KR101230603B1 - Colorimetric sensor for specific detection, and method for its preparation and detection method using the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 특이적 검출을 위한 발색 센서, 이의 제조방법 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것으로, 상세하게는 외부 노출기가 비이온성기로 치환된 디아세틸렌 모노머를 이용한 발색 센서로서, 비이온성 디아세틸렌 모노머의 자기조립을 위해 수용성 또는 지용성의 지지체를 이용하고, 특이적 결합을 위해서는 특이적인 관능기로 치환된 디아세틸렌 모노머를 상기 비이온성 디아세틸렌 모노머와 혼합하여 지지체에 자기조립하거나 또는 지지체에 자기조립된 비이온성 디아세틸렌 모노머의 일부를 특이적인 관능기로 치환한 후 중합함으로써 제조되는, 비이온성 디아세틸렌 모노머와 특이적인 관능기를 가진 디아세틸렌 모노머가 지지체에 자기조립된 후 중합함으로써 제조되는 발색 센서, 이의 제조방법 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것이다.The present invention relates to a color sensor for specific detection, a method for manufacturing the same, and a method for detecting the same. Specifically, the present invention relates to a color sensor using a diacetylene monomer in which an external exposure group is substituted with a nonionic group. For self-assembly, a water-soluble or fat-soluble support is used, and for specific binding, a diacetylene monomer substituted with a specific functional group is mixed with the nonionic diacetylene monomer to self-assemble to a support or a non-ionic self-assembled to a support. A color sensor manufactured by polymerizing a portion of a diacetylene monomer by substituting a specific functional group and then polymerizing the non-acetyl diacetylene monomer and a diacetylene monomer having a specific functional group on a support and then polymerizing the same; It relates to a detection method using the same.
Description
도 1은 본 발명에 따른 발색 센서의 제조 공정을 개략적으로 나타낸 도이다.1 is a view schematically showing a manufacturing process of a color sensor according to the present invention.
도 2a는 본 발명에 따른 발색 센서에 “KRIBB" 글자 모양이 패턴된 마스크를 이용하여 글자 부분에만 UV를 조사한 후 이를 에탄올로 세척하면 푸른색이던 “KRIBB" 글자 부분이 붉은색으로 변한 것을 발색 센서 전체에 대해 개략적으로 나타낸 도이며,Figure 2a is a color sensor according to the present invention using a mask patterned "KRIBB" letter pattern to the UV light only after irradiating the letter portion of the color "KRIBB" letter was changed to red when washed with ethanol color sensor A schematic representation of the whole,
도 2b는 본 발명에 따른 발색 센서에서 디아세틸렌이 자기조립 되기 전의 지지체 부분(1)을 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope; SEM)으로 확대하여 나타낸 도이고,FIG. 2B is an enlarged view of the
도 2c는 본 발명에 따른 발색 센서에서 디아세틸렌이 지지체에 자기조립 된 후 UV를 조사하기 전의 지지체 부분(2)를 주사전자현미경으로 확대하여 나타낸 도이고,Figure 2c is an enlarged view of the support portion (2) with a scanning electron microscope after irradiating UV after the diacetylene self-assembled on the support in the color sensor according to the present invention,
도 2d는 본 발명에 따른 발색 센서에서 디아세틸렌이 지지체에 자기조립 된 후 UV를 조사하여 중합된 부분(3)을 주사전자현미경으로 확대하여 나타낸 도이다.Figure 2d is a diagram illustrating an enlarged portion of the polymerized
도 3은 본 발명에 따른 발색 센서의 자기조립 및 중합과정 후, 이를 목적물 질인 스트렙트아비딘(streptavidin)과 반응시키는 과정을 나타낸 도이다.3 is a diagram illustrating a process of reacting with a target material streptavidin after self-assembly and polymerization of the color sensor according to the present invention.
도 4는 본 발명에 따른 발색 센서를 이용하여 바이오틴-스트렙트아비딘 (Biotin-streptavidin; PDA-biotin : PDA-OH = 0:10, 2:8, 4:6, 6:4, 8:2, 10:0) 결합에 대한 유색 변화를 나타낸 도이다.Figure 4 is biotin-streptavidin (PDA-biotin: PDA-OH = 0:10, 2: 8, 4: 6, 6: 4, 8: 2, using a color sensor according to the present invention) 10: 0) is a diagram showing color change for binding.
도 5는 본 발명에 따른 발색 센서를 이용하여 바이오틴-스트렙트아비딘 (Biotin-streptavidin; PDA-biotin : PDA-OH = 4:6) 결합에 대한 농도별 형광 변화를 나타낸 도이다.FIG. 5 is a graph showing concentration-specific fluorescence changes for binding of biotin-streptavidin (PDA-biotin: PDA-OH = 4: 6) using a color sensor according to the present invention.
본 발명은 특이적 검출을 위한 발색 센서, 이의 제조방법 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것이다.The present invention relates to a color sensor for specific detection, a manufacturing method thereof and a detection method using the same.
단위 분자들의 집합체 또는 분자의 상호작용에 의해 형성되는 초분자(supramolecule)는 단위 분자가 가질 수 없는 특이한 물리, 화학적 특성을 나타낸다. 디아세틸렌 모노머의 중합에 의해 얻어진 폴리디아세틸렌(polydiacetylene; PDA)은 대부분 640㎚ 부근에서 최대 흡수파장을 가지며 푸른색을 띈다. 푸른색의 폴리디아세틸렌은 pH, 온도, 용매, 물리적 자극, 분자인식과 같은 외부 환경의 변화에 의해 약 550㎚에서 최대 흡수파장을 지니는 붉은색으로 전이가 일어난다. 최근, 폴리디아세틸렌의 이러한 성질을 기초로 한 여러 가지 화학적 및 생물학적 분석물질의 검출 방법이 제안되고 있으며, 이를 이용한 바이오 센서의 개발이 활발히 진행되고 있다.The supramolecule formed by the aggregation of unit molecules or the interaction of molecules exhibits unique physical and chemical properties that unit molecules cannot possess. Polydiacetylene (PDA) obtained by polymerization of diacetylene monomers has a maximum absorption wavelength near 640 nm and has a blue color. The blue polydiacetylene transitions to red with a maximum absorption wavelength at about 550 nm due to changes in the external environment such as pH, temperature, solvent, physical stimulus and molecular recognition. Recently, various methods for detecting chemical and biological analytes based on such properties of polydiacetylene have been proposed, and the development of biosensors using the same has been actively conducted.
