KR101243696B1

KR101243696B1 - 병원성 미생물의 의사소통 저해제 및 이를 이용한 항균 조성물

Info

Publication number: KR101243696B1
Application number: KR1020120054269A
Authority: KR
Inventors: 최상호; 김병식; 김원빈; 임동렬; 김명희
Original assignee: 서울대학교산학협력단; 한국생명공학연구원; 세종대학교산학협력단
Priority date: 2012-05-22
Filing date: 2012-05-22
Publication date: 2013-03-15

Abstract

본 발명의 1-(5-브로모티오펜-2-설포닐)-1H-피라졸{1-(5-bromothiophene-2-sulfonyl)-1H-pyrazole} 화합물은 쿼럼센싱에 관여하는 SmcR 단백질에 직접적으로 결합하여, SmcR 단백질이 병원성 관련 표적(target) DNA에 결합하지 못하도록 한다. 이를 통해 병원성 관련 유전자의 발현을 차단하며, 궁극적으로 관련 질병의 발병을 억제(예방 또는 치료)할 수 있는데, 내성 유발의 문제로 인해 그 사용이 통제되고 있는 일반적 항생제를 대체하여 사용될 수 있다.

Description

병원성 미생물의 의사소통 저해제 및 이를 이용한 항균 조성물{Quorum sensing inhibitor against pathogenic microorganism and antibiotic composition therefrom}

본 발명은 병원성 미생물의 의사소통 저해제 및 이를 이용한 항균 조성물에 관한 것으로서, 병원성 미생물 상호 간의 의사소통을 저해하여 해당 미생물이 병원성을 띄지 못하게 함으로써, 해당 미생물이 일으키는 감염 또는 질병을 예방하거나 치료하기 위한 것이다.

다양한 세균들은 확산성의 신호전달 물질(autoinducer; AI)을 합성하여 분비하고, 이를 다시 인지함으로써 동족(同族)의 수를 감지한다. 이와 같은 과정을 통해 병원성균은 호스트 내에서 해당 균이 가지고 있는 병원성을 띄게 되고, 결국 호스트에 대해 감염성 질병을 유발하게 된다.

세균 의사소통 기작(quorum sensing)이라고 알려진 이런 현상의 자세한 메커니즘은 각 세균의 종마다 상이하다 (참고문헌 1). 전형적인 쿼럼센싱 시스템(LuxRI system)에서는, AI들이 LuxI 계열의 생성효소(synthase)에 의해 합성되고, 세포 밖에 축적되는데, 특정 농도 이상이 되었을 때, 다시 세포 내로 확산하여 들어와 수용체(receptor) 단백질, 즉 LuxR _Vf 계열의 전자조절인자에 결합한다. 이와 같은 시스템은 비브리오 피쉐리(Vibrio fischeri), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 등 많은 그람 음성균에서 발견된다.

한편, 스타필로코쿠스 아루에우스(Staphylococus aureus), 비브리오 하르베이(V. harveyi), 비브리오 콜레라에(V. cholerae) 등의 몇몇 그람 양성균 및 음성균에 의해 생성되는 특정 AI들은 세균의 막에 존재하는 수용체(receptor) 단백질에 의해 감지가 되고, 이런 감지 시그널이 순차적인 단계경로(cascade)를 따라 세포 내부의 조절인자로 전해진다.

식중독균인 패혈증 비브리오균은 상기 비브리오 하르베이(V. harveyi)의 쿼럼센싱 시스템 구성 단백질들과 유사한 단백질들로 이루어진 쿼럼센싱 시스템을 지니고 있는데, 특히 LuxR _Vh 와 유사한 최종 주요 전사 조절자인 SmcR을 지니고 있다 (참고문헌 2).

세균들은 상기와 같은 쿼럼센싱 기작을 통해 새로운 환경에의 적응 및 생존에 필요한 생체발광(bioluminescence), 생물막 형성, 포자 형성 등의 다양한 생리 현상들을 조절한다. 많은 병원균들에서 독성인자의 생성 또한 쿼럼센싱에 의해 조절되는데, 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa)의 엘라스토리틱 프로테아제(elastolytic protease)인 LasA와 LasB, 그리고 버콜데리아 글루매(Burkholderia glumae)의 토톡스플라빈(toxoflavin) 등이 대표적인 예이다.

따라서, 세균의 쿼럼센싱 시스템을 저해함으로써 병원균의 발병을 조절하려는 시도가 다양하게 이루어져 왔다. 하지만, 비브리오 종에 대한 이러한 시도는 거의 이루어지지 않은 실정이다.

그런데, 패혈증 비브리오균의 잠재적 독성인자인 엘라스타아제(elastase)의 발현이 SmcR에 의해 직접적으로 촉진되며, 그 외에도 최소 121개의 유전자들의 발현이 SmcR에 의해 직접적으로 조절되는 것으로 예상되기 때문에, SmcR 저해를 통한 패혈증 비브리오균의 쿼럼센싱 저해는 패혈증 비브리오균에 의한 발병을 조절하기 위한 좋은 전략이 될 수 있다.

대한민국 특허공개번호 제10-2011-0067148호 (2011년 06월 21일 공개)에는 "다른 항균 화합물이 부가된 질화 헤테로사이클릭 항균 화합물의 신규한 배합 및 약품으로서의 이들의 용도"가 기재되어 있는데, 미생물의 감염 질환에 대해 효과적이라는 점에서 본원발명과 유사점이 있으나, 본원발명이 패혈증 비브리오에 대해 효과적인 반면, 상기 공개문헌은 슈도모나스 속의 미생물에 대해 효과적이라는 점에서 차이가 있고, 그 작용 기전 또한 쿼럼센싱의 억제를 통해 병원성화를 컨트롤하고자 하는 본원발명과 현저한 차이가 있다.

본 발명에서는 독성인자의 발현에 중요한 역할을 하는 SmcR 단백질을 저해할 수 있는 물질을 찾아, SmcR 단백질의 저해를 통해 세균 내 독성인자의 발현을 억제함으로써, 궁극적으로 해당 미생물에 의한 감염 및 관련 질환의 발명을 억제할 수 있는 방안을 제공하고자 한다.

비브리오 파라헤메오라이티쿠스(V. parahemeolyticus) OpaR, 비브리오 안구일라룸(V. anguillarum) VanT, 비브리오 콜레라에(V. cholerae) HapR 및 비브리오 불니피쿠스(V. vulnificus ) SmcR과 같은 LuxR _Vh 동족체(homologue)들은, 범용적 조절인자(global regulator)로서, 비브리오 종들의 생존과 발병에 영향을 미치는 다양한 유전자들을 조절한다.

그런데, 많은 연구들에서 qrr이나 AphA와 같은 LuxR _Vf 의 발현을 조절하는 인자들에 대해서는 밝혀졌지만, LuxR _Vh 의 활성을 조절하는 인자 또는 그 메커니즘은 지금까지 연구되거나 알려진 것이 거의 없다. 이는 LuxR _Vf 동족체들과 달리 LuxR _Vh 동족체들은 그들의 AI와 결합하지 않으며, 발현량이 조절되는 특성이 있기 때문에, 그들에 대한 조절 인자를 찾으려는 시도가 상대적으로 적었기 때문으로 생각된다.

