유전자의 프로모터와 녹색 형광단백질(green fluorenscent protein)을 결합한 재조합 플라스미드 형질전환체(Wu C.H., Biotechnol. Prog., 25, 898-903, (2009)), 대장균의 cadAC 유전자의 프로모터와 녹색 형광단백질을 결합한 재조합 플라스미드 형질전환체(Shetty R.S. et al., Anal. Bioanal. Chem., 376, 11-17, (2003)) 등이 보고되었다. 그러나, 세포 자체가 병원성 미생물이거나 카드뮴 특이성이 비교적 낮거나, 또는 기초 발현도가 높은 단점이 있다. 따라서, 카드뮴을 더욱 특이적이고 민감하게 탐지할 수 있는 바이오센서에 대한 필요성은 여전히 존재한다.
Biosensors are devices that consist of immobilized biological components and transducers that convert biochemical signals into quantifiable electrical signals, an analytical technique that can quickly and accurately detect substances in various environments at low concentrations. Biosensors are largely divided into protein-based and cell-based methods. The biosensors are based on cell-based whole-cell biosensors in terms of biological applicability, selectivity, convenience and measurement sensitivity. A lot of research is being done. Whole-cell biosensors use genetically modified recombinant cells composed of promoters capable of specifically responding to environmental pollutants' toxicity and reporter systems such as β-galactosidase and firefly luciferase. It is an advanced bio-monitoring technology that can be applied to environmental pollution measurement of rivers, lakes, water and sewage sources, and soil. Most whole-cell biosensors that measure cadmium primarily use prokaryotic microbes. An example is Staphylococcus Recombinant plasmid transformant (Tauriainen S. et al., Biosens. Bioelectron., 13, 931-938, (1998)) combining the promoter of the cadmium resistance gene cadA of aureus and firefly luciferase, Pseudomonas putida ) of cadmium promoter and green fluorescent protein gene cadR for adjusting the resistance (. fluorenscent green protein) bound recombinant plasmid transformants (Wu CH, Biotechnol the Prog., 25, 898-903, ( 2009)), cadAC of E. coli Recombinant plasmid transformants (Shetty RS et al., Anal. Bioanal. Chem., 376, 11-17, (2003)) that combine the promoter of the gene with the green fluorescent protein have been reported. However, there are disadvantages that the cells themselves are pathogenic microorganisms, relatively low cadmium specificity, or high basal expression. Thus, there is still a need for biosensors capable of detecting cadmium more specifically and sensitively.
한편, 데이노코커스 레디오듀란스(Deinococcus radiodurans)는 대표적인 방사선 저항성 미생물로, 방사선 이외에도 자외선, 건조 및 과산화수소 등 DNA 손상물질 또는 환경에 대한 높은 저항성을 가지고 있으므로, 상기 미생물은 DNA 손상을 유발하는 카드뮴을 측정하기 위한 전세포 바이오센서의 숙주로의 이용에 다른 미생물에 비해 유망하다고 할 수 있다.
Meanwhile, Deinococcus radiodurans is a representative radiation-resistant microorganism, and in addition to radiation, it has high resistance to DNA damaging substances such as ultraviolet rays, drying and hydrogen peroxide or the environment. The use of whole cell biosensors as a host for measurement can be said to be promising compared to other microorganisms.
이에, 본 발명자들은 방사선 저항성 미생물인 데이노코커스 레디오듀란스(Deinococcus radiodurans) 균주의 DR_0070 유전자의 발현율이 카드뮴 노출에 의해 특이적으로 높아지는 것을 확인하고, 상기 DR_0070 유전자의 프로모터와 β-갈락토시다제 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 제조하고, 이를 데이노코커스 야생형에 형질전환하여, 재조합 형질전환체를 제조하였으며, 상기 재조합 형질전환체가 카드뮴에 대해 특이성과 민감도가 매우 높음을 확인함으로써, 상기 형질전환체를 카드뮴 검출용 바이오센서로 유용하게 사용할 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
Thus, the present inventors have deinococcus radiation resistant microorganisms ( Dinococcus) radiodurans ) was confirmed that the expression rate of the DR_0070 gene of the strain is specifically increased by exposure to cadmium, to prepare a recombinant plasmid containing the promoter of the DR_0070 gene and β-galactosidase gene, which was transformed into the daynococcus wild type By converting, a recombinant transformant was prepared, and by confirming that the recombinant transformant had very high specificity and sensitivity to cadmium, it was found that the transformant could be usefully used as a biosensor for detecting cadmium. The invention was completed.
본 발명의 목적은 데이노코커스 레디오듀란스(Deinococcus radiodurans) 균주의 DR_0070 유전자의 프로모터를 포함하는 유전자 컨스트럭트, 상기 컨스트럭트를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현벡터가 형질전환된 재조합 형질전환체, 상기 형질전환체를 포함하는 바이오센서, 상기 바이오센서의 제조 방법 및 상기 바이오센서를 이용한 카드뮴 검출 방법을 제공하는 것이다.
An object of the present invention is Deinococcus radiodurans ) gene construct comprising a promoter of the DR_0070 gene of the strain, an expression vector comprising the construct, a recombinant transformant transformed with the expression vector, a biosensor comprising the transformant, the bio It is to provide a manufacturing method of the sensor and a cadmium detection method using the biosensor.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 데이노코커스 레디오듀란스(Deinococcus radiodurans)의 DR_0070 유전자의 프로모터와 상기 DR_0070 유전자의 프로모터에 작동가능하도록 연결된 리포터(reporter) 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트(gene construct)를 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention provides a gene construct including a promoter of the DR_0070 gene of Deinococcus radiodurans and a reporter gene operably linked to the promoter of the DR_0070 gene. Provide construct.
또한, 본 발명은 상기 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.The present invention also provides an expression vector comprising the gene construct.
또한, 본 발명은 상기 발현 벡터가 숙주세포에 형질전환된 재조합 형질전환체를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a recombinant transformant transformed into a host cell.
또한, 본 발명은 상기 재조합 형질전환체를 포함하는 카드뮴 검출용 바이오센서를 제공한다.The present invention also provides a biosensor for detecting cadmium comprising the recombinant transformant.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 카드뮴 검출용 바이오센서의 제조 방법을 제공한다:In addition, the present invention provides a method of manufacturing a cadmium detection biosensor comprising the following steps:
1) 데이노코커스 레디오듀란스(Deinococcus radiodurans)의 DR_0070 유전자의 프로모터와 상기 DR_0070 유전자의 프로모터에 작동가능하도록 연결된 리포터(reporter) 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트가 포함된 발현 벡터를 제조하는 단계; 및1) preparing an expression vector comprising a gene construct comprising a promoter of a DR_0070 gene of Deinococcus radiodurans and a reporter gene operably linked to a promoter of the DR_0070 gene; And
2) 상기 단계 1)의 발현 벡터를 숙주세포에 형질전환시킨 재조합 형질전환체를 포함하는 카드뮴 검출용 바이오센서를 제조하는 단계.2) preparing a cadmium detection biosensor comprising a recombinant transformant transformed into a host cell the expression vector of step 1).