리간드-수용체의 분자인식 개념을 기초로 한 폴리디아세틸렌 바이오 센서는 1993년 미국 로렌스 버클리 연구소의 카리크(Charych) 연구실이 처음 발표하면서 본격적으로 연구가 시작되었다. 특히, 수용체가 바이오샘플에 존재하는 병원성 박테리아, 바이러스, 독소 등의 특이적 리간드와 결합하였을 때, 색이 푸른색에서 붉은색으로 변화되는 것을 확인하였다. 예를 들어, 말단에 인플루엔자 바이러스를 인식할 수 있는 시알산(sialic acid) 기능기를 지니는 폴리디아세틸렌 LB(Langmuir-Blodget) 필름을 바이러스가 들어있는 용액에 담근 결과 LB 필름의 색이 푸른색에서 붉은색으로 전이되는 것을 관찰하였다.The polydiacetylene biosensor, based on the molecular recognition concept of the ligand-receptor, was begun in earnest in 1993 by Charych's lab at Lawrence Berkeley in the US. In particular, when the receptor is bound to specific ligands, such as pathogenic bacteria, viruses, toxins present in the biosample, it was confirmed that the color changes from blue to red. For example, a polydiacetylene Langmuir-Blodget (LB) film with a sialic acid functional group capable of recognizing the influenza virus at its end was immersed in a solution containing the virus. The transition to color was observed.
상기와 같이 분자인식에 의한 색전이 폴리디아세틸렌을 이용한 바이오 센서는 기존의 형광 표식인자 또는 비환경 친화적인 동위원소를 이용한 센서를 대체 또는 보완할 수 있는 장점을 가진다. 따라서, 분자인식에 의한 색전이 폴리디아세틸렌은 의료용 센서, 환경오염물질 검출, 신약 후보물질 분석, 식중독균의 검출 등 다양한 응용 가능성을 가지고 있다.As described above, the biosensor using the metabolic polydiacetylene based on molecular recognition has an advantage of replacing or supplementing a sensor using an existing fluorescent marker or an environment-friendly isotope. Therefore, the metabolic polydiacetylene by molecular recognition has a variety of applications, such as medical sensors, environmental pollutant detection, new drug candidate analysis, food poisoning bacteria detection.
일반적으로, 디아세틸렌을 함유하고 있는 기본 분자는 LB(Langmuir-Blodget) 방법을 이용한 필름(Film)과 같은 2D 형태 또는 리포좀(Liposome)과 같은 3D 형태로 자기조립시킨 후, 이를 이용한 다양한 목적 물질의 검출에 사용되고 있다. 이렇게 만들어질 수 있는 디아세틸렌(Diacetylene)류는 또한 2D-, 3D- 배열을 시킬 수 있다(Sasaki, D.Y. et al, J. Colloid Interf. Sci. 229, 490 [2000]; Lu, Y.et al, Nature 410, 913 [2001]; Song, J. et al, J. Am. Chem. Soc. 126, 8459 [2004]; Cheng, Q. et al, Langmuir 16, 5333 [2000]). 상기 LB 방법은 친수성기와 소수성기를 같이 가진 분자를 낮은 끓는점을 가진 용매 (예를 들어, 클로로포름 등)에 녹인 후, 이를 수면 상에 떨어뜨려 얇게 퍼지게 하면, 용매가 증발하면서 수면 상에 모노머 층이 형성되고, 이때 수면 상의 바를 천천히 움직여 분자를 압축하면 분자들의 소수성기는 수면 위로 위치하고 친수성기는 수면 아래로 위치하면서 분자들 간의 간격이 좁혀져서 막을 형성하도록 하는 방법이다.In general, the basic molecule containing diacetylene is self-assembled in a 2D form, such as a film (Film) using a LB (Langmuir-Blodget) method or a 3D form, such as liposomes, and then used to It is used for detection. Diacetylenes that can be made can also be 2D- and 3D-aligned (Sasaki, DY et al, J. Colloid Interf. Sci. 229, 490 [2000]; Lu, Y. et al. , Nature 410, 913 [2001]; Song, J. et al, J. Am. Chem. Soc. 126, 8459 [2004]; Cheng, Q. et al, Langmuir 16, 5333 [2000]). The LB method dissolves a molecule having both a hydrophilic group and a hydrophobic group in a solvent having a low boiling point (for example, chloroform, etc.), and then drops it on the water to spread it thinly. As the solvent evaporates, a monomer layer is formed on the water surface. At this time, when the bar on the surface of the water is slowly compressed to compress the molecules, the hydrophobic groups of the molecules are located above the surface of the water and the hydrophilic groups are located below the surface of the water, and the gap between the molecules is narrowed to form a film.