본 발명은 SmcR의 3차원 입체구조를 확인하면서부터 시작되었다. 다른 TetR계열의 조절자들과 마찬가지로 SmcR은 각 모노머(monomer)의 다이머라이제이션 도메인(dimerization domain) 안에 잠재적인 리간드-바인딩 포켓(ligand-binding pocket)을 지니고 있었다 [도 1].

TetR/tetracycline 혹은 IcaR/gentamicin처럼 작은 분자량의 리간드들은 TetR 계열의 조절인자(regulator)에 결합하고, 그것을 DNA로부터 떨어뜨려 내기 때문에, SmcR에 결합해 그 활성을 저해하는 저분자 화합물도 존재할 것이라고 가정하였다.

본 발명의 고속 대량 탐색 실험에서는 SmcR를 발현하는 플라스미드와 SmcR에 의존적인 리포터 플라스미드를 동시에 지니는 대장균 시스템을 구축하여 이용하였다. 이를 통해, 만약 패혈증 비브리오균 자체를 이용했을 때 문제가 될 수 있는 점, 즉 SmcR이 아닌 다른 쿼럼센싱 구성 성분 저해제의 발견을 미리 회피하고자 한 것이다.

본 발명의 실험을 통해 발견한 하기 화학식 1의 구조를 갖는 SmcR 저해제 377B6 화합물은, SmcR에 직접적으로 결합함으로써 그 활성을 저해함이 확인되었다.

[화학식 1]

상기 화합물은 ITC 실험에서 SmcR과 2개 위치 결합 모델(two-site binding model)로 결합함이 예측되었는데, 이는 SmcR 다이머(dimer)에 두 개의 잠재적인 리간드-바인딩 포켓(ligand-binding pocket)이 존재한다는 사실과 부합하는 결과이다. 이 포켓이 양친매성(amphipathic)이라는 점을 고려할 때, 377B6의 프로톤화된 질소(protonated nitrogen)와 설포닐 그룹(sulfonyl group)은 SmcR의 친수성 잔기들과 상호작용할 것이며, 브롬(brome)과 같은 화합물의 소수성 부분은 SmcR의 소수성 잔기들과 상호 반응함을 예상할 수 있다. 377B6화합물 한 분자가 이 포켓에 결합할 때 발생하는 이와 같은 상호작용은 SmcR의 DNA 바인딩 도메인의 구조를 변화시킴으로써, DNA로부터 SmcR을 떨어뜨려 내는 것으로 여겨지며, 또한 다른 모노머(monomer)의 구조도 변화시키는 것으로 예상된다. 이와 같은 예상은 ITC 실험 결과 첫 번째 위치에 대한 결합력이 두 번째 위치 대한 결합력에 비해 약 10배 정도 더 강한 것을 바탕으로 한다.

한편, LuxR _Vh 동족체들은 그 구조가 서로 간에 굉장히 비슷하고, 특히 잠재적인 리간드-바인딩 포켓을 이루는 잔기들이 잘 보존되어 있기 때문에, 377B6 화합물은 이들 동족체들 역시 저해할 수 있을 것이라고 생각된다.

LuxR _Vh 동족체의 저해는 비브리오 종들에 있어 쿼럼센싱을 조절하는 가장 효과적인 방법인데, 그 이유는 이들 단백질들이 비브리오 종들에서 쿼럼센싱 주요 조절자(master regulator)로서, AI의 종류에 상관없이 신호전달단계(signaling cascade)의 가장 마지막 단계에서 역할하고 있기 때문이다. 만약, 비브리오 종의 쿼럼센싱을 조절하기 위해 AI 생성효소(synthase)나 막에 존재하는 AI 수용체(receptor)를 저해하는 전략을 사용한다면, 한 종 내에서도 여러 종류의 AI가 존재하는 특성 때문에, 모든 종류의 AI 생성효소 또는 수용체를 저해야만 모든 비브리오 종의 쿼럼센싱을 막을 수 있는 한계가 있는 것이다.

패혈증 비브리오균의 독성인자, 그리고 다양한 적응 및 생존 인자를 조절하는 SmcR을 저해하는 본 발명의 화학식 1에 기재된 화합물 377B6은 패혈증 비브리오균의 쿼럼센싱, 더 나가 그 발병을 조절하는 약으로 개발될 가능성을 보여준다. 특히 도 9에서 알 수 있듯이, 이 화합물은 세포에 대한 독성이 없기 때문에 그 가능성이 더욱 높은 것이다.

또한, 패혈증 비브리오균의 시험관 내(in vitro) 성장을 저해하지 않는다는 특징[도 7]은, 이 화합물이 항생제로 사용되었을 경우 항생제 내성을 유발시키지 않을 것임을 예상하게 해 주며, 현재 문제가 되고 있는 내성 유발 항생제를 대체할 수 있는 신약으로의 가능성을 보여주는 것이다.

이에 본 발명은 상기 화학식 1의 구조를 갖는 1-(5-브로모티오펜-2-설포닐)-1H-피라졸{1-(5-bromothiophene-2-sulfonyl)-1H-pyrazole}을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 SmcR 단백질 저해제(protein inhibitor)를 제공한다.

SmcR은 패혈증 비브리오균의 잠재적 독성인자인 엘라스타아제(elastase)의 발현을 직접적으로 촉진하며, 그 외에도 최소 121개의 유전자들의 발현이 SmcR에 의해 직접적으로 조절되는 것으로 보고되고 있다.

본 발명의 실험에 의할 경우, 본 발명의 화학식 1의 구조를 갖는 화합물이 SmcR에 결합하여 그 작용을 억제함이 확인되었다. 이와 같은 사실의 확인으로부터 본 발명의 화학식 1의 구조를 갖는 화합물은 SmcR의 억제제로 사용될 수 있는데, 이는 실험실 수준의 여러 실험에서, 본 발명 화학식 1의 구조를 갖는 화합물이 SmcR의 억제제로 사용될 수 있고, 더 중요하게는 피브리오 패혈증 관련 질환의 예방 및 억제용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있음을 의미한다.

한편, 본 발명은 상기 화학식 1의 구조를 갖는 1-(5-브로모티오펜-2-설포닐)-1H-피라졸{1-(5-bromothiophene-2-sulfonyl)-1H-pyrazole}을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항균 조성물을 제공한다.

본 발명의 화학식 1의 구조를 갖는 1-(5-브로모티오펜-2-설포닐)-1H-피라졸{1-(5-bromothiophene-2-sulfonyl)-1H-pyrazole}은 SmcR 단백질을 저해함이 확인되었다. SmcR 단백질이 저해되면, 세균은 쿼럼센싱 기작에 장애가 발생하여 병원성 특성을 나타내지 못하게 된다.