아울러, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 카드뮴 검출 방법을 제공한다:In addition, the present invention provides a cadmium detection method comprising the following steps:
1) 피검시료를 본 발명의 바이오센서에 노출시키는 단계; 및1) exposing the test sample to the biosensor of the present invention; And
2) 상기 단계 1)의 바이오센서를 통해 DR_0070 유전자의 프로모터의 작동에 의한 리포터 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계.
2) measuring the expression level of the reporter gene by the operation of the promoter of the DR_0070 gene through the biosensor of step 1).
본 발명의 데이노코커스 레디오듀란스의 DR_0070 유전자의 프로모터와 리포터 유전자인 LacZ가 연결된 유전자를 포함하는 전세포 바이오센서는 종래 카드뮴 검출 방법에 비해 그 특이성 및 민감도가 매우 뛰어나므로, 카드뮴을 더욱 민감하고 정확하게 검출할 수 있다.
The whole-cell biosensor comprising a promoter linked to the promoter of the Dinococcus radidiourans DR_0070 gene of the present invention and LacZ, which is a reporter gene, is more specific and sensitive than the conventional cadmium detection method, and thus more sensitive to cadmium. Can be detected accurately.
도 1은 DR_0070 유전자의 중금속 처리에 따른 발현 양상을 나타낸 결과이다.
도 2는 0070p::pRADZ3 재조합 플라스미드의 구조를 나타낸 그림이다.
도 3은 0070p의 다양한 중금속 처리에 따른 발현 양상을 나타낸 결과이다.
도 4는 0070p의 카드뮴 농도에 따른 발현 양상을 나타낸 결과이다.
도 5는 0070p의 카드뮴 처리 시간에 따른 발현 양상을 나타낸 결과이다.1 is a result showing the expression pattern according to heavy metal treatment of DR_0070 gene.
2 is a diagram showing the structure of 0070p :: pRADZ3 recombinant plasmid.
Figure 3 is a result showing the expression pattern according to the treatment of various heavy metals of 0070p.
4 shows the results of expression according to the cadmium concentration of 0070p.
5 is a result showing the expression pattern according to the cadmium treatment time of 0070p.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 데이노코커스 레디오듀란스(Deinococcus radiodurans)의 DR_0070 유전자의 프로모터와 상기 DR_0070 유전자의 프로모터에 작동가능하도록 연결된 리포터(reporter) 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트(gene construct)를 제공한다. The present invention provides a gene construct comprising a promoter of the DR_0070 gene of Deinococcus radiodurans and a reporter gene operably linked to the promoter of the DR_0070 gene.
상기 DR_0070 유전자의 프로모터는 중합 효소 연쇄반응에 의해 서열번호 3 및 4에 기재된 프라이머쌍으로 증폭되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.The promoter of the DR_0070 gene preferably has a nucleotide sequence amplified by the primer pairs set forth in SEQ ID NOs: 3 and 4 by polymerase chain reaction, but is not limited thereto.
상기 DR_0070 유전자의 프로모터는 서열번호 5로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.The promoter of the DR_0070 gene preferably has a nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 5, but is not limited thereto.
상기 리포터 유전자는 DR_0745 유전자의 프로모터에 의해 발현되도록 작동가능하게 연결될 수 있다면 다양한 공지의 리포터 유전자들이 이용가능하며, 형광단백질(GFP), 루시페라제(luciferase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 및 β-갈락토시다제(galactosidase)를 암호화하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 리포터 유전자인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, β-갈락토시다제(galactosidase, lacZ)를 암호화하는 유전자인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. The reporter gene can be operably linked to be expressed by the promoter of the DR_0745 gene, and various known reporter genes are available, and fluorescent protein (GFP), luciferase, alkaline phosphatase, and β -It is preferable that it is any one reporter gene selected from the group consisting of a gene encoding a galactosidase (galactosidase), but is not limited thereto, the gene encoding β-galactosidase (galactosidase, lacZ) More preferably, it is not limited thereto.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 데이노코커스 레디오듀란스의 DR_0070 유전자의 발현이 카드뮴에 특이적으로 매우 높게 나타남을 확인하였고(도 1 참조), DR_0070 유전자에 특이적인 PCR 프라이머 서열에, 정방향 프라이머(서열번호 3) 말단에는 BglII, DR_0070 역방향 프라이머(서열번호 4) 말단에는 SpeI 제한효소 인식서열을 첨가하여 제작하고, 데이노코커스 레디오듀란스의 게놈 DNA를 주형으로 상기 두 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 상기 반응액을DR_0070 유전자의 프로모터 DNA(0070p)를 분리 농축하였으며, 상기 0070p를 BglII와 SpeI 제한효소로 처리하여 절단한 후, 정제하였다. 이후, pRADZ3 발현벡터를 BglII와 SpeI 제한효소로 처리한 후 lacZ 유전자에 연결된 프로모터가 제거된 벡터 부위를 정제한 다음, 정제된 프로모터 DNA와 pRADZ3 벡터를 연결하여 0070p:pRADZ3 재조합 플라스미드를 제작하였다(도 2 참조). 상기 재조합 플라스미드를 데이노코커스 야생형에 형질전환하여 카드뮴 바이오센서용 형질전환체 KDH049를 제조하였다.In a specific embodiment of the present invention, it was confirmed that the expression of the DR_0070 gene of Dinococcus radidiourans was very high specifically for cadmium (see FIG. 1), and the PCR primer sequence specific to the DR_0070 gene was used as a forward primer ( SEQ ID NO: 3) BglII at the end, DR_0070 reverse primer (SEQ ID NO: 4) at the end of the SpeI restriction enzyme recognition sequence was prepared by adding the genomic DNA of Dinococcus radiodiorus using the two primers as a template to the polymerase chain The reaction was carried out. The reaction solution was concentrated to isolate the promoter DNA (0070p) of the DR_0070 gene, and the 0070p was digested with BglII and SpeI restriction enzymes, and then purified. Thereafter, the pRADZ3 expression vector was treated with BglII and SpeI restriction enzymes, and the vector site from which the promoter linked to the lacZ gene was removed was purified. Then, the 0070p: pRADZ3 recombinant plasmid was prepared by connecting the purified promoter DNA and the pRADZ3 vector (Fig. 2). The recombinant plasmid was transformed into Daynococcus wild type to prepare transformant KDH049 for cadmium biosensor.