목적 물질을 검출하기 위해서는 용액상태로 리포좀이나 세관(tubules)과 같은 형태로 자기조립을 시킨 후 용액 상으로든 배열된 형태로든 검출에 적용될 수 있다(Reppy, et al, U.S. Pat. No. 6,984,528; Charych et al, U.S. Pat. No. 6,001,556; Charych et al, U.S. Pat. No. 6,180,135). 이러한 디아세틸렌류의 자기조립을 위해서는 친수성의 머리(Head) 부분과 소수성의 꼬리(Tail) 부분의 적당한 비율에 의해 구조체를 형성하고, 이를 저온에서 4시간 이상 보관한 후 만들어지는 번거로움이 있다(Okada, S. et al, Acc. Chem. Res. 31, 229 [1998]). 또한 이렇게 만들어진 구조체라 할지라도 용액상에서 목적물질을 검출하기 위해서는 높은 농도가 필요하며, 민감도 또한 좋지 못하다(Carpick, R.W. et al, Langmuir 16, 1270 [2000]).In order to detect a target substance, self-assembly in the form of liposomes or tubules in a solution state may be applied to the detection in the form of a solution or an array (Reppy, et al, US Pat. No. 6,984,528; Charych et al, US Pat. No. 6,001,556; Charych et al, US Pat. No. 6,180,135). For self-assembly of such diacetylenes, a structure is formed by an appropriate ratio of a hydrophilic head portion and a hydrophobic tail portion, which is cumbersome after storing for 4 hours or more at low temperature ( Okada, S. et al, Acc. Chem. Res. 31, 229 [1998]). In addition, even in this structure, a high concentration is required to detect a target substance in solution, and its sensitivity is also poor (Carpick, R. W. et al, Langmuir 16, 1270 [2000]).
한편, 단백질과 같은 생물학적인 분자를 검출하기 위해서는 비특이적인 결합을 해결하여야 한다(Kolusheva, S.et al, J. Am. Chem. Soc. 123, 417 [2001]; Jung, Y.K. et al, Biosens. Bioelectron. 21, 1536-1544 [2006]). 기존 연구에서 사용된 디아세틸렌 모노머는 카르복실기를 가지고 있으며, 따라서 이는 음이온성 계면활성제로서 생물학적인 분자 또는 화학물질 간에 이온결합을 초래할 수 있다(Kolusheva, S. et al, J. Am. Chem. Soc. 122, 776 [2000]). 따라서, 2D 또는 3D 형태의 구조에서 특이적인 관능기를 가지고 있는 모노머를 포함하고 있더라도 주 구성체인 디아세틸렌의 카르복실기는 이온결합에 의한 비특이적인 결합을 형성한다. 이러한 비특이적인 결합을 최소화하기 위하여 UV를 조사하기 전에 소 혈청 알부민(Bovine serum albumin; BSA) 등으로 미리 비특이적인 결합을 시킨 후 특이적인 반응을 수행하는 시도를 하였다. 그러나 반응시간이 경과할수록 소 혈청 알부민에 의한 색의 변화가 나타나게 된다. 따라서 순수하게 특이적인 결합만을 보기 위해서는 이물질이 포함되어 있지 않은 상태에서 목적물질의 반응을 보아야 하므로, 이에 대한 연구가 필요한 실정이다.On the other hand, in order to detect biological molecules such as proteins, nonspecific binding must be resolved (Kolusheva, S. et al, J. Am. Chem. Soc. 123, 417 [2001]; Jung, YK et al, Biosens. Bioelectron. 21, 1536-1544 [2006]). The diacetylene monomers used in previous studies have carboxyl groups, which can result in ionic bonds between biological molecules or chemicals as anionic surfactants (Kolusheva, S. et al, J. Am. Chem. Soc. 122, 776 [2000]). Therefore, even if it contains a monomer having a specific functional group in the 2D or 3D structure, the carboxyl group of the main constituent diacetylene forms a nonspecific bond by ionic bond. In order to minimize such nonspecific binding, an attempt was made to perform a specific reaction after pre-specific binding with bovine serum albumin (BSA) and the like before UV irradiation. However, as the reaction time elapses, the color change caused by bovine serum albumin appears. Therefore, in order to see purely specific binding, it is necessary to study the reaction of the target substance in a state in which foreign substances are not included.
이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 디아세틸렌의 친수성 부분의 관능기를 비이온성기로 치환한 비이온성 디아세틸렌 모노머의 비특이적 반응성이 적은 성질을 이용하여, 외부 노출기가 비이온성기로 치환된 디아세틸렌 모노머를 이용한 발색 센서를 제공하되, 비이온성 디아세틸렌 모노머의 자기조립을 위해 수용성 또는 지용성의 지지체를 이용하고, 특이적 결합을 위해서는 특이적인 관능기로 치환된 디아세틸렌 모노머를 상기 비이온성 디아세틸렌 모노머와 혼합하여 지지체에 자기조립하거나 또는 지지체에 자기조립된 비이온성 디아세틸렌 모노머의 일부를 특이적인 관능기로 치환한 후 중합함으로써 제조되는, 비이온성 디아세틸렌 모노머와 특이적인 관능기를 가진 디아세틸렌 모노머가 지지체에 자기 조립된 후 중합함으로써 제조되는 발색 센서를 제조하고, 이를 목적물질과 반응시켰을 때 반응된 목적물질이 푸른색에서 붉은색으로 변하는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors, in order to solve the above problems, by using the non-specific reactivity of the nonionic diacetylene monomer in which the functional group of the hydrophilic portion of the diacetylene is substituted with a nonionic group, the external exposure group is a nonionic group. To provide a color sensor using a substituted diacetylene monomer, using a water-soluble or fat-soluble support for self-assembly of the non-ionic diacetylene monomer, and for the specific binding to the non-ionic diacetylene monomer substituted with a specific functional group Diacetylene having a specific functional group and a nonionic diacetylene monomer prepared by mixing with a diacetylene monomer to self-assemble on the support or by substituting a portion of the non-ionic diacetylene monomer self-assembled on the support with a specific functional group and then polymerizing After the monomer self-assembles to the support A color sensor manufactured by combining was prepared, and when reacted with the target material, it was confirmed that the reacted target material changed from blue to red color, and completed the present invention.
따라서, 본 발명은 특이적 검출을 위한 발색 센서, 이의 제조방법 및 이를 이용한 검출방법을 제공하고자 한다.Accordingly, the present invention is to provide a color sensor for specific detection, a manufacturing method thereof and a detection method using the same.
