KR101201650B1 - 시로리무스가 고정화된 아파타이트 복합체, 이의 제조방법 및 상기 복합체를 포함하는 시로리무스의 제어 방출용 스텐트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 시로리무스가 고정화된 아파타이트 복합체, 이의 제조방법 및 상기 복합체를 포함하는 시로리무스의 제어 방출용 스텐트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 알칼리 처리된 코발트-크롬 합금 기질을 DPBS 용액 중에 침지시키고 시로리무스를 포함하는 DPBS 용액 중에 배양시켜 시로리무스가 고정화된 아파타이트 층을 형성시킨 시로리무스/아파타이트 복합체, 이의 제조방법 및 상기 복합체를 포함하는 시로리무스의 제어 방출용 스텐트에 관한 것이다.

Description

시로리무스가 고정화된 아파타이트 복합체, 이의 제조방법 및 상기 복합체를 포함하는 시로리무스의 제어 방출용 스텐트{An apatite complex incorporated with sirolimus, a method of preparation thereof and a stent for controllable release of sirolimus comprising the complex}

본 발명은 시로리무스가 고정화된 아파타이트 복합체, 이의 제조방법 및 상기 복합체를 포함하는 시로리무스의 제어 방출용 스텐트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 알칼리 처리된 코발트-크롬 합금 기질을 DPBS 용액 중에 침지시키고 시로리무스를 포함하는 DPBS 용액 중에 배양시켜 시로리무스가 고정화된 아파타이트 층을 형성시킨 시로리무스/아파타이트 복합체, 이의 제조방법 및 상기 복합체를 포함하는 시로리무스의 제어 방출용 스텐트에 관한 것이다.

현재 치과 및 정형외과적 응용물에 사용되는 생체 적합 물질 중에서 코발트-크롬 (Co-Cr) 합금은 중요한 위치를 차지하고 있다. 이는 뛰어난 기계적 특성과 생체 적합성을 가지고, 생체 내에서 우수한 생체 내성 및 매우 높은 부식 저항성을 나타내어 관절 및 치과 인공 보철물과 같은 장기 임플란트 응용물에 사용된다. ASTM 표준 F562 및 F90에 맞는, Co-Cr 합금은 수십년간 사용되어 왔으며, 최근에는 관상동맥 스텐트를 제조하는데 사용되고 있다. 이러한 합금을 이용하여 증가된 강도를 가지는 극히 얇은 지주를 제조하는 능력은 이들의 주요 장점 중의 하나이다 [Rittersma S et al., Am J Cardiol ., 2004, 93(4), 477-480]. 이와 더불어, 이들은 방사성 불투과성이고 [Kereiakes D et al., Am J Cardiol ., 2003, 92(4), 463-466] MRI-친화성이다 [Klocke A et al., J Orofac Orthop ., 2005, 66(4), 279-287].