쿼럼센싱 기작의 장애는 해당 병원성 미생물의 생육 억제, 더 나아가 사멸까지를 의미하는 것은 아니지만, 해당 미생물의 병원성 발현을 억제할 수 있기 때문에, 이는 실질적으로 해당 세균에 대한 포괄적 항균성을 의미할 수 있다. 따라서, 본 발명의 화학식 1의 구조를 갖는 화합물은 항균 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있는 것이다.

본 발명의 항균 조성물에 있어서, 상기 1-(5-브로모티오펜-2-설포닐)-1H-피라졸{1-(5-bromothiophene-2-sulfonyl)-1H-pyrazole}은, 바람직하게 세균 간 의사소통 기작(quorum sensing)을 방해함으로써, 병원성 세균이 병원성을 나타내지 못하게 하는 것이다.

한편, 본 발명의 항균 조성물은, 일 예로 항 패혈증 비브리오 조성물일 수 있다. 즉, 패혈증 비브리오 균에 대해 적용될 수 있는 것이다. 하지만, 본 발명 화학식 1의 화합물이 유전자의 조절에 관여하는 SmcR 단백질의 작용을 저해함으로써 세균의 쿼럼센싱을 저해하고, 이를 통해 병원성의 발현을 억제하는 것으로 명확히 규명되었기 때문에, 본 발명은 패혈증을 일으키는 비브리오 균에만 국한되지 않고, 병원성 기작의 발현이 LuxR _Vh 동족체에 의해 매개되는 다른 세균에도 당연히 적용 가능하다.

한편, 본 발명의 항균 조성물은, 일 예로, 약학 조성물 또는 식품 조성물 또는 식품 첨가제 조성물 또는 사료 조성물일 수 있다.

본 발명의 항균 조성물에 있어, 1-(5-브로모티오펜-2-설포닐)-1H-피라졸{1-(5-bromothiophene-2-sulfonyl)-1H-pyrazole}의 유효 농도는 섭취 대상의 상태, 연령, 건강상태 등의 다양한 요인을 고려하여 가감될 수 있다.

한편, 본 발명의 항균 조성물 중 약학 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 1-(5-브로모티오펜-2-설포닐)-1H-피라졸{1-(5-bromothiophene-2-sulfonyl)-1H-pyrazole}를 바람직하게 0.1 내지 50 % 중량으로 포함할 수 있고, 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 더욱 상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물에 있어, 1-(5-브로모티오펜-2-설포닐)-1H-피라졸{1-(5-bromothiophene-2-sulfonyl)-1H-pyrazole}의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라 달라질 수 있다, 일반적으로 0.01 내지 500 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 다만, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 독성이 없는 것으로 확인되었기 때문에 안심하고 사용할 수 있다.

한편, 본 발명의 조성물은 식품 첨가제 조성물 또는 식품 조성물일 수 있는데, 1-(5-브로모티오펜-2-설포닐)-1H-피라졸{1-(5-bromothiophene-2-sulfonyl)-1H-pyrazole}을 유효성분으로 함유하는 항균 식품 조성물 또는 항균 식품 첨가물 조성물 형태로 제공될 수 있다.

상기 식품 첨가제 또는 식품 조성물은 1-(5-브로모티오펜-2-설포닐)-1H-피라졸{1-(5-bromothiophene-2-sulfonyl)-1H-pyrazole}을 함유하기만 하면, 그 제형에 특별히 국한되지 않는다. 일 예로 병원성 비브리오에 의해 오염되어 패혈증을 일으키기 쉬운 식품 또는 그 가공품일 수 있다.

본 발명의 화합물 1-(5-브로모티오펜-2-설포닐)-1H-피라졸{1-(5-bromothiophene-2-sulfonyl)-1H-pyrazole}을 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있으며, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다. 이때, 식품 또는 식품 첨가제 중의 상기 화합물의 양은, 일반적으로 식품 전체 중량의 0.01 내지 15 중량%로 첨가할 수 있으며, 음료 조성물의 경우 100 mL를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다. 하지만, 상기의 범위에 반드시 국한되는 것은 아니다.

본 발명의 식품 조성물 중 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한 점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린; 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

그밖에 본 발명의 식품 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만, 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

한편, 본 발명은 1-(5-브로모티오펜-2-설포닐)-1H-피라졸{1-(5-bromothiophene-2-sulfonyl)-1H-pyrazole}를 함유하는 사료 조성물 또는 사료 첨가제 조성물을 제공한다. 상기 사료 첨가제 또는 사료 조성물은 1-(5-브로모티오펜-2-설포닐)-1H-피라졸{1-(5-bromothiophene-2-sulfonyl)-1H-pyrazole}을 함유하기만 하면 그 제형에 국한되지 않는다. 일 예로는, 병원성 비브리오에 감염되기 쉬운 동물, 특히 어류 등을 대상으로 하는 사료 첨가제 또는 사료이면 더욱 바람직하다.

본 발명에서 발굴한 화학식 1의 구조를 갖는 1-(5-브로모티오펜-2-설포닐)-1H-피라졸{1-(5-bromothiophene-2-sulfonyl)-1H-pyrazole} 화합물은 쿼럼센싱에 관여하는 SmcR 단백질에 직접적으로 결합하여, SmcR 단백질이 병원성 관련 표적(target) DNA에 결합하지 못하도록 한다. 이를 통해 병원성 관련 유전자의 발현을 차단하며, 궁극적으로 관련 질병의 발병을 억제(예방 또는 치료)할 수 있는데, 내성 유발의 문제로 인해 그 사용이 통제되고 있는 일반적 항생제를 대체하여 사용될 수 있다.