본 발명의 일 양태에서는 외부 노출기가 비이온성기로 치환된 디아세틸렌 모노머와 특이적인 관능기를 가진 디아세틸렌 모노머의 혼합액을 지지체에 자기조립한 후 중합함으로써 제조되는 특이적 검출을 위한 발색 센서를 제공한다.An aspect of the present invention provides a color sensor for specific detection, which is prepared by self-assembling a mixture of a diacetylene monomer substituted with a nonionic group and a diacetylene monomer having a specific functional group on a support, followed by polymerization. .
또한, 본 발명은In addition,
1) 외부 노출기가 비이온성기로 치환된 디아세틸렌 모노머와 특이적인 관능기를 가진 디아세틸렌 모노머를 유기용매에 녹여 혼합하는 단계,1) mixing a diacetylene monomer in which the external exposure group is substituted with a nonionic group and a diacetylene monomer having a specific functional group in an organic solvent, and then mixing
2) 상기 혼합 용액에 지지체를 담그는 단계,2) dipping the support in the mixed solution,
3) 상기 지지체를 꺼낸 후 지지체의 용매를 건조시켜 자기조립하는 단계, 및3) taking out the support and drying the solvent of the support to self-assemble, and
4) 상기 지지체에 자기조립된 디아세틸렌 모노머를 중합하는 단계를 포함하는 상기 발색 센서의 제조방법을 제공한다.4) It provides a method for producing the color sensor comprising the step of polymerizing the self-assembled diacetylene monomer on the support.
이하, 상기 본 발명의 구체적 양태를 상세히 설명한다.Hereinafter, specific embodiments of the present invention will be described in detail.
본 발명에 따른 발색 센서는 금이나 형광물질과 같은 표지 형식이 아닌 비표지 방식으로 목적물질을 검출하는 센서에 관한 것으로, 디아세틸렌의 외부로 노출되는 음이온성 관능기인 카르복실기를 비이온성인 히드록시기로 치환시킨 비이온성 디아세틸렌 모노머(PDA-OH)와, 목적물질과 특이적 결합을 할 수 있는 특이적인 관능기를 포함하는 디아세틸렌 모노머(PDA-리간드)를 혼합한 후, 이를 지지체에 자기조립시켜 중합하는 것을 특징으로 한다.The color sensor according to the present invention relates to a sensor for detecting a target substance in a non-labeled manner, not a label type such as gold or fluorescent substance, and replacing a carboxyl group, an anionic functional group exposed to the outside of diacetylene, with a nonionic hydroxyl group. A nonionic diacetylene monomer (PDA-OH) and a diacetylene monomer (PDA-ligand) containing a specific functional group capable of specific binding with a target substance, and then self-assembled onto a support to polymerize. It is characterized by.
상기 디아세틸렌은 양친성 분자로서, 수용액상에서 리포좀 및 다양한 구조체를 형성할 수 있다. 이렇게 형성된 구조체는 UV에 조사되었을 때 다양한 색을 나타내게 되는데, 색을 가진 폴리디아세틸렌은 온도, 특이적인 결합, 비특이적인 결합 등과 같은 요인에 의해 붉은색 쪽으로 변하게 된다. 또한 붉은색 쪽으로 변할수록 그 형광의 세기는 강하게 나타나게 된다. 수용액상에서 만들어진 폴리디아세틸렌 구조체는 특이적 반응에 의해 색의 변화가 유도되지만, 이를 위해서는 고농도의 목적물질이 요구되고 비특이적 반응으로 인한 색 변화의 단점이 있다. 특히 비특이적 반응에 대한 문제점은 목적물질의 검출에 중요하게 작용한다. 따라서 이런 비특이적인 반응을 최소화하는 비이온성 디아세틸렌의 합성과 사용으로 구조체를 형성하여 적용해야 한다.The diacetylene is an amphiphilic molecule, which can form liposomes and various structures in an aqueous solution. The structure thus formed has various colors when irradiated with UV. The colored polyacetylene is changed to red color due to factors such as temperature, specific binding, and nonspecific binding. In addition, the intensity of the fluorescence becomes stronger as it turns toward red color. The polydiacetylene structure made in the aqueous solution is induced a change in color by a specific reaction, but this requires a high concentration of the target material and has the disadvantage of color change due to non-specific reaction. In particular, problems with nonspecific reactions play an important role in the detection of the target substance. Therefore, it is necessary to form and apply a structure by synthesizing and using nonionic diacetylene which minimizes this nonspecific reaction.
따라서, 본 발명에서는 비특이적인 결합을 최소화하기 위하여 디아세틸렌의 친수성 부분의 관능기를 비이온성기로 치환한 비이온성 디아세틸렌 모노머의 비특이적 반응성이 적은 성질을 이용하였다. 그러나 본 발명에서와 같이 히드록시기로 치환된 비이온성 디아세틸렌 모노머(PDA-OH)는 수용액상에서 베시클(vesicle)이나 다른 구조체를 형성하기 어렵다. 비이온성인 히드록시기로 치환된 디아세틸렌 모노머(PDA-OH)가 수용액 상에서 구조체를 형성하기 위해서는 친수성 부분의 친수성이 보다 큰 다른 모노머(PDA-COOH 또는 PDA-NH2 등)가 필요하다. 그러나, 이와 같이 친수성이 큰 이온성 디아세틸렌에는 비특이적인 결합이 존재하므로, 목적물질과의 반응에서 비특이적 반응으로 인해 색 변화가 일어날 수 있다.Therefore, in the present invention, in order to minimize nonspecific binding, the nonspecific reactivity of the nonionic diacetylene monomer in which the functional group of the hydrophilic portion of the diacetylene is substituted with a nonionic group is used. However, as in the present invention, a nonionic diacetylene monomer (PDA-OH) substituted with a hydroxy group is difficult to form a vesicle or other structure in an aqueous solution. In order for the non-hydroxyl-substituted diacetylene monomer (PDA-OH) to form a structure in an aqueous solution, another monomer having a higher hydrophilicity of the hydrophilic portion (such as PDA-COOH or PDA-NH 2 ) is required. However, since non-specific binding exists in the ionic diacetylene having high hydrophilicity, color change may occur due to non-specific reaction in reaction with a target substance.