또한, 본 발명의 또 다른 구체적인 실시예에서, 상기 제조된 바이오센서가 카드뮴에만 매우 특이적으로 반응하고(도 3 참조), 낮은 카드뮴 농도에서도 유전자의 발현이 증가하여(도 4 참조), 카드뮴에 대해 높은 민감도를 지니고 있을 뿐 아니라, 0070p의 발현이 시간이 증가함에 따라 점진적으로 증가하는 것을 확인하여(도 5 참조), 본 발명의 바이오센서에서 0070p의 발현이 카드뮴의 농도에 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다.
In addition, in another specific embodiment of the present invention, the prepared biosensor reacts very specifically to cadmium only (see FIG. 3), and even at low cadmium concentrations, the expression of genes is increased (see FIG. 4). In addition to having a high sensitivity to the expression, it was confirmed that the expression of 0070p gradually increases with time (see FIG. 5), so that the expression of 0070p in the biosensor of the present invention increases depending on the concentration of cadmium. Confirmed.
또한, 본 발명은 데이노코커스 레디오듀란스(Deinococcus radiodurans) 균주의 DR_0070 유전자의 프로모터와 상기 DR_0070 유전자의 프로모터에 작동가능하도록 연결된 리포터 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.In addition, the present invention is Deinococcus ( Dinococcus) radiodurans ) provides an expression vector comprising a promoter comprising a promoter of the DR_0070 gene of the strain and a reporter gene operably linked to the promoter of the DR_0070 gene.
또한, 본 발명은 상기 발현 벡터가 숙주세포에 형질전환된 재조합 형질전환체를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a recombinant transformant transformed into a host cell.
또한, 본 발명은 상기 재조합 형질전환체를 포함하는 카드뮴 검출용 바이오센서를 제공한다.The present invention also provides a biosensor for detecting cadmium comprising the recombinant transformant.
상기 DR_0070 유전자의 프로모터는 중합 효소 연쇄반응에 의해 서열번호 3 및 4에 기재된 프라이머쌍으로 증폭되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.The promoter of the DR_0070 gene preferably has a nucleotide sequence amplified by the primer pairs set forth in SEQ ID NOs: 3 and 4 by polymerase chain reaction, but is not limited thereto.
상기 DR_0070 유전자의 프로모터는 서열번호 5로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.The promoter of the DR_0070 gene preferably has a nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 5, but is not limited thereto.
상기 리포터 유전자는 DR_0745 유전자의 프로모터에 의해 발현되도록 작동가능하게 연결될 수 있다면 다양한 공지의 리포터 유전자들이 이용가능하며, 형광단백질(GFP), 루시페라제(luciferase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 및 β-갈락토시다제(galactosidase)를 암호화하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 리포터 유전자인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, β-갈락토시다제(galactosidase, lacZ)를 암호화하는 유전자인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. The reporter gene can be operably linked to be expressed by the promoter of the DR_0745 gene, and various known reporter genes are available, and fluorescent protein (GFP), luciferase, alkaline phosphatase, and β -It is preferable that it is any one reporter gene selected from the group consisting of a gene encoding a galactosidase (galactosidase), but is not limited thereto, the gene encoding β-galactosidase (galactosidase, lacZ) More preferably, it is not limited thereto.
상기 발현 벡터는 pRADZ3인 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. The expression vector is preferably pRADZ3, but is not limited thereto.
상기 숙주세포는 데이노코커스 레디오듀란스(Deinococcus radiodurans)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.The host cell is preferably Deinococcus radiodurans , but is not limited thereto.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 데이노코커스 레디오듀란스의 DR_0070 유전자의 발현이 카드뮴에 특이적으로 매우 높게 나타남을 확인하고, DR_0070 유전자에 특이적인 PCR 프라이머를 이용하여 데이노코커스 레디오듀란스의 게놈 DNA를 주형으로 중합효소 연쇄반응을 수행하여 얻어진 DNA를 분리 농축, 절단 후 정제하였다. 이후, 정제된 프로모터 DNA와 pRADZ3 벡터를 연결하여 0070p:pRADZ3 재조합 플라스미드를 제작하였으며, 상기 재조합 플라스미드를 데이노코커스 야생형에 형질전환하여 카드뮴 바이오센서용 형질전환체 KDH049를 제조하였다.In a specific embodiment of the present invention, it was confirmed that the expression of the DR_0070 gene of Dinococcus radidiourans is very high specifically for cadmium, and using the PCR primer specific for the DR_0070 gene, the genome of Dinococcus radidiourans The DNA obtained by performing polymerase chain reaction with DNA as a template was isolated, concentrated, digested and purified. Then, 0070p: pRADZ3 recombinant plasmid was prepared by connecting the purified promoter DNA and the pRADZ3 vector, and the transformed plasmid was transformed into Dinococcus wild type to prepare transformant KDH049 for cadmium biosensor.
또한, 본 발명의 또 다른 구체적인 실시예에서, 상기 제조된 바이오센서가 카드뮴에만 매우 특이적으로 반응하고, 낮은 카드뮴 농도에서도 유전자의 발현이 증가하여, 카드뮴에 대해 높은 민감도를 지니고 있을 뿐 아니라, 0070p의 발현이 시간이 증가함에 따라 점진적으로 증가하는 것을 확인하여, 본 발명의 바이오센서에서 0070p의 발현이 카드뮴의 농도에 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다.In addition, in another specific embodiment of the present invention, the prepared biosensor reacts only specifically to cadmium, and the expression of the gene is increased even at low cadmium concentration, and thus has a high sensitivity to cadmium. It was confirmed that the expression of the gradual increase with increasing time, it was confirmed that the expression of 0070p in the biosensor of the present invention increases depending on the concentration of cadmium.
따라서, 본 발명의 DR_0070 유전자의 프로모터가 포함된 유전자 컨스트럭트가 형질전환된 형질전환체를 포함하는 바이오센서는 카드뮴을 검출하는 바이오센서로 유용하게 이용될 수 있다.
Therefore, a biosensor comprising a transformant in which a gene construct including a promoter of the DR_0070 gene of the present invention is transformed may be usefully used as a biosensor for detecting cadmium.
본 발명은 하기의 단계를 포함하는 카드뮴 검출용 바이오센서의 제조 방법을 제공한다:The present invention provides a method for manufacturing a cadmium detection biosensor comprising the following steps:
1) 데이노코커스 레디오듀란스(Deinococcus radiodurans)의 DR_0070 유전자의 프로모터와 상기 DR_0070 유전자의 프로모터에 작동가능하도록 연결된 리포터(reporter) 유전자를 포함하는 유전자 컨스트럭트가 포함된 발현 벡터를 제조하는 단계; 및1) preparing an expression vector comprising a gene construct comprising a promoter of a DR_0070 gene of Deinococcus radiodurans and a reporter gene operably linked to a promoter of the DR_0070 gene; And
2) 상기 단계 1)의 발현 벡터를 숙주세포에 형질전환시킨 재조합 형질전환체를 포함하는 카드뮴 검출용 바이오센서를 제조하는 단계.2) preparing a cadmium detection biosensor comprising a recombinant transformant transformed into a host cell the expression vector of step 1).