현재, 약물 용출 스텐트 (DES)는 2003년에 시장에 도입된 이후로, 재발협착증을 방지하는 잠재적인 이점을 고려하여 심혈관 중재시술에 점점 널리 사용되고 있다 [Rao SV et al., Am Heart J., 2006, 152(2), 321-326]. 널리 입수 가능한 DES는 약물로서 파클리탁셀 또는 시로리무스를 사용한다. 라파마이신으로도 불리는 시로리무스 (SRL)는 마크로라이드계 항생제로서 1975년에 최초로 개발되었다. 이는 강한 항진균성, 면역억제, 및 항암 특성을 갖는다 [Tanaka, H. et al., J. Am . Chem. Soc ., 1987, 109, 5031-5033; Groth C G et al., Transplantation,　1999, 67(7), 1036-1042]. 이는 맥락막 신생혈관생성 및 당뇨병성 황반부종의 치료를 위한 잠재적인 치료제로서, 결절성 경화증 치료에 적용이 가능하다 [K.V. Paghdal et al., J. Am . Acad . Dermatol ., 2007, 57, 1046-1050; Jozwiak Jaroslaw et al., Medicinal research reviews,　2006, 26(2), 160-180]. 약물 방출은 약물이 스텐트에 로딩되는 방식에 따른다. 약물이 금속 표면이나 다공성 표면에 물리적으로 흡착하는 경우, 이는 단순한 확산에 의해 방출될 수 있다. 이때, 다공성 표면은 더욱 큰 표면적으로 인하여 금속 표면 보다 더욱 많은 약물을 결합하는 능력을 갖는다. 약물 방출의 양은 또한 기공의 크기 및 밀도에 의해 제어될 수 있다. 생분해를 통한 약물 전달은 가장 흔한 현상이며 이는 정형외과 [Saito N et al., Adv Drug Deliv Rev., 2005, 57(7), 1037-1048], 안과 [Yasukawa T et al., Expert Opin Drug Deliv, 2006, 3(2), 261-273], 신경과 [Domb A et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1991, 8(1), 1-17; Wang P et al., Adv Drug Deliv Rev, 2002, 54(7), 987-1013], 및 심장혈관 적용 [Tanguay J et al., Cardiol Clin, 1994, 12(4), 699-713; Tsuji T et al., Int J Cardiovasc Intervent, 2003, 5(1), 13-16]을 위한 문헌들에서 널리 검토되었다. 다수의 조사에서 종래 단순 금속 (BM) 스텐트에 비해 재발협착증의 비율이 현저하게 감소하는 것으로 나타났다 [Pasceri V et al., Am Heart J., 2007, 153(5), 749-754; Marzocchi A et al., Circulation, 2007, 115(25), 3181-3188]. 그럼에도 불구하고, 기존의 폴리머 코팅들이 완전히 비활성이 아니어서, 이들 폴리머에 대한 과민 반응들이 자주 보고되고 있는 주요 한계점을 갖는다 [Virmani R et al., Circulation, 2004, 109, 701-705; Nebeker JR et al., J Am Coll Cardiol ., 2006, 47, 175-181]. 이러한 데이터와 일맥 상통하게, 혈관벽의 염증 증가, 혈전형성 반응, 및 평활근 세포의 아폽토시스 유도와 같은 장기 부작용이 언급되어 왔다 [Sousa JE et al., Circulation, 2004, 110, e5-e6; Suzuki T et al., Circulation, 2001, 104, 1188-1193]. 또한, 신생내막 과형성증을 예방하기 위하여, 재발협착증의 생물학적 현상이 발생하는 것으로 알려진 적어도 30일 동안 적절한 약물 농도가 이행되어야 한다 [Joner M et al., J Am Coll Cardiol ., 2006, 48(1), 193-202; Pfisterer M et al., J Am Coll Cardiol ., 2006, 48(12), 2584-2591]. 폴리머로 인하여, 75%의 약물이 처음 10일에 걸쳐서 천천히 방출된다 [Joost Daemen et al., Circulation, 2007, 116, 316-328]. 폴리머에 의해 부분적으로 야기되는, 염증 반응을 줄이고 약물 방출의 균형을 잡기 위하여, DES 내 시로리무스의 서방형을 위해 아파타이트 코팅이 개발되었다. 아파타이트 코팅은 생체 아파타이트 (뼈)와 매우 유사한 잘 알려진 뛰어난 바이오세라믹스이고; 생체 적합성, 생체활성 및 생체재흡수성을 갖는다 [Rajtar A et al., Euro Intervention, 2006, 2, 113-115]. 더 나아가, 이의 다공성 구조는 이것을 이상적인 약물 전달체로 만든다. 마지막으로, Intracoronary Stenting and Angiographic Restenosis-Test Equivalence Between 2 Drug-Eluting Stents (ISAR-TEST) 조사는 최근 폴리머-프리의, 다공성, 시로리무스 코팅된 Yukon 스텐트 (Translumina, The Drug-Eluting System Company, Hechinger, Germany)가 재발협착증의 감소 면에 있어서 폴리머-기초의 PES에 비해 열등하지 않다는 점을 보여주었다 [Mehilli J et al., Circulation, 2006, 113, 273-279]. 최근 기술에 따라, 생체모방의 아파타이트 코팅은 물리화학적인 또는 형태학적인 변경 과정 이외에 약물 전달을 위한 하나의 전략이 된다 [Puleo DA et al., Biomaterials, 1999, 20, 2311-2321].