본 발명은 이와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 비이온성 디아세틸렌 모노머가 친수성기 없이도 자기조립할 수 있게 하는 수용성 또는 지용성의 지지체를 사용하는 것을 특징으로 한다.In order to solve this problem, the present invention is characterized by using a water-soluble or fat-soluble support that allows the nonionic diacetylene monomer to self-assemble without a hydrophilic group.
본 발명의 바람직한 양태에서는 비특이적인 결합을 최소화하기 위하여 히드록시기로 치환된 비이온성 디아세틸렌(PDA-OH)을 사용하되, 특이적 결합을 유도하기 위하여 특이적인 관능기를 가진 디아세틸렌(PDA-리간드)을 상기 히드록시기로 치환된 디아세틸렌과 다양한 농도 비율로 유기용매에 녹여 혼합한 후, 이를 수용성 또는 지용성 막과 같은 지지체 상에서 자기조립시킴으로써, 베시클 뿐만 아니라 다양한 구조체를 형성하는 발색 센서를 제조할 수 있었다. 이때 형성된 자기조립 층은 혼합 농도와 지지체의 크기에 따라 단층에서 다층으로 다양하게 만들 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention, a nonionic diacetylene (PDA-OH) substituted with a hydroxy group is used to minimize nonspecific binding, but a diacetylene (PDA-ligand) having a specific functional group is used to induce specific binding. By dissolving and mixing the diacetylene substituted with the hydroxy group in an organic solvent at various concentration ratios, and then self-assembled on a support such as a water-soluble or fat-soluble film, it was possible to manufacture a color sensor to form various structures as well as vesicles. At this time, the formed self-assembly layer can be made from a single layer to a multi-layer depending on the mixing concentration and the size of the support.
상기 특이적인 관능기로는 단백질, 항체, 항원, DNA, RNA, 효소, 바이오틴, 말레이미드 및 지질류(lipid)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.The specific functional group may be selected from the group consisting of proteins, antibodies, antigens, DNA, RNA, enzymes, biotin, maleimide and lipids (lipid), but is not limited thereto.
상기 유기용매는 클로로포름, 벤젠, 에탄올, 시클로헥산, 헥산, 메틸렌 클로라이드, 아세토니트릴 및 사염화탄소로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.The organic solvent may be selected from one or more selected from the group consisting of chloroform, benzene, ethanol, cyclohexane, hexane, methylene chloride, acetonitrile and carbon tetrachloride, but is not limited thereto.
상기 지지체는 일반적으로 사용하는 여과용 필터 등 다양한 막을 사용할 수 있다. 바람직하게는 폴리프로필렌(Polypropylene; PP), 폴리비닐 클로라이드(Polyvinyl chloride; PVC), 폴리카보네이트(Polycarbonate; PC), 폴리테트라플루오로에틸렌(Polytetrafluoroethylene; PTFE), 폴리비닐리덴 플루오라이드(Polyvinylidene fluoride; PVDF), 혼합 셀룰로오스 에스테르(Mixed cellulose esters; MCE), 니트레이트 셀룰로오스(Nitrate cellulose; NC), 폴리에테르 설폰(Polyether sulfone; PES) 및 나일론(Nylon; NYL)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.As the support, various membranes such as filtration filters that are generally used may be used. Preferably, polypropylene (PP), polyvinyl chloride (PVC), polycarbonate (PC), polytetrafluoroethylene (PTFE), polyvinylidene fluoride (PVDF) ), Mixed cellulose esters (MCE), nitrate cellulose (NC), polyether sulfone (PES) and nylon (Nylon; NYL).
이렇게 제조된 센서에 UV 등으로 중합반응(Polymerization)을 유도하면 중합된 부분은 푸른색을 가지게 되며, 이는 목적물질과 반응하여 붉은색 쪽으로 변하게 된다. 이렇게 변한 색은 육안으로 뿐만 아니라 좁은 영역 내에서의 반응에 대한 변화는 광학현미경 등을 통해 확인이 가능하며, 또한 붉은색 쪽으로 변한 것은 형광으로도 검출이 가능하다. 이렇게 변한 색의 정도를 수치화하면 미지의 목적 물질 농도도 계산할 수도 있게 된다.Inducing the polymerization reaction (Polymerization) in the UV sensor or the like is a polymerized part has a blue color, which is reacted with the target material turns red. The changed color is not only visible to the naked eye, but the change in the reaction in a narrow region can be confirmed by an optical microscope, and the change in the red color can be detected by fluorescence. By quantifying the degree of color change, unknown concentrations of the target substance can be calculated.
본 발명의 다른 양태에서는, 외부 노출기가 비이온성기로 치환된 디아세틸렌 모노머를 지지체에 자기조립한 후, 상기 비이온성기의 일부를 특이적인 관능기로 치환한 후 중합함으로써 제조되는 발색 센서를 제공한다.In another aspect of the present invention, there is provided a color sensor prepared by self-assembling a diacetylene monomer in which an external exposure group is substituted with a nonionic group to a support, and then substituting a part of the nonionic group with a specific functional group for polymerization. .
예를 들어, 상기 자기조립된 디아세틸렌 모노머의 비이온성기의 일부를 화학물질(예를 들어, 시아노겐 브로마이드(CNBr))과 반응시키면, 비이온성기의 일부가 아민기와 쉽게 반응할 수 있는 특이적인 관능기로 변하게 된다. 이러한 특이적인 관능기를 포함하는 디아세틸렌 모노머를 UV 조사로 중합한 후, 아민기(NH2)를 포함하는 물질인 목적물질과 반응시키면 목적물질의 색이 붉은색 쪽으로 변하게 된다. 또한 반응 후에도 디아세틸렌 모노머에 비이온성기가 남아있게 되므로, 비특이적 반응을 최소화할 수 있다.For example, when a portion of the nonionic group of the self-assembled diacetylene monomer is reacted with a chemical (eg, cyanogen bromide (CNBr)), a portion of the nonionic group may easily react with the amine group. It becomes a functional group. After the polymerization of the diacetylene monomer containing such a specific functional group by UV irradiation, and reacted with the target material, which is a material containing an amine group (NH 2 ) to change the color of the target material toward the red color. In addition, since the nonionic group remains in the diacetylene monomer even after the reaction, the nonspecific reaction can be minimized.