상기 단계 1)의 리포터 유전자는 DR_0745 유전자의 프로모터에 의해 발현되도록 작동가능하게 연결될 수 있다면 다양한 공지의 리포터 유전자들이 이용가능하며, 형광단백질(GFP), 루시페라제(luciferase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 및 β-갈락토시다제(galactosidase)를 암호화하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 리포터 유전자인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, β-갈락토시다제(galactosidase, lacZ)를 암호화하는 유전자인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. If the reporter gene of step 1) can be operably linked to be expressed by the promoter of DR_0745 gene, various known reporter genes are available, and fluorescent protein (GFP), luciferase, alkaline phosphatase (alkaline phosphatase) ), And any reporter gene selected from the group consisting of a gene encoding β-galactosidase, but is not limited thereto, and encodes β-galactosidase (lacZ). More preferably, the gene is not limited thereto.
상기 발현 벡터는 pRADZ3인 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. The expression vector is preferably pRADZ3, but is not limited thereto.
상기 단계 2)의 숙주세포는 데이노코커스 레디오듀란스(Deinococcus radiodurans)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.The host cell of step 2) is preferably Deinococcus radiodurans , but is not limited thereto.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 데이노코커스 레디오듀란스의 DR_0070 유전자의 발현이 카드뮴에 특이적으로 매우 높게 나타남을 확인하고, DR_0070 유전자에 특이적인 PCR 프라이머를 이용하여 데이노코커스 레디오듀란스의 게놈 DNA를 주형으로 중합효소 연쇄반응을 수행하여 얻어진 DNA를 분리 농축, 절단 후 정제하였다. 이후, 정제된 프로모터 DNA와 pRADZ3 벡터를 연결하여 0070p::pRADZ3 재조합 플라스미드를 제작하였으며, 상기 재조합 플라스미드를 데이노코커스 야생형에 형질전환하여 카드뮴 바이오센서용 형질전환체 KDH049를 제조하였다.In a specific embodiment of the present invention, it was confirmed that the expression of the DR_0070 gene of Dinococcus radidiourans is very high specifically for cadmium, and using the PCR primer specific for the DR_0070 gene, the genome of Dinococcus radidiourans The DNA obtained by performing polymerase chain reaction with DNA as a template was isolated, concentrated, digested and purified. Then, the 0070p :: pRADZ3 recombinant plasmid was prepared by connecting the purified promoter DNA and the pRADZ3 vector. The recombinant plasmid was transformed into a Dinococcus wild type to prepare a transformant KDH049 for cadmium biosensor.
또한, 본 발명의 또 다른 구체적인 실시예에서, 상기 제조된 바이오센서가 카드뮴에만 매우 특이적으로 반응하고, 낮은 카드뮴 농도에서도 유전자의 발현이 증가하여, 카드뮴에 대해 높은 민감도를 지니고 있을 뿐 아니라, 0070p의 발현이 시간이 증가함에 따라 점진적으로 증가하는 것을 확인하여, 본 발명의 바이오센서에서 0070p의 발현이 카드뮴의 농도에 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다.In addition, in another specific embodiment of the present invention, the prepared biosensor reacts only specifically to cadmium, and the expression of the gene is increased even at low cadmium concentration, and thus has a high sensitivity to cadmium. It was confirmed that the expression of the gradual increase with increasing time, it was confirmed that the expression of 0070p in the biosensor of the present invention increases depending on the concentration of cadmium.
따라서, 본 발명의 바이오센서는 카드뮴에 대해 매우 특이적이고 민감성이 높으므로, 본 발명의 DR_0070 유전자의 프로모터가 포함된 유전자 컨스트럭트가 형질전환된 형질전환체는 카드뮴 검출용 바이오센서의 제조 방법에 유용하게 사용될 수 있다.
Therefore, since the biosensor of the present invention is very specific and highly sensitive to cadmium, the transformant transformed into the gene construct including the promoter of the DR_0070 gene of the present invention may be used for the preparation method of the biosensor for detecting cadmium. It can be usefully used.
아울러, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 카드뮴 검출 방법을 제공한다:In addition, the present invention provides a cadmium detection method comprising the following steps:
1) 피검시료를 본 발명의 바이오센서에 노출시키는 단계; 및1) exposing the test sample to the biosensor of the present invention; And
2) 상기 단계 1)의 바이오센서를 통해 DR_0070 유전자의 프로모터의 작동에 의한 리포터 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계.2) measuring the expression level of the reporter gene by the operation of the promoter of the DR_0070 gene through the biosensor of step 1).
상기 DR_0070 유전자의 프로모터는 서열번호 5로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. The promoter of the DR_0070 gene preferably has a nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 5, but is not limited thereto.
상기 단계 2)의 리포터 유전자는 DR_0745 유전자의 프로모터에 의해 발현되도록 작동가능하게 연결될 수 있다면 다양한 공지의 리포터 유전자들이 이용가능하며, 형광단백질(GFP), 루시페라제(luciferase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 및 β-갈락토시다제(galactosidase)를 암호화하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 리포터 유전자인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, β-갈락토시다제(galactosidase, lacZ)를 암호화하는 유전자인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. If the reporter gene of step 2) can be operably linked to be expressed by the promoter of DR_0745 gene, a variety of known reporter genes are available, and fluorescent protein (GFP), luciferase, alkaline phosphatase (alkaline phosphatase) ), And any reporter gene selected from the group consisting of a gene encoding β-galactosidase, but is not limited thereto, and encodes β-galactosidase (lacZ). More preferably, the gene is not limited thereto.
