KR101211962B1 - Generation composition for induced pluripotent stem cells with Bmi1, G9aHMTase inhibitor and DMNT inhibitor treatment and method of manufacturing induced pluripotent stem cells using the same - Google Patents

Generation composition for induced pluripotent stem cells with Bmi1, G9aHMTase inhibitor and DMNT inhibitor treatment and method of manufacturing induced pluripotent stem cells using the same Download PDF

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KR101211962B1 KR1020100043697A KR20100043697A KR101211962B1 KR 101211962 B1 KR101211962 B1 KR 101211962B1 KR 1020100043697 A KR1020100043697 A KR 1020100043697A KR 20100043697 A KR20100043697 A KR 20100043697A KR 101211962 B1 KR101211962 B1 KR 101211962B1
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Abstract

본 발명은 a) Bmi1 (B cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site 1) 단백질 또는 Bmi1 단백질을 코딩하는 핵산분자; 및 b) G9aHMTase 억제제와 DMNT 억제제를 포함하는 체세포로부터 배아줄기세포 유사세포로의 역분화를 유도하는 조성물 및 이를 이용한 배아줄기세포 유사세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 기존의 역분화 유도 주요인자인 4개 유전자 (Oct4, Sox2, Klf4, and C-Myc/Oct4, Sox2, Nanog, Lin28) 외에 새로운 인자인 Bmi1 유전자 하나만을 도입하고 저분자성 화학물질인 G9aHMTase 억제제와 DMNT 억제제를 처리하여 상대적으로 간단한 방법으로 역분화 유도 인자의 수를 최소화하면서 전분화능을 갖는 배아줄기세포 유사세포를 제공할 수 있는 이점이 있다. The present invention provides a) Bmi1 (B cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site 1) protein or a nucleic acid molecule encoding Bmi1 protein; And b) a composition which induces the differentiation of embryonic stem cell-like cells from somatic cells comprising a G9aHMTase inhibitor and a DMNT inhibitor, and a method for producing embryonic stem cell-like cells using the same. According to the present invention, in addition to four genes (Oct4, Sox2, Klf4, and C-Myc / Oct4, Sox2, Nanog, Lin28), which are the main factors for inducing differentiation, only one new Bmi1 gene is introduced and a low molecular weight chemical By treating the G9aHMTase inhibitor and the DMNT inhibitor, there is an advantage of providing embryonic stem cell-like cells having pluripotency while minimizing the number of dedifferentiation inducing factors in a relatively simple manner.

Description

Ｂｍｉ１, Ｇ９ａＨＭＴａｓｅ 억제제와 ＤＭＮＴ 억제제를 이용하여 체세포로부터 배아줄기세포 유사세포로의 역분화를 유도하는 조성물 및 이를 이용한 배아줄기세포 유사세포의 제조방법{Generation composition for induced pluripotent stem cells with Bmi1, G9aHMTase inhibitor and DMNT inhibitor treatment and method of manufacturing induced pluripotent stem cells using the same}Composition composition for inducing differentiation of somatic cells from embryonic stem cell-like cells by using a bacillium inhibitor and a DNA inhibitor and a method for producing embryonic stem cell-like cells using the same (Generation composition for induced pluripotent stem cells with Bmi1, G9aHMTase inhibitor and DMNT inhibitor treatment and method of manufacturing induced pluripotent stem cells using the same}

본 발명은 Bmi1, G9aHMTase 억제제와 DMNT 억제제를 이용하여 체세포로부터 배아줄기세포 유사세포로의 역분화를 유도하는 조성물 및 이를 이용한 배아줄기세포 유사세포의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 Bmi1 유전자를 도입하고 저분자성 물질 G9aHMTase 억제제와 DMNT 억제제를 처리하여 체세포로부터 리프로그래밍 과정을 통해 배아줄기세포와 같은 세포를 유도하는 새로운 조성물 및 이를 이용한 역분화를 위한 새로운 배아줄기세포 유사세포 제조방법을 제시하는 것이다.The present invention relates to a composition for inducing differentiation of somatic cells from embryonic stem cell-like cells using Bmi1, G9aHMTase inhibitors and DMNT inhibitors, and a method for producing embryonic stem cell-like cells using the same. More specifically, the present invention provides a novel composition for introducing a Bmi1 gene and treating a low molecular weight G9aHMTase inhibitor and a DMNT inhibitor to induce cells, such as embryonic stem cells, through reprogramming from somatic cells, and new embryos for reverse differentiation using the same. It is to suggest a method for producing stem cell-like cells.

줄기세포는 정상적인 체세포와 다르게 무한히 분열할 수 있는 능력을 가지며 적합한 환경 조건 아래에서 특정 세포로 분화하는 능력을 가진다. 그 분화 능력은 줄기세포의 특성에 따라 전분화능(pluripotency), 다분화능(multipotency), 또는 단일분화능(unipotency) 으로 정의되어진다. 따라서 줄기세포를 배양을 통해 증식시킨 후 특정 세포로 분화를 시키는 기술은 세포 치료라는 측면에서 여러 질병을 치료할 수 있는 잠재력을 가지고 있다 할 수 있다. Stem cells, unlike normal somatic cells, have the capacity to divide indefinitely and to differentiate into specific cells under suitable environmental conditions. The differentiation capacity is defined as pluripotency, multipotency, or unipotency depending on the characteristics of the stem cells. Therefore, the technique of proliferating stem cells through culturing and then differentiating them into specific cells has the potential to treat various diseases in terms of cell therapy.

조혈줄기세포(hematopoietic stem cell), 골수줄기세포(bone marrow stem cell), 신경 줄기세포(neural stem cell) 등의 줄기세포는 성체에서도 존재하므로 환자 본인으로부터 추출할 수 있어 질병 치료 시 면역 거부반응이라는 문제점을 극복할 수 있는 장점이 있다. 이러한 장점은 기존의 장기이식에서 장기 제공자의 확보가 어려웠던 부분을 극복할 수 있다. Since hematopoietic stem cells, bone marrow stem cells, and neural stem cells are also present in the adult body, they can be extracted from the patient himself. There is an advantage that the problem can be overcome. These advantages can overcome difficulties in securing long-term providers in existing organ transplants.

하지만, 지금까지 알려진 견해에 따르면 성체줄기세포는 단지 다분화능으로, 분화할 수 있는 능력에 한계를 가진다. 이는 곧 조직 특이줄기세포는 같은 조직유형의 세포로만 분화할 수 있다는 것인데, 중추신경계(central nervous system) (Science 255, 1707-1710 1992; Science 287, 1433-1438 2000), 골수(bone marrow) (Science 276, 71-74, 1997; Science 287, 1442-1446, 2000; Science 284, 143-147, 1999), 망막(retina) (Science 287, 2032-2036, 2000)와 골격근(skeletal muscle) (Proc. Natl Acad. Sci. USA 96, 14482-14486, 1999; Nature 401, 390-394, 1999)에서 분리된 줄기세포는 분화능력 역시 유사조직 계통으로만 분화가 가능하다는 것을 의미한다. 그 예로 조혈줄기세포(hematopoietic stem cell)는 혈액에 관련된 세포로, 신경줄기세포(neural stem cell)는 신경세포(neuron) 또는 신경아교세포(glial cell)로, 골수줄기세포(bone marrow stem cell)는 중배엽세포(mesodermal cell)로 분화가 가능하다. 뿐만 아니라 이론적으로 무한히 증식 가능한 성체줄기세포이지만, 현재까지의 보고로는 이러한 성체줄기세포를 인 비트로(in vitro) 상에서 증식시키는데 어려움이 있으며 실제 환자로부터 많은 양의 세포를 분리해 내는 것 또한 어렵다.However, according to heretofore known observations, adult stem cells are only multipotent and have a limited ability to differentiate. This is because tissue-specific stem cells can only differentiate into cells of the same tissue type, including the central nervous system (Science 255, 1707-1710 1992; Science 287, 1433-1438 2000), bone marrow (Science 287, 2032-2036, 2000) and the skeletal muscle (Proc < RTI ID = 0.0 > The ability of the differentiated stem cells to differentiate into the pseudotypical system can be differentiated from that of the stem cells isolated from Natl Acad Sci USA 96, 14482-14486, 1999 (Nature 401, 390-394, 1999). For example, hematopoietic stem cells are blood-related cells, neural stem cells are neurons or glial cells, and bone marrow stem cells are mesoderm. Differentiation into cells (mesodermal cell) is possible. In addition, it is theoretically infinitely proliferating adult stem cells, but to date, it has been difficult to propagate these adult stem cells in vitro and it is also difficult to separate large amounts of cells from actual patients.