상기 아민기를 포함하는 물질인 목적물질은 단백질, 항체, 항원, DNA, RNA, 효소, 화학물질 및 지질류(lipid)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.The target material, which is a substance including the amine group, may be selected from the group consisting of proteins, antibodies, antigens, DNA, RNA, enzymes, chemicals, and lipids, but is not limited thereto.
나아가, 본 발명의 발색 센서는 다양한 모양 및 크기를 가지는 금 나노 또는 은 나노 입자를 더 포함하여 제조될 수 있다. 즉, 상기 금 나노 또는 은 나노 입자가 포함된 용매를 디아세틸렌류(PDA-OH 또는 PDA)와 혼합하여 상기 설명한 바와 동일한 본 발명에 따른 방법으로 센서를 제조하고, 이의 일정 부분에만 UV를 조사하여 중합된 디아세틸렌류와 나노입자가 혼합된 색을 나타내는 센서를 제조할 수 있다.Furthermore, the color sensor of the present invention may be manufactured further comprising gold nanoparticles or silver nanoparticles having various shapes and sizes. That is, by mixing the solvent containing the gold nano or silver nanoparticles with diacetylenes (PDA-OH or PDA) to prepare a sensor by the method according to the present invention as described above, by irradiating UV only a portion thereof A sensor exhibiting a color in which polymerized diacetylenes and nanoparticles are mixed can be manufactured.
본 발명에 따른 발색 센서의 제조방법을 도 1을 참조하여 상세히 설명한다.A method of manufacturing a color sensor according to the present invention will be described in detail with reference to FIG. 1.
히드록시기로 치환된 비이온성 디아세틸렌 모노머(PDA-OH)와 특이적인 관능기를 가진 디아세틸렌 모노머(PDA-리간드)를 다양한 농도 비율(0:10, 2:8, 4:6, 6:4, 8:2, 10:0)로 유기용매에 녹여 혼합한다(A1). 상기 혼합 용액에 지지체를 담근다(A2). 상기 혼합 용액에 담궈진 지지체를 꺼낸 후(A3), 자연적으로 용매를 건조시키면 히드록시기로 치환된 비이온성 디아세틸렌(PDA-OH)과 특이적인 관능기를 가진 디아세틸렌(PDA-리간드)이 지지체에 자기조립된다(A4). 이러한 방법에 따르면, 기존의 2D, 3D 구조체보다 매우 빠른 시간(1~2 분) 내에 센서를 제조할 수 있다. 이렇게 제조된 센서는 2차, 3차적으로 관능기를 치환하는 단계를 더 포함할 수도 있다(A5).Nonionic diacetylene monomer (PDA-OH) substituted with a hydroxy group and a diacetylene monomer (PDA-ligand) having a specific functional group were used at various concentration ratios (0:10, 2: 8, 4: 6, 6: 4, 8). : 2, 10: 0), dissolved in an organic solvent and mixed (A1). Soak the support in the mixed solution (A2). After removing the support immersed in the mixed solution (A3), when the solvent is dried naturally, a nonionic diacetylene (PDA-OH) substituted with a hydroxy group and a diacetylene (PDA-ligand) having a specific functional group are magnetized to the support. It is assembled (A4). According to this method, the sensor can be manufactured in a much faster time (1-2 minutes) than the existing 2D and 3D structures. The sensor thus manufactured may further include a step of substituting functional groups on a secondary and tertiary basis (A5).
상기 제조된 발색 센서에 목적물질을 반응시키기 위하여, 센서 전체 또는 원하는 부분에만 UV(254 ㎚)를 조사하여 중합시킨다(A6). 특정 부분에만 UV를 조사하기 위하여, 다양한 방법이 사용될 수 있으나, 편리하게 본 발명에서는 원하는 부분을 패턴화한 마스크를 이용하여 패턴된 부분에만 UV가 조사되도록 하는 방법을 실시하였다. 조사시간에 따라 중합된 부분의 색이 다르게 만들어질 수도 있다. 이렇게 자기조립된 지지체 역시 디아세틸렌에 의한 형광 검출의 특성도 가지고 있다. 따라서 목적 물질과의 반응 후 육안으로 색의 변화를 관찰할 수 있을 뿐만 아니라 소량의 농도에 대한 검출은 형광을 통해 확인할 수 있다.In order to react the target substance with the manufactured color sensor, the whole or desired portion of the sensor is irradiated with UV (254 nm) to polymerize (A6). In order to irradiate UV only to a specific part, various methods may be used, but in the present invention, a method of irradiating UV only to a patterned part using a mask patterned on a desired part was performed. Depending on the irradiation time, the color of the polymerized portion may be made different. This self-assembled support also has the characteristic of fluorescence detection by diacetylene. Therefore, not only can the color change be observed with the naked eye after the reaction with the target substance, but the detection of a small concentration can be confirmed through fluorescence.