분석대상인 카드뮴은 표면에 흡착되거나, 액체 매질중에 용해되어 있는 경우에 바이오센서를 사용하여 측정할 수 있다. 입자에 부착되거나, 수성 시료에 용해되어 있는 카드뮴을 검출하기 위하여 바이오센서를 사용할 수 있으나, 일반적으로는 액상에서 측정하는 것이 바람직하다. 상기 유전자 컨스트럭트를 포함하는 바이오센서가 확실히 기능을 할 수 있도록 충분한 수분을 이용할 수 있으면 되고, 시료를 분석 전에 적당한 완충 조성물로 희석하여, 이 용액 내에서 배양하는 것이 바람직하다. 또한, 분석대상은 선택적 투과성 막이나 용매 등을 이용하여 분석 전에 시료로부터 분리할 수 있다. 예를 들면, 적당한 고체 흡착제를 통과시켜 분석물을 분석전에 농축할 수도 있다.Cadmium to be analyzed can be measured using a biosensor if it is adsorbed on the surface or dissolved in a liquid medium. A biosensor can be used to detect cadmium attached to particles or dissolved in an aqueous sample, but generally it is desirable to measure in liquid phase. It is preferable that sufficient moisture be available so that the biosensor including the gene construct can function reliably, and the sample is diluted with an appropriate buffer composition before culturing and cultured in this solution. In addition, the analyte may be separated from the sample before analysis using a selective permeable membrane or a solvent. For example, the analyte may be concentrated prior to analysis by passing through a suitable solid adsorbent.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 데이노코커스 레디오듀란스의 DR_0070 유전자의 발현이 카드뮴에 특이적으로 매우 높게 나타남을 확인하고, DR_0070 유전자에 특이적인 PCR 프라이머를 이용하여 데이노코커스 레디오듀란스의 게놈 DNA를 주형으로 중합효소 연쇄반응을 수행하여 얻어진 DNA를 분리 농축, 절단 후 정제하였다. 이후, 정제된 프로모터 DNA와 pRADZ3 벡터를 연결하여 0070p:pRADZ3 재조합 플라스미드를 제작하였으며, 상기 재조합 플라스미드를 데이노코커스 야생형에 형질전환하여 카드뮴 바이오센서용 형질전환체 KDH049를 제조하였다.In a specific embodiment of the present invention, it was confirmed that the expression of the DR_0070 gene of Dinococcus radidiourans is very high specifically for cadmium, and using the PCR primer specific for the DR_0070 gene, the genome of Dinococcus radidiourans The DNA obtained by performing polymerase chain reaction with DNA as a template was isolated, concentrated, digested and purified. Then, 0070p: pRADZ3 recombinant plasmid was prepared by connecting the purified promoter DNA and the pRADZ3 vector, and the transformed plasmid was transformed into Dinococcus wild type to prepare transformant KDH049 for cadmium biosensor.
또한, 본 발명의 또 다른 구체적인 실시예에서, 상기 제조된 바이오센서가 카드뮴에만 매우 특이적으로 반응하고, 낮은 카드뮴 농도에서도 유전자의 발현이 증가하여, 카드뮴에 대해 높은 민감도를 지니고 있을 뿐 아니라, 0070p의 발현이 시간이 증가함에 따라 점진적으로 증가하는 것을 확인하여, 본 발명의 바이오센서에서 0070p의 발현이 카드뮴의 농도에 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다.In addition, in another specific embodiment of the present invention, the prepared biosensor reacts only specifically to cadmium, and the expression of the gene is increased even at low cadmium concentration, and thus has a high sensitivity to cadmium. It was confirmed that the expression of the gradual increase with increasing time, it was confirmed that the expression of 0070p in the biosensor of the present invention increases depending on the concentration of cadmium.
따라서, 본 발명의 바이오센서는 카드뮴에 대해 매우 특이적이고 민감성이 높으므로, 본 발명의 DR_0070 유전자의 프로모터가 포함된 유전자 컨스트럭트가 형질전환된 형질전환체는 카드뮴의 검출 방법에 유용하게 사용될 수 있다.
Therefore, since the biosensor of the present invention is very specific and highly sensitive to cadmium, the transformant transformed into the gene construct including the promoter of the DR_0070 gene of the present invention can be usefully used for the detection method of cadmium. have.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples and Experimental Examples.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
However, the following Examples and Experimental Examples are merely illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following Examples and Experimental Examples.
<< 실시예Example 1> 1> DRDR _0070 유전자의 중금속에 대한 발현율 비교Comparison of expression rates for heavy metals of _0070 gene
데이노코커스 레디오듀란스의 DR_0070 유전자의 중금속에 대한 발현율을 정량적으로 상호 비교하기 위하여, 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 이용하였다.Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to quantitatively compare the expression levels of heavy metals of the DR_0070 gene of Dinococcus rediodurans.
