KR101211315B1 - The stimulatory effects of led spectral sensitivity on the ovarian maturation in the aquaculture fish - Google Patents
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Abstract
Description
LED 광원 조사에 의한 어류의 성 성숙 제어를 이용한 어류의 양식방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 특정 LED 광원으로 어류의 성 성숙 및 발달을 조절시킬 수 있는지 여부를 LED 파장 및 강도에 따른 광 환경 조건에서 사육하여 비텔로제닌(vitellogenin; VGT)과 ER mRNA 및 각각의 단백질 발현 변화를 분석하고, 생식소 크기 지표와 스테로이드 호르몬인 estradiol-17β (E2) 농도, 그리고 난모 세포의 발달을 확인하기 위하여 H-E 염색을 통해 생식소 조직을 관찰함으로서 LED 광원을 이용한 성성숙 제어방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method of farming fish using control of maturation of fish by irradiation of LED light source. More specifically, whether or not a specific LED light source can control sex maturation and development of fish can be bred under light environmental conditions according to the wavelength and intensity of LED, thereby changing the expression of vitellogenin (VGT) and ER mRNA and their respective proteins. The present invention relates to a method for controlling sexual maturity using an LED light source by observing the gonad tissue through HE staining to analyze the gonad size index, the steroid hormone estradiol-17β (E 2 ), and the development of oocytes.
환경적 요인이 어류의 성장 및 성숙에 영향을 미친다고 알려져 있다. 많은 환경적 요인들 중 빛은 대부분의 식물 및 동물들의 생활에 있어 필수적인 요소이며, 몇몇 종들은 깊은 바다(aphotic zone)나 동굴 내부에서 빛이 없어도 살 수 있긴 하지만, 일반적으로 빛은 생체 리듬을 조절하는 중요한 인자 중 하나로 24 시간 일주기 내 일어나는 생리학적 및 행동학적 변화를 조절하는 요인이다. 이와 같이 어류의 성장, 성숙에 영향을 미치는 다양한 환경 요인 중 빛은 파장, 세기, 광주기의 특징을 포함하고, 어류의 생리적 기능에 막대한 영향을 미치는 주요한 환경적 요인으로 알려져 있다. Environmental factors are known to affect fish growth and maturity. Among many environmental factors, light is an essential component of most plants and animals, and although some species can live without light in the aphotic zone or caves, in general, light modulates biorhythms. One important factor is the regulation of physiological and behavioral changes that occur within the 24-hour work cycle. Among the various environmental factors affecting the growth and maturation of fish, light includes the characteristics of wavelength, intensity, photoperiod, and is known as a major environmental factor that has a great influence on the physiological function of fish.
특히, 광 환경 조건에서 어류를 포함한 생물체의 성장은 매우 필수적인 생물학적 과정으로, 어류의 먹이 섭취능, 항상성 유지능, 대사 조절능 및 환경 스트레스에 의한 영향을 파악할 수 있는 지표가 될 수 있다.In particular, the growth of organisms, including fish in the light environment conditions is a very essential biological process, it can be an indicator to determine the effects of fish food intake, homeostasis, metabolic regulation and environmental stress.
빛은 수중에서 흥미로운 특징을 지니고 있는데, 이는 다양한 범위에서 물에 흡수되는 여러 가지 파장(quality), 여러 가지 세기(quantity), 위도에 따른 다양한 계절적 변화로 인한 일주기(periodicity)가 주로 특징으로 거론되고 있다. Light is an interesting feature in the water, which is mainly characterized by the different wavelengths absorbed by the water, the intensity, the intensity, and the periodicity caused by various seasonal variations in latitude. It is becoming.
이러한 빛이 어류의 다양한 생리적 기능에 영향을 미치는데 이 중 번식능은 감각기관(sensory system)에 의해 빛과 같은 환경 인자를 수용하여 번식 내분비 축에 적절한 신호로 전환되어 조절되는 것으로 알려져 있다.Such light affects various physiological functions of fish. Among them, the ability to reproduce is controlled by the sensory system, which receives environmental factors such as light and converts them into signals appropriate for the breeding endocrine axis.
어류의 성 성숙 및 성 발달은 시상하부-뇌하수체-생식소 축을 중심으로 gonadotropin-releasing hormone (GnRH), gonadotropin hormone (GTH)과 스테로이드 호르몬 이외에 신경내분비물질, 생식소 호르몬과 같은 다양한 성 호르몬에 의해 조절된다. 이 중 에스트로겐(estrogen)은 번식에 필수적인 스테로이드 호르몬으로 성 성숙과 난 형성, 난황 형성 및 정소 발달을 포함한 성 분화에도 중요한 역할을 수행하는 호르몬으로 알려져 있다. Sexual maturation and sexual development of fish is regulated by a variety of sex hormones, such as neuroendocrine and gonad hormones, in addition to gonadotropin-releasing hormone (GnRH), gonadotropin hormone (GTH) and steroid hormones around the hypothalamus-pituitary-gonad axis. Of these, estrogen is an essential steroid hormone for breeding and is known to play an important role in sex differentiation including sex maturation and egg formation, egg yolk formation and testicular development.
또한, 에스트로겐은 골격, 뇌 및 심장과 같은 번식과 관련 없는 조직에서도 기능을 수행하는 것으로 나타났다. 에스트로겐 작용은 에스트로겐 수용체에 의해 이루어지며, 이는 수용체들의 promoter 부분에 있는 consensus 에스트로겐 response element (ERE)가 포함된 목표 유전자의 전사를 조절하는 ligand-dependent 전사 요소로 그 기능을 수행한다. Estrogens have also been shown to function in non-reproductive tissues such as the skeleton, brain and heart. Estrogen action is driven by estrogen receptors, which function as ligand-dependent transcription factors that regulate the transcription of target genes, including the consensus estrogen response element (ERE) in the promoter portion of the receptors.
ERs은 다른 스테로이드 호르몬과 갑상선 호르몬 수용체를 포함한 ligand- activated 핵 수용체의 광범위한 superfamily의 한 부분으로 희귀 수용체라고도 알려져 있다. 지금까지, 포유류에서 세 타입의 ER이 발견되었는데 각각 ERα, ERβ1 및 ERβ2로 명명되었다. ERα는 target gene의 promoter에 위치한 cis-acting enhancer elements와 결합하여 target gene의 발현을 유도하는 전사인자 그룹의 하나이며, 두 번째 타입인 ERβ는 수컷의 생식주기 동안 많이 발현된다고 알려져 있다. 또한, 어류에서 세 번째 타입의 ER이 보고되었는데, 다른 두 타입과는 유전적으로 분명하게 분류되며 ERβ2 또는 ERγ로 명명되었다. ERs are also known as rare receptors as part of an extensive superfamily of ligand-activated nuclear receptors, including other steroid hormones and thyroid hormone receptors. To date, three types of ER have been found in mammals, named ERα, ERβ1 and ERβ2, respectively. ERα is a group of transcription factors that induce the expression of target genes by binding to cis-acting enhancer elements located in the promoters of target genes. The second type of ERβ is known to be expressed during the male reproductive cycle. In addition, a third type of ER has been reported in fish, genetically distinct from the other two, and named ERβ2 or ERγ.
ERs과 관련된 많은 연구를 통하여 ERs은 번식 시스템에서 성 분화 과정과 성 발달에 관여한다는 것을 알 수 있으며, 경골어류에서 ERs이 배아 발달 및 생식소 분화 초기에 발현되는 것으로 보아, 어류에서 성 분화 시 ERs이 중요한 역할을 하고 있는 것이라고 추측된다.Many studies related to ERs indicate that ERs are involved in sexual differentiation and sexual development in the reproductive system.In the tibia fish, ERs are expressed early in embryonic and gonad differentiation. It is assumed that it plays an important role.
간에서 유도되는 비텔로제닌(VGT)은 ER 관련 경로에 의해 에스트로겐과 반응하는 난황 전구 단백질로 난생 어종에서 최초로 보고되었으며, 수컷에서의 비텔로제닌(VGT)는 환경 에스트로겐으로 오염 노출 지표로 널리 사용되고 있다. 큰입우럭과 대서양 연어에서 ERα와 함께 간에서 높은 비텔로제닌(VGT) mRNA의 발현량이 관찰되어 ER과 비텔로제닌(VGT) 사이의 높은 상관 관계를 유추해 볼 수 있다. The liver-induced vitelogenin (VGT) is an egg yolk precursor protein that reacts with estrogen by ER-related pathways and was first reported in oviparous fish species. Vitelogenin (VGT) in males is widely used as an indicator of contamination exposure as an environmental estrogen. have. Higher vitelogenin (VGT) mRNA levels were observed in liver and ERα in largemouth and atlantic salmon, suggesting a high correlation between ER and vitelogenin (VGT).