본 발명자들은 시로리무스의 방출을 제어하기 위한 새로운 약물 방출 시스템을 개발하고자 하였다. Co-Cr-Mo 합금은 NaOH 처리에 의해 층을 형성하지 않을 수 있으며, 결과적으로 SBF 중에서 아파타이트 층을 형성하지 않는다고 보고되어 있다 [Hyun-Min Kim et al., Journal of Biomedical Materials Research, 1996, 32, 409-417]. 생체모방법에 의하여 Co-Cr 합금 상에 아파타이트를 형성하고 생체모방의 아파타이트 형성 과정 도중에 시로리무스를 고정하는 것은 본 발명에 의해 처음 시도되었다. 이러한 스텐트 개념은 특별히 고안된 스텐트의 개별화된, 투여량 제어의 자가 코팅을 고려하였다. 이들의 미세다공성 표면으로 인하여, 코팅은 폴리머의 사용이 필수적이지 않았다. 시로리무스는 잠재적인 항염증 및 항증식성 효과를 나타내는 생물학적으로 활성인 약물이어서 [Kaltwasser JP et al., Expert Opin Pharmacother., 2005, 6(5), 787-801], 재발협착증의 예방을 위하여 관심의 대상이 되는 약물이 되었다.

본 발명의 목적은 알칼리 처리된 코발트-크롬 합금 기질 상에 형성시킨 시로리무스가 고정화된 아파타이트 복합체를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 시로리무스가 고정화된 아파타이트 복합체를 제조하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 시로리무스가 고정화된 아파타이트 복합체를 포함하는 시로리무스의 제어 방출용 스텐트를 제공하고자 하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 알칼리 처리된 코발트-크롬 합금 기질 상에, 시로리무스가 고정화된 아파타이트 층을 형성시킨 시로리무스/아파타이트 복합체를 제공한다.

본 발명에서, 상기 알칼리 처리는 NaOH 용액 등을 이용하여 수행될 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 시로리무스/아파타이트 복합체 제조방법을 제공한다:

1) 코발트-크롬 합금 기질을 알칼리 처리시키는 단계;

2) 상기 알칼리 처리된 기질을 DPBS를 포함하는 용액 중에 침지시켜 아파타이트 코팅층을 형성시키는 단계; 및

3) 상기 아파타이트 코팅층이 형성된 기질을 시로리무스를 함유하는 DPBS 용액 중에서 침지시켜 시로리무스가 고정화된 아파타이트 층을 형성시키는 단계.

상기 단계 1은, 코발트-크롬 합금 기질을 알칼리 처리시키는 단계로서, 코발트-크롬 합금 기질 상에 코팅층의 핵형성 및 이후 성장을 보다 용이하게 이루어질 수 있도록 기질의 표면을 보다 다공성의 거친 표면이 되도록 처리하는 단계이다.

본 발명에서, 상기 알칼리 처리는 NaOH 용액 등을 이용하여 수행될 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서, 상기 알칼리 처리는 알칼리 용액 중에서 100~160℃의 온도로 2 내지 10 시간 동안 수행할 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 알칼리 처리는 NaOH 용액을 이용하여 140℃의 온도로 6 시간 동안 수행하였다.

본 발명에서, 상기와 같이 알칼리 처리된 코발트-크롬 합금 기질은 증류수로 세척한 후 건조시켜 이후 단계를 수행할 수 있다.

상기 단계 2는, 상기 알칼리 처리된 기질을 DPBS를 포함하는 용액 중에 침지시켜 아파타이트 코팅층을 형성시키는 단계로서, 코발트-크롬 합금 기질 상에 시로리무스가 고정화된 아파타이트의 층을 형성시키는 단계이다.

본 발명에서, 상기 DPBS 용액은 초순수에 둘베코 인산염 완충용액 및 CaCl₂를 용해시켜 제조된 것이다.

본 발명에서, 상기 DPBS 용액 중에 침지시키는 단계는 35 내지 40℃에서 2 내지 12 시간 동안 수행하는 것이 바람직하다.