도 1은 SmcR 단백질의 3차 구조 분석결과를 보여준다. 두 개의 잠재적 리간드-바인딩 포켓의 표면이 그물망으로 표현되어 있다. SmcR 모노머에 각각 위치하고 있는 각 포켓을 붉은 화살표로 표시하였다.
도 2는 대장균과 패혈증 비브리오균을 이용한 샘플 화합물들의 검증 결과이다. (A)는 pBSS-WT과 pBS0918을 보유한 대장균을 0.0002%의 아라비노오스(arabinose)가 존재하는 LB배지에서 증식기까지 배양한 뒤, 각 샘플 화합물들을 최종 20 μM이 되도록 처리한 결과이다. 세균의 성장과 생체 발광은 화합물 처리 후 0, 1, 2, 3 시간 뒤에 Infinite^TM M200 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 측정하였다. (B)는 pBB1 플라스미드를 지닌 야생형 타입(wild type)의 패혈증 비브리오균을 LBS에서 키워 이용한 결과이다. (C)는 pBB1 플라스미드를 지닌 Δ luxO 스트레인을 이용한 결과이다.
도 3은 377B6 화합물이 SmcR의 세포 내 양이 아니라, 그 활성을 저해함을 확인시켜주는 결과이다. (A)는 네 개의 구입가능한 샘플 화합물들에 대해, 대장균 시스템을 이용해 활성을 다시 확인한 결과이다. 대장균은 600 nm에서의 흡광도가 0.5에 이를 때까지 0.0002 % 아라비노오스가 있는 배지에서 배양하였으며, 각 화합물들은 20 μM의 농도로 처리하였다. 이후 1.5 시간 뒤에 세포의 성장과 생체발광정도를 스펙트로포토미터(spectrophotometer)와 루미노미터(luminometer)로 각각 측정하였다. NS는 양성대조군으로 pBAD24-BS 및 pBS0918을 함유하는 대장균(E. coli)이고, NI는 또 다른 양성대조군인 아라비노오스 비유도 군임. (B)는 패혈증 비브리오균 DH0602 균주를 초기 증식기 (A₆₀₀ = 0.2)까지 배양한 뒤, 377B6 화합물을 20 μM 처리한 결과이다. 30 ℃에서 16 시간 동안 배양한 뒤 β-갈락토시다아제의 활성을 측정하였다. NO는 양성대조군으로 pJH0311을 보유한 DH0602이고, WT는 pBSJH-WT을 보유한 DH0602이다. (C)는 다양한 농도의 377B6가 처리된 패혈증 비브리오균 샘플에서 총 프로테아제와 엘라스테아제의 활성을 측정한 결과이다. 세포 내 SmcR의 양은 웨스턴 블랏팅(Western blotting)을 이용해 확인하였다.
도 4는 SmcR에 대한 377B6의 효과를 보여준다. (A)는 vvpE 유전자의 프로모터 영역(promoter region)에 해당하는 DNA 200 bp를 방사성으로 표지하고, EMSA 실험의 프로브(probe)로 이용한 결과이다. 15 ng의 프로브에 25 혹은 50 nM의 SmcR 단백질을 섞고, DMSO (2%), 377B6(100 μM) 또는 대조군 화합물(100 μM)을 처리하였다. (B)는 (A)에서와 마찬가지로 EMSA를 수행하되, SmcR의 양을 50 nM로 고정하고, 377B6의 양을 순차적으로 늘려준 결과(0.01, 0.1, 1, 10 μM)이다. N은 비 단백질(no protein) 및 비 화합물(no chemical) 군이고, B는 결합(bound) DNA 군이고, F는 유리(free) DNA 군이다. (C)는 95 ng의 SmcR 단백질을 DMSO혹은 377B6 화합물과 37 ℃에서 20 분간 반응시킨 뒤, 트립신을 넣어 부분적 분해를 일으킨 결과이다. 각 배양시간 뒤, 5X SDS 샘플 버퍼(sample buffer)와 섞어주고, PAGE 후 웨스턴 블랏으로 밴드를 관찰하였다. 다이머 형태와 모노머 형태의 SmcR에서 유래한 밴드들을 표시해두었다. No는 비 트립신(no trypsin) 군이다.
도 5는 등온적정열량계를 이용한 377B6와 SmcR의 상호작용을 확인한 결과이다. SmcR 단백질에 대한 377B6화합물의 적정을 통해 상호작용을 살펴보았다. 위쪽 그래프는 377B6 용액에 SmcR을 30회에 걸쳐 주입한 실측 결과(raw data)이며, 아랫쪽 그래프는 이를 이용해 계산한 인테그레이션 플랏(integration plot)이다. 각 결합에 대한 열역학적 값들은 표에 나타내었다.
도 6은 SmcR 레귤론(regulon) 중 vvpE를 포함한 5개의 유전자를 선정하고, 377B6 처리 상황에서 발현 여부를 qRT-PCR로 확인한 결과이다. 야생형 혹은 smcR 돌연변이 패혈증 비브리오균을 초기 증식기 (A₆₀₀ = 0.25)까지 배양하고, 377B6를 20 μM농도로 처리하였다. 대조군에는 DMSO를 처리하였다. A₆₀₀ = 5까지 세균을 키운 뒤, 전체 RNA를 퀴아젠(qiagen)사의 'RNeasy mini kit'로 정제하고, 바이오래드(BioRad)사의 'iscript qRT-PCR kit'를 이용해 각 유전자의 발현 정도를 확인하였다. mRNA의 발현은 16s rRNA의 발현량을 이용해 정규화(normalization)하였으며, DMSO가 처리된 야생형 타입 세포에서의 발현량을 기준으로, 377B6가 처리된 야생형 타입 세포 (검은 막대) 및 DMSO가 처리된 smcR 돌연변이 세포 (회색막대)의 발현량을 표시하였다.
도 7은 야생형 타입 또는 smcR 돌연변이 패혈증 비브리오균을 초기 증식기 까지 배양한 뒤, 500 μl의 배양액을 24 웰 플레이트에 옮겨 담고, 표시된 농도만큼의 377B6를 처리한 결과이다. 대조군으로 DMSO를 최종농도 2%가 되도록 처리하였으며, smcR 돌연변이에 DMSO를 처리한 샘플도 대조군으로 포함하였다. 이 플레이트를 30 ℃에서 교반하며, 10 시간 동안 배양하였다. 'Tecan Infinite M200Pro'를 이용해 각 시간대별로 600 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 8은 패혈증 비브리오균이 초기 대수 증식기에 도달했을 때, 377B6의 유도체인 화합물들을 20 μM 처리한 결과이다. 377B6의 유도체 화합물들을 20 μM 처리한 후, 200 μl의 배양액을 96-웰 화이트 플레이트에 옮겨 담고, 다시 4.5 시간 동안 30분 배양하였다. 발광(luminescence)을 측정하고, 이를 A ₆₀₀ 값으로 보정하여 RLU로 표시하였다. 아래쪽은 각 샘플에서 SmcR 양이 줄어들지 않았음을 보여주는 웨스턴 블랏 사진이다.
도 9는 377B6 화합물의 세포 독성을 확인한 실험 결과이다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[ 실시예 1: SmcR 억제제의 선별을 위한 고속 대량 탐색( high throughput screening) 실시]

본 실험에 사용한 박테리아 종과 플라스미드는 표1에 정리되어 있다.

균주 또는 플라스미드	상대적 특성 (Relevant characteristics) ^a	참고문헌 또는 소스(source)
박테리아 균주
*V. vulnificus*
ATCC29307	야생형 V. vulnificus, 병원성	본 발명자인 최상호 교수 소속 실험실 보유
MO6-24/O	야생형 V. vulnificus, 병원성	참고문헌 3
KPM201	MO6-24/O, luxO, Km^r	참고문헌 4
DH0602	lacZ, smcR::nptI, vvpE 프로모터에 프로모터리스 lacZ가 융합된 ATCC29307; Sm^r, Km^r, Cm^r	본 발명자인 최상호 교수 소속 실험실 보유
*E. coli*
DH5a	supE44 lacU169 (F80 lacZ M15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relAI	본 발명자인 최상호 교수 소속 실험실 보유
SM10pir	thi thr leu tonA lacY supE recA::RP4-2-Tc::Mu pir; Km^r; p-리콰이어링(requiring) 플라스미드을 위한 호스트; 컨쥬갈 도너(conjugal donor)	참고문헌 5