현재까지 빛의 일주기가 어류의 번식능에 중요한 역할을 수행하며, 이는 생식소 발달의 초기 및 종료 단계에서의 역할에 대한 연구가 광범위하게 이루어졌다. 최근 본 발명자들에 의한 선행발명으로 흰동가리(yellowtail clownfish, Amphiprion clarkii)를 이용하여 단파장인 녹색과 청색 파장이 산화 스트레스에 대응하기 위한 항산화 물질의 증가에 효과적이라는 연구 결과를 출원하였으며, 적색 LED 파장은 어류의 생리적 기능에 영향을 미쳐 흰동가리의 경우 산화 스트레스를 유도하였다는 연구 결과를 선행발명으로 출원하였다 (출원번호 10-2012-61201, 10- 2012-66215). 그러나 빛의 파장에 따른 번식능에 대한 연구 또는 이와 관련된 선행 발명은 찾아볼 수 없다.To date, the work cycle of light plays an important role in the reproductive capacity of fish, which has been extensively studied for its role in the early and final stages of gonad development. Recently, the inventors of the present invention have applied for a research result that the short wavelength green and blue wavelengths are effective in increasing antioxidants to cope with oxidative stress using yellowtail clownfish ( Amphiprion clarkii) . The present invention has applied for the results of the study that the induction of oxidative stress in the case of clownfish affects the physiological function of fish (Application No. 10-2012-61201, 10-2012-66215). However, there is no research on the propagation ability according to the wavelength of light or related prior invention.
특히, 본 발명에서 사용되는 주광원인 발광다이오드 (Light emitting diodes; LED)는 다양한 형태의 빛 중 새로운 형태의 빛의 기술이며, 특정 파장의 빛을 방출할 수 있는 장점을 가지고 있는 신개념의 광학 기술로 인해 만들어 졌다. LED는 협대역 (narrow bandwidth)의 특징을 가지고 있으며, 다양한 수중 환경 및 종에 선택적으로 적용할 수 있다. 이러한 LED를 활용한 연구 결과를 토대로 어류의 다양한 서식 환경요인 중, 광 환경 요인으로 LED의 적용이 가능할 수 있을 것으로 판단된다. In particular, light emitting diodes (LEDs), which are the main light sources used in the present invention, are a new type of light technology among various types of light, and are a new concept of optical technology having an advantage of emitting light of a specific wavelength. Was made. LEDs feature narrow bandwidths and can be selectively applied to a variety of underwater environments and species. Based on the research results using these LEDs, it is considered that among the various environmental factors of fish, LED can be applied as a light environmental factor.
어종 및 수중 환경에 따라 특정 파장은 달리 적용될 수 있으며, 파장마다 수중에서 빛의 구성이 각각 달라지며 수심이 깊어질수록 빛의 투과성이 약해진다. 청색과 같은 단파장의 빛은 깊은 수심까지 통과하나 적색과 같은 장파장의 빛은 얕은 수심에서만 통과가 가능하나 적색과 같은 장파장의 빛은 얕은 수심까지만 통과할 수 있다. LED는 이러한 특성으로부터 최근 양식 산업에 이용되는 빛으로 다양한 환경 및 종에 적용할 수 있다.
Specific wavelengths can be applied differently according to fish species and underwater environment, and the composition of light varies in water for each wavelength, and the deeper the water, the weaker the light transmission. Short-wavelength light such as blue passes through deep water, while long-wavelength light such as red can pass only in shallow depths, while long-wavelength light such as red can pass only to shallow depths. LEDs are the light used in the recent aquaculture industry from these characteristics and can be applied to various environments and species.
본 발명에서는 해수 관상어인 파랑돔 (yellowtail blue damselfish)를 이용하여 청색, 적색, 녹색 및 자주색 (purple) 4가지의 LED 파장과 광도가 서로 다른 조명 조건하에서 사육하여 각각의 파장별 및 광도별 실험구의 실험어에서 비텔로제닌(VGT)와 ER mRNA 및 각각의 단백질 발현 변화를 분석 확인하였다. 또한, 생식소 중량지수 (GSI)와 생식소 크기 지표와 스테로이드 호르몬인 estradiol-17β (E2)의 농도와 생식소의 조직학적 관찰을 통하여 LED 특정 광원에 의한 생식소의 성숙 정도의 차이를 관찰함으로서, LED 광원 조사에 의한 어류의 성 성숙 제어를 이용한 양식방법의 제공을 목적으로 한다.
In the present invention, four kinds of LED wavelengths and luminosities of blue, red, green, and purple are bred under different lighting conditions using yellowtail blue damselfish, which is a seawater ornamental fish. In experimental fish, the telogenin (VGT) and ER mRNA and protein expression changes were analyzed. In addition, by monitoring the gonad weight index (GSI), gonad size index, the concentration of the steroid hormone estradiol-17β (E 2 ) and histological observation of the gonads, the difference in the degree of maturation of the gonads by the LED-specific light source was observed. The purpose of this study is to provide a farming method by controlling sex maturation of fish by survey.
해수 관상어로서 널리 알려져 있는 파랑돔을 이용하여 청색, 적색, 녹색 및 자주색 4종류의 LED 파장과 광도 조건 하에서 총 4개월 동안 사육하여 각각의 LED 파장별 및 세기별 실험구의 실험어에서 비텔로제닌 (VGT)과 에스트로겐 리셉터 (ER) mRNA 및 각각의 단백질 발현량의 변화를 분석하였으며, 생식소 크기 지표와 스테로이드 호르몬인 estradiol-17β (E2)의 농도, 그리고 난모 세포의 발달을 확인하기 위하여 H-E 염색을 통한 생식소 조직을 관찰하였다.
Four blue, red, green and purple LED domes were bred for four months under the blue and red, green and purple LED wavelengths and luminosity conditions. VGT) and estrogen receptor (ER) mRNA and protein expression levels were analyzed and HE staining was performed to confirm the gonad size index, the concentration of steroid hormone estradiol-17β (E 2 ), and oocyte development. Gonad tissue was observed through.
1. 실험어1. Experimental word
파랑돔 (n = 180; 전장, 3.5±0.3 cm; 무게, 1.1 ± 0.2 g)은 일반 수족관에서 구입하였으며, 실험실의 300-l 수조에서 순치시켰다. 실험어는 2주 동안 자연 광주기에서 안정화시켰다. 대조구인 형광등 (27 W)은 표층에서 0.96 W/m2의 세기를 가지고 있으며, 수온 27 ± 1℃ 와 광주기 12-h light:12-h dark (07:00-19:00)를 유지시켰다. 사료공급은 하루에 2번 공급하였다. Blue dome ( n = 180; full length, 3.5 ± 0.3 cm; weight, 1.1 ± 0.2 g) was purchased in a normal aquarium and was incubated in a laboratory 300-l bath. Experimental fish were stabilized in natural photoperiod for 2 weeks. The control, fluorescent (27 W), had an intensity of 0.96 W / m 2 at the surface and maintained a water temperature of 27 ± 1 ° C and a photoperiod 12-h light: 12-h dark (07: 00-19: 00). . Feeding was provided twice a day.
대조구는 형광등에 머물게 하면서 하루에 2회(오전 9시, 오후 5시) 사료를 공급하였다. 실험구는 자주색(최대파장 410 nm), 청색 (최대파장 450 nm), 녹색 (최대파장 530 nm), 적색 (최대파장 630 nm) LED 광원 (Daesin LED Co. Kyunggi, Korea, 표층, 0.9 w/m2 기준)으로 노출시키면서 12일 동안 절식시켰다. LED 등은 표층에서부터 50 cm 떨어져 있으며, 표층의 광원은 0.3 (low; L), 0.6 (middle; M), 0.9 (high; H) W/m2로 설정하여 총 4개월 동안 사육하였다. 혈액은 헤파린 처리된 3-ml 주사기를 사용하여 얻었으며, 얻어진 혈액은 4 ℃, 10,000 x g, 5 분 원심분리 후 혈장을 분리하여 -80℃에 보관하였다. 각 어류는 4개월 째 간과 생식소 조직을 채취하였다.
The control was fed twice a day (9 am, 5 pm) while staying in the fluorescent lamp. Experimental zones include purple (maximum wavelength 410 nm), blue (
2. 샘플링 2. Sampling
4개월째 10 마리의 실험어에서 간과 생식소를 (형광등, 보라색, 적색, 녹색, 청색 LED 실험구) 채취하였다. 조직을 채취한 후 곧바로 액체 질소에 넣은 후, total RNA 추출 시까지 -80℃의 초저온 냉동고에 보관하였다. 혈액은 헤파린 처리된 3-ml 주사기를 사용하여 얻었으며, 얻어진 혈액은 4℃, 10,000 x g, 5 분 원심분리 후 혈장을 분리한 뒤, 분석 전까지 -80℃에 보관하였다.Liver and gonads (fluorescent, purple, red, green, blue LED test plots) were collected from 10 experimental fish at 4 months. The tissue was collected and immediately placed in liquid nitrogen, and then stored in an ultra-cold freezer at -80 ° C until total RNA extraction. Blood was obtained using a heparinized 3-ml syringe, and the obtained blood was separated from plasma after centrifugation at 4 ° C., 10,000 × g , 5 min, and stored at −80 ° C. until analysis.
생식소를 채취하고 무게를 잰 후 조직학적 분석을 위해 Bouin's 용액에 고정시켰다. 생식소 중량 지수 (GSI) [GSI = (생식소 중량/체 중량) x 100]는 각 개체마다 측정하였다.