전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell)는 앞에서 열거한 성체줄기세포가 가지고 있던 여러 가지 단점들을 극복해 줄 수 있는 훌륭한 자원이다. 이 세포는 인체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화가 가능하며 인비트로(in vitro) 상에서 무한히 증식이 가능하다. 현재까지 알려진 전분화능 줄기세포로는 배아줄기세포(embryonic stem cell), 배아생식세포(embryonic germ cell), 배아종양세포(embryonic carcinoma cell)가 있으며 그 중 배아줄기세포는 가장 많은 연구가 이루어져 특정 세포들로의 분화 방법 및 동물질병 모델 연구한 기능성 검증과 임상 이용시 다양한 질병들에 대한 치료 가능성을 보여주었다. Pluripotent stem cells are a great resource to overcome the many drawbacks of the adult stem cells listed above. These cells are capable of differentiating into all kinds of cells constituting the human body and infinitely proliferating in vitro. To date, embryonic stem cells (embryonic stem cells), embryonic germ cells, and embryonic carcinoma cells are among the known pluripotent stem cells. Among them, embryonic stem cells are the most studied, We have demonstrated the possibility of treating various diseases in clinical use and functional testing of animal models of differentiation and animal models.

하지만 이러한 배아줄기세포 역시 성체줄기세포처럼 임상이용을 위해 극복해야만 하는 단점들이 존재한다. 우선, 배아줄기세포를 얻기 위해서는 수정된 배아를 파괴해야 하므로 윤리적인 문제점을 가지고 있으며 배아줄기에서 분화된 세포를 환자에 이식했을 경우 면역 거부반응이 일어난다는 문제점을 가지고 있다. However, these embryonic stem cells also have disadvantages that must be overcome for clinical use like adult stem cells. First, in order to obtain embryonic stem cells, the modified embryo must be destroyed. Therefore, it has an ethical problem, and it has a problem that immune rejection occurs when transplanted cells are transplanted into a patient.

때문에 배아줄기세포의 이러한 문제점들을 극복하기 위해서 다양한 접근 방법이 시도되었는데 그 중 가장 각광을 받은 것이 분화된 세포에서 미분화된 세포로의 역분화 유도 (reprogramming)이다. 역분화는 분화된 세포를 이용하여 배아줄기세포와 같은 전분화능 줄기세포를 만들어내는 것을 총칭하며, 이러한 방법으로는 1) 핵치환 (nuclear transfer), 2) 핵융합 (cell fusion), 3) 세포추출물 처리 (cell extract treatment), 그리고 4) 유전자 도입을 통한 역분화(induced pluripotent stem cell;iPS cell) 기술이 있다 (Cell 132, 567-582, 2008). Therefore, various approaches have been attempted to overcome these problems of embryonic stem cells, the most prominent of which is the reprogramming of differentiated cells from undifferentiated cells. Reverse differentiation collectively refers to the generation of pluripotent stem cells, such as embryonic stem cells, using differentiated cells, such as 1) nuclear transfer, 2) cell fusion, and 3) cell extracts. Cell extract treatment, and 4) induced pluripotent stem cell (iPS cell) technology (Cell 132, 567-582, 2008).

iPS cell 기술은 현재까지 연구되어 오던 어떤 기술보다 배아줄기세포에 가까운 세포를 만들어 내는데 성공했으며 이러한 결과와 기작을 증명하기 위해 처음 기술이 발표되었던 2006년 이후 현재까지 수많은 연구 논문들이 쏟아져 나오고 있는 실정이다. 기본적으로는 마우스 또는 인간의 체세포에 4개의 유전자 (역분화 유도인자; Oct4, Sox2, Klf4, and C-Myc/Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)를 도입한 후 배아줄기세포 배양조건에서 장기간 배양 했을 경우 배아줄기세포와 유사한 특성의 줄기세포가 확립될 수 있었으며 이는 배아줄기세포와의 유전자발현 (gene expression), 후성학적 특성 (epigenetics), 인 비트로/인 비보 (in vitro/in vivo) 에서의 삼배엽성 분화 능력 (three germ layer differentiation), 테라토마 (teratoma) 형성 능력, 키메라 마우스 생성 (chimeric mouse generation) 그리고 키메라 마우스의 생식 가능 (germline transmission) 등의 특성이 상당히 유사한 것으로 증명되었다 (Cell 126, 663-676, 2006; Science 318, 1917-1920, 2007). iPS cell technology has succeeded in producing cells that are closer to embryonic stem cells than any other technology that has been studied so far, and numerous research papers have been pouring out since 2006 when the technology was first published to prove these results and mechanisms. . Basically, four genes (de-differentiation inducer; Oct4, Sox2, Klf4, and C-Myc / Oct4, Sox2, Nanog, Lin28) were introduced into mouse or human somatic cells and cultured in embryonic stem cell culture conditions for a long time. In this case, stem cells with similar characteristics to embryonic stem cells could be established, which are three times in gene expression, epigenetics, and in vitro / in vivo. Three germ layer differentiation, teratoma formation ability, chimeric mouse generation, and germline transmission of chimeric mice have been shown to be quite similar (Cell 126, 663-). 676, 2006; Science 318, 1917-1920, 2007).

하지만, 이러한 역분화 과정의 기작은 역분화 유도를 위해 사용된 유전자의 수가 너무 많아 자세한 기작을 규명하기 어렵기 때문에 현재까지 밝혀진 수준이 미미한 상태이다. 또한, 역분화 유도기술이 확립이 되었음에도 실제 치료적용을 위해서는 기술적으로 간편하고 효율이 높은 방법을 계속해서 개발해야만 하고 이렇게 개발된 기술들은 모두 효율과 안전성 측면에서 평가되어야 한다. However, the mechanism of this dedifferentiation process is so small that it is difficult to elucidate the detailed mechanism because the number of genes used to induce dedifferentiation is too small. In addition, despite the establishment of dedifferentiation induction technology, a technically simple and efficient method must be continuously developed for actual therapeutic application, and all of the developed technologies must be evaluated in terms of efficiency and safety.

최근 발표된 연구 결과에 따르면, 암억제 유전자인 p53의 비활성화 (inactivation)는 iPS 세포의 생성 효율을 증가시킨다고 보고되었다 (Nature 460, 1132-1135, 2009). p53유전자는 Ink4a/Arf locus에 의해 조절되는데 이 locus는 선택적 스플라이싱 (alternative splicing)에 의해 발현이 조절되며 Arf 에 의해 생성된 p19Arf 는 p53유전자를, Ink4a에 의해 생성된 p16Ink4a 는 Rb 유전자의 발현을 유도하는 것으로 알려져 있다. 이 두 가지 유전자 p16Ink4a 와 p19Arf 의 발현을 억제 시킨 경우 p19Arf 만을 억제시킨 경우 보다 iPS 생성 효율이 증가되었다는 보고도 있다 (Nature, 460, 1140-1144, 2009).Recently published studies have reported that inactivation of the cancer suppressor gene p53 increases the production efficiency of iPS cells (Nature 460, 1132-1135, 2009). The p53 gene is regulated by the Ink4a / Arf locus, which is regulated by selective splicing. p19 Arf produced by Arf is the p53 gene and p16 Ink4a produced by Ink4a is the Rb gene. It is known to induce the expression of. Inhibition of the expression of these two genes, p16 Ink4a and p19 Arf , has been reported to increase iPS production efficiency compared to the inhibition of p19 Arf alone (Nature, 460, 1140-1144, 2009).

Polycomb group(PcG) 단백질은 후생유전학적 유전자 억제자 (epigenetic gene silencer)로써 PcG 단백질의 하나인 Bmi1은 p16Ink4a 와 p19Arf의 발현을 억제시킴으로써 p53과 Rb의 발현을 억제시킨다고 보고 되어있다 (Genes Dev, 2678-2690, 1999). 또한 Bmi1은 염색질(chromatin)의 구조를 변화시켜 타겟 유전자의 발현을 억제한다고 알려져 있으며 이러한 특성으로 인해 신경줄기세포 (neural stem cell) 및 조혈줄기세포 (hematopoietic stem cell)의 자가재생 (self-renewal)에서 중요한 역할을 수행한다고 알려져 있다. 이에 따라 본 발명자들의 기존 연구에서는 마우스의 성상세포(astrocyte)에 Bmi1을 과발현(overexpression) 시켜 신경줄기세포(neural stem cell)로의 역분화에 성공했음을 보고 하였으며 이렇게 역분화된 신경줄기세포의 특성은 실제 마우스에서 분리한 신경줄기세포와 상당 부분 유사하였는데 그 중 역분화 유도인자 중 하나이자 신경줄기세포의 자가재생에 중요한 역할을 하는 유전자인 Sox2의 발현이 증가됨을 확인하였다 (Biochem Biophys Res Commun. 371, 267-272, 2008). Polycomb group (PcG) protein is an epigenetic gene silencer. One of the PcG proteins, Bmi1, has been reported to inhibit the expression of p53 and Rb by inhibiting the expression of p16 Ink4a and p19 Arf (Genes Dev). , 2678-2690, 1999). In addition, Bmi1 is known to inhibit the expression of target genes by altering the structure of chromatin, and this property is responsible for the self-renewal of neural stem cells and hematopoietic stem cells. It is known to play an important role. Accordingly, the present inventors reported that Bmi1 was overexpressed in the astrocytes of the mouse and succeeded in the differentiation into neural stem cells. The characteristics of the de-differentiated neural stem cells in the mouse It was similar to the isolated neural stem cells. Among them, the expression of Sox2, one of the de-differentiation inducing factors and an important role in the self-renewal of neural stem cells, was increased (Biochem Biophys Res Commun. 371, 267-272, 2008).