상기 단계 3은, 상기 아파타이트의 층이 형성된 기질에 시로리무스 및 DPBS를 포함하는 용액 중에 침지시켜 시로리무스를 고정화시키는 단계로서, DPBS에 의하여 아파타이트 층이 형성됨과 동시에 시로리무스가 고정화된다. 상기 침지시키는 단계는 35 내지 40℃에서 2 내지 12 시간 동안 수행하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 시로리무스/아파타이트 복합체 제조방법을 제공한다:

1) 코발트-크롬 합금 기질을 알칼리 처리시키는 단계;

2) 상기 알칼리 처리된 기질을 DPBS를 포함하는 용액 중에 침지시켜 아파타이트 코팅층을 형성시키는 단계; 및

3) 상기 아파타이트 코팅층이 형성된 기질에 시로리무스를 함유하는 용액을 떨어뜨려 시로리무스가 고정화된 아파타이트 층을 형성시킨 후 건조하는 단계.

또한, 상기 단계 3) 이후에 다시 단계 2) 및 단계 3)을 반복할 수 있다.

상기 단계 2는, 상기 알칼리 처리된 기질을 DPBS를 포함하는 용액 중에 침지시켜 아파타이트 코팅층을 형성시키는 단계로서, 시로리무스 고정화 전에 미리 아파타이트의 층을 형성시키는 단계이다.

본 발명에서, 상기 DPBS 용액 중에 침지시키는 단계는 35 내지 40℃에서 2 내지 12 시간 동안 수행하는 것이 바람직하다.

이때 침지 온도가 상기 범위 밖이면, 아파타이트 층의 형성이 쉽지 않은 단점이 있고, 침지 시간이 2시간 보다 짧으면 아파타이트 층의 형성이 완전히 이루어질 수 없고 12 시간 보다 길면 아파타이트 층이 과잉 형성되는 단점이 있다.

상기 단계 3은, 상기 아파타이트 코팅층이 형성된 기질에 시로리무스를 함유하는 용액을 떨어뜨려 시로리무스가 고정화된 아파타이트 층을 형성시키는 단계로서, 단계 2에서 형성된 아파타이트에 시로리무스를 고정화시켜 아파타이트와 시로리무스로 이루어진 복합체 층을 형성시키는 단계이다.

상기 시로리무스를 함유하는 용액은 DPBS 용액 또는 메틸렌클로라이드 용액을 사용할 수 있으며, 효율적인 시로리무스의 고정화를 위하여 메틸렌클로라이드가 바람직하다.

본 발명에서, 상기 단계 3은 35 내지 40℃에서 수행하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 단계 3) 이후에 다시 단계 2) 및 단계 3)을 반복할 수 있으며, 이에 따라 시로리무스를 더욱 고정화시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 시로리무스/아파타이트 복합체를 포함하는 시로리무스의 제어 방출용 스텐트를 제공한다.

본 발명에서, 상기 스텐트는 시로리무스의 서방형 방출 거동을 보일 수 있다.

본 발명에서, 상기 스텐트는 1일 이내에 버스트 방출을 나타내고 40일 내지 90일 동안 시로리무스의 지연 방출을 나타내는 특징을 갖는다.

또한, 본 발명에서, 상기 스텐트는 재발협착증이 억제되어 장기간의 시로리무스의 제어 방출에 적합하다.

이하, 본 발명의 구성을 더욱 상세하게 설명한다.

지난 세기 1970년대 말에 관상동맥 중재술 (PCI)이 도입되고 1980년대 말에 스텐트가 도입된 이후, 재발협착증은 PCI의 주요 단점으로 항상 고려되어 왔다. 이후 재발협착증의 발생은 DESs의 도입에 의해 현저하게 낮춰졌다. 그러나, 적절한 후속 조치를 취한 상당수의 임상 환자들에서 소수이지만 종래 DESs와 관련된 혈전증의 유의적인 증가가 있다는 점이 보고된 바 있다 [Kastrati A et al., N Engl J Med., 2007, 356, 1030-1039]. 또한, DESs의 현재 용도는 시로리무스의 고정화 기술과 Co-Cr 합금 표면으로부터 시로리무스의 제어 방출에 한정되어 있다. 최근, 생리적인 온도에서 몇몇의 생물학적으로 활성인 분자를 함유하는 과포화된 칼슘 포스페이트 용액 중에 임플란트를 침지시킴으로써 상기 임플란트의 표면 상에 약물이 결합된 코팅 층을 형성시키는 기술이 개발되었다 [M. Uchida et al., Adv Mater ., 2004, 16, 1071-1074; Sogo Y et al., Curr . Appl . Phys ., 2005, 5, 526-530]. 본 발명에서는 EDS용 Co-Cr 합금으로부터 시로리무스를 제어 방출시키기 위한 새로운 약물-용출 시스템을 제공하고자 하였다.