The gonads were harvested, weighed and fixed in Bouin's solution for histological analysis. Gonad Weight Index (GSI) [GSI = (gonad weight / body weight) x 100] was measured for each individual.
3. Quantitative PCR (QPCR)3. Quantitative PCR (QPCR)
광원의 광도에 따른 성장효과의 확인을 위해 생식소 성숙 정도를 알아보기 위하여 비텔로제닌(VGT) (JQ906787)와 ER (JQ906788) mRNA의 발현량 변화를 파랑돔의 간 및 생식소에서 얻어진 total RNA를 사용하여 각각 quantitative real-time PCR (QPCR)을 이용하여 분석하였다. QPCR의 수행을 위한 프라이머는 이미 공지된 타종의 염기배열을 기초로 하여 다음과 같이 설계하였다.
To determine the degree of gonad maturation, we used total RNA obtained from the liver and gonad of blue dome to measure the expression level of vitelogenin (VGT) (JQ906787) and ER (JQ906788) mRNA. Each was analyzed using quantitative real-time PCR (QPCR). Primers for performing QPCR were designed as follows based on the base sequence of other known species.
- VGT forward primer (5'-GTT GCC AAG ATA GAC ATC AC-3'), -VGT forward primer (5'-GTT GCC AAG ATA GAC ATC AC-3 '),
- VGT reverse primer (5'-TTA GAC TCT CCT CGT TGC-3'), VGT reverse primer (5'-TTA GAC TCT CCT CGT TGC-3 '),
- ER forward primer (5'-GCA ACT ACC AGC GTG ATG-3'), ER forward primer (5'-GCA ACT ACC AGC GTG ATG-3 '),
- ER reverse primer (5'-CAG ACA CCT TGA ACT TGG A-3'), ER reverse primer (5'-CAG ACA CCT TGA ACT TGG A-3 '),
- β-actin forward primer (5'-GCA AGA GAG GTA TCC TGA CC-3') β-actin forward primer (5'-GCA AGA GAG GTA TCC TGA CC-3 ')
- β-actin reverse primer (5'-CTC AGC TCG TTG TAG AAG G-3').
β-actin reverse primer (5'-CTC AGC TCG TTG TAG AAG G-3 ').
QPCR은 BIO-RAD iCycler iQ Multicolor Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, USA)과 iQTM Sybr 녹색 Supermix (Bio-Rad, USA)를 이용하여 95℃에서 5분간 초기 열변성 1회, 95℃에서 20초간 열변성, 55℃에서 20초간 프라이머 결합을 총 40회 실시하였다. 내부표준 유전자로는 β-actin을 사용하여 PCR이 진행됨에 따라 calculated threshold cycle (Ct) 값을 결정하여 β-actin에 대한 발현량을 정량화하였다. QPCR was subjected to initial thermal denaturation at 95 ° C for 5 minutes at 95 ° C using BIO-RAD iCycler iQ Multicolor Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, USA) and iQTM Sybr green Supermix (Bio-Rad, USA). A total of 40 primer debonding was performed for 20 seconds at 20 ° C. for 20 seconds. As the internal standard gene, β-actin was used to determine the calculated threshold cycle (Ct) value as the PCR proceeded to quantify the expression level for β-actin.
ΔΔCt= 2^-(ΔCt항산화 유전자 - ΔCt내부표준 유전자).
ΔΔCt = 2 ^ − (ΔCt antioxidant gene —ΔCt internal standard gene ).
4. 통계분석4. Statistical Analysis
각 실험 결과로부터 얻어진 자료값 사이의 유의차 유무는 Statistical Package for the Social Sciences software program (SPSS; version 10.0)에 의한 One-way ANOVA 및 Tukey's post hoc test 를 실시하여 각 시간별, 파장별에 따른 통계학적으로 유의적 차이를 분석하였다. P < 0.05의 수치는 평균간 통계적 유의성을 검정하였다.Significant differences between the data obtained from each experiment were analyzed by one-way ANOVA and Tukey's post hoc test using the Statistical Package for the Social Sciences software program (SPSS; version 10.0). The significant differences were analyzed. A value of P <0.05 tested the statistical significance between the means.
이로부터 특정 LED 파장에 따른 어류의 성성숙 효과를 조사하기 위하여 적색, 녹색, 청색 각각의 파장대를 이용하여 어류를 사육하고, 각 파장의 광도별로 조명 후 비텔로제닌(VGT) 및 ER mRNA 및 각각의 단백질 발현, 생식소 중량 지수(GSI), 그리고 혈장 estradiol-17β (E2) 호르몬 농도의 측정을 통해 난 성숙을 조사함으로서 LED 광원 조사에 의한 어류의 성성숙 제어효과를 확인함으로서 이를 이용한 양식방법을 완성하였다.
In order to investigate the maturation effects of fish according to specific LED wavelengths, fish were bred using the wavelength bands of red, green, and blue, and after the illumination of each wavelength, vitelogenin (VGT) and ER mRNA and Investigating egg maturation by measuring protein expression, GSI, and plasma estradiol-17β (E 2 ) hormone concentrations, the fish farming method was completed by confirming the control of maturation of fish by irradiation with LED light. .
적색, 녹색, 청색 등 각각의 파장을 갖는 LED 광원을 이용하여 어류의 성장 실험을 실시 한 결과, 특정한 LED 파장이 GH mRNA 발현량의 변화에 영향을 미치는 것으로 파악되었고, 각 파장별 및 세기별로 조명 후 비텔로제닌(VGT), ER mRNA 및 혈장 estradiol-17β (E2) 호르몬 측정을 통해 난 성숙을 조사한 결과, 녹색 및 청색 파장에서 비텔로제닌(VGT)와 ER mRNA 및 각각의 단백질 발현이 다른 파장에 비해 유의적으로 높게 나타났다. 광원 강도의 경우, 각 LED 파장별로 세 가지의 강도(0.3, 0.6, 0.9 W/m3)로 조명하여 관찰한 결과, 저(0.3 W/m2) 또는 중(0.6 W/m2)의 강도로 조명한 실험구가 난 성숙에 유의적으로 효과적임을 알 수 있었다. 이러한 결과들로 미루어 보아 녹색 및 청색 중, 특히 녹색 파장과 0.3 내지 0.6 W/m2 강도에서 생식소의 성숙에 가장 긍정적인 효과가 있는 것으로 나타나 LED 광원 조사에 의한 성 성숙 제어를 이용한 양식방법으로의 이용이 가능하다.
As a result of fish growth experiments using LED light sources with red, green, and blue wavelengths, it was found that specific LED wavelengths affected the changes in GH mRNA expression levels and illuminated by each wavelength and intensity. In vitro egg maturation was determined by virtue of vitelogenin (VGT), ER mRNA and plasma estradiol-17β (E 2 ) hormonal measurements, which showed different expressions of vitelogenin (VGT) and ER mRNA and their respective proteins at green and blue wavelengths. It was significantly higher than the wavelength. In the case of the light source intensity, the intensity of low (0.3 W / m 2 ) or medium (0.6 W / m 2 ) is observed by illuminating three LEDs (0.3, 0.6, 0.9 W / m 3 ) for each LED wavelength. The experimental group illuminated by 수 was found to be significantly effective for egg maturation. These results indicate that the most positive effect on the gonad maturation among green and blue, especially at green wavelength and intensity of 0.3 to 0.6 W / m 2 , has been shown to be aquaculture method using sex maturation control by LED light source irradiation. Available.
도 1은 본 발명의 기술적 특징을 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 연구에 사용된 청색(B), 녹색(G) 및 적색(R) LED 파장 및 이를 이용한 광원 조사 기구를 나타낸 사진이다.
도 3은 각각의 광원 및 광도의 조건에서 어류를 사육한 경우 파랑돔의 전장의 길이를 나타낸다.
도 4 는 QPCR을 이용하여 파장별 및 세기별로 비텔로제닌(VGT) 및 ER mRNA의 발현량의 변화를 조사한 결과를 나타낸다.
도 5는 각각의 광원 파장 및 광도의 조건에서 어류를 사육한 경우 파랑돔의 생식소 중량지수를 나타낸다.
도 6은 각각의 광원 파장 및 광도의 조건에서 어류를 사육한 경우 파랑돔의 생식소 조직을 촬영한 사진을 나타낸다. 왼쪽부터 형광등, 적색, 녹색, 청색의 결과를 나타낸다.
도 7은 파장 및 광도별 실험구에서 혈장 E2 호르몬 농도는 plate reader기를 이용하여 분석한 결과를 나타낸다.
도 8은 Quantitative real-time PCR을 이용하여 적색 청색(B), 녹색(G) 및 적색(R) LED 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명 아래에서 흰동가리의 뇌하수체에서 GH mRNA 발현 (A) 및 멜라토닌 주입 시 GH mRNA 발현 (B) 변화를 관찰한 결과를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 결과를 이용한 광 제어를 이용한 사육수조를 나타낸 것이다.1 is a schematic diagram showing the technical features of the present invention.
FIG. 2 is a photograph showing blue (B), green (G) and red (R) LED wavelengths and a light source irradiation mechanism using the same.
Figure 3 shows the length of the blue sea bream when fish were bred under the conditions of each light source and light intensity.