구체적으로, 야생형 데이노코커스 레디오듀란스(농촌진흥청 농업유전자원정보센터, Deinococcus radiodurans, KACC No. 12248)를 TGY 액상배지(0.5% tryptone, 0.2% yeast extract, 0.02% glucose)에 24시간 동안 30℃에서 현탁배양하였다(200 rpm). 상기 전배양액을 새로운 배지 부피에 1% 재접종하고 대수 생장기(OD600=0.6, ~1×108 cells/L)까지 배양한 후 염화카드뮴(CdCl2), 염화크롬(CrCl3), 염화납(PbCl2), 염화니켈(NiCl2), 염화아연(ZnCl2), 염화철(FeCl2), 염화구리(CuCl2), 염화비소(AsCl3), 염화망간(MnCl2), 및 염화수은(HgCl2)을 각각 10 uM 농도로 첨가하였으며, 이후, 1시간 동안 배양한 다음, 상기 배양액 5 ml을 원심분리하여 상등액을 제거하고 배양세포를 회수하였다. 이후, 회수한 세포에 RiboEx 용액(GeneAll Biotechnology, Korea) 1 ml 및 0.1 mm 지르코니아/실리카 비드(zirconia/silica bead)를 첨가한 후 비드 비터(bead beater, Bertin Technoligies, France)를 사용하여 세포를 분쇄하고 전체 RNA를 추출하였다. 전체 RNA 10 ㎍에 역전사용 프라이머를 첨가하고 70℃에서 가열 냉각한 후 역전사 반응용 완충용액, dNTP, 역전사효소 혼합물을 첨가하였다. 역전사 반응은 42℃에서 2시간 동안 수행하였으며, 0.5 M NaOH와 50 mM EDTA를 첨가하여 반응을 정지시키고, 70 ℃에서 15분 동안 열처리하여 DNA/RNA 혼성물을 변성시킨 다음, 0.5 M HCl을 첨가하여 반응을 중화시켰으며, 위의 반응액을 Minielute PCR 정제키트(QIAGEN, USA)을 사용하여 cDNA를 분리 농축하였다. 이후, 상기 합성한 cDNA를 주형으로 DR_0070 유전자 내부의 서열(서열번호 1: 5‘-TAAGGAGGAGGCAGATGTTG-3' 및 서열번호 2: 5‘-CGATGGGAAACTGGTAGCC-3')을 포함하는 프라이머를 이용한 RT-PCR(94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초)을 SYBRPremix Ex TaqTM(Takara Biotechnology, Japan)과 SmartCycler II(Cepheid, USA)를 사용하여 중금속을 처리하지 않은 세포와 중금속을 처리한 세포에서 DR_0070 유전자의 발현율을 측정하였다.Specifically, wild-type Dayococcus radiodurans (Rural Genetic Resources Information Center, Deinococcus radiodurans , KACC No. 12248) was suspended in TGY broth (0.5% tryptone, 0.2% yeast extract, 0.02% glucose) at 30 ° C. for 24 hours (200 rpm). Re-inoculate the preculture with 1% fresh media and incubate to log growth (OD 600 = 0.6, ˜1 × 10 8 cells / L), followed by cadmium chloride (CdCl 2 ), chromium chloride (CrCl 3 ), and lead chloride (PbCl 2 ), nickel chloride (NiCl 2 ), zinc chloride (ZnCl 2 ), iron chloride (FeCl 2 ), copper chloride (CuCl 2 ), arsenic chloride (AsCl 3 ), manganese chloride (MnCl 2 ), and mercuric chloride ( HgCl 2 ) were each added at a concentration of 10 uM, followed by incubation for 1 hour, followed by centrifugation of 5 ml of the culture to remove the supernatant and recovering the cultured cells. Thereafter, 1 ml of RiboEx solution (GeneAll Biotechnology, Korea) and 0.1 mm zirconia / silica bead were added to the recovered cells, and then the cells were pulverized using a bead beater (Bertin Technoligies, France). And total RNA was extracted. Reverse transcriptase was added to 10 [mu] g of total RNA, heated and cooled at 70 [deg.] C., and a mixture of reverse transcriptase, dNTP, and reverse transcriptase was added. Reverse transcription was carried out at 42 ° C. for 2 hours, the reaction was stopped by addition of 0.5 M NaOH and 50 mM EDTA, heat treated at 70 ° C. for 15 minutes to denature DNA / RNA hybrids, and then 0.5 M HCl was added. The reaction was neutralized, and the reaction solution was concentrated using a Minielute PCR Purification Kit (QIAGEN, USA). Subsequently, RT-PCR (94) using a primer containing a sequence inside the DR_0070 gene (SEQ ID NO 1: 5'-TAAGGAGGAGGCAGATGTTG-3 'and SEQ ID NO: 2: 5'-CGATGGGAAACTGGTAGCC-3') as a template using the synthesized cDNA DR_0070 gene was used in SYBRPremix Ex TaqTM (Takara Biotechnology, Japan) and SmartCycler II (Cepheid, USA) for the treatment of heavy metals and cells treated with heavy metals. The expression rate of was measured.
그 결과, 데이노코커스 레디오듀란스의 DR_0070 유전자는 다른 중금속 처리시에는 대조군과 비교하여 그 발현율에 큰 차이가 없었으나, 카드뮴에는 그 발현율이 특이적으로 매우 높게 나타났다(도 1).
As a result, the DR_0070 gene of Dinococcus radiodurans showed no significant difference in the expression rate when treated with other heavy metals compared to the control group, but the expression rate was particularly high in cadmium (FIG. 1).
<< 실시예Example 2> DR_0070 유전자의 프로모터 및 β- 2> promoter and β- of the DR_0070 gene 갈락토시다제Galactosidase 유전자( gene( lacZlacZ )를 포함하는 바이오센서의 제조Preparation of a biosensor comprising
DR_0070 유전자의 프로모터 및 β-갈락토시다제 유전자(lacZ)를 포함하는 전세포 바이오센서를 제조하기 위하여, 먼저 DR_0070 유전자의 프로모터를 포함하는 재조합 플라스미드를 제조하고, 이를 세포에 형질전환하였다.In order to prepare a whole-cell biosensor comprising a promoter of the DR_0070 gene and a β-galactosidase gene ( lacZ ), a recombinant plasmid comprising a promoter of the DR_0070 gene was first prepared and transformed into cells.
구체적으로, pRADZ3(Meima R. et al., Appl. Environ. Microbiol., 66, 3856-3867, (2000))에 DR_0070 유전자의 프로모터를 연결하기 위하여, DR_0070 유전자에 특이적인 PCR 프라이머(서열 3: 5‘-TCAAGATCTCTTATCGAGTGCGTGCACT-3’및 서열번호 4: 5‘-GTAACTAGTCTTTCATGCTCCACGTTCA-3’)에 DR_0070 정방향 프라이머(서열번호 3) 말단에는 BglII, DR_0070 역방향 프라이머(서열번호 4) 말단에는 SpeI 제한효소 인식서열을 첨가하여 제작하였다. 데이노코커스 레디오듀란스의 게놈 DNA를 주형으로 상기 두 프라이머 및 TaKaRa LA TaqTM kit(Takara Biotechnology, Japan)를 사용하여 중합효소 연쇄반응(94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초)을 30회 수행하였다. 상기 반응액을 Minielute PCR 정제 키트(QIAGEN, USA)을 사용하여 267 bp 길이의 DR_0070 유전자의 프로모터 DNA(0070p)를 분리 농축하였으며, 상기 0070p를 BglII와 SpeI 제한효소로 처리하여 절단한 후, Minielute PCR 정제키트(QIAGEN, USA)을 사용하여 정제하였다. 이후, 발현벡터인 pRADZ3는 BglII와 SpeI 제한효소로 처리한 후 절단하여 아가로즈 젤 상에서 전기영동을 한 후 lacZ 유전자에 연결된 프로모터가 제거된 벡터 부위를 Gel extraction kit(QIAGEN, USA)를 사용하여 정제하였다. 제한효소 처리 후 정제된 프로모터 DNA와 pRADZ3 벡터를 T4 DNA 리가제(Takara Biotechnology, Japan)를 사용하여 연결하여 0070p::pRADZ3 재조합 플라스미드를 제작하였다(도 2). 상기 재조합 플라스미드를 데이노코커스 야생형에 형질전환하여 카드뮴 바이오센서용 형질전환체 KDH049를 제조하였다.