일반 체세포의 경우 역분화를 하기 위해서는 4개 (Oct4, Sox2, Klf4, C-Myc) 혹은 3개(Oct4, Sox2, Klf4)의 유전자가 필요하지만 이 유전자를 내재적으로 발현(endogenously expression) 하는 세포에 한해서는 유전자의 도입이 추가적으로 필요하지는 않은 것으로 알려져 있다. 그중 대표적인 것이 마우스/사람의 신경줄기세포에 Oct4 유전자 하나만을 도입하여 역분화줄기세포를 확립했다는 연구 결과이며 이는 신경줄기세포가 내재적으로 Sox2, Klf4, C-Myc을 발현하기 때문이다 (Nature, 461, 649-653, 2009). Normal somatic cells require 4 genes (Oct4, Sox2, Klf4, C-Myc) or 3 genes (Oct4, Sox2, Klf4) in order to dedifferentiate, but to endogenously expressing cells It is known that no additional introduction of genes is necessary. Representative among them is the result of research that established only differentiated stem cells by introducing only one Oct4 gene into mouse / human neural stem cells, because neural stem cells intrinsically express Sox2, Klf4 and C-Myc (Nature, 461, 649). -653, 2009).

또한, 역분화 유도 과정에서 G9aHMTase 억제제와 DMNT 억제제를 처리함으로써 리프로그래밍의 효율을 향상시킬 수 있다고 보고된 바 있다 (Cell Stem Cell, 3, 568-574, 2008). In addition, it has been reported that treatment of G9aHMTase inhibitors and DMNT inhibitors can improve reprogramming efficiency in the process of inducing differentiation (Cell Stem Cell, 3, 568-574, 2008).

그러나 아직까지 Bmi1 유전자 도입과 화학물질 처리에 의해서 역분화 유도가 가능하고 이를 이용하여 전분화능을 가진 배아줄기세포 유사세포를 제조하는 방법은 알려진 바가 없다.
However, there is no known method of producing embryonic stem cell-like cells having pluripotency by inducing differentiation by introducing Bmi1 gene and processing chemicals.

따라서 본 발명자들은 상기와 같은 점을 감안하여 마우스의 체세포에 Bmi1 유전자를 도입하고 EGF가 제외된 신경줄기세포의 배양 조건에서 상배엽 줄기세포 유사세포 (epiblast stem cell like cells)로의 유도가 가능하다는 것을 확인하였다. 이 때 형성된 신경구와 같은 세포에 현재까지 보고된 저분자성 물질 중에 BIX02194 (G9a histone methyltransferase (G9a HMTase) inhibitor)와 RG108 (DNA methyltransferase (DMNT) inhibitor)을 처리하고 마우스 배아줄기세포 배양 조건에서 배양을 한 결과 배아줄기세포와 유사한 특성을 지니는 역분화 줄기세포주가 형성이 되는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과를 바탕으로 하여, Bmi1 유전자만이 도입된 세포에 저분자성 물질, BIX02194 (G9a histone methyltransferase (G9a HMTase) inhibitor)와 RG108 (DNA methyltransferase (DMNT) inhibitor)을 처리하고 배아줄기세포의 배양 조건에서 배양한 결과 배아줄기세포와 유사한 형태의 세포군을 확립할 수 있었으며 이렇게 확립된 세포군은 유전자발현 (gene expression), 후성학적 특성 (epigenetics), 테라토마 (teratoma) 형성 능력이 마우스 배아줄기세포와 매우 유사함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. Therefore, the present inventors confirmed that the Bmi1 gene was introduced into somatic cells of the mouse and induced to epiblast stem cell like cells under culture conditions of neural stem cells excluding EGF. It was. In this case, BIX02194 (G9a histone methyltransferase (G9a HMTase) inhibitor) and RG108 (DNA methyltransferase (DMNT) inhibitor) were treated with low molecular weight substances reported so far to cells such as neurospheres and cultured in mouse embryonic stem cell culture conditions. As a result, it was confirmed that dedifferentiated stem cell lines having similar characteristics to embryonic stem cells were formed. Based on these results, the Bmi1 gene-treated cells were treated with a low molecular weight substance, BIX02194 (G9a histone methyltransferase (G9a HMTase) inhibitor) and RG108 (DNA methyltransferase (DMNT) inhibitor) and cultured in embryonic stem cells. The culture resulted in the establishment of a cell population similar in shape to embryonic stem cells. The established cell populations are very similar to mouse embryonic stem cells in terms of gene expression, epigenetics, and teratoma formation. By confirming that the present invention was completed.

따라서 본 발명은 Bmi1 유전자 및 저분자성 물질인 G9aHMTase 억제제와 DMNT 억제제를 이용하여 체세포로부터 배아줄기세포 유사세포로의 역분화를 유도하는 조성물을 제공하는 것이다.Accordingly, the present invention provides a composition for inducing the differentiation of somatic cells into embryonic stem cell-like cells using the Bmi1 gene and G9aHMTase inhibitors and DMNT inhibitors, which are low molecular weight substances.

본 발명의 다른 목적은 Bmi1 유전자 및 저분자성 물질인 G9aHMTase 억제제와 DMNT 억제제를 이용하여 체세포로부터 배아줄기세포와 유사한 특성을 지니는 전분화성 역분화 줄기세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for producing pluripotent dedifferentiated stem cells having characteristics similar to embryonic stem cells from somatic cells using the Bmi1 gene and G9aHMTase inhibitors and DMNT inhibitors, which are low molecular weight substances.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 방법으로 생산된 배아줄기세포 유사세포를 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide an embryonic stem cell-like cell produced by the above method.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명자들은 마우스 체세포에 Bmi1 유전자가 도입되고 배양조건을 조절하여 형성된 상배엽 줄기세포 유사세포 (epiblast stem cell like cells)에 저분자성 물질 (G9aHMTase 억제제와 DMNT 억제제)을 처리한 후 배아줄기세포의 배양 조건에서 배양할 경우, 이미 분화된 세포 타입인 체세포가 전분화능을 가지는 배아줄기세포 유사세포로 역분화 (de-differentiation) 되는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다. The present inventors cultured embryonic stem cells after treatment of low molecular weight substances (G9aHMTase inhibitor and DMNT inhibitor) to epiblast stem cell like cells formed by introducing Bmi1 gene into mouse somatic cells and controlling culture conditions. When cultured under the conditions, it was found that somatic cells, already differentiated cell types, were de-differentiated into embryonic stem cell-like cells having pluripotency.

본 발명의 일 양태로서, 본 발명은 a) Bmi1 (B cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site 1) 단백질 또는 Bmi1 단백질을 코딩하는 핵산분자; 및 b) G9aHMTase 억제제(G9a histone methyltransferase inhibitor)와 DMNT 억제제 (DNA methyltransferase inhibitor)를 포함하는 체세포로부터 배아줄기세포 유사세포로의 역분화를 유도하는 조성물을 제공한다.As one aspect of the invention, the invention is a) Bmi1 (B cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site 1) protein or a nucleic acid molecule encoding the Bmi1 protein; And b) G9a histone methyltransferase inhibitor and a DMNT inhibitor (DNA methyltransferase inhibitor).

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 ⅰ) Bmi1(B cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site 1) 단백질 또는 Bmi1 단백질을 코딩하는 핵산분자를 체세포에 도입하는 단계; ⅱ) bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)를 포함하는 신경줄기세포 배양조건에서 배양하는 단계; 및 ⅲ) G9aHMTase 억제제와 DMNT 억제제를 처리하는 단계를 포함하여 구성되는 체세포로부터 배아줄기세포 유사세포를 제조하는 방법을 제공한다.In another embodiment of the present invention, the present invention comprises the steps of: i) introducing a B cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site 1) protein or a nucleic acid molecule encoding Bmi1 protein into somatic cells; Ii) culturing in neural stem cell culture conditions including basic Fibroblast Growth Factor (bFGF); And iii) treating a G9aHMTase inhibitor and a DMNT inhibitor to provide a method for producing embryonic stem cell-like cells from somatic cells.