플라스미드
pBAD24	P_BAD 프로모터를 보유한 발현 백터; Ap^r	참고문헌 6
pBAD24BS	XbaI 사이트 대신 유일한 XhoI 사이트를 갖는 pBAD24; Ap^r	본 발명
pBSS-WT	smcR을 갖는 pBAD24BS; Ap^r	본 발명
pJH0311	pCOS5 유래의, pUC19의 멀티 클로닝 사이트를 갖는 벡터; Ap^r, Cm^r	참고문헌 7
pBSJH-WT	smcR 유전자와 rrnB 터미네이터를 갖는 pJH0311; Ap^r	본 발명
pBBR_lux	프로모터-리스(less) lux operon을 갖는 넓은-호스트-범위 벡터; Cm^r	참고문헌 8
pBS0918	VV2 _1398 프로모터 영역을 갖는 pBBR_lux ; Cm^r	본 발명
pBB1	코스미드(cosmid) 형태의 V. harveyi luxCDABE; Tc^r	참고문헌 9
^aAp^r, 암피실린(ampicillin) 저항성; Cm^r , 클로람페니콜(chloramphenicol) 저항성; Km^r, 카나마이신(kanamycin) 저항성; Rif^r, 리팜피신(rifampicin) 저항성; Tc^r, 테트라사이클린(tetracycline) 저항성; Sm^r, 스트렙토마이신(streptomycin) 저항성.

본 발명에서 사용한 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli)는 루리아-베르타니(Luria-Bertani, LB) 배지에서 37℃로 배양하였으며, 비브리오 불니피쿠스(V. vulnificus)는 2% NaCl이 첨가된 LB 배지(LBS)에서 30℃의 온도로 배양하였다. 필요한 경우 다음과 같이 항생제를 추가하였다. 대장균 및 비브리오 불니피쿠스에 공히 100 μg/mL의 암피실린 및 100 μg/mL의 카나마이신, 대장균 및 비브리오 불니피쿠스 각각에 20 μg/mL 및 3 μg/mL의 클로람페니콜, 대장균 및 비브리오 불니피쿠스 각각에 10 μg/mL 및 3 μg/mL의 테트라사이클린, 대장균에 100 μg/mL의 스트렙토마이신.

한편, 대장균 리포터 시스템 구축 및 고속 대량 탐색을 수행하고자, 야생형 smcR 유전자가 아라비노오스에 의해 유도되도록 클로닝된 pBSS-WT 플라스미드를 구축하였다. 리포터 플라스미드는 SmcR에 의해 발현이 직접 억제되는 VV2_1398 유전자의 프로모터가 바이오루미네센스 오페론(bioluminescence operon, lux operon)의 앞에 클로닝된 pBS0918이다. 이 두 플라스미드를 대장균 DH5a에 동시에 트랜스포메이션(transformation)하여 대장균 리포터 시스템을 구축하였다. 이 대장균 리포터 스트레인은 아라비노오스의 농도가 증가할수록 생체 발광이 줄어드는 것으로 확인되었으며, SmcR 억제제를 탐색하기 위한 리포터 시스템으로 이용되었다.

탐색을 위해 한국 화합물은행으로부터 약 8800개의 저분자 화합물을 분양받았으며, 아래와 같이 실험하였다. 16 시간 동안 배양한 대장균 리포터 스트레인을 LB 배지에 100배 희석 접종하고, 최종농도 0.0002 %가 되도록 아라비노오스를 첨가해 주었다. 양성대조군에는 아라비노오스 대신 물을 첨가함으로써 SmcR이 발현되지 않아 리포터 플라스미드가 억제되지 않도록 하였다. 37 ℃에서 배양하여 배양액의 흡광도 (600 nm)가 0.5에 이르렀을 때, 배양액을 100 μl씩 96 웰 플레이트로 옮겨담았다. 각 웰에는 최종 농도 20μM의 각 화합물들 및 대조군으로 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)를 처리하였다. 이를 37 ℃에서 배양하면서, 리포터 스트레인의 성장과 생체 발광정도를 'Infinite^TM M200 microplate reader (Tecan, Mannedorf, Switzerland)'로 측정하였다. 측정된 발광값을 흡광도로 나누어서 정규화(normalization)하였다.

대장균 리포터 스트레인을 이용하여 8800 여 개 화합물들의 활성을 탐색한 결과, 몇 화합물은 대장균의 성장을 저해하였으며, 다른 몇 개는 세균의 성장에 영향을 미치지 않으면서 생체 발광을 감소시켰다.

SmcR의 저해제로는 총 10 개의 화합물들이 스크리닝되었는데, 이들은 대장균 리포터 스트레인의 생체 발광을 유의적으로 증가시켰다.

고속 대량 탐색 실험의 결과를 검증하기 위해 10 개 화합물들을 새로운 플레이트에 옮기고 대장균 시스템을 이용해 다시 실험하였다. 이 검증 실험에서는 4 시간 동안 배양을 하였으며, 매 한 시간마다 대장균의 성장과 생체 발광 정도를 측정하였다. 도 2의 (A)에서 보듯이 대부분의 화합물들이 SmcR 저해 효과, 다시 말해 RLU의 증가를 보였다. 특히 377B6와 359H12 화합물의 경우, 강한 SmcR 저해능을 보였다.

한편, 허위 양성(false positive) 결과를 제외하기 위해 비브리오 리포터 시스템을 이용한 검증 실험도 수행되었다. 즉, pBB1 플라스미드를 지닌 패혈증 비브리오균을 이용하여 화합물의 효과가 오직 대장균에만 국한되는 것이 아니며, 오직 vvpE 프로모터에만 적용되는 것이 아님을 확인하고자 하였다.

실험을 위해, lux 오페론의 발현이 SmcR과 같은 LuxR _Vh 계열의 단백질들에 의해 직접적으로 촉진되는 pBB1 플라스미드를 컨쥬게이션(conjugation)을 통해 패혈증 비브리오균의 야생형과 luxO 돌연변이 균주에 도입하였다. 구축된 비브리오 리포터 시스템들에 샘플 화합물들을 처리하고 30 ℃에서 배양하며, 위 대장균 시스템 스크리닝과 같은 방법으로 세포의 성장과 발광 정도를 측정하였다.

도 2의 (B)와 같이 pBB1 플라스미드를 지닌 야생형 패혈증 비브리오균에 대조군인 DMSO를 처리하였을 경우에는, 쿼럼센싱의 대표 모델균인 비브리오 하비아이균이 보여주듯이, 'A ₆₀₀ vs. RLU'그래프에서 전형적인 U 모양의 그래프를 나타내 주었다. 반면, 대부분의 샘플 화합물들을 처리하였을 경우에는 이런 U 모양의 그래프가 아니라, 계속해서 빛이 감소하는 양상을 보여주었다. 빛이 감소하는 것은 샘플 화합물의 처리에 의해 SmcR이 억제되고, 그 결과 lux 오페론의 발현이 촉진되지 못하는 것을 의미한다. 다만, H1C3와 H1C5의 경우는 다소 예외적이었는데, 특히 H1C3는 패혈증 비브리오균의 성장을 저해함을 확인할 수 있었다. luxO 돌연변이 균주에서도 유사한 결과가 나타나, 8개이 화합물들이 계속해서 발광을 저해하였다 [도 2의(C)].