Figure 4 shows the results of the changes in the expression level of the vitelogenin (VGT) and ER mRNA by wavelength and intensity using QPCR.
Figure 5 shows the gonad weight index of the blue dome when fish were bred under the conditions of the light source wavelength and light intensity.
Figure 6 shows a photograph of the gonad tissue of the blue dome when fish are bred under the conditions of light source wavelength and light intensity. It shows the result of fluorescent lamp, red, green, blue from the left.
FIG. 7 shows plasma E 2 at experimental groups of different wavelengths and intensities. Hormone concentration is the result of analysis using plate reader.
FIG. 8 shows GH mRNA expression in the pituitary pituitary gland under red blue (B), green (G) and red (R) LEDs and simulated natural photoperiod (SNP) illumination using Quantitative real-time PCR. A) and melatonin injection show changes in GH mRNA expression (B).
Figure 9 shows a breeding tank using light control using the results of the present invention.
본 발명의 목적을 달성하기 위한, LED 광원 조사에 의한 어류의 성성숙 제어를 이용한 양식방법은 어류를 수조에서 일정기간 사육하는 단계; 상기 사육된 어류를 자연광이 배제된 광 환경조건에서 청색 (430-490 nm) 또는 녹색 (520-580 nm) 파장 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 LED 광원으로 조사하는 단계; 및 상기 단계의 광원을 1-4개월 동안, 명암 주기 12시간으로 조사하는 광 자극을 주어 어류의 생식소 성숙을 유도시키는 단계를 포함하여 이루어진다.
In order to achieve the object of the present invention, aquaculture method using the maturation control of the fish by irradiation with LED light source includes the step of breeding the fish in the tank for a certain period; Irradiating the bred fish with any one or more LED light sources selected from blue (430-490 nm) or green (520-580 nm) wavelengths under natural environmental conditions; And inducing the gonad maturation of the fish by giving a light stimulus to irradiate the light source of the step for 1-4 months in a light and dark cycle of 12 hours.
또 다른 실시 예로서의 LED 광원 조사에 의한 어류의 성 성숙 제어를 이용한 양식방법은 어류 양식용 종묘를 준비하는 단계; 자연광이 차단된 수조에 상기 단계의 종묘(치어)를 입식시키는 단계; 수조에 파장 600-650 nm의 LED 광원을 조사하여 1-3일간 사육하여 어류의 체내에서 초기에 일시적으로 산화 스트레스를 유발시킴으로서, 어체 내에서 멜라토닌의 분비를 촉진시켜 안정화시키는 단계; 안정화 단계를 거친 종묘를 자연광 조건에서 일정기간 사육하여 성장시키는 단계; 성장 단계를 거친 어류를 자연광이 배제된 광 환경조건에서 청색 (430-490nm) 또는 녹색(520-580nm) 파장 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 LED 광원으로 조사하는 단계; 상기 선택된 광원을 1-4개월 동안, 명암 주기 12시간으로 조사하는 광 자극을 주어 어류의 생식소 성숙을 유도시키는 단계를 포함하여 이루어질 수 있다.
In another embodiment, a method of farming using sex maturation control of fish by irradiation with an LED light source includes preparing a seed for fish farming; Stocking the seedlings of the above step (cheer) in the water-blocked water tank; Irradiating an LED light source having a wavelength of 600-650 nm to the tank for 1-3 days to induce oxidative stress initially in the body of the fish, thereby promoting and stabilizing the secretion of melatonin in the fish body; Breeding the seedlings undergoing stabilization in natural light conditions for a certain period of time; Irradiating the fish having undergone the growth step with at least one LED light source selected from blue (430-490 nm) or green (520-580 nm) wavelengths under natural environmental conditions; It may comprise the step of inducing gonad maturation of the fish by giving a light stimulation to irradiate the selected light source for 1-4 months, the
또한, 상기 방법에서 광 자극으로 이용되는 LED 광원 파장의 조사 강도는 0.3 내지 0.6 W/m2인 것을 특징으로 하며, 광 자극으로 선택된 LED 광원의 점등은 초기 6시간은 녹색 (520-580 nm)을 점등하고 후기 6시간은 청색 (430-490 nm)을 점등하여 광 자극을 변화시킴으로서 LED 광원 조사에 의한 어류의 성 성숙 제어를 이용한 양식방법으로 구성할 수 있다.
In addition, the irradiation intensity of the LED light source wavelength used as the light stimulation in the method is characterized in that 0.3 to 0.6 W / m 2 , the lighting of the LED light source selected as the light stimulation is green (520-580 nm) for the first 6
본 발명의 목적을 달성하기 위한 장치로는 자연광이 개폐가 가능한 일정 공간; 상기 공간의 일부에는 종묘를 입식할 수 있는 수조; 상기 수조에는 사육수를 여과할 수 있는 여과장치와 산소공급기가 연결 설치되고, 상기 수조 상부에는 파장 600-650 nm, 430-490 nm, 520-580 nm인 LED 광원이 각각 복수 개 설치되고, 상기 LED 광원의 점등 및 광원의 강도를 제어할 수 있는 광원 제어장치가 설치된 것을 특징으로 하는 LED 광원 조사에 의한 어류의 성 성숙 제어를 이용한 양식장치가 제공된다.
Apparatus for achieving the object of the present invention includes a predetermined space capable of opening and closing the natural light; Part of the space is a tank for stocking seedlings; The tank is connected to a filtration device and an oxygen supply unit for filtering breeding water, and a plurality of LED light sources having a wavelength of 600-650 nm, 430-490 nm, and 520-580 nm are respectively installed on the tank. There is provided a farming apparatus using the control of maturation of fish by irradiation with LED light source, characterized in that a light source control device for controlling the lighting of the LED light source and the intensity of the light source is provided.
이하 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 상기의 전체적인 구성을 실시 예와 함께 자세히 설명하면 다음과 같다.
In order to achieve the object of the present invention, when described in detail with the embodiment as described above as follows.
I. LED 광원의 파장, 강도별 어류의 성성숙 제어 효과 I. Control of maturity of fish by wavelength and intensity of LED light source
1. One. WesternWestern blotblot 분석에 의한 간과 Overlooked by Analysis 생식소에서At the gonad 비텔로제닌Vitelogenin (( VGTVGT ) 및 ) And ERER 발현 Expression
파랑돔의 간과 생식소로부터 분리된 단백질은 protein extraction buffer [5.6 mM Tris, 0.55 mM EDTA, 0.55 mM EGTA, 0.1% SDS, 0.15 mg/ml phenylmethyl- sulfonyl fluoride (PMSF), 0.15 mg/ml leupeptin]를 이용하여 추출하였으며, Bradford 방법 (Bio-Rad)을 이용하여 농도를 측정하였다. Proteins isolated from liver and gonads of blue dome were extracted using protein extraction buffer [5.6 mM Tris, 0.55 mM EDTA, 0.55 mM EGTA, 0.1% SDS, 0.15 mg / ml phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 0.15 mg / ml leupeptin]. Extraction was carried out, and concentration was measured using the Bradford method (Bio-Rad).
단백질은 4% acrylamide stacking gel 층과 12% acrylamide resolving gel 층으로 이루어진 겔에 영동을 하였으며, 단백질 마커 (Fermentas)를 사용하여 크기를 확인하였다. 전기영동은 stacking gel 영동을 위해 80 V, resolving gel 영동을 위해, 150 V 를 사용하였으며, 겔 마지막까지 영동하였다. 전기영동된 gel은 즉시 olyvinylidene diflouride (PVDF) membrane (Bio-Rad)로 옮겨서 4℃ 에서 1.5 시간동안 85 V로 옮겼다. Proteins were run on a gel consisting of a 4% acrylamide stacking gel layer and a 12% acrylamide resolving gel layer, and their size was confirmed using protein markers (Fermentas). Electrophoresis was performed at 80 V for stacking gel electrophoresis and 150 V for resolving gel electrophoresis, and was run to the end of gel. The electrophoresis gel was immediately transferred to olyvinylidene diflouride (PVDF) membrane (Bio-Rad) and transferred to 85 V at 4 ° C. for 1.5 hours.
단백질이 옮겨진 membrane은 5% milk가 포함된 Tris-buffe적색 saline (TBS) (pH 7.4)에 45분 동안 흔들어주면서 blocking 하였으며, TBS로 세척하였다. Blocking된 Membranes은 1차 항체 catalase (sc-58332, 1/2,000 dilution, Santa Cruze Biotechnology, USA)와 2차 항체 horseradish peroxidase conjugated anti-mouse IgG secondary antibody (dilution 1:2,000, Bio-Rad)를 2시간, 1시간 씩 차례로 반응 시켰다. 또한, 내재적 표준을 위해서 1차 항체 β-tubulin (dilution 1:5000, ab6046, abcam, UK)와 horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG secondary antibody (1:5,000; Bio-Rad), 또한, 차례로 2시간, 1시간씩 순서대로 반응시켰다. 단백질 밴드는 standard ECL 방법과 ECL systems (ECL Advance; GE Life Sciences, Sweden)을 사용하여 반응하였으며, film에 2분 동안 노출시켜 확인하였다.The protein-transferred membrane was blocked with shaking for 45 minutes in Tris-buffe red saline (TBS) containing 5% milk (pH 7.4) and washed with TBS. Blocked membranes were treated with primary antibody catalase (sc-58332, 1 / 2,000 dilution, Santa Cruze Biotechnology, USA) and secondary antibody horseradish peroxidase conjugated anti-mouse IgG secondary antibody (dilution 1: 2,000, Bio-Rad) for 2 hours. , Were reacted one by one each time. In addition, the primary antibody β-tubulin (dilution 1: 5000, ab6046, abcam, UK) and horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG secondary antibody (1: 5,000; Bio-Rad) for the intrinsic standard, followed by 2 hours in turn The reaction was carried out in order for 1 hour. Protein bands were reacted using standard ECL methods and ECL systems (ECL Advance; GE Life Sciences, Sweden) and confirmed by exposure to film for 2 minutes.