본 발명에서는 기질의 알칼리 처리, 아파타이트 코팅 및 약물 결합을 통해 새로운 약물-용출 시스템을 구축하였다.

Si，Ti, Zr, Nb 및 Ta 금속의 표면 상에서 생체모방의 아파타이트를 형성시키는 것은 과포화된 칼슘 포스페이트 용액 중에서 재생될 수 있음은 이미 확인되었다 [T. Kokubo et al., Journal of the European Ceramic Society, 2009, 29, 1267-1274]. 또한 Co-Cr-Mo 합금은 SBF 중에서 층을 형성할 수 없음이 보고된바 있다. 그러나, Co-Cr 합금은 알칼리 처리와 생체모방 과정을 통한 아파타이트 형성 능력을 가지며, 이점을 본 발명에서 최초로 확인하였다. Cr₂O₃는 DPBS 중에서 이들의 표면 상에 아파타이트를 형성함을 확인하였으며(도 3), 이들 표면 상에 많이 존재하는 히드록시기가 아파타이트 핵형성에 효과적임을 확인하였다 (도 4). Ca-P 아파타이트는 2 시간 동안 DPBS 용액 중에 침지시킨 후 알칼리 처리된 표면 상에 증착되었고, 이는 도 6a에서 보여주듯이 아파타이트의 핵형성에 해당한다. 일단 아파타이트 핵이 형성되면, 용액으로부터 칼슘, 포스페이트 및 히드록사이드 이온이 부가됨에 따라 결정들이 플레이크와 같은 단위로 성장하였다. SEM 현미경사진(도 6)은 DPBS 용액 중에서 알칼리 처리된 시료의 표면 상에 아파타이트가 형성되는 과정을 보여준다.