이상의 결과로부터, 본 발명의 화합물들은 대장균 시스템뿐만 아니라, 패혈증 비브리오균에서도 SmcR의 활성을 저해하는 저해제임을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 2: 화합물 377B6가 SmcR 의 세포 내 농도 감소가 아닌 SmcR 의 활성을 직접적으로 저해함을 확인]

샘플 화합물들 중 구입 가능하거나 합성 가능한 네 개의 화합물을 대상으로 시험관에서 스케일-업 확인 실험을 수행하였다. 예상대로 네 개 화합물들 모두 강한 SmcR저해 활성을 보여주었다 [도 3의 (A)]. 특히, 화합물 377B6가 가장 강력한 저해능력을 보여주어, 이 화합물을 SmcR 저해제로 선정하고 추후 실험을 진행하였다. 이전까지의 모든 실험들이 루시퍼라아제(luciferase) 유전자를 리포터 유전자로하여 생체 발광 정도를 리포터 리드-아웃(reporter read-out) 하였기 때문에 다른 리포터 유전자 시스템을 이용해 377B6의 활성을 다시 확인해 보았다.

한편, 또 다른 비브리오 리포터 스트레인 DH0602에 smcR 발현 플라스미드 pBSJH-WT을 컨쥬게이션을 통해 도입하였다. DH0602는 smcR과 lacZ 유전자가 결여되어 있고, SmcR에 의해 직접 발현이 촉진되는 vvpE 유전자의 프로모터 부위가 프로모터리스 (promotorless) lacZ 유전자와 융합되어 있기 때문에 SmcR의 활성 정도에 따라 β-갈락토시다아제 활성이 다르게 나타난다. 이 스트레인을 성장기(exponential phase)까지 배양하고 여기에 샘플 화합물들을 20 μM의 농도가 되도록 처리하고 16 시간 동안 더 배양하였다. 화합물의 효과는 밀러(Miller)에 의해 제안된 클로로포름-소디움 도데실 설페이트(chloroform-sodium dodecyl sulfate) 방법에 따라 세포 내 β-갈락토시다아제 활성을 측정함으로써 확인하였다.

실험 결과, 유전체(Chromosome) 상에 구축된 β-갈락토시다아제 리포터 유전자 시스템을 이용했을 경우에도 377B6 화합물은 여전히 vvpE유전자의 프로모터 활성을 떨어뜨렸다 [도 3의 (B)]. 이 실험을 통해, 377B6 화합물이 루시퍼라아제의 활성이나, 리포터 플라스미드의 복제를 방해하는 것이 아니라, 정말 SmcR에 영향을 미치는 것임을 확인할 수 있었다.

한편, 비브리오 종에 있어서 프로테아제와 엘라스테아제의 발현이 쿼럼센싱에 의해서 조절된다는 것이 잘 알려져 있기 때문에, 이 두 활성의 변화를 377B6 처리에 의한 패혈증 비브리오균 자체의 표현형 변화 지표로 삼아 실험해 보았다.

총 프로테아제 및 엘라스타아제 활성은 다음의 방법으로 측정하였다. 먼저 위와 같이 패혈증 비브리오균을 배양하고 샘플 화합물을 처리하였다. 배양액을 원심분리하여 상등액을 얻고 활성을 측정하였다. 프로테아제 활성은 카제인 가수분해능을 통해 확인하였는데, 10 mM Tris-HCl 버퍼 (pH 7.5)에 용해되어 있는 아조카제인(azocasein) 용액 (0.25 mg/ml) 2 ml에 여과한 상등액 100 μl를 넣어 반응을 시작하였다. 30 ℃에서 한 시간 동안 배양한 뒤, 8% (w/v) 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid) 2 ml을 넣어 반응을 중단시켰다. 이를 다시 원심분리하고 투명한 상등액만을 2 ml의 0.5M 소디움 하이드록사이드(sodium hydroxide)와 반응시켜 발색시키고, 400 nm에서 흡광도를 측정하였다. 엘라스타아제 활성은 300 μl의 여과 상등액을 1 ml의 엘라스틴-콩고 레드 용액(elastin-congo red solution; 20 mg / ml in 10 mM sodium phosphate, pH 7.0)에 처리하여 측정하였다. 37 ℃에서 4 시간 동안 교반 배양하였으며, 원심분리 후 494 nm에서 흡광도를 측정하였다. 프로테아제 활성 1 unit은, 한 시간 반응 동안 흡광도 0.001 증가로 정의하였으며, 엘라스타아제 활성 1 unit은, 흡광도 0.01 증가로 정의하였다.

실험 결과, 도 3의 (C)처럼, 377B6 화합물이 처리된 샘플들의 경우, 프로테아제와 엘라스타아제 활성이 화합물의 농도에 의존적으로 감소하였다. 반면, 대조군인 DMSO 처리군의 경우, 활성의 변화가 없었다. 특히 이러한 감소에도 불구하고, 웨스턴 블랏을 이용하여 확인한 각 샘플 내의 SmcR의 양은 큰 차이를 보이지 않았다. 이 사실은 화합물 377B6의 정확한 타겟이 SmcR이며, 이 화합물이 SmcR의 활성을 저해하는 것이지, 세포 내 SmcR의 양을 줄이는 것은 아님을 말해준다.

[ 실시예 3: 377B6가 SmcR 이 DNA 에 결합하는 것을 억제함을 확인]

샘플 화합물이 처리된 SmcR 단백질의 DNA 결합능력을 vvpE 프로모터 부위의 DNA를 이용한 EMSA 실험을 통해 확인하였다. vvpE 유전자의 프로모터 부위를 ³²P-라벨 프라이머 VVPE021(3'-AGAATGGCGATTTTCATAG-5')와 라벨되지 않은 프라이머 VVPE022(3'-GAATCCATCTCACTGCGA-5')를 이용해, PCR 증폭하였다. 이 프로브 15 ng을 25 또는 50 nM의 SmcR, 그리고 100 μM의 화합물 혹은 DMSO와 반응 버퍼 (0.1 M KCl, 0.02 M Tris-Cl pH 8.0, 3 mM MgCl₂, 0.1 mM EDTA, 1 mg of poly[dI-dC] 및 0.1 mM DTT) 내에서 37 ℃의 온도로 30 분간 반응시켰다. DNA-SmcR 복합체는 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel)에 전기영동(electrophoresis)하고, BAS 리더를 통해 밴드 위치를 확인하였다.

도 4의 (A)에서 보듯이 DMSO나, 대조군 화합물이 처리된 경우에는 SmcR의 DNA 결합능력이 변화하지 않았으나, 377B6 화합물을 처리한 경우에 있어 그 결합력이 크게 감소하였다. 이 감소는 377B6의 농도가 증가할수록 더욱 컸다 [도 4의 (B)].