상기와 같이 제조된 발색 센서는, 도 2a로부터 알 수 있는 바와 같이, “KRIBB" 글자 모양이 패턴된 마스크를 이용하여 글자 부분에만 UV를 조사한 후 이를 에탄올로 세척하면 푸른색이던 “KRIBB" 글자 부분이 붉은색으로 변한 것을 알 수 있다. 이는 본 발명에 따른 발색 센서에서 디아세틸렌의 자기조립에 의해 지지체(예를 들어, 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF))[도 2c 및 도 2d] 막의 기공 크기가 자기조립 전[도 2b]보다 줄어든 것으로 확인될 수 있다. 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope; SEM)으로 확인을 위해 사용된 모노머는 10 mM PDA-OH 로서 이는 디아세틸렌의 초기 농도에 따라 단층 또는 다층으로 자기조립이 형성될 수 있 음을 보여준다. 따라서, 보다 높은 농도에서 자기조립을 하였을 경우 같은 시간 동안 UV를 조사하면 변화된 색이 점점 진하게 나타나게 된다.As can be seen from Figure 2a, the color sensor manufactured as described above, the "KRIBB" letter pattern pattern using a mask irradiated with UV light only in the letter portion and then washed with ethanol "KRIBB" letter portion was blue You can see that it turned red. This is because the pore size of the support (eg polyvinylidene fluoride (PVDF)) [FIGs. 2C and 2D] membranes is reduced by self-assembly of diacetylene in the color sensor according to the present invention than before self-assembly [FIG. 2B]. It can be confirmed that. The monomer used for identification by Scanning Electron Microscope (SEM) is 10 mM PDA-OH, which shows that self-assembly can be formed in a single layer or multiple layers depending on the initial concentration of diacetylene. Therefore, when the self-assembly at a higher concentration is irradiated with UV for the same time, the changed color appears darker.
또한, 본 발명은 상기 발색 센서를 이용한 목적물질의 검출방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for detecting a target substance using the color sensor.
본 발명에 따른 발색 센서에서 PDA-OH의 함유량에 따른 목적물질 검출의 최적 농도를 찾기 위하여, 히드록시기로 치환된 비이온성 디아세틸렌 모노머(PDA-OH)와 특이적인 관능기를 가진 디아세틸렌 모노머(PDA-리간드)를 다양한 몰농도 비율(0:10, 2:8, 4:6, 6:4, 8:2, 10:0)로 제조한 센서에 다양한 농도의 스트렙트아비딘(streptavidin)을 반응시켰을 경우(도 3), PDA-바이오틴 : PDA-OH의 몰비가 4:6 일 때 가장 민감하고 진한 색의 변화를 나타냄을 알 수 있다(도 4). 또한, 높은 농도의 스트렙트아비딘에서 유색 변화가 있지만, 형광으로 확인할 경우 보다 낮은 농도에서의 변화까지도 검출이 가능하다는 것을 확인할 수 있다(도 5).In order to find the optimum concentration of the target substance detection according to the content of PDA-OH in the color sensor according to the present invention, a nonionic diacetylene monomer (PDA-OH) substituted with a hydroxy group and a diacetylene monomer having a specific functional group (PDA- Ligand) reacted with various concentrations of streptavidin in a sensor made at various molar ratios (0:10, 2: 8, 4: 6, 6: 4, 8: 2, 10: 0) 3, it can be seen that the most sensitive and dark color change when the molar ratio of PDA-biotin: PDA-OH is 4: 6 (Fig. 4). In addition, although there is a color change in the high concentration of streptavidin, it can be confirmed that even a change in the lower concentration can be detected by fluorescence (FIG. 5).
본 발명에 따른 발색 센서는 비표지 및 특이적 검출을 위한 것으로, 현재까지 이용되고 있는 금 입자나 형광 표지 방식 등으로 적용하고 있는 진단 시스템을 대체할 뿐만 아니라 다양한 화학 센서 등 비표지 방식이지만 유색 및 형광 등을 이용한 검출이 모두 가능하므로, 그 응용이 폭넓게 사용될 수 있다.The color sensor according to the present invention is for non-labeling and specific detection, and replaces a diagnostic system applied to gold particles or fluorescent labeling methods, which are used until now, as well as non-labeling methods such as various chemical sensors. Since all detection using fluorescence etc. is possible, the application can be used widely.
예를 들어, 본 발명의 일 실시예로서, 발색 센서를 구성하는 디아세틸렌에 치환된 특이적인 관능기로 말레이미드를 사용한 경우, 말레이미드 말단이 pH 7~9와 실온에서 -SH와 반응성이 좋은 점을 이용하여, 지지체를 완충용액에 포함되어 있는 단백질(-SH 포함)과 반응시켜서 단백질 또는 항체-항원 센서를 제조할 수 있다. 또한, 특이적인 관능기로 화학물질을 사용한 경우 화학센서(chemosensor)로 제조될 수 있다.For example, as an embodiment of the present invention, when maleimide is used as a specific functional group substituted with diacetylene constituting the color sensor, the maleimide terminal has good reactivity with -SH at pH 7-9 and room temperature. By using, the support may be reacted with a protein (including -SH) included in the buffer to prepare a protein or antibody-antigen sensor. In addition, when a chemical is used as a specific functional group, it may be manufactured as a chemical sensor.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 발색 센서는 세포, 항체-항원, 단백질-단백질 상호작용, 효소기질 반응, 바이러스, 리간드, 에피토프, 압타머, 아미노산, 탄수화물, 지방, 스테로이드, 핵산, DNA, RNA, 화학물질, 다양한 이온들의 검출에 유용하므로, 바이오 센서뿐만 아니라 화학센서로도 유용하게 이용할 수 있다.As described above, the color sensor according to the present invention is a cell, antibody-antigen, protein-protein interaction, enzyme substrate reaction, virus, ligand, epitope, aptamer, amino acid, carbohydrate, fat, steroid, nucleic acid, DNA, RNA Because it is useful for the detection of chemicals and various ions, it can be used not only as a biosensor but also as a chemical sensor.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are merely provided to more easily understand the present invention, and the contents of the present invention are not limited thereto.
실시예Example 1 One : 다양한 혼합비의 센서의 제조 : Manufacturing of Sensors of Various Mixing Ratios
비이온성 히드록시기로 치환된 디아세틸렌 모노머(PDA-OH)와, 바이오틴으로 치환된 디아세틸렌 모노머(PDA-바이오틴)를 다양한 농도 비율(0:10, 2:8, 4:6, 6:4, 8:2, 10:0)로 클로로포름에 녹였다.Diacetylene monomer (PDA-OH) substituted with a nonionic hydroxy group and diacetylene monomer (PDA-biotin) substituted with biotin were used at various concentration ratios (0:10, 2: 8, 4: 6, 6: 4, 8). : 2, 10: 0) in chloroform.