본 발명에서는 QPCR을 이용하여 파장별 및 세기별로 비텔로제닌(VGT) 및 ER mRNA 발현을 조사하였다 (도 4). 녹색 및 청색 LED 실험구에서 비텔로제닌(VGT) 및 ER mRNA 발현은 다른 파장에 비하여 유의적으로 높게 나타났다. 특히, 저(0.3 W/m2) 또는 중(0.6 W/m2)의 세기에서 다른 세기에 비하여 유의적으로 높게 나타났다. In the present invention, by using QPCR, the expression of vitelogenin (VGT) and ER mRNA by wavelength and intensity was investigated (FIG. 4). The vitelogenin (VGT) and ER mRNA expressions in the green and blue LEDs were significantly higher than other wavelengths. In particular, the low (0.3 W / m 2 ) or medium (0.6 W / m 2 ) intensity was significantly higher than the other intensity.
단백질 발현을 관찰하기 위해 western blot 분석을 시행한 결과, 특이적으로 비텔로제닌(VGT) 및 ER 면역 반응이 관찰되었으며 파랑돔 비텔로제닌(VGT) (43-kDa) 및 ER (64-kDa)의 예상된 단백질 크기에 맞게 관찰되었다. 파랑돔의 간과 생식소에서의 비텔로제닌(VGT) 및 ER 단백질 발현 경향은 mRNA 발현 경향과 유사하게 나타났다(도 4A, C).
Western blot analysis was performed to observe the protein expression, and specifically, vitelogenin (VGT) and ER immune responses were observed and blue-domed bitelogenin (VGT) (43-kDa) and ER (64-kDa) It was observed to fit the expected protein size of. The tendency of vitelogenin (VGT) and ER protein expression in liver and gonad of blue sea bream was similar to that of mRNA expression (Fig. 4A, C).
2. 2. GSIGSI 및 조직학적 분석 And histological analysis
각 실험구에서 채취된 생식소 조직을 Bouin 용액에 고정시킨 후 에탄올 농도에 따라 탈수 과정을 거쳐 자일렌으로 에탄올을 제거하고 파라핀으로 봉합하였다. 잘 절편된(5 μm thick) 샘플을 선택하여 haematoxylin-eosin으로 염색 후 현미경으로(Olympus BS50, Japan) 관찰하여 디지털 카메라(Olympus DP-50, Japan)로 이미지를 얻어내었다.The gonad tissues collected from each experimental section were fixed in Bouin solution, dehydrated according to ethanol concentration, ethanol was removed with xylene, and sutured with paraffin. Finely sectioned (5 μm thick) samples were selected and stained with haematoxylin-eosin and observed under a microscope (Olympus BS50, Japan) to obtain images with a digital camera (Olympus DP-50, Japan).
GSI는 녹색 (4.5±0.3; 중) 및 청색 (3±0.3; 중) LED 실험구에서 다른 실험구의 GSI보다 유의적으로 높게 관찰되었다. 더욱이, 저 또는 중의 세기로 조명한 실험구에서 고의 세기인 실험구보다 유의적으로 높게 관찰되었다 (도 5). GSI was significantly higher in the green (4.5 ± 0.3; medium) and blue (3 ± 0.3; medium) LED groups than in the other groups. Moreover, the experimental group illuminated with low or medium intensity was significantly higher than the high intensity experimental group (FIG. 5).
생식소의 조직학적 데이터는 도 6에 나타냈으며, LED 파장별로 생식소 발달(성숙 정도) 정도를 확인하기 위하여 조직학적 관찰을 통해 조사한 결과, 형광등, 적색 및 보라색 실험구의 모든 개체에서는 몇몇의 제1난모 세포만 관찰되었으나(도 6A, B, E), 녹색 및 청색 LED 실험구에서는 발달된 난황이 포함되어 있는 난모 세포가 관찰되었다 (도 6C, D). 이로부터 단파장인 녹색과 청색가 난 성숙을 유도한 것을 확인할 수 있었다.The histological data of the gonads is shown in FIG. 6, and histologic observation was performed to confirm the degree of gonad development (maturation) according to the LED wavelengths. Only observed (Fig. 6A, B, E), the green and blue LED experiments were observed oocytes containing the developed egg yolk (Fig. 6C, D). From this, it was confirmed that the short-wave green and blue matured.
이처럼 파장별로 성숙 정도 차이를 나타낼 뿐만 아니라 각각 세 가지 세기로 실험을 수행한 결과, 가장 세기가 낮은 저 (low) 또는 중 (middle)의 세기에서 mRNA, 단백질 및 GSI의 결과를 통해 성숙이 가장 촉진된 것으로 관찰되었다. 이는 에너지 효율 측면에서 보았을 때 긍정적인 효과로 보이며, 동시에 LED의 자체적인 에너지 효율과 낮은 빛의 세기의 장점으로 인한 경제적 시너지 효과가 발생될 것으로 사료된다. In addition to the differences in the degree of maturity by wavelength, the experiments were performed at three intensities, respectively.Maturation was most promoted through the results of mRNA, protein, and GSI at the lowest or middle intensity. Was observed. This seems to be a positive effect in terms of energy efficiency, and at the same time, economic synergies are expected due to the advantages of LED's own energy efficiency and low light intensity.
이와 같이 단파장에서 난 성숙이 유도되는 메커니즘에 대해서는 아직까지 명확하게는 밝혀져 있지 않지만, 이는 광범위한 분광 감도의 하나의 색소 또는 몇몇의 광색소들이 외부 빛의 자극이 전환되는 것과 밀접한 관련이 있을 가능성을 제시할 수 있다. 또한, 특이적 광 수용체가 성 성숙 기능에 관련이 있는 것으로 알려져 있지만, 아직까지 정확하게 밝혀진 바 없으나, 이 중 하나의 가능성은 눈(lateral eyes)에 있는 광색소와 밀접한 관련이 있는 것으로 판단된다.
This mechanism of induction of short-term egg maturation is not yet clear, but it suggests that one pigment or several photopigs with broad spectral sensitivity may be closely related to the switching of external light stimuli. can do. In addition, although specific photoreceptors are known to be involved in sexual maturation function, it has not yet been precisely identified, but one possibility is considered to be closely related to the photopigment in the lateral eyes.
3. 혈액 분석에 따른 혈장 E 2 농도 3 . Plasma E 2 according to blood analysis density
혈장 estradiol-17β (E2) 농도는 immunoassay 기법을 사용한 E2 ELISA kit (Cusabio Biotech, Hubei, China)로 측정하였다. 파장별 및 세기별 실험구에서 혈장 E2 농도는 plate reader기를 이용하여 분석하였다 (도 7). Plasma estradiol-17β (E 2 ) concentration was measured by E 2 using immunoassay technique. It was measured by ELISA kit (Cusabio Biotech, Hubei, China). Plasma E 2 in Experimental Species by Wavelength and Intensity Concentration was analyzed using a plate reader (Fig. 7).
혈장 E2 농도는 녹색 파장 실험구 (503±35 pg/mL; 저) 및 청색 파장 실험구 (504±16.7 pg/mL; 저)에서 다른 실험구에 비하여 유의적으로 높은 농도가 관찰됨으로서 단파장인 녹색과 청색 파장은 어류의 성장과 동시에 난 성숙을 유도하여 번식능을 증진시키는 데 긍정적인 효과가 있는 것으로 사료된다.Plasma E 2 Concentrations were significantly higher in the green wavelength (503 ± 35 pg / mL; low) and blue wavelength (504 ± 16.7 pg / mL; low) than other experiments. Wavelength is thought to have a positive effect on the growth of fish and fertility by inducing egg maturation.
이와 같이 빛의 파장과 성숙과의 관련성 혹은 메커니즘에 대하여 빛(파장)에 대한 생리적 반응으로도 설명이 가능할 것으로 보인다. 빛에 대한 어류의 생리적 반응 중, 스트레스와의 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되어있는데, 본 발명자들의 선행발명에 의하면, 흰동가리에 적색, 녹색, 청색 LED 파장을 조명하였을 때, 녹색과 청색 LED 실험구에서 다른 파장의 실험구에 비하여 lipid peroxidation (LPO)와 H2O2 농도가 다른 실험구에 비하여 유의하게 낮은 값을 보여 산화 스트레스를 억제하는 것으로 보고하고 있다. As such, it may be explained by the physiological response to light (wavelength) in relation to the wavelength or maturity of light. It is reported that the physiological response of fish to light is closely related to stress. According to the inventors' prior invention, when the red, green, and blue LED wavelengths are illuminated on the clownfish, the green and blue LED experiments The lipid peroxidation (LPO) and H 2 O 2 concentrations were significantly lower than those of the other wavelengths, and it was reported to inhibit oxidative stress.