SmcR은 다이머 형태로 DNA에 결합하는 것으로 알려져 있기 때문에 앞에서와 같이 DNA에 대한 결합력의 감소는 화합물에 의한 SmcR 모노머리제이션(monomerization) 혹은 언폴딩(unfolding) 때문일 가능성이 있다. 이를 확인해 보기 위해서 377B6가 처리된 SmcR과 DMSO가 처리된 SmcR의 부분적인 절단(digestion) 패턴을 비교해 보았다. 95 ng의 SmcR 단백질을 500 μM의 화합물과 섞어 버퍼 (25 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl) 속에서 37 ℃의 온도로 20 분간 배양하였다. 8 μl의 트립신 반응 버퍼(trypsin reaction buffer; 40 mM ammonium bicarbonate, 9 % acetonitrile, 최종 320 ng/ml의 트립신 함유)를 SmcR-화합물 복합체에 넣어 부분적인 프로테오라이시스(proteolysis)를 진행하였다. 반응을 0, 10, 20, 40 분 동안 시킨 뒤 5X SDS 샘플 버퍼를 처리하였다. 웨스턴 이뮤노블랏(Western immunoblot)을 통해 분해된 펩타이드들의 밴드를 확인하였다.

그 결과, 도 4의 (C)처럼 377B6가 처리되거나 DMSO가 처리되거나, 각 시간별로 트립신에 의한 부분 분해 패턴이 동일하게 나타났다. 이를 통해 377B6 화합물이 SmcR의 다이머리제이션이나 폴딩에 영향을 미쳐 그 활성을 떨어뜨리는 것은 아님을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 4: 377B6가 SmcR 에 직접적으로 결합함을 확인]

377B6 화합물이 정말로 SmcR 단백질과 직접적으로 상호 작용하는지를 확인하기 위해 등온적정열량계를 이용해 실험하였다. SmcR 단백질을 50 mM Tris pH 7.0 및 300 mM NaCl가 포함된 버퍼에 투석하였으며, 샘플 화합물을 이 버퍼에 희석하였다. 이 샘플들을 진공 아스피레이션(aspiration)을 통해 탈기(degassing)하였으며, 25 ℃에서 적정(titration)을 진행하였다. 칼로리메트릭 어세이(Calorimetric assay)는 VP-ITC (Isothermal Titration Calorimeter) (MicroCal Inc., Northampton, MA)를 이용해 아래처럼 이루어졌다. 교반은 분당 300 레볼루션(revolution)이었으며, 서말 파워(thermal power)는 매 10초마다 측정되었다. SmcR 다이머 0.44 mM을 반응 셀(reaction cell)에 들어있는 0.025 mM 화합물에 적정하였다. 적정에 대한 서모그램(thermogram) 분석은 기기와 함께 제공된 'Origin package (version 7)'통해 이루어졌다.

그 결과, 377B6는 SmcR 다이머에 대해 '두 개 위치 결합 모델(two-site binding model)'로 결합함을 확인할 수 있었으며, 각 결합의 결합력은 서로 다른 것으로 나타났다 [도 5]. 첫 번째 위치에 대한 해리 상수는 0.47 μM이었으며, 두 번째 위치에 대한 해리 상수는 5μM 이었다. 반면, SmcR과 DMSO를 이용한 실험에서는 상호작용이 관찰되지 않았다.

이상의 결과들은 377B6가 SmcR에 의해 매개되는 SmcR 레귤론(regulon)들에 대해 그 발현의 촉진/억제를 저해할 수 있는 특이적인 저해제임을 보여준다.

[ 실시예 5: 377B6이 SmcR 레귤론의 발현에 미치는 영향 조사]

377B6의 처리가 vvpE 외 다른 ScmR 레귤론들의 발현에 형향을 주는를 확인하기 위해 qRT-PCR을 이용해, mRNA의 발현량을 살펴보았다. SmcR에 의해 직접적으로 발현이 조절받는 것으로 확인된 바 있는 유전자들 (VVMO6_00311, VVMO6_00969, VVMO6_02837, VVMO6_03187)을 선정해 qRT-PCR용 프라이머를 제작하고, 실험을 수행하였다.

그 결과, 도 6처럼 야생형 패혈증 비브리오균에 377B6를 처리한 경우, smcR 돌연변이의 경우와 유사한 수준으로 그 발현들이 감소 혹은 증가하였다. 이 결과로부터, 377B6의 활성이 SmcR과 vvpE 유전자의 프로모터 사이의 특정한 결합만을 방해하는 것이 아니라, SmcR 자체의 활성을 조절함으로써, SmcR 레귤론 전체의 발현을 조절함을 알 수 있었다.

[ 실시예 6: 377B6이 비브리오 불니피쿠스( V. vulnificus )의 생육에 미치는 영향 조사]

377B6 화합물이 패혈증 비브리오균의 성장에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위해 다양한 농도의 377B6를 처리하면서, 패혈증 비브리오균의 성장을 관찰하였다. 도 7에서 보듯이, 1~100 μM의 377B6 처리는 패혈증 비브리오균의 시험관 내(in vitro) 성장에 유의미한 영향을 미치지 않았다. 이와 같은 결과는 본 발명의 377B6가 패혈증 비브리오균의 성장을 보장하면서도, 병원성을 나타내지 않게 하는 것을 의미한다.

이는 본 발명의 화합물이 병원성균 사멸시킴으로써 해당 병원성 인자를 숙주로부터 제거하고자 하는 일반적인 항생제와 다른 기작으로 병원성 미생물을 컨트롤하는 것을 의미한다. 이는 항생제 내성 기작을 유도하지 않고서도 병원성 미생물의 병원성을 조절할 수 있음을 보여주는 것이고, 또한 내성 기작이 이미 가동된 미생물에 대해서도 해당 균주의 병원성을 본 발명의 방법을 통해 컨트롤할 수 있음을 보여주는 것이다.

[ 실시예 7: 377B6 유도체의 SmcR 저해 활성 확인]

377B6의 유도체 2종류에 대해 SmcR 저해 활성을 확인해 보았다. 패혈증 비브리오균을 이용한 검증 실험에서와 마찬가지로 pBB1 플라스미드를 지니고 있는 패혈증 비브리오균에 각 화합물들을 처리하고, 일정 시간 배양 뒤 생체 발광 정도로 SmcR의 저해 정도를 확인하였다.

도 8처럼 첫 번째 유도체 (Dev_1)의 경우 377B6보다는 약하나, SmcR의 저해 활성을 지니고 있음을 확인할 수 있었다. 이에 반해 두 번째 유도체 (Dev_2)의 경우에는 저해 활성이 거의 없음을 확인하였다. 모든 경우에 있어, 세포 내 SmcR의 양은 감소하지 않았음을 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다.

[ 실시예 8: 377B6 화합물의 세포 독성 실험]

377B6 화합물에 시험관 내(in vitro) 세포독성이 있는 지를 측정하기 위해, 5 x 10⁵ 인간장내세포 INT-407 세포에 100~500 μM 377B6 또는 용매(DMSO)를 처리하고 210분 후, 'LDH release assay'를 통해 세포 독성을 측정하였다(Roche, LDH release assay kit). 2 % Triton-X 100 처리에 의해 나타나는 세포독성을 100 %로하여, 세포 독성(Cytotoxicity, %)를 계산하였다.