본 발명에서 용어, "배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC) 유사 세포"는 전분화성을 가지는 세포를 의미하며, 형질전환 없는 증식, 무한증식, 자가-재생산 및 3종류의 모든 배아 층으로부터 유래된 어떠한 세포로 발달할 수 있는 능력을 포함하는 배아줄기세포의 특성을 의미하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에서 배아줄기세포 유사세포는 배아줄기세포, 유도된 전분화성 줄기세포, 또는 유도 만능 줄기세포로도 기술되기도 한다. As used herein, the term "embryonic stem cell (ESC) -like cell" refers to a cell having pluripotency, and is derived from all three embryonic layers without proliferation, endless growth, self-reproduction and transformation without transformation. Refers to the characteristics of embryonic stem cells, including but not limited to the ability to develop into any cell. Embryonic stem cell-like cells in the present invention may also be described as embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells, or induced pluripotent stem cells.

본 발명의 배아줄기세포 유사세포를 유도함에 있어서, 출발 체세포의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 임의의 체세포를 이용할 수 있다. 예를 들어, 태아기(embryonic period)의 체세포 이외에 성숙한(matured) 체세포를 이용해도 된다. 배아줄기세포 유사세포를 질병의 치료에 이용하는 경우에는 환자로부터 분리된 체세포를 이용하는 것이 바람직하며, 예를 들어, 질병에 관여하는 체세포나 질병치료에 관여하는 체세포 등을 이용할 수 있다. 바람직하게는 상기 체세포는 섬유아세포이며, 본 발명에서 섬유아세포는 인간과 마우스, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물 유래의 모든 섬유아세포를 포함한다.In inducing embryonic stem cell-like cells of the present invention, the type of starting somatic cell is not particularly limited, and any somatic cell may be used. For example, mature somatic cells may be used in addition to somatic cells of the embryonic period. When embryonic stem cell-like cells are used for the treatment of a disease, it is preferable to use somatic cells isolated from the patient. For example, somatic cells involved in the disease or somatic cells involved in the disease treatment can be used. Preferably, the somatic cells are fibroblasts, and in the present invention, the fibroblasts include all fibroblasts derived from animals such as humans, mice, horses, sheep, pigs, goats, camels, antelopes, and dogs.

섬유아세포 세포는 배지에서 배양한 후 사용될 수 있는데, 상기 섬유아세포를 배양하는 배지는 당해 분야에서 섬유아세포 배양에 통상적으로 사용되는 배지를 모두 포함한다. 배양에 사용되는 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 DMEM (high glucose, w/o sodium pyruvate) + 10% FBS (Fetal bovine serum) + 0.1mM non-essential amino acid + 1% penicilin/streptomycin + 0.1mM β-mercaptoethanol) 배지에서 배양하였다. Fibroblast cells can be used after culturing in a medium, the medium for culturing the fibroblasts includes all media commonly used in the culture of fibroblasts. The medium used for culturing generally contains a carbon source, a nitrogen source and a trace element component. In a specific embodiment of the present invention in DMEM (high glucose, w / o sodium pyruvate) + 10% Fe bovine serum (FBS) + 0.1 mM non-essential amino acid + 1% penicilin / streptomycin + 0.1 mM β-mercaptoethanol) Incubated.

본 발명의 Bmi1은 단백질 또는 이의 단백질을 코딩하는 핵산의 형태로 제공된다. 본 발명의 Bmi1은 인간과 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물 유래의 모든 Bmi1를 포함하며, 바람직하게는 인간 Bmi1이다. 또한, 배아줄기세포 유사세포로의 역분화에 사용되는 본 발명의 Bmi1 단백질은 이의 야생형(wild type)의 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 Bmi1 단백질의 변이체를 포함한다. Bmi1 of the present invention is provided in the form of a protein or a nucleic acid encoding the protein thereof. Bmi1 of the present invention includes all Bmi1 derived from humans and animals such as horses, sheep, pigs, goats, camels, antelopes, dogs, and preferably human Bmi1. In addition, the Bmi1 protein of the present invention used for reverse differentiation into embryonic stem cell-like cells includes variants of the Bmi1 protein as well as proteins having their wild type amino acid sequences.

상기 Bmi1 단백질의 변이체란 Bmi1의 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 상기 변이체는 천연 단백질과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 기능적 등가물이거나 필요에 의해서 단백질의 물리 화학적 성질이 변형된 변이체일 수 있다. 물리, 화학적 환경에 대한 구조적 안정성이 증대되거나 생리학적 활성이 증대된 변이체이다.The variant of the Bmi1 protein refers to a protein in which the natural amino acid sequence of Bmi1 and one or more amino acid residues have different sequences by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof. The variant may be a functional equivalent exhibiting the same biological activity as the native protein or a variant in which the physicochemical properties of the protein are modified as necessary. It is a variant with increased structural stability to physicochemical environment or enhanced physiological activity.

바람직하게는, Bmi1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산의 형태로 제공된다. Preferably, it is provided in the form of a nucleic acid having a nucleotide sequence encoding a Bmi1 protein.

상기 Bmi1을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 야생형 또는 상기한 바와 같은 변이체 형태의 Bmi1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로서, 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 천연에서 분리되거나 화학적 합성법을 이용하여 제조할 수 있다.The nucleotide sequence encoding the Bmi1 is a nucleotide sequence encoding a Bmi1 protein in wild-type or variant form as described above, wherein one or more bases can be mutated by substitution, deletion, insertion, or a combination thereof, It may be prepared using chemical synthesis.

상기한 Bmi1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자(게놈, cDNA) 또는 RNA 분자일 수 있다. Nucleic acid having a nucleotide sequence encoding the above Bmi1 protein may be single or double chain, DNA molecules (genome, cDNA) or RNA molecules.

상기 Bmi1 단백질을 코딩하는 핵산은 당 분야의 공지 방법, 예를 들어 벡터 형태의 네이키드 DNA로 세포내로 도입하거나(Wolff et al. Science,1990: Wolffet al. J Cell Sci. 103:1249-59, 1992), 리포좀(Liposome), 양이온성 고분자(Cationic polymer)등을 이용하여 세포내로 도입될 수 있다. 리포좀은 유전자 도입을 위하여 DOTMA나 DOTAP 등의 양이온성 인지질을 혼합하여 제조한 인지질 막으로, 양이온성의 리포좀과 음이온성의 핵산이 일정 비율로 혼합하면 핵산-리포좀 복합체가 형성된다. The nucleic acid encoding the Bmi1 protein may be introduced into cells in a manner known in the art, for example, as naked DNA in the form of a vector (Wolff et al. Science, 1990: Wolffet al. J Cell Sci. 103: 1249-59, 1992), liposomes, cationic polymers (Cationic polymer) can be introduced into the cell. Liposomes are phospholipid membranes prepared by mixing cationic phospholipids such as DOTMA or DOTAP for gene introduction. When liposomes and anionic nucleic acids are mixed in a proportion, a nucleic acid-liposomal complex is formed.

본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. As used herein, the term "vector" refers to a gene construct, which is an expression vector capable of expressing a protein of interest in a suitable host cell, and which contains essential regulatory elements operably linked to express the gene insert.

본 발명에서 용어, "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 재조합벡터와의 작동적 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다. As used herein, the term "operably linked" refers to a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence and a nucleic acid sequence encoding a desired protein to perform a general function. Operational linkage with recombinant vectors can be prepared using genetic recombination techniques well known in the art, and site-specific DNA cleavage and ligation employs enzymes commonly known in the art.

본 발명의 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다. The vector of the present invention may include a signal sequence or a leader sequence for membrane targeting or secretion in addition to an expression regulatory element such as a promoter, an operator, an initiation codon, a stop codon, a polyadenylation signal, an enhancer, and the like. The promoter of the vector may be constitutive or inducible. In addition, the expression vector includes a selectable marker for selecting a host cell containing the vector, and includes a replication origin in the case of a replicable expression vector. The vector may be self-replicating or integrated into the host DNA.

벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 바람직하게는, 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스(Retrovirus), 예를 들어 HIV(Human immunodeficiency virus) MLV(Murineleukemia virus) ASLV(Avian sarcoma/leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus), MMTV(Mouse mammary tumor virus) 등, 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 관련 바이러스(Adeno-associatedvirus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 등에서 유래한 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는, Bmi1 유전자의 경우 MLV-기반-바이러스 벡터 (Moloney leukemia virus based virus vector)로 푸로마이신에 대한 선별마커를 포함하는 pBabe puro 벡터를 이용하였다.Vectors include plasmid vectors, cosmid vectors, viral vectors, and the like. Preferably, it is a viral vector. Viral vectors are retroviruses such as Human immunodeficiency virus HIV (Murineleukemia virus) Avian sarcoma / leukosis (ASLV), Spleen necrosis virus (SNV), Rous sarcoma virus (RSV), and Mouse mammary tumor viruses, such as, but are not limited to, vectors derived from Adenovirus, Adeno-associated virus, Herpes simplex virus, and the like. In a specific embodiment of the present invention, for the Bmi1 gene, a pBabe puro vector containing a selection marker for puromycin was used as a MLV-based-virus vector (Moloney leukemia virus based virus vector).