이러한 결과들을 종합해 보면 단파장이 스트레스로부터 체내를 보호하며, 동시에 면역 기능까지 향상시킴으로써 어류의 건강도를 최상으로 유지시켜 줌으로써 번식능의 증진으로 이어지는 것으로 사료된다.
Taken together, these results suggest that short-wavelengths protect the body from stress and at the same time improve immune function, leading to improved fertility by maintaining fish's health.
IIII . . LEDLED 광원의 조사에 의한 어류의 성 성숙 제어를 이용한 양식방법 Aquaculture method using sex maturation control of fish by irradiation of light source
본 발명에서는 어류의 생식소 발달을 LED의 특정 광원으로만 조절할 수 있는지를 확인하기 위하여, 적색, 녹색, 청색 및 자주색 LEDs 파장의 조명과 각각의 파장별로 세 가지 강도로 설치한 실험구의 파랑돔의 간과 생식소에서 난황 전구 단백질인 비텔로제닌(VGT)와 에스트로겐의 수용체인 ER mRNA 및 각각의 단백질 발현을 확인하였다. In the present invention, in order to determine whether the gonad development of fish can be controlled only by a specific light source of the LED, the red, green, blue and purple LEDs wavelength illumination and overlooking the blue dome of the experimental zone installed with three intensities for each wavelength In the gonad, the egg yolk precursor protein (VGT) and estrogen receptor ER mRNA and the expression of each protein were confirmed.
파랑돔을 총 4개월 동안 각 파장별 및 세기별로 조명 시 비텔로제닌(VGT)와 ER mRNA 및 각각의 단백질량의 발현 변화를 분석한 결과, 단파장인 녹색과 청색 LED 조명 시 다른 파장보다 유의적으로 높은 발현량이 관찰되었고 파장의 조사 강도는 0.3 내지 0.6 W/m2인 경우가 좋은 결과를 보였다(도 4). Analysis of the changes in the expression of vitelogenin (VGT) and ER mRNA and the amount of each protein when the blue dome was illuminated for each wavelength and intensity for a total of four months was found to be more significant than other wavelengths when the short wavelength green and blue LEDs were illuminated. High expression was observed and the irradiation intensity of the wavelength was 0.3 to 0.6 W / m 2 showed a good result (Fig. 4).
또한, 본 발명자들에 의한 선행 발명에서는 흰동가리를 형광등, 적색, 녹색 및 청색 LED 조명 아래서 사육한 결과, 녹색과 청색 LED 실험구에서 성장 호르몬이 유의적으로 높게 분비되었다고 보고하였으며, 총 4개월간 사육 시 녹색과 청색 LED 실험구에서 유의적으로 높은 체성장도가 관찰된 것으로 보고하고 있다. 본 발명에서도 파랑돔을 파장별로 사육한 결과 녹색 및 청색의 단파장 환경이 다른 파장에 비하여 높은 체성장도를 유도하는 것을 관찰할 수 있었다(도 3). In addition, in the preceding invention by the present inventors, when the clownfish were bred under fluorescent, red, green, and blue LED lighting, they reported that the growth hormone was secreted significantly higher in the green and blue LED experiments, and it was raised for a total of four months. City green and blue LEDs were reported to have significantly higher body growth. In the present invention, as a result of breeding blue dome by wavelength, it was observed that green and blue short wavelength environments induced higher body growth than other wavelengths (FIG. 3).
이와 같은 본 발명의 실험 결과로부터 단파장인 녹색과 청색 파장이 난 성숙 촉진에 영향을 미쳐 어류의 번식능 비율을 증가시키는 것으로 사료된다. From the experimental results of the present invention, it is thought that the green and blue wavelengths, which are short wavelengths, influence the stimulation of maturation and increase the rate of fertility of fish.
어류의 양식은 산업성 및 경제성을 담보로 이루어지는 것이므로, 단위시간 동안의 어류생장 효율은 양식업의 산업적 가치를 결정짓는 중요한 요소이다. 따라서 양식을 위한 종묘의 입식에서 종묘의 초기생존율을 높이는 것이 중요하고, 또한 본 양식에 있어서 단기간에 어류를 성장시키는 것은 양식 산업의 경제적 이윤 추구 면에서 중요한 의의를 갖는다. Since fish farming is made of industrial and economic collateral, the efficiency of fish farming per unit time is an important factor in determining the industrial value of aquaculture. Therefore, it is important to increase the initial survival rate of seedlings in the stocking of seedlings for aquaculture, and the growth of fish in a short time in this farming is important for the economic profit pursuit of aquaculture industry.
이러한 목적을 달성하기 위해 본 발명자는 어류가 외부 환경 요인에 의한 스트레스에 대하여 체내에서 자가 내분비 조절에 의하여 자기방어 물질을 분비하게 하여 체내에서 초기에 일시적으로 산화 스트레스를 유발시켜, 어체 내에서 강력한 항산화 물질인 멜라토닌의 분비를 촉진시키는 계기를 만들어 주는 어류의 스트레스 제어 방법을 이용한 양식방법으로의 이용을 제안하였다 (출원번호 10-2012- 0061201). In order to achieve this object, the present inventors allow fish to secrete self-defense substances in the body by regulating self-endocrine in response to stress caused by external environmental factors, thereby causing oxidative stress in the body at the beginning, and thus, powerful antioxidant in the body. A fish farming method has been proposed to use fish as a method for controlling stress of melatonin (appl. No. 10-2012- 0061201).
또한, 녹색 및 청색 파장은 어체 내에서 성장 호르몬(GH)의 분비를 자극시킴으로써 어류의 성장을 촉진시키는 역할을 수행한 것을 확인하고 어류의 성장을 효과적으로 증진시킬 수 있는 어류 사육을 위한 인공적인 광원 시스템의 설계의 활용 및 수조에서 사육된 종묘를 청색 (430-490 nm) 또는 녹색 (520-580 nm) LED 광원을 일정시간 조사하여 어류 체내의 뇌하수체 자극을 유발시킴으로서 성장호르몬의 분비를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 LED 광원 조사에 의한 어류의 성장 제어를 이용한 양식방법을 제안하였다 (출원번호 10-2012-66215).In addition, green and blue wavelengths have been shown to play a role in promoting the growth of fish by stimulating the secretion of growth hormone (GH) in the body and artificial light source system for fish breeding that can effectively promote the growth of fish Promote secretion of growth hormone by irradiating the blue (430-490 nm) or green (520-580 nm) LED light source for a certain period of time with the seedlings bred in the tank and causing pituitary stimulation in the fish body A farming method using the growth control of fish by irradiation with LED light source was proposed (Application No. 10-2012-66215).
이러한 제안된 방법은 양식 어류의 종묘를 입식하는 경우, LED 광원을 점등함으로서 치어가 외부로부터 스트레스를 받는 환경 스트레스를 내분비 작용효과로 극복하면서 초기 사망률을 낮추는 효과를 갖고, 또한, 녹색과 청색의 LED광원을 점등하여 일정기간 사육함으로서 그렇지 않은 경우보다 단기간에 어류를 성장시켜 어류 양식의 경제성을 높이는 효과를 갖게 한다.The proposed method has the effect of lowering the initial mortality rate by extinguishing the environmental stress stressed from the outside by the endocrine effect by turning on the LED light source when stocking the breeding of farmed fish, and also the green and blue LED By lighting the light source for a certain period of time, the fish grows in a shorter time than it would otherwise, thereby increasing the economics of fish farming.
한편, 자연광의 조건 또는 본 발명 및 선행 발명에서와 같이 인공광원 조건에서 성장한 어류를 번식시키기 위해서는 자연적인 성 성숙에 의해 산란유도가 가능하나, 필요에 의한 경우 본 발명의 조건을 이용함으로서 인위적으로 성 성숙을 유도시켜 산란을 유도할 수 있다.On the other hand, in order to breed fish grown in artificial light source conditions as in the natural light conditions or the present invention and the prior invention, it is possible to induce spawning by natural maturation, but if necessary, artificially by using the conditions of the present invention Induction of maturation can lead to spawning.
즉, 어류를 수조에서 일정기간 사육하는 단계를 거쳐 산란을 유도해야할 시기라고 판단되면 상기 사육된 어류를 자연광이 배제된 광 환경조건에서 청색 (430- 490nm) 또는 녹색 (520-580 nm) 파장 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 LED 광원으로 조사를 시작한다. 상기의 선택된 LED 광원을 1 내지 4개월 동안, 명암 주기 12시간으로 조사하는 광 자극을 주는 것으로 어류의 생식소 성숙을 유도시켜 필요한 시기에 산란을 유도할 수가 있을 것이다. That is, when it is determined that it is time to induce spawning through the breeding of fish in a tank for a certain period of time, the reared fish may be caught in a blue (430-490 nm) or green (520-580 nm) wavelength under light environmental conditions in which natural light is excluded. Irradiation is started with any one or more LED light sources selected. By irradiating the selected LED light source with light stimulation for 1 to 4 months in a light and dark cycle of 12 hours, the gonad maturation of the fish may be induced to induce spawning when necessary.