Specifically, in order to link the promoter of the DR_0070 gene to pRADZ3 (Meima R. et al., Appl. Environ. Microbiol., 66, 3856-3867, (2000)), PCR primers specific for the DR_0070 gene (SEQ ID NO: 3). Add 5'-TCAAGATCTCTTATCGAGTGCGTGCACT-3 'and SEQ ID No. 4: 5'-GTAACTAGTCTTTCATGCTCCACGTTCA-3') to the end of DR_0070 forward primer (SEQ ID NO: 3) and to the end of Sgl I restriction enzyme at the end of BglII and DR_0070 reverse primer (SEQ ID NO: 4) It was produced by. Polymerase chain reaction using the two primers and TaKaRa LA Taq ™ kit (Takara Biotechnology, Japan) as a template using the genome DNA of Dinococcus radidiodurans (94 °
<< 실험예Experimental Example 1> 1> 바이오센서의 카드뮴 특이성 확인Confirmation of cadmium specificity of biosensor
본 발명의 바이오센서의 카드뮴 특이성을 확인하기 위하여, 상기 <실시예 2>에서 제조된 형질전환체 KDH049를 배양한 후, 염화카드뮴(CdCl2), 염화크롬(CrCl3), 염화납(PbCl2), 염화니켈(NiCl2), 염화아연(ZnCl2), 염화철(FeCl2), 염화구리(CuCl2), 염화비소(AsCl3), 염화망간(MnCl2), 및 염화수은(HgCl2)을 각각 10 uM 농도로 첨가하였으며, 이후, 1시간 동안 배양한 다음, 배양하고 얻어진 배양액 1 ml을 원심분리하여 상등액을 제거한 다음, 세포를 회수하였다. 상기 회수한 세포에 100 ㎕의 세포 용해를 위한 완충용액(10 mM TRIS-HCl (pH 8), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1.5 %(w/v) SDS, 2.5 %(v/v) Triton X100)을 첨가하여 세포를 용해시키고, 10분간 30℃ 수조에 정치하였다. 이후, Sommer의 방법(Sommer S. et al., Mol. Gen. Genet. 198, 456464, (1985))을 이용하여 상기 용해된 세포 내 β-갈락토시다제 활성을 측정하였다. In order to confirm the cadmium specificity of the biosensor of the present invention, the <Example 2> After incubation, the prepared transformant KDH049 from chloride, cadmium (CdCl 2), chloride, chromium (CrCl 3) chloride, lead (PbCl 2 ), Nickel chloride (NiCl 2 ), zinc chloride (ZnCl 2 ), iron chloride (FeCl 2 ), copper chloride (CuCl 2 ), arsenic chloride (AsCl 3 ), manganese chloride (MnCl 2 ), and mercury chloride (HgCl 2 ) Each was added at a concentration of 10 uM, then incubated for 1 hour, and then cultured and 1 ml of the obtained culture was centrifuged to remove the supernatant, and then the cells were recovered. 100 μl of cell lysis solution (10 mM TRIS-HCl, pH 8), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1.5% (w / v) SDS, 2.5% (v / v) Triton X100) was added to lyse the cells and allowed to stand in a 30 ° C. water bath for 10 minutes. Then, the lysed intracellular β-galactosidase activity was measured using Sommer's method (Sommer S. et al., Mol. Gen. Genet. 198, 456464, (1985)).
그 결과, DR_0070의 프로모터 0070p는 카드뮴에만 매우 특이적으로 반응하고 다른 중금속(염화크롬(CrCl3), 염화납(PbCl2), 염화니켈(NiCl2), 염화아연(ZnCl2), 염화철(FeCl2), 염화구리(CuCl2), 염화비소(AsCl3))에는 거의 반응하지 않는 것으로 나타났으며(도 3), 본 발명의 바이오센서는 카드뮴에서 특이적으로 반응함을 확인하였다.
As a result,
<< 실험예Experimental Example 2> 2> 바이오센서의 카드뮴 민감도 확인 Check the Cadmium Sensitivity of the Biosensor
본 발명의 바이오센서의 카드뮴에 대한 민감도를 확인하기 위하여, 바이오센서의 카드뮴 농도에 따른 발현 양상을 확인하였다. In order to confirm the sensitivity of the biosensor of the present invention to cadmium, the expression pattern according to the cadmium concentration of the biosensor was confirmed.
구체적으로, 상기 <실시예 2>에서 제조된 형질전환체 KDH049를 TGY 액상배지에 24시간 동안 30℃에서 현탁배양하였다(200 rpm). 이후, 상기 전배양액을 새로운 배지 부피의 1%가 되게 재접종하고 대수 생장기(OD600=0.6, ~1×108 cells/L)까지 배양한 후 염화카드뮴(CdCl2)을 1nM, 10uM, 100nM, 200nM, 500nM, 1uM, 5uM 및 10uM 농도로 첨가하고 무첨가 대조군과 동일하게 1 시간 동안 배양한 다음, 얻어진 배양액 1 ml을 원심분리하여 상등액을 제거하고 세포를 회수하였다. 이후, Sommer의 방법(Sommer S. et al., Mol. Gen. Genet. 198, 456464, (1985))을 이용하여 상기 회수한 세포의 β-갈락토시다제 활성을 측정하였다. Specifically, the transformant KDH049 prepared in Example 2 was suspended in TGY broth for 24 hours at 30 ° C. (200 rpm). Then, the preculture was reinoculated to 1% of the fresh medium volume and incubated to the logarithmic growth period (OD 600 = 0.6, ˜1 × 10 8 cells / L), followed by cadmium chloride (CdCl 2 ) in 1 nM, 10 uM, 100 nM. , 200 nM, 500 nM, 1 uM, 5 uM and 10 uM concentration was added and incubated for 1 hour in the same manner as the no addition control, and then 1 ml of the obtained culture was centrifuged to remove the supernatant and cells were recovered. Then, β-galactosidase activity of the recovered cells was measured using Sommer's method (Sommer S. et al., Mol. Gen. Genet. 198, 456464, (1985)).
그 결과, 10 nM 이하의 카드뮴 농도에서는 0070p의 발현이 아주 낮게 나타났으나, 카드뮴 100 nM부터 5 uM 농도로 처리한 실험군에서는 0070p의 발현이 카드뮴 농도 증가에 따라 점진적으로 증가하는 것으로 나타났으며(도 4), 본 발명의 바이오센서는 낮은 카드뮴 농도에서도 그 발현이 증가하여, 카드뮴에 대해 높은 민감도를 지니고 있음을 확인하였다.
As a result, the expression of 0070p was very low at the concentration of cadmium below 10 nM, but the expression of 0070p was gradually increased as the concentration of cadmium increased in the experimental group treated with 100 nM to 5 uM of cadmium. 4), it was confirmed that the biosensor of the present invention increases its expression even at a low cadmium concentration, and has a high sensitivity to cadmium.
<< 실험예Experimental Example 3> 3> 바이오센서의 카드뮴 처리 시간에 따른 발현 양상 확인Expression of biosensor according to cadmium treatment time
본 발명의 바이오센서의 카드뮴 처리 시간에 따른 발현 양상을 확인하기 위하여, 바이오센서에 카드뮴을 처리하고 0070p의 시간에 따른 발현율을 측정하였다.In order to confirm the expression pattern according to the cadmium treatment time of the biosensor of the present invention, the cadmium was treated in the biosensor and the expression rate over time of 0070p was measured.