본 발명의 구체적인 실시예에서는, pBabe puro 벡터에 Bmi1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(NCBI accession No. L13689)을 삽입하여 제조한 벡터(pBabe puro Bmi1)를 광범위한 포유류 숙주세포에 감염이 가능한 고역가바이러스를 생성하는 패키징 세포인 PT67 세포에 형질전환시켜 Bmi1 단백질을 발현하는 바이러스를 제조하여 섬유아세포를 감염시켰다.
In a specific embodiment of the present invention, a vector (pBabe puro Bmi1) prepared by inserting a nucleotide sequence (NCBI accession No. L13689) encoding a Bmi1 protein into a pBabe puro vector generates a high titer virus capable of infecting a wide range of mammalian host cells. PT67 cells, which are packaging cells, were transformed to prepare a virus expressing Bmi1 protein to infect fibroblasts.

상기 방법의 (ⅱ) 단계의 신경줄기세포 배양 조건은 당해 분야에서 신경줄기세포 배양에 통상적으로 사용되는 배지를 모두 포함한다. 다만 bFGF(basic Fibroblast Growth Factor)를 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 EGF (Epidermal Growth Factor)을 제외하고 bFGF만을 포함한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 DMEM/F12 + B27 + N2 + 1% penicillin/streptomycin + 20 ng/ml bFGF를 이용하였다. 상기 배양조건에서 배양하였을 때, 생식세포(germ cell)와 같은 세포가 형성된다 (도 1a 및 도 1b 참조).
Neural stem cell culture conditions of step (ii) of the method includes all of the medium commonly used in the culture of neural stem cells in the art. However, it is characterized in that it comprises a bFGF (basic Fibroblast Growth Factor). Preferably only bFGF is excluded, except for EGF (Epidermal Growth Factor). In a specific embodiment of the present invention, DMEM / F12 + B27 + N2 + 1% penicillin / streptomycin + 20 ng / ml bFGF was used. When cultured in the above culture conditions, cells such as germ cells are formed (see FIGS. 1A and 1B).

구체적인 일 양태에 의하면, 본 발명은 상기 단계 ⅱ)에서 7일 배양하는 것을 특징으로 한다. 상기 배양기간을 거쳐야 배아줄기세포에서 발현되는 주요 유전자들의 발현과 유사한 발현양상을 보이고 세포치료 등으로 사용시 분화효율을 높일 수 있다.
According to a specific aspect, the present invention is characterized in that the culture in step ii) 7 days. Only after the culture period shows an expression pattern similar to the expression of the main genes expressed in embryonic stem cells can be used to increase the differentiation efficiency when used as a cell therapy.

상기 단계 ⅲ)에서 G9aHMTase 억제제란 G9a 히스톤 메틸트랜스퍼라아제 (histon methlytransferase)를 억제하고, H3K9me2를 생성시키는 물질들을 의미한다. In step iii), the G9aHMTase inhibitor refers to a substance that inhibits G9a histone methyltransferase and generates H3K9me2.

상기 G9aHMTase (G9a histon methlytransferase)는 일반적으로 히스톤의 lysine 잔기에 메틸화 (methylation)를 유도할 수 있는 메틸트랜스퍼라아제 (methyltransferase)에 SET (Suvar3-9, Enhancer-of-zeste,Trithorax) 도메인이라고 하는 특이적 효소활성 도메인을 공유하고 있다. The G9aHMTase (G9a histon methlytransferase) is a specificity called SET (Suvar3-9, Enhancer-of-zeste, Trithorax) domain in methyltransferase that can induce methylation at lysine residues of histones. It has an enzymatic activity domain.

본 발명의 조성물에 포함되는 G9aHMTase 억제제는 바람직하게는 BIX01294를 의미한다. 상기 BIX01294는 2-(Hexahydro-4-methyl-1H-1,4-diazepin-1-yl)-6,7-dimethoxy-N-[1-(phenylmethyl)-4-piperidinyl]4-quinazolinamine으로 표시된다. 그러나, 상기 화합물 외에도 모든 G9aHMTase 억제제가 본 발명의 범주에 속하게 됨은 당업자에게 있어서 자명하다.
The G9aHMTase inhibitor included in the composition of the present invention preferably means BIX01294. The BIX01294 is represented by 2- (Hexahydro-4-methyl-1H-1,4-diazepin-1-yl) -6,7-dimethoxy-N- [1- (phenylmethyl) -4-piperidinyl] 4-quinazolinamine . However, it will be apparent to those skilled in the art that all G9aHMTase inhibitors in addition to the above compounds fall within the scope of the present invention.

본 발명에서 "DMNT 억제제"란 DMNT (DNA methyltransferase)를 억제하는 물질들을 의미한다. 본 발명의 조성물에 포함되는 DMNT 억제제는 바람직하게는 RG108을 의미한다. 상기 RG108은 N-Phthalyl-L-tryptophan으로 표시된다. 그러나 상기 화합물 외에도 모든 DMNT 억제제가 본 발명의 범주에 속하게 됨은 당업자에게 있어서 자명하다.In the present invention, "DMNT inhibitor" refers to substances that inhibit DMNT (DNA methyltransferase). DMNT inhibitor included in the composition of the present invention preferably means RG108. RG108 is represented by N-Phthalyl-L-tryptophan. However, it will be apparent to those skilled in the art that all DMNT inhibitors in addition to the above compounds fall within the scope of the present invention.

상기 저분자성 물질 G9aHMTase 억제제와 DMNT 억제제는 시중에서 구입(Stemolecule™)하여 사용하거나 제조하여 사용할 수 있으며 상기 억제제 처리에 의해 역분화 효율이 증가된다 (Cell Stem Cell, 3, 568-574, 2008).The low molecular weight G9aHMTase inhibitors and DMNT inhibitors are commercially available (Stemolecule ™) or can be prepared and used to increase the reverse differentiation efficiency by the inhibitor treatment (Cell Stem Cell, 3, 568-574, 2008).

상기 G9aHMTase 억제제와 DMNT 억제제는 배지에 처리하면 된다. 상기 배지에 유효 농도로 포함되도록 한다. 배지의 종류 및 배양방법 등 당분야에서 잘 알려진 요소에 따라 유효농도는 영향을 받을 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 BIX01294 1μＭ과 RG108 0.5μＭ 의 양으로 처리하였다.The G9aHMTase inhibitor and the DMNT inhibitor may be treated in a medium. It is included in the medium at an effective concentration. Effective concentrations may be affected by factors well known in the art, such as media type and culture method. In a specific embodiment of the present invention, BIX01294 1 μM and RG108 0.5 μM were treated.

본 발명의 구체적인 양태로서, 상기 방법은 ⅳ) 배아줄기세포의 배양 조건에서 배양하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 배아줄기세포 배양 조건은 당해 분야에서 배아줄기세포 배양에 통상적으로 사용되는 배지를 모두 포함한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 지지세포가 있는 조건에서 하이 글루코오즈 DMEM에 15% FBS (Fetal bovine serum) + 1 % nonessential amino acid +1% penicillin/streptomycin + 0.1mM β-mercaptoethanol + 1000 unit/ml mouse LIF (leukemia inhibitory factor)의 배양액에서 배양하면서 2-3일에 한 번씩 계대 배양을 하였다.
As a specific embodiment of the present invention, the method is characterized in that it further comprises the step of culturing in culture conditions of embryonic stem cells. The embryonic stem cell culture conditions include all of the medium commonly used in the culture of embryonic stem cells. In a specific embodiment of the present invention, 15% FBS (Fetal bovine serum) + 1% nonessential amino acid + 1% penicillin / streptomycin + 0.1 mM β-mercaptoethanol + 1000 unit / ml mouse in high glucose DMEM Subcultures were performed every 2-3 days while incubated in LIF (leukemia inhibitory factor) media.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 배아줄기세포 유사세포를 제공한다.As another aspect of the present invention, the present invention provides an embryonic stem cell-like cell prepared by the above method.

본 발명의 역분화 방법으로 제조된 배아줄기세포 유사세포는 유전자발현 (gene expression), 후성학적 특성 (epigenetics), 인 비트로/인 비보 (in vitro/in vivo)에서의 삼배엽성 분화 능력 (three germ layer differentiation), 테라토마 (teratoma) 형성 능력, 키메라 마우스 생성(chimeric mouse generation)이 마우스 배아줄기세포와 매우 유사한 것을 확인하였다.
Embryonic stem cell-like cells prepared by the reverse differentiation method of the present invention are gene expression, epigenetics, in vitro / in vivo three germ differentiation ability (three germ) It was confirmed that layer differentiation, teratoma formation ability, and chimeric mouse generation were very similar to mouse embryonic stem cells.