산란을 유도하기 위한 LED 광원의 광자극의 패턴으로서 본 발명에서는 초기 6시간은 녹색 (520-580 nm)을 점등하고 후기 6시간은 청색 (430-490 nm)을 점등하여 광 자극을 변화시킴으로서 LED 광원 조사에 의한 어류의 성성숙을 제어한다. 이는 동일한 광원을 자극원으로 일정시간 사용하게 되면 자극원을 받는 수용체는 자극원에 대해 내성이 생겨 자극으로 인식되지 않게 되기 때문으로 동일한 자극원으로 오랜 시간을 조사하는 것보다 유사한 효과를 낼 수 있는 광원의 파장으로 변화시켜 자극을 인식시킴으로서 상승된 효과를 갖게 할 수 있다. As a pattern of photo-stimulation of the LED light source to induce scattering, in the present invention, the initial 6 hours light green (520-580 nm) and the last 6 hours light blue (430-490 nm) to change the light stimulation LED Controlling the maturation of fish by light source irradiation. This is because when the same light source is used as a stimulus source for a certain time, the receptor receiving the stimulus source becomes resistant to the stimulus source and thus cannot be recognized as a stimulus. By changing the wavelength of the light source to recognize the stimulus can have an elevated effect.
이를 뒷받침할 실험결과로는 본 발명자들에 의한 선행발명의 실험에서 적색, 녹색, 청색의 LED 파장을 갖는 광원을 설치한 실험구별로 흰동가리의 성장 관련 실험 및 멜라토닌에 의한 흰동가리의 성장 증진 효과를 확인해 보기 위하여, 멜라토닌을 복강 내 주입한 후 일주기별 성장호르몬 (GH) mRNA 발현량의 측정을 통하여 특정한 LEDs 파장이 GH mRNA 발현량의 변화에 미치는 영향을 파악한 실험결과가 이를 뒷받침한다. Experimental results to support this are the experiments related to the growth of clownfish and the effect of enhancing the growth of clownfish by melatonin in each experimental section where light sources with red, green and blue LED wavelengths were installed in the experiments of the present invention by the present inventors. In order to confirm the results, an experimental result of determining the effect of specific LEDs wavelength on the change in GH mRNA expression level by measuring GH mRNA expression level per cycle after intraperitoneal injection of melatonin is supported.
도 8은 Quantitative real-time PCR을 이용하여 적색 청색(B), 녹색(G) 및 적색(R) LED 및 자연 광주기 (simulated natural photoperiod; SNP) 조명 아래에서 흰동가리의 뇌하수체에서 GH mRNA 발현 (A) 및 멜라토닌 주입 시 GH mRNA 발현 (B) 변화를 관찰한 결과를 나타낸다. 실험어의 명암 주기를 12:12로 설정하여 사육하였으며, 총 뇌하수체 RNA (2.5 μg)는 역전사하여 증폭시켰다. 결과는 같은 샘플 내 β-actin양에 비례하여 표준화된 발현량으로 나타났다. 흰색 바는 명기를 나타낸 것이며, 검은 바는 암기를 나타낸 것이다. 각각 다른 알파벳 문자는 동일한 파장 내 Zeitgeber times (ZT) 간의 유의적인 차이를 나타내며 (P < 0.05), 십자 표시(†)는 동일한 Zeitgeber times (ZT) 내 파장 별로 유의적인 차이를 나타낸 것이고 (P < 0.05), 별표는 멜라토닌 주입 실험구와 주입하지 않은 실험구 간의 유의적 차이를 나타내었다. 모든 수치들은 평균 ± SD (n = 5)로 표현하였다.FIG. 8 shows GH mRNA expression in the pituitary pituitary gland under red blue (B), green (G) and red (R) LEDs and simulated natural photoperiod (SNP) illumination using Quantitative real-time PCR. A) and melatonin injection show changes in GH mRNA expression (B). The light and dark cycles of experimental fish were set at 12:12, and total pituitary RNA (2.5 μg) was reverse transcribed and amplified. The results showed normalized expression in proportion to the amount of β-actin in the same sample. White bars indicate light and black bars indicate memorization. Each different alphabet letter represents a significant difference between Zeitgeber times (ZT) within the same wavelength ( P <0.05), and a cross mark (†) represents a significant difference by wavelength within the same Zeitgeber times (ZT) ( P <0.05). , The asterisk showed a significant difference between the melatonin injection group and the non-injection group. All values are expressed as mean ± SD ( n = 5).
즉, 도 8에서 QPCR을 이용하여 파장별 뇌하수체 GH mRNA 발현 변화를 조사한 결과 (도 8), GH mRNA는 모든 파장 실험구에서 명기보다 암기에서 유의적으로 높은 발현량을 보이며, 더욱이 청색 LED 실험구에서 다른 파장 실험구보다 유의적으로 높은 발현량이 관찰되었다 (도 8A). 멜라토닌을 주입한 실험구에서의 일주기 동안 GH mRNA 발현 변화는 주입하지 않은 실험구와 비슷한 패턴을 보이나 전체적인 발현량은 주입하지 않은 실험구에 비하여 유의적으로 높은 발현량이 관찰되었다 (도 8B). That is, as a result of examining the changes in pituitary GH mRNA expression for each wavelength using QPCR in FIG. 8 (FIG. 8), the GH mRNA shows a significantly higher expression level in the memorization than the specified period in all wavelength experiments. Significantly higher expression was observed in the other wavelengths than in the experimental group (FIG. 8A). Changes in GH mRNA expression during one cycle in the experimental group injected with melatonin showed a similar pattern to the experimental group not injected, but the overall expression level was significantly higher than the experimental group not injected (FIG. 8B).
각 LED 파장별 암기의 GH mRNA 발현 변화 패턴을 살펴보면 전반 6시간은 녹색광원에서 우세하고 후반 6시간 동안의 GH mRNA 발현 변화 패턴은 청색광원이 우세한 것을 볼 수 있다 (도 8). 따라서 광원을 이용하여 성성숙을 유도하더라도 자극을 일정시간의 간격으로 바꿔줌으로서 더욱 상승된 효과를 얻을 수 있다. Looking at the change pattern of GH mRNA expression of the memorization by each LED wavelength can be seen that the first 6 hours of the green light source and the second 6 hours of GH mRNA expression change pattern is predominantly blue light source (Fig. 8). Therefore, even if the induction of maturity using a light source can be further enhanced by changing the stimulus at a certain time interval.
또한, 본 발명자들에 의한 선행발명의 실험결과에서는 6개월 동안 장기간 사육 후, 흰동가리의 전장을 측정해 본 결과, 녹색과 청색 LED 파장에서 유의적으로 빠른 성장률을 나타낸 점으로부터 녹색 및 청색 빛과 같은 단파장이 어류의 자어뿐만 아니라 성어의 성장에도 효과적으로 영향을 미치고 있고, 어류를 포함한 생물체의 성장을 촉진하는 물질로서 주로 송과체에서 분비되는 호르몬인 멜라토닌의 분비작용에도 중요한 역할을 하는 것으로 보고하였다. In addition, the experimental results of the present invention by the present inventors, after measuring the full-length of the clownfish after long-term breeding for 6 months, the green and blue light and It is reported that the same short wavelength has an effect on the growth of fish as well as fish larvae, and plays an important role in the secretion of melatonin, a hormone secreted from the pineal gland, as a substance that promotes the growth of organisms including fish.
이러한 결과를 종합해 보면, 녹색 및 청색 파장은 본 발명에서와 같이 파랑돔의 성 성숙 영향뿐만 아니라, 흰동가리의 성장을 촉진시키는 요인 및 멜라토닌이 어체 내에서 GH 분비를 자극시킴으로써 흰동가리의 성장을 촉진시키는 역할을 수행한 것으로부터 다음과 같은 양식방법 및 양식장치로 이용이 가능하다.Taken together, these results suggest that green and blue wavelengths, as in the present invention, not only affect the maturation of blue dome, but also the factors that promote the growth of clownfish and melatonin stimulate GH secretion in fish bodies, thereby promoting the growth of clownfish. It can be used as aquaculture methods and farming equipment as follows from the role of promoting.