상기 각 농도별 용액에 0.5㎝×3㎝ 크기의 지용성 막인 폴리비닐리덴 플루오라이드(polyvinylidene fluoride)를 담갔다가 뺀 후 용매를 자연 건조시켜 센서를 제조하였다.A sensor was prepared by immersing and subtracting polyvinylidene fluoride, which is a 0.5 cm × 3 cm sized fat-soluble film, in the solution for each concentration.
초기 선택한 모노머의 농도는 10 mM (PDA-OH + PDA-바이오틴)이지만, 희석 또는 더 높은 농도의 용액을 통해 각각 다른 센서를 제조할 수도 있다.The concentration of the initially selected monomer is 10 mM (PDA-OH + PDA-Biotin), but different sensors can also be prepared via dilution or higher concentration solutions.
실시예Example 2 2 : 다양한 형태로 : In various forms 패턴(Pattern)된Patterned 센서의 제조 Manufacture of sensors
상기 실시예 1에서 제조된 센서에 다양한 모양(KRIBB, 원형, 띠 모양)의 마스크를 이용하여 UV를 조사한 후 에탄올로 세척하였다. 그 다음 주사전자현미 경(Scanning Electron Microscope; SEM)으로 색변화를 관찰하였다.The sensor prepared in Example 1 was irradiated with UV using a mask of various shapes (KRIBB, circular, band-shaped) and washed with ethanol. Then, the color change was observed with a scanning electron microscope (SEM).
UV 조사 시간(10sec, 30sec, 1min)의 조절로 나타나는 색의 진하기를 조절할 수도 있다.It is also possible to adjust the darkness of the color represented by the adjustment of the UV irradiation time (10 sec, 30 sec, 1 min).
결과는 도 2에 나타내었다.The results are shown in Fig.
도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 발색 센서에 "KRIBB" 글자 부분의 마스크를 이용하여 글자 부분에만 UV가 조사되도록 한 후, 이를 에탄올로 세척하면 푸른색이던 "KRIBB" 글자 부분이 붉은 색으로 변한 것을 확인할 수 있었다.As shown in Figure 2, after using the mask of the "KRIBB" letter portion of the color sensor according to the present invention so that UV is irradiated only on the letter portion, and washed with ethanol, the "KRIBB" letter portion of the blue color was red It could be confirmed that changed to.
실시예Example 3 3 : 목적물질의 검출 방법 : Detection of target substance
상기 실시예 1에서 제조된 발색 센서에 UV를 조사하여 나타난 푸른색 계열 영역 위에 목적물질인 스트렙트아비딘(streptavidin)을 다양한 농도(1.0, 0.5, 0.2, 0.1, 0.02, 0.01 mg/ml)로 반응시켜 색의 변화를 육안 및 형광으로 확인하였다. 대조군으로는 소 혈청 알부민(Bovine Serum Albumin; BSA)을 고농도(2 mg/ml)로 사용하였다.Reaction of the target substance streptavidin (streptavidin) at various concentrations (1.0, 0.5, 0.2, 0.1, 0.02, 0.01 mg / ml) on the blue-based region indicated by UV irradiation to the color sensor prepared in Example 1 The change in color was visually confirmed by fluorescence. As a control, bovine serum albumin (Bovine Serum Albumin; BSA) was used at a high concentration (2 mg / ml).
결과는 도 4 및 도 5에 나타내었다.The results are shown in FIGS. 4 and 5.
도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 발색 센서에 다양한 농도의 스트렙트아비딘(streptavidin)을 반응시켰을 경우, PDA-바이오틴 : PDA-OH이 몰비 4:6으로 혼합되었을 때 가장 민감하고 진한 색의 변화를 나타내었다.As shown in Figure 4, when reacted with various concentrations of streptavidin (streptavidin) to the color sensor of the present invention, the most sensitive and dark color change when PDA-biotin: PDA-OH mixed in a molar ratio 4: 6 Indicated.
또한, 도 5에 나타난 바와 같이, PDA-바이오틴 : PDA-OH이 몰비 4:6으로 혼합된 발색 센서를 스트렙트아비딘과 반응시킨 후 형광으로 확인한 경우, 낮은 농도에서의 변화까지도 검출이 가능하였다.In addition, as shown in Figure 5, PDA-biotin: PDA-OH when the color sensor mixed with a molar ratio of 4: 6 reacted with streptavidin and confirmed by fluorescence, it was possible to detect even changes in low concentrations.
본 발명에 따른 발색 센서는 목적 물질과 반응하여 반응된 목적 물질이 푸른색에서 붉은색으로 변하게 되고, 변화된 부분은 형광을 가지게 된다. 본 발명에 따른 발색 센서에서 반응 전/후에 변화되는 색은 육안, 일반적인 광학현미경 또는 형광을 이용하여 식별할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 발색 센서는 현재까지 이용되고 있는 금 입자나 형광 표지 방식 등으로 적용하고 있는 진단 시스템을 대체할 뿐만 아니라 다양한 화학 센서 등 비표지 방식이지만 유색 및 형광 등을 이용한 검출이 모두 가능하므로, 그 응용이 폭넓게 사용될 수 있다.In the color sensor according to the present invention, the target substance reacted with the target substance is changed from blue to red, and the changed portion has fluorescence. The color changing before and after the reaction in the color sensor according to the present invention can be identified using the naked eye, a general optical microscope or fluorescence. Therefore, the color sensor according to the present invention not only replaces the diagnostic system applied to the gold particles or fluorescent labeling methods currently used, but also a non-labeling method such as various chemical sensors, but can detect both color and fluorescence. Therefore, the application can be widely used.
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2006
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