본 발명의 배아줄기세포 유사세포는 다양한 타입의 세포를 제공하는 좋은 소스(source)이다. 예를 들면, 상기 배아줄기세포 유사세포는 세포 분화를 위한 조건의 배지에서 배양하여 조혈세포, 신경세포, 베타세포, 간세포, 연골세포, 상피세포, 요로 세포 및 이의 유사 세포로 분화 유도될 수 있다. Embryonic stem cell-like cells of the present invention are good sources for providing various types of cells. For example, the embryonic stem cell-like cells may be induced to differentiate into hematopoietic cells, neurons, beta cells, hepatocytes, chondrocytes, epithelial cells, urinary tract cells and similar cells by culturing in a medium for cell differentiation. .

배아줄기세포 유사세포가 분화하기 위한 배지 조건 및 방법은 Palacios, et al., PNAS. USA, 92:7530-7537(1995), Pedersen, J. Reprod. Fertil. Dev., 6;543-552(1994), 및 Bain et al., Dev. Biol, 168:342-357(1995)에 개시되어 있다. 상기 배아줄기세포 유사세포는 이식을 통해서 수많은 치료에 응용될 수 있다. 상기 배아줄기세포 유사세포는 당뇨병, 파킨스병, 알츠하이머병, 암, 척수 손상, 다발성 경화, 근위축성 측삭 경화증(루게릭병), 근이영양증, 간 질환, 고 콜레스테롤 혈증, 심장 질환, 연골 대체, 창상, 족부 궤양, 위장병, 혈관질환, 신장 질환, 요로 질환, 노화관련 질환 및 상태와 같은 수많은 질병 또는 질환 치료에 응용할 수 있다. 그 외, 본 발명의 배아줄기세포 유사세포는 약물개발 시 평가 등에도 응용될 수 있다.
Media conditions and methods for differentiation of embryonic stem cell-like cells are described in Palacios, et al., PNAS. USA, 92: 7530-7537 (1995), Pedersen, J. Reprod. Fertil. Dev., 6; 543-552 (1994), and Bain et al., Dev. Biol, 168: 342-357 (1995). The embryonic stem cell-like cells can be applied to numerous treatments through transplantation. The embryonic stem cell-like cells are diabetes, Parkin's disease, Alzheimer's disease, cancer, spinal cord injury, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis (Lou Gehrig's disease), muscular dystrophy, liver disease, hypercholesterolemia, heart disease, cartilage replacement, wound, It can be applied to the treatment of numerous diseases or disorders such as foot ulcers, gastrointestinal diseases, vascular diseases, kidney diseases, urinary tract diseases, aging-related diseases and conditions. In addition, the embryonic stem cell-like cells of the present invention can be applied to evaluation during drug development.

상술한 바와 같이, 본 발명에 의하면 Bmi1을 도입하고 저분자성 물질 G9aHMTase 억제제와 DMNT 억제제를 처리하여 체세포를 전분화능을 가진 역분화 줄기세포로 유도할 수 있다. 본 발명에 의해 역분화된 배아줄기세포 유사세포는 예를 들어, 심근세포, 인슐린 생산세포, 또는 신경세포 등의 세포로 분화하여 심부전, 인슐린의존성 당뇨병, 파킨슨병이나 척수손상 등 다양한 질환에 대한 줄기세포 이식요법에 이용할 수 있으며, 사람배아를 이용하는 윤리적 문제나 이식 후의 거부반응을 회피할 수 있으므로 극히 유용하다. 또한, 유도 전분화성 줄기세포를 분화시켜서 생기는 각종 세포(예를 들어, 심근세포, 간세포 등)는 화합물, 약제, 독물 등의 약효나 독성을 평가하기 위한 시스템으로서 유용하게 사용될 수 있다.As described above, according to the present invention, by introducing Bmi1 and treating the low molecular weight G9aHMTase inhibitor and the DMNT inhibitor, somatic cells can be induced into dedifferentiated stem cells having pluripotency. Embryonic stem cell-like cells differentiated by the present invention are differentiated into cells such as cardiomyocytes, insulin-producing cells, or neurons, for example, stems for various diseases such as heart failure, insulin-dependent diabetes mellitus, Parkinson's disease or spinal cord injury. It can be used for cell transplantation and is extremely useful because it can avoid ethical problems using human embryos and rejection after transplantation. In addition, various cells (eg, cardiomyocytes, hepatocytes, etc.) generated by differentiating induced pluripotent stem cells can be usefully used as a system for evaluating the efficacy or toxicity of compounds, drugs, poisons and the like.

또한, 본 발명은 기존의 유도인자 유전자 도입 없이 Bmi1이라는 하나의 유전자의 도입과 저분자성 화학물질 처리라는 상대적으로 간단한 방법만으로 역분화 배아줄기세포 유사세포를 제조할 수 있어, 유전자 도입 없는 세포주를 확립하는데 기반이 되는 기술을 제공하는 줄기세포분야에 매우 유용한 발명이라고 할 수 있다.
In addition, the present invention can be used to prepare a differentiated embryonic stem cell-like cells by the introduction of a single gene, Bmi1 and treatment of low molecular weight chemicals without the introduction of conventional inducer genes, thereby establishing a cell line without gene introduction. It can be said that the invention is very useful in the field of stem cells, which provides a technology based on it.

도 1은 본 발명에 의해 Bmi1 유전자가 도입된 마우스 체세포의 배양 조건을 바꾸어 주었을 때 생식세포 (germ cell)와 같은 세포가 형성되는 것을 나타내는 도면이다.
도 1a는 본 발명에 의해 Bmi1 유전자가 도입된 마우스 체세포의 배양 조건을 바꾸어 주었을 때 생식세포 (germ cell)와 같은 세포의 모양이 형성되는 것을 나타내는 도면이다.
도 1b는 본 발명에 의해 Bmi1 유전자가 도입된 마우스 체세포의 배양 조건을 바꾸어 주었을 때 생식세포 (germ cell)와 같은 유전자 발현을 RT-PCR로 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2a는 마우스 체세포에 Bmi1 유전자를 도입하고, 신경줄기세포의 배양 조건에서 배양하여 형성된 상배엽 줄기세포 유사세포에 BIX01294과 RG108을 처리하고 배아줄기세포의 배양조건에서 배양한 결과 배아줄기세포와 유사한 세포가 형성된 것을 나타내고 있다. (이와 같이 형성된 세포를 BC-iPS②로 명명함).
도 2b는 본 발명에 의해 형성된 세포에서 배아줄기세포의 특이적 발현 마커들이 발현이 되고 있는 것을 면역화학염색법을 통해 확인한 결과를 보여주고 있다. 이 때 AP stain을 했을 때 포지티브 (positive)한 결과를 보이고 있는 것을 확인할 수 있었다.
도 2c는 본 발명에 의한 역분화 줄기세포에서 배아줄기세포의 대표적인 유전자들이 발현되는 것을 웨스턴 블럿 (western blot) 분석 방법을 통해 확인한 결과를 보여준다.
도 3은 본 발명에 의해 확립된 세포에서 배아줄기세포의 자가재생 능력 유지에 중요한 Oct4와 Nanog의 프로모터 부위가 demethylation 되어 있는 결과를 보여주고 있다.
도 4는 본 발명에 의한 역분화 줄기세포가 배아줄기세포와 같이 자연발생적 분화 유도를 하였을 때 삼배엽에 해당하는 대표적인 세포로의 분화가 유도되는 지를 확인한 결과를 나타내고 있다.
도 5는 본 발명에 의한 역분화 줄기세포가 배아줄기세포와 같이 테라토마 (teratoma)를 형성하고 있는 것을 확인한 결과를 나타내고 있다. Balb/c 누드마우스의 신장 (kidney)에 캡슐 (capsule) 형태로 세포를 주사 (injection)하고 8-10주 후에 테라토마 (teratoma)가 형성된 것을 prep하고 H&E 염색방법을 통해 염색을 하여 삼배엽에 해당하는 대표적인 세포로 분화가 된 것을 확인한 결과를 보여주고 있다. 1 is a view showing that cells such as germ cells are formed when the culture conditions of mouse somatic cells into which the Bmi1 gene is introduced according to the present invention are changed.
Figure 1a is a diagram showing that the shape of the cells, such as germ cells (germ cells) when the culture conditions of the mouse somatic cells introduced Bmi1 gene is formed by the present invention.
Figure 1b is a diagram showing the results confirmed by RT-PCR gene expression, such as germ cells when the culture conditions of mouse somatic cells introduced Bmi1 gene introduced by the present invention.
Figure 2a is introduced to the Bmi1 gene in mouse somatic cells, and treated with BIX01294 and RG108 to the mesenchymal stem cell-like cells formed by culturing in the culture conditions of neural stem cells and cultured in the culture conditions of embryonic stem cells, cells similar to embryonic stem cells Indicates that is formed. (The cells thus formed are named BC-iPS②).
Figure 2b shows the results confirmed by immunochemical staining that specific expression markers of embryonic stem cells in the cells formed by the present invention is being expressed. At this time, when the AP staining, it was confirmed that the positive (positive) results.
Figure 2c shows the results confirmed by Western blot analysis of the representative gene expression of embryonic stem cells in the dedifferentiated stem cells according to the present invention.
Figure 3 shows the results of the demethylation of the promoter region of Oct4 and Nanog, which is important for maintaining the self-renewal capacity of embryonic stem cells in the cells established by the present invention.
Figure 4 shows the result of confirming that the differentiation of the stem cells according to the present invention to the representative cells corresponding to the three germ cells when induction of spontaneous differentiation such as embryonic stem cells.
5 shows the results of confirming that the differentiated stem cells according to the present invention form teratoma like embryonic stem cells. Balb / c nude mice injected with cells in the form of capsules and prep that teratoma was formed after 8-10 weeks. It shows the results confirming that they have been differentiated into representative cells.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These embodiments are only for describing the present invention more specifically, and the scope of the present invention is not limited by these examples.