치어 종묘를 수조에 입식시켜 산란이 가능한 성어까지 양식을 하는 경우, 어류 양식용 종묘를 준비하는 단계, 자연광이 차단된 수조에 종묘 (치어)를 입식시키는 단계; 상기 수조에 파장 600-650 nm의 LED 광원을 조사하여 1-3일간 사육하여 어류의 체내에서 초기에 일시적으로 산화 스트레스를 유발시킴으로서, 어체 내에서 멜라토닌의 분비를 촉진시켜 안정화시키는 단계를 거친 종묘를 자연광 조건에서 일정기간 사육하여 성장시키는 단계; 또는 자연광이 배제된 광 환경조건에서 청색 (430-490nm) 또는 녹색 (520-580 nm) 파장 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 LED 광원으로 조사하여 일정기간 성장시키는 단계를 거치고, 일정의 크기로 사육된 어류를 자연광이 배제된 광 환경조건에서 청색 (430-490nm) 또는 녹색 (520-580 nm) 파장 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 LED 광원을 1-4개월 동안, 명암 주기 12시간으로 조사하는 광 자극을 주어 어류의 생식소 성숙을 유도시키는 단계를 포함하여 이루어지는 LED 광원 조사에 의한 어류의 성 성숙 제어를 이용한 양식방법으로의 응용이 가능할 것이다. When the fry seedlings are stocked in a tank to produce a spawnable adult fish, preparing fish seedlings, and placing seedlings (fry) in the tank where natural light is blocked; By irradiating the tank with an LED light source having a wavelength of 600-650 nm and breeding for 1-3 days to induce a temporary oxidative stress in the fish body early, the seedlings which have been stabilized by promoting the secretion of melatonin in the fish body Breeding and growing for a certain period of time under natural light conditions; Alternatively, the fish bred to a certain size after being irradiated with one or more LED light sources selected from blue (430-490 nm) or green (520-580 nm) wavelengths under natural light conditions and growing for a certain period of time. In a light environment where natural light is excluded, any one or more LED light sources selected from blue (430-490 nm) or green (520-580 nm) wavelengths are irradiated for 1-4 months with a light / dark cycle for 12 hours. Application of the method to aquaculture using control of fish maturation by irradiation with LED light source comprising the step of inducing gonad maturation of fish.
도 9는 상기 양식방법을 실현하기 위해 필요한 어류의 성 성숙 제어에 이용되는 양식장치의 예를 나타낸다. LED 광원 조사에 의한 어류의 성 성숙 제어를 이용한 양식에 사용되는 장치는 자연광이 개폐가 가능한 일정 공간(1); 상기 공간의 일부에는 종묘를 입식할 수 있는 수조(3); 상기 수조에는 사육수를 여과할 수 있는 여과장치(4)와 산소 공급기(5)가 연결 설치되고, 상기 수조 상부에는 파장 600-650 nm, 430-490 nm, 520-580 nm인 LED 광원이 각각 복수 개 설치되고(2), 상기 LED 광원의 점등 및 광원의 강도를 제어할 수 있는 광원 제어장치가 설치된 장치로 제공될 수 있다. Fig. 9 shows an example of a farming apparatus used to control sex maturation of fish necessary for realizing the farming method. Apparatus used in aquaculture using the control of maturation of fish by irradiation with LED light source is a certain space (1) capable of opening and closing natural light; A
이와 같이 본 발명과 본 발명자들에 의한 선행 발명의 실험결과를 종합하면, 광 제어를 통해 어류의 성장을 효과적으로 증진 가능하고, 또한 광 제어를 이용한 어류의 성 성숙을 제어함으로서 필요한 시기에 어류의 산란 유도가 가능한 양식방법으로의 응용이 가능한 것으로 판단되며, 이와 같은 광 제어를 통한 양식방법은 최근 개발이 시도되고 있는 고밀도 빌딩양식 등에 필요한 양식기법의 완성을 위한 주요 기술서의 산업적 이용이 가능하다.
As described above, the experimental results of the present invention and the inventors of the present invention can be combined to effectively promote the growth of fish through light control, and also to scatter the fish at a necessary time by controlling the sex maturation of the fish using light control. It is judged that it can be applied to the induction method which can be induced, and the light control method through the light control can be industrially used for the completion of the aquaculture technique necessary for the high density building modality which is being developed recently.
각각의 파장을 갖는 LED 광원을 이용하여 어류의 성장 실험을 실시 한 결과, 특정한 LED 파장이 GH mRNA 발현량의 변화에 영향을 미치는 것으로 파악하였고, 각 파장별 및 세기별로 조명 후 비텔로제닌(VGT), ER mRNA 및 혈장 estradiol-17β (E2) 호르몬 측정을 통해 난 성숙을 조사한 결과, 녹색 및 청색 파장을 저 (0.3 W/m2) 또는 중(0.6 W/m2)의 강도에서 조사한 결과, 비텔로제닌(VGT)와 ER mRNA 및 각각의 단백질 발현이 다른 파장에 비해 유의적으로 높게 나타났다. 이와 같은 결과로 보아 녹색 및 청색의 단파장, 0.3 내지 0.6 W/m2 강도로서 어류의 성장을 유도시킬 수 있을 뿐만 아니라 생식소 성숙에도 가장 긍정적인 효과가 있는 것으로 나타나 단파장의 광 제어를 이용함으로서 필요한 시기에 어류의 산란 유도가 가능한 양식방법으로의 응용이 가능하고, 이와 같은 광 제어를 통한 양식방법은 최근 개발이 시도되고 있는 고밀도 빌딩양식 등에 필요한 양식기법의 완성을 위한 주요 기술서의 산업적 이용이 가능하다.As a result of the fish growth experiment using LED light source having each wavelength, it was found that the specific LED wavelength influences the change of GH mRNA expression level. ), ER mRNA and plasma estradiol-17β (E 2 ) hormonal measurements of egg maturation and green and blue wavelengths at low (0.3 W / m 2 ) or medium (0.6 W / m 2 ) , Vitelogenin (VGT) and ER mRNA and protein expression were significantly higher than other wavelengths. These results show that green and blue short wavelengths, 0.3 to 0.6 W / m 2 intensity, can not only induce fish growth but also have the most positive effect on gonad maturation. It is possible to apply it to aquaculture method that can induce the scattering of fish, and this method of light control through the light control can be industrially used to complete aquaculture techniques necessary for high density building culture, which is being developed recently. .
Claims (6)
b) 상기 사육된 어류를 자연광이 배제된 광 환경조건에서 파장 430-490 nm 또는 파장 520-580 nm 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 LED 광원을 조사 강도 0.3-0.6 W/m2 로 조사하는 단계;
c) 상기 b) 단계의 광원을 1-4개월 동안, 명암 주기 12시간으로 조사하는 광 자극을 주어 어류의 생식소 성숙을 유도시키는 단계를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 LED 광원 조사에 의한 어류의 성 성숙 제어를 이용한 양식방법
a) raising fish in the tank for a period of time;
b) irradiating the bred fish with one or more LED light sources selected from a wavelength of 430-490 nm or a wavelength of 520-580 nm under light environmental conditions in which natural light is excluded at an irradiation intensity of 0.3-0.6 W / m 2 ;
c) the sex of the fish by irradiation of the LED light source, characterized in that it comprises the step of inducing the gonad maturation of the fish by giving a light stimulus to irradiate the light source of step b) for 1-4 months, the light cycle 12 hours Aquaculture Method Using Maturity Control
The method of claim 1, wherein the lighting of the LED light source of step b) turns on the wavelength of 520-580 nm for the first 6 hours and the wavelength of 430-490 nm for the last 6 hours to change the light stimulus. Farming Methods Using Gender Maturity Control
b) 자연광이 차단된 수조에 a) 단계의 치어 종묘를 입식시키는 단계;
c) 수조에 파장 600-650 nm의 LED 광원을 조사하여 1-3일간 사육하여 어류의 체내에서 초기에 일시적으로 산화 스트레스를 유발시킴으로서, 어체 내에서 멜라토닌의 분비를 촉진시켜 안정화시키는 단계;
d) 상기 c)단계를 거친 종묘를 자연광 조건에서 일정기간 사육하여 성장시키는 단계;
e) d) 단계의 사육된 어류를 자연광이 배제된 광 환경조건에서 파장 430-490nm 또는 파장 520-580nm 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 LED 광원을 조사 강도는 0.3-0.6 W/m2 로 조사하는 단계;
f) 상기 e)단계의 광원을 1-4개월 동안, 명암 주기 12시간으로 조사하는 광 자극을 주어 어류의 생식소 성숙을 유도시키는 단계를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 LED 광원 조사에 의한 어류의 성성숙 제어를 이용한 양식방법
a) preparing fish seedlings
b) stocking a young seedling of step a) in a water-blocked tank;
c) stabilizing by irradiating the LED light source having a wavelength of 600-650 nm in the tank for 1-3 days to induce a temporary oxidative stress in the body of the fish initially, thereby promoting the secretion of melatonin in the fish;
d) breeding the seedlings passed through step c) for a certain period of time under natural light conditions;
e) irradiating at least one LED light source selected from a wavelength of 430-490 nm or a wavelength of 520-580 nm in a light environment in which the fish bred in step d) are excluded from natural light at an irradiation intensity of 0.3-0.6 W / m 2 ; ;
f) the maturation of the fish by irradiation of the LED light source, characterized in that it comprises the step of inducing the gonad maturation of the fish by giving a light stimulation to irradiate the light source of step e) for 1-4 months, the light cycle 12 hours Form Method Using Control
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| KR20210142374A (en) | 2020-05-18 | 2021-11-25 | 제주대학교 산학협력단 | Composition comprising chemical material for inhibiting gonadal maturation in fishes and method for inhibiting gonadal maturation in fishes using the same |
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