구체적으로, 상기 <실시예 2>에서 제조된 형질전환체 KDH049를 배양한 후, 전배양액을 새로운 배지 부피에 1 %로 재접종하고, 대수 생장기(OD600=0.6, ~1×108 cells/L)까지 배양하였다. 이후, 상기 배양액에 염화카드뮴(CdCl2) 5 uM을 첨가하고 무첨가 대조군과 동일하게 0분, 15분, 30분, 1시간, 그리고 2시간 동안 배양한 다음, 배양액 1 ml을 원심분리하여 상등액을 제거하고 세포를 회수하였다. 이후, Sommer의 방법(Sommer S. et al., Mol. Gen. Genet. 198, 456464, (1985))을 이용하여 상기 회수한 세포의 β-갈락토시다제 활성을 측정하였다. Specifically, after culturing the transformant KDH049 prepared in <Example 2>, the pre-culture was re-inoculated to 1% in a fresh medium volume, logarithmic growth period (OD 600 = 0.6, ~ 1 × 10 8 cells / Incubated to L). Subsequently, 5 uM of cadmium chloride (CdCl 2 ) was added to the culture solution, and incubated for 0 minutes, 15 minutes, 30 minutes, 1 hour, and 2 hours in the same manner as the non-added control group, and then 1 ml of the culture solution was centrifuged to remove the supernatant. Removed and recovered cells. Then, β-galactosidase activity of the recovered cells was measured using Sommer's method (Sommer S. et al., Mol. Gen. Genet. 198, 456464, (1985)).
그 결과, 0070p의 발현이 시간이 증가함에 따라 점진적으로 증가하는 것으로 나타났으며(도 5), 이를 통해, 본 발명의 바이오센서에서 0070p의 발현이 카드뮴의 농도에 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다.
As a result, it was found that the expression of 0070p gradually increases with time (FIG. 5). Through this, it was confirmed that the expression of 0070p increased depending on the concentration of cadmium in the biosensor of the present invention.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 데이노코커스 레디오듀란스의 DR_0070 유전자의 프로모터를 포함하는 바이오센서는 인체 및 환경에 대한 카드뮴 바이오센서 및 세포 기반 바이오센서로서 매우 유용하게 이용될 수 있다.As described above, the biosensor including the promoter of the DR_0070 gene of the Dinococcus radidiodurans of the present invention may be very useful as a cadmium biosensor and a cell-based biosensor for humans and the environment.
<110> Korea Atomic Energy Research Institute <120> Biosensor for detecting cadmium and the manufacturing method thereof <130> 10p-10-13 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR_0070 gene forward primer <400> 1 taaggaggag gcagatgttg 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR_0070 gene reverse primer <400> 2 cgatgggaaa ctggtagcc 19 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR_0070 gene promoter forward primer <400> 3 tcaagatctc ttatcgagtg cgtgcact 28 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR_0070 gene promoter reverse primer <400> 4 gtaactagtc tttcatgctc cacgttca 28 <210> 5 <211> 267 <212> DNA <213> Deinococcus radiodurans <220> <221> promoter <222> (1)..(267) <223> DR_0070 gene promoter sequence <400> 5 cttatcgagt gcgtgcactg cggcttgcag cgccgggtga ccatgcccag cctccctgct 60 ccagcgcccg cccgcaaacc cgagcggcgg ctgttcgggc tcttgcgaat ctgaaggtct 120 tggtgcccgg cctctgctgg gaggcgggac actggcaccg gcttccccga tgtgttatgt 180 tatttacgta aggaggaggc agatgttgca gattgaattt atcaccgacc tgggtgcgcg 240 ggtcacggtg aacgtggagc atgaaag 267 <110> Korea Atomic Energy Research Institute <120> Biosensor for detecting cadmium and the manufacturing method the <130> 10p-10-13 <160> 5 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR_0070 gene forward primer <400> 1 taaggaggag gcagatgttg 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR_0070 gene reverse primer <400> 2 cgatgggaaa ctggtagcc 19 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR_0070 gene promoter forward primer <400> 3 tcaagatctc ttatcgagtg cgtgcact 28 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DR_0070 gene promoter reverse primer <400> 4 gtaactagtc tttcatgctc cacgttca 28 <210> 5 <211> 267 <212> DNA <213> Deinococcus radiodurans <220> <221> promoter (222) (1) .. (267) <223> DR_0070 gene promoter sequence <400> 5 cttatcgagt gcgtgcactg cggcttgcag cgccgggtga ccatgcccag cctccctgct 60 ccagcgcccg cccgcaaacc cgagcggcgg ctgttcgggc tcttgcgaat ctgaaggtct 120 tggtgcccgg cctctgctgg gaggcgggac actggcaccg gcttccccga tgtgttatgt 180 tatttacgta aggaggaggc agatgttgca gattgaattt atcaccgacc tgggtgcgcg 240 ggtcacggtg aacgtggagc atgaaag 267
Claims (15)
Recombinant transformants transformed with an expression vector comprising a promoter of the DR_0070 gene of Deinococcus radiodurans of SEQ ID NO: 5 and a reporter gene operably linked to the promoter of the DR_0070 gene Cadmium specific detection biosensor comprising a.
2) 상기 단계 1)의 발현 벡터를 숙주세포에 형질전환시킨 재조합 형질전환체를 포함하는 카드뮴 검출용 바이오센서를 제조하는 단계를 포함하는 카드뮴 특이적 검출용 바이오센서의 제조 방법.
1) Expression comprising a gene construct comprising a promoter of the DR_0070 gene of Deinococcus radiodurans as set forth in SEQ ID NO: 5 and a reporter gene operably linked to the promoter of the DR_0070 gene Preparing a vector; And
2) A method of manufacturing a cadmium specific detection biosensor comprising the step of preparing a cadmium detection biosensor comprising a recombinant transformant transformed with the expression vector of step 1) to a host cell.
The method of claim 9, wherein the reporter gene of step 1) is a gene encoding β-galactosidase (galactosidase, lacZ).
The method of claim 9, wherein the host cell of step 2) is Deinococcus radiodurans .
2) 상기 단계 1)의 바이오센서를 통해 서열번호 5로 기재되는 DR_0070 유전자의 프로모터의 작동에 의한 리포터 유전자의 발현 정도를 측정하는 단계를 포함하는 시료 내 카드뮴 특이적 검출 방법.
1) exposing the test sample to the biosensor of claim 8; And
2) cadmium specific detection method in a sample comprising the step of measuring the expression level of the reporter gene by the operation of the promoter of the DR_0070 gene described in SEQ ID NO: 5 through the biosensor of step 1).
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| Christopher Rensing 등. Ecotoxicology and Environmental Safety. 2003. Vol. 56, No. 1, 페이지 140-147. * |
| Christopher Rensing 등. Ecotoxicology and Environmental Safety. 2003. Vol. 56, No. 1, 페이지 140-147.* |
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