실시예 1. 마우스 체세포의 배양 및 Bmi1 유전자 도입Example 1 Culture of Mouse Somatic Cells and Bmi1 Gene Introduction

배아줄기세포 유사세포를 제조하기 위해, 마우스 체세포 중 마우스 섬유아세포를 이용하였다. 마우스 섬유아세포는 CF1 스트레인 마우스(CF1 strain mouse)가 임신한지 13.5일째가 되었을 때의 배아(embryo)를 준비하고 DMEM (high glucose, w/o sodium pyruvate) + 10% FBS (Fetal bovine serum) + 0.1mM non-essential amino acid + 1% penicilin/streptomycin + 0.1mM β-mercaptoethanol) 배지의 조직배양 플라스크(tissue culture flask)에서 배양을 한 후에 3 계대 (3rd passage)가 되었을 때 2 X 105의 세포를 6 웰플레이트(well plate)에 접종 (seeding)을 하였다. To prepare embryonic stem cell-like cells, mouse fibroblasts of mouse somatic cells were used. Mouse fibroblasts were prepared from embryos at day 13.5 of CF1 strain mouse pregnancy and prepared with DMEM (high glucose, w / o sodium pyruvate) + 10% Fetal bovine serum (FBS) + 0.1 Cells of 2 X 10 5 at 3rd passage after incubation in a tissue culture flask in mM non-essential amino acid + 1% penicilin / streptomycin + 0.1 mM β-mercaptoethanol medium Six well plates were seeded.

레트로 바이러스로 유전자를 도입하는 방법을 사용하기 위해, 바이러스 파티클 (virus particles)을 PT67 패키징 세포주를 이용하여 준비하였다. 보다 구체적으로 pBabe puro 벡터에 인간 Bmi1 (NCBI accession No. L13689) 유전자를 삽입하여 제조한 pBabe puro Bmi1 (from Dr.G.P.Dimri, Evanston Northwestern Healthcare Research Institute, Feinberg School of Medicine,Northwestern University, Evanston, IL 60201, USA)를 PT67 팩키징 세포주(packagingcell line, Clontech)에 터보펙트(Turbofect, Fermentas)를 이용하여 트랜스펙션(transfection)을 한 후 푸로마이신(puromycine, 3μｇ/ml)(BD bioscience)으로 선별하였다. PT67 팩키징 세포주는 광범위한 포유류 숙주세포에 감염이 가능한 고역가 바이러스를 생성하는 세포이다. To use the method of introducing genes into retroviruses, virus particles were prepared using a PT67 packaging cell line. More specifically, pBabe puro Bmi1 (from Dr. GPDimri, Evanston Northwestern Healthcare Research Institute, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, Evanston, IL 60201) prepared by inserting the human Bmi1 (NCBI accession No. L13689) gene into the pBabe puro vector , USA) were transfected to a PT67 packaging cell line (Clontech) using turbofect (Turbofect, Fermentas) and selected by puromycine (puromycine, 3 μg / ml) (BD bioscience). The PT67 packaging cell line is a cell that produces high titer viruses capable of infecting a wide range of mammalian host cells.

각각의 유전자의 발현을 RT-PCR의 방법을 통해 확인한 후에, 이와 같이 만들어진 세포주가 80% 정도 되었을 때 상등액 (supernatant)을 취하여 0.45μｍ (Millipore) 필터로 필터링 (filtering)을 하여 세포 파편 (cell debris)을 제거한 후에 폴리브렌 (polybrene, 6μｇ/ml)(sigma)을 첨가하여 12시간 간격으로 분리한 마우스 섬유아세포에 3회 반복해서 감염 (infection)시켰다.
After confirming the expression of each gene by RT-PCR method, the supernatant was taken when 80% of the cell lines thus formed were filtered using a 0.45μm (Millipore) filter and then cell debris. ), Polybrene (6 μg / ml) (sigma) was added, and the mouse fibroblasts isolated at 12 hour intervals were repeatedly infected three times.

실시예 2. Bmi1 유전자가 도입된 체세포를 배양 조건을 조절했을 때 생식세포 (germ cell)와 같은 세포로의 유도Example 2. Induction of somatic cells into which Bmi1 gene is introduced into cells such as germ cells when culture conditions are controlled

도 1은 마우스 체세포에 레트로바이러스를 이용하여 Bmi1 유전자를 도입하고 배양 조건을 EGF를 제외하고 신경줄기세포의 배양 조건 (DMEM/F12 + B27 + N2 + 1% penicillin/streptomycin + 20 ng/ml bFGF)에서 배양하였을 때, 스피어 (spheres)와 같은 모양의 세포가 형성되었고, 이를 더 배양하였을 때 생식세포 (germ cell)와 같은 세포가 형성되는 것을 확인할 수 있었다 (도 1a). 이때의 세포에서 유전자 발현을 RT-PCR의 방법을 통해 확인한 결과 생식세포 (germ cell)에서 발현되는 유전자들이 발현되는 것을 확인할 수 있었다 (도 1b).
1 is a retrovirus to mouse somatic cells using the Bmi1 gene and culture conditions except for EGF in the culture conditions of neural stem cells (DMEM / F12 + B27 + N2 + 1% penicillin / streptomycin + 20 ng / ml bFGF) When cultured, cells shaped like spheres were formed, and when further cultured, cells such as germ cells were formed (FIG. 1A). As a result of confirming the gene expression in the cell through the method of RT-PCR, it was confirmed that the genes expressed in germ cells were expressed (FIG. 1B).

실시예 3. 저분자성 물질 처리를 통한 역분화 줄기세포로의 유도 및 배아줄기세포의 특성 분석Example 3. Induction into De-differentiated Stem Cells and Characterization of Embryonic Stem Cells through Treatment of Low Molecular Weight Materials

마우스 체세포에 Bmi1 유전자를 도입하고, 신경줄기세포 배양 조건에 EGF가 제외된 조건에서 배양을 한 후 형성된 신경구와 같은 세포에 저분자성 물질을 BIX01294와 RG108을 처리하였다. 보다 구체적으로 상기 형성된 세포를 single cell로 0.1% 젤라틴 코팅된 플레이트 (gelatin coated plate)에 접종 (seeding)을 하고, 마우스 배아줄기세포의 배양 조건에서 BIX01294 1μＭ과 RG108 0.5μＭ로 일주일 동안 처리하였다. 그 결과 전분화능을 갖는 역분화 줄기세포주를 확립할 수 있었다. 이와 같이 형성된 세포를 BC-iPS②로 명명하였다. 마우스 배아줄기세포의 배양 조건은 지지세포가 있는 조건에서 하이 글루코오즈 DMEM에 15% FBS (Fetal bovine serum) +1% nonessential amino acid +1% penicillin/streptomycin + β-mercaptoethanol + 1000 unit/ml mouse LIF (leukemia inhibitory factor)의 배양액에서 배양하면서 2-3일에 한 번씩 계대 배양을 하였다.The Bmi1 gene was introduced into mouse somatic cells and cultured under the condition of excluding EGF in neural stem cell culture conditions, and then treated with low molecular weight BIX01294 and RG108 in the same cells as neurospheres formed. More specifically, the formed cells were seeded on a 0.1% gelatin coated plate as a single cell, and treated with BIX01294 1 μM and RG108 0.5 μM for one week under culture conditions of mouse embryonic stem cells. As a result, dedifferentiated stem cell lines having pluripotent ability could be established. The cells thus formed were named BC-iPS②. Culture conditions for mouse embryonic stem cells were 15% FBS (Fetal bovine serum) + 1% nonessential amino acid + 1% penicillin / streptomycin + β-mercaptoethanol + 1000 unit / ml mouse LIF in high glucose DMEM under supporting cells. Subculture was performed every 2-3 days while incubated with a culture of leukemia inhibitory factor.