도 9에서 보는 바와 같이, 377B6 화합물은 조사한 전 농도 구간 (100~500 μM)에서 INT-407 세포에 대한 세포 독성이 용매 DMSO의 세포독성과 유사한 것으로 나타났다. 이로부터 377B6 화합물 자체의 세포독성은 없는 것으로 판단되었다.

또한, 화합물 377B6의 생체 내(in vivo) 독성 여부를 조사하기 위해, 7 주령 ICR 생쥐 암컷에 10 μM 또는 100 μM의 377B6 (100 μl/생쥐)를 복강 주사하고, 30 시간 후 생쥐의 생존 여부를 관찰하였다 (5 마리/실험군).

도 9에서 보는 바와 같이, 사용한 농도 전 구간 (10~100 μM, 100 μl)에서 377B6를 주사한 모든 생쥐들이 생존하였는데, 이로부터 생체 내(in vivo) 독성이 없는 것으로 판단되었다.

한편, 하기에 본 발명의 화합물을 이용한 제제예를 예시하나 이는 본 발명을 이에 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

[ 제제예 1: 산제의 제조]

1-(5-브로모티오펜-2-설포닐)-1H-피라졸 300 ㎎

유당 100 ㎎

탈크 10 ㎎

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

[ 제제예 2: 정제의 제조]

1-(5-브로모티오펜-2-설포닐)-1H-피라졸 300 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

[ 제제예 3: 캅셀제의 제조]

1-(5-브로모티오펜-2-설포닐)-1H-피라졸 300 ㎎

결정성 셀룰로오스 3 ㎎

락토오스 14.8 ㎎

마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

[ 제제예 4: 주사제의 제조]

1-(5-브로모티오펜-2-설포닐)-1H-피라졸 300 ㎎

만니톨 180 ㎎

주사용 멸균 증류수 2974 ㎎

Na₂HPO₄·2H₂O 26 ㎎

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

[ 제제예 5: 액제의 제조]

1-(5-브로모티오펜-2-설포닐)-1H-피라졸 300 ㎎

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 로 조절한 후 갈색 병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

[ 제제예 6: 1-(5- 브로모티오펜 -2- 설포닐 )-1H- 피라졸을 함유하는 식품의 제조]

시판 중인 S 제조의 우유 200 mL에 본 발명의 1-(5-브로모티오펜-2-설포닐)-1H-피라졸을 1%(w/v) 첨가하여 본 발명에 따른 우유 조성물을 제조하였다.

[ 제제예 7: 1-(5- 브로모티오펜 -2- 설포닐 )-1H- 피라졸을 함유하는 사료 첨가제 제조]

a-토코페롤 5.0중량%, 오징어간유 0.75중량%, 효모 93.25중량%, 본 발명의 1-(5-브로모티오펜-2-설포닐)-1H-피라졸 1.0중량%를 혼합하여 사료 첨가제를 1 kg을 제조하였다.

[ 제제예 8: 1-(5- 브로모티오펜 -2- 설포닐 )-1H- 피라졸을 함유하는 사료의 제조]

어분 58중량%, 대두박 4중량%, 콘글루텐분 3중량%, 소맥분 28.7중량%, 오징어간유 4중량%, 비타민 혼합제 1.2중량% 및 미네랄 혼합제 1중량%를 포함한 기본 사료에 본 발명의 1-(5-브로모티오펜-2-설포닐)-1H-피라졸 1.0%중량%를 첨가하여 넙치 양식용 사료조성물 1 kg을 제조하였다.

[참고문헌]

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2. Kim, Y., B. S. Kim, Y. J. Park, W. C. Choi, J. Hwang, B. S. Kang, T. K. Oh, S. H. Choi, and M. H. Kim. 2010. Crystal structure of SmcR, a quorum-sensing master regulator of Vibrio vulnificus, provides insight into its regulation of transcription. J. Biol. Chem. 285:14020-14030.

3. Wright, A. C., L. M. Simpson, J. D. Oliver, and J. G. Morris, Jr. 1990. Phenotypic evaluation of acapsular transposon mutants of Vibrio vulnificus . Infection. Immun. 58:1769-1773.

4. Roh, J. B., M. A. Lee, H. J. Lee, S. M. Kim, Y. Cho, Y. J. Seok, S. J. Park, and K. H. Lee. 2006. Transcriptional regulatory cascade for elastase production in Vibrio vulnificus: LuxO activates luxT expression and LuxT represses smcR expression. J. Biol. Chem. 281:34775-34784.

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6. Guzman, L., D. Belin, M. J. Carson, and J. Beckwith. 1995. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose P_BADpromoter.J. Bacteriol. 177: 4121-4130.

7. Goo, S. Y., H. J. Lee, W. H. Kim, K. L. Han, D. K. Park, H. J. Lee, S. M. Kim, K. S. Kim, K. H. Lee, and S. J. Park. 2006. Identifiction of OmpU of Vibrio vulnificus as a fibronectin-binding protein and its role in bacterial pathogenesis. Infect. Immun. 74:5586-5594.

8. Lenz, D. H., K. C. Mok, B. N. Lilley, R. V. Kulkarni, N. S. Wingreen, and B. L. Bassler. 2004. The small RNA chaperone Hfq and multiple small RNAs control quorum sensing in Vibrio harveyi and Vibrio cholerae. Cell. 118:69-82.

9. Bassler, B. L., M. Wright, R. E. Showalter, and M. R. Silverman. 1993. Intercellular signalling in Vibrio harveyi: sequence and function of genes regulating expression of luminescence. Mol. Microbiol. 9:773-786.

Claims

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하기 화학식 1의 구조를 갖는 1-(5-브로모티오펜-2-설포닐)-1H-피라졸{1-(5-bromothiophene-2-sulfonyl)-1H-pyrazole}을 유효성분으로 포함하고,
병원성 기작의 발현이 AI와 SmcR의 결합에 의해 매개되는 세균에 대해 항균활성이 있는 것을 특징으로 하는 항균 조성물.
[화학식 1]
제2항에 있어서,
상기 1-(5-브로모티오펜-2-설포닐)-1H-피라졸{1-(5-bromothiophene-2-sulfonyl)-1H-pyrazole}은
세균 간 의사소통 기작(quorum sensing)을 방해함으로써 병원성 세균이 병원성을 나타내지 못하게 하는 것을 특징으로 하는 항균 조성물.
제2항에 있어서,
상기 항균 조성물은,
항 패혈증 비브리오 조성물인 것을 특징으로 하는 항균 조성물.
제2항에 있어서,
상기 조성물은,
항 패혈증 비브리오 약학 조성물인 것을 특징으로 하는 항균 조성물.
제2항에 있어서,
상기 조성물은,
식품 조성물인 것을 특징으로 하는 항균 조성물.
제2항에 있어서,
상기 조성물은,
사료 조성물인 것을 특징으로 하는 항균 조성물.
제2항에 있어서,
상기 조성물은,
식품 첨가제 조성물인 것을 특징으로 하는 항균 조성물.
제2항에 있어서,
상기 조성물은,
사료 첨가제 조성물인 것을 특징으로 하는 항균 조성물.