저분자성 물질의 처리를 한 세포를 피더 (feeder) 위로 옮긴 후에 배양을 하면서 콜로니의 형성을 관찰하였고, 이와 같은 방법을 통해 확립된 세포가 형태 (morphology) 측면에서 배아줄기세포와 유사한 것을 도 2a의 결과를 통해 확인할 수 있었다. After the cells treated with the low molecular weight material were transferred to the feeder and cultured, colony formation was observed. Through this method, established cells were similar to embryonic stem cells in terms of morphology. The results confirmed this.

이와 같은 방법을 통해 형성된 역분화 줄기세포가 AP stain을 했을 때 포지티브 (positive)한 결과를 보이며, 배아줄기세포에서 특이적으로 발현되는 마커들이 발현이 되고 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 2b).When the dedifferentiated stem cells formed through the above method were AP stained, the results were positive, and markers specifically expressed in embryonic stem cells were expressed (FIG. 2B).

또한, 웨스턴 블럿 (western blot) 분석 방법을 통해 배아줄기세포에서 발현되는 주요 유전자들의 발현이 배아줄기세포와 같이 발현이 되고 있는 것을 확인할 수 있었고, 배아줄기세포의 대표적인 표지인자로 알려진 SSEA1도 함께 발현이 되고 있는 것을 유세포 분석 방법을 통해 확인할 수 있었다 (도 2c). 이와 같은 결과를 통해 마우스 체세포에 Bmi1 유전자 도입과 저분자성 물질의 처리를 통해 역분화 줄기세포로의 유도가 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
In addition, Western blot analysis showed that the expression of major genes expressed in embryonic stem cells was expressed like embryonic stem cells, and SSEA1, which is a representative marker of embryonic stem cells, was also expressed. It could be confirmed through the flow cytometry method (Fig. 2c). These results confirm that the induction into de-differentiated stem cells through the introduction of Bmi1 gene into the mouse somatic cells and treatment of low molecular weight substances.

실시예 4. 역분화 줄기세포의 주요 유전자들의 프로모터의 메틸화 (methylation) 상태를 배아줄기세포와 비교 분석Example 4 Comparative Analysis of Methylation Status of Promoters of Main Genes of Inverted Stem Cells with Embryonic Stem Cells

역분화 줄기세포에서 배아줄기세포의 자가재생 능력의 유지에 중요한 유전자들의 프로모터 부위를 분석하기 위해서, 바이설파이트 시퀀싱 (bisulfite sequencing) 방법을 도입하여, Oct4와 Nanog의 프로모터 부위의 메틸화 (methylation) 유무를 분석하였다. 그 결과 역분화 줄기세포의 경우 배아줄기세포와 같이 프로모터 부위가 탈메틸화 (demethylation) 되어 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 3). 대부분 메틸화 (methylation)되어 있는 마우스 체세포와는 상이한 결과를 나타내고 있고, 역분화 과정을 통해 확립된 세포가 배아줄기세포와 같은 특성을 지니고 있는 것을 확인한 결과를 나타내고 있다.
In order to analyze the promoter regions of genes important for maintaining the self-renewal ability of embryonic stem cells in dedifferentiated stem cells, the bisulfite sequencing method was introduced to detect the methylation of promoter regions of Oct4 and Nanog. Was analyzed. As a result, in the case of dedifferentiated stem cells, the promoter region was demethylated (demethylation) like embryonic stem cells (FIG. 3). Most of the results are different from those of mouse somatic cells that are methylated, and the results of confirming that the cells established through the reverse differentiation process have the same characteristics as the embryonic stem cells.

실시예 5. 역분화 줄기세포의 분화 능력 확인Example 5. Confirmation of Differentiation Ability of Inverted Stem Cells

인 비트로에서 분화 능력을 가지고 있는지 여부를 확인하기 위해서, 역분화 줄기세포를 배아체 (embryonic bodies; EB)를 형성 유도한 후에 이를 0.1% 젤라틴 코팅 플레이트 (gelatin coated plate)에 접종 (seeding)하고 EB 배지 (EB media)에서 자연발생적 분화 유도를 하였다. 7일 후에 삼배엽에 해당하는 대표적인 마커들을 면역화학염색법을 이용하여 염색을 한 후에 확인을 하였더니 인비트로에서 대표적인 세포로의 분화 유도가 된 것을 확인할 수 있었다 (도 4). To determine whether they have differentiation capacity in vitro, dedifferentiated stem cells are induced to form embryonic bodies (EBs), which are then seeded in 0.1% gelatin coated plates and Spontaneous differentiation was induced in EB media. After 7 days, the representative markers corresponding to the three germ layers were stained by immunochemical staining, and then confirmed to be induced in differentiation into representative cells in vitro (FIG. 4).

또한, 인 비보에서 분화 능력을 가지고 있는지 여부를 확인하기 위해서 테라토마 (teratoma) 형성이 가능한지를 실험하였다. 106의 세포를 8000 rpm에서 5분 동안 원심분리를 하고 배아줄기세포 배양액에서 펠릿 (pellet) 배양을 24시간 동안 한 후에 6주령 Balb/c 누드마우스 (nude mouse)의 신장 (kidney)에 캡슐 (capsule) 형태로 주사 (injection)하였다. 8-10주 후에 신장 (kidney)을 분리하여 삼배엽으로 분화되었는지 여부를 파라핀 블록 (parrafin block)을 만들고 H&E 염색을 하여 확인하였다. 그 결과 삼배엽에 해당하는 세포로 분화가 된 것을 확인할 수 있었다 (도 5). 이와 같은 결과를 통해 역분화 줄기세포가 배아줄기세포와 같이 테라토마 (teratoma)를 형성하는 것을 확인할 수 있었고, 배아줄기세포와 유사한 세포가 형성된 것을 위의 실험 결과를 통해 증명할 수 있었다. In addition, it was tested whether teratoma formation was possible in order to confirm whether the in vivo has a differentiation ability. 10 6 cells were centrifuged at 8000 rpm for 5 minutes and pellet cultured in embryonic stem cell culture for 24 hours, followed by capsules in kidneys of 6-week old Balb / c nude mice. Injected in the form of capsules. After 8-10 weeks, kidneys were separated and differentiated into trioderm to determine whether paraffin blocks were made and H & E staining. As a result, it was confirmed that the differentiation into cells corresponding to the three germ layers (Fig. 5). Through these results, it was confirmed that the dedifferentiated stem cells form teratoma like embryonic stem cells, and that the cells similar to embryonic stem cells were formed through the above experimental results.

Claims (4)

a) Bmi1 (B cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site 1) 단백질 또는 Bmi1 단백질을 코딩하는 핵산분자; 및
b) G9aHMTase 억제제 (G9a histone methyltransferase inhibitor)인 BIX01294와 DMNT 억제제 (DNA methyltransferase inhibitor)인 RG108로 이루어진, 체세포로부터 배아줄기세포 유사세포로의 역분화를 유도하는 조성물.a) Bmi1 (B cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site 1) protein or a nucleic acid molecule encoding Bmi1 protein; And
b) A composition which induces the differentiation of somatic cells from embryonic stem cell-like cells consisting of BIX01294, a G9a histone methyltransferase inhibitor, and RG108, a DMNT inhibitor (DNA methyltransferase inhibitor). ⅰ) Bmi1 (B cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site 1) 단백질 또는 Bmi1 단백질을 코딩하는 핵산분자를 체세포에 도입하는 단계;
ⅱ) bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)를 포함하는 신경줄기세포 배양배지에서 배양하는 단계; 및
ⅲ) G9aHMTase 억제제 (G9a histone methyltransferase inhibitor)인 BIX01294와 DMNT 억제제 (DNA methyltransferase inhibitor)인 RG108를 처리하는 단계를 포함하는 체세포로부터 배아줄기세포 유사세포를 제조하는 방법.Iii) introducing Bmi1 (B cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site 1) protein or a nucleic acid molecule encoding Bmi1 protein into somatic cells;
Ii) culturing in neural stem cell culture medium containing basic Fibroblast Growth Factor (bFGF); And
Iii) a method for producing embryonic stem cell-like cells from somatic cells comprising the step of treating BIX01294, a G9a histone methyltransferase inhibitor, and RG108, a DMNT inhibitor (DNA methyltransferase inhibitor). 삭제delete 삭제delete
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