아파타이트 코팅 층의 결정화는 시간이 증가함에 따라 증가하였다. 도 6의 SEM 그래프로부터, 처리된 시료 상에 형성되는 아파타이트가 2 시간 침지 후에 처음으로 관찰됨을 확인할 수 있다. 그러나, Ca^{2 +}의 감소는 1 시간 침지 이후였다. EDS 결과는 또한 6 시간 후의 Ca/P 비율이 12 시간 침지 이후의 Ca/P 비율보다 더 높음을 보여주었으며, 이들 값은 장기화된 침지 이후에 증가하여 각각 대략 1.9 및 2.27이었다. 상기 결과는 아파타이트 층이 낮은 결정화도로 시료 상에 빠른 속도로 형성되는 것을 나타내고, Ca^{2 +} 농도가 12 시간 배양 이후에 최소값에 이른다는 것을 나타낸다. DPBS 용액 중에서 Ca^{2 +} 농도는 용액으로부터 칼슘, 포스페이트 및 히드록사이드 이온을 소비하여 아파타이트가 성장함에 따라 지속적으로 감소하였다. 다공성을 조절하는 능력과 함께, 생체적합성, 생활성 및 생체재흡수성이 입증되었기 때문에, 칼슘 포스페이트 기초의 물질은 현재 약물 체류 및 용출을 위하여 조사되고 있다. 아파타이트는 폴리머 대용물로서 매우 유용한 대체물인 것으로 확인되었다. 도 6c 및 도 6f에서 보여지듯이, 새롭게 형성된 균질한 코팅층이 표면 상에서 관찰되었고 이는 2개의 하위층으로 나타났다. 외부층은 헐겁고 내부층은 Co-Cr 기질에 가까운 치밀한 핵형성 층이었다. 외부층으로부터 내부층으로, 그 다음 기질까지, 표면의 형태는 훨씬 더 치밀하게 되었고, 상기 형태의 변화는 경사도를 가졌으며, 이는 처리된 기질과 아파타이트 코팅 사이에 단단한 결합을 이루기에 좋았다. 다공성의 거친 표면은 매끄러운 표면에 비해 코팅과의 더욱 강한 결합 강도를 갖는다. 코팅의 내부층이 얇을지라도, 이는 구조적 보존을 계속 유지하게 하고 기질 상에 계속 단단히 부착하여 있게 한다. 외부층은 헐겁고 잘 결정화된 층으로 이루어졌다. 얇은 판으로 된 입자들이 대체로 서로 평행하게 배향되고 시료 표면에 대해서는 거의 수직으로 배향되었다. 어느 정도까지는, 치밀한 내부층이 상기 결합 강도를 증가시키는데 있어 중요한 역할을 하였다. 본 발명에서는, 상기 코팅의 분리나 외견상의 분해를 DPBS 용액에 침지시켜 코팅시킨 Co-Cr 합금 기질 상에서 관찰할 수 없었다. 코팅층-대-기질의 결합 강도 이외에, 코팅의 화학적 성질 및 결정성은 상기 코팅의 안정성에 영향을 주는 주요한 요인이 될 수 있다. 생체모방체로 형성된 코팅은 일반적으로 HA, TCP, 테트라칼슘 포스페이트 (TTCP), CaO 및 비결정질의 칼슘 포스페이트 (ACP)를 함유한다. 이들 모든 성분들은 결정형 HA에 비해 생리학적 유체 내에서 더욱 용해 가능하다 [Fernandez J et al., J Therm Spray Technol., 2007, 16, 220e8; Zhang QY et al., Biomaterials, 2003, 24, 4741-4748]. 이 XRD 패턴은 뚜렷한 비결정질의 구조를 보여준다. 그러나, 6 시간 이후의 EDS의 Ca/P 비율은 HA의 비율(1.66)에 비해 더욱 높았으며 장기화된 침지 이후에 증가하였다. 비결정질의 비율에 따라, 상기 코팅은 생리학적 유체 내에서 분해되었으며, 이는 시험관 내 침지 테스트에 의해 본 발명에서 확인되었다 (도 7). 또한, 이의 미세 기공 구조는 여기에서 시로리무스의 고정화에 유리하였다.

본 발명에서는 아파타이트 코팅층을 분석하기 위하여 코팅층의 형태, 조성, 및 구조를 확인하고 세포 배양 실험을 수행하였다.

생체모방의 아파타이트 형성 과정은 핵형성 및 성장을 포함한다. 금속 표면 상에 핵을 형성하는 것은 어려우나 성장 과정은 더 쉽다. 생체모방의 아파타이트 형성 과정 중에 시로리무스를 고정화하는 것은 완전히 새로운 개념으로, 이를 통해 흡수 가능한 약물-용출 시스템의 제작을 위한 시로리무스가 결합된 생체모방의 아파타이트를 제공할 수 있다. SM-DPBS 용액 중에 배양시키는 과정은 6 시간 이후에 완전한 핵형성을 이루었다. 아파타이트의 성장과 함께, 시로리무스의 고정화가 동시에 발생한다. 그러므로 본 발명의 방법에 의한 시로리무스의 고정화는 더욱 단단하게 이루어진다. SEM 조사를 통해 SM-DPBS 용액 중에서의 코팅된 시료의 배양(도 1d)과 SM 용액 중에서의 다른 코팅된 시료의 배양(도 1f) 간에 구조에 있어 차이가 드러났다. SM-DPBS 용액 중에서 배양시킨 후 시로리무스의 아파타이트 고정화 형태는 시로리무스가 없는 것과 현저하게 달랐다. 시로리무스가 없이 형성된 아파타이트 결정은 날카로운 가장자리를 가진 직선형이었으며, 12 시간 침지 후 핵형성의 형태로부터 성장 형태에 이르도록 변화하였다. 시로리무스와 함께 형성된 아파타이트 결정은 구부러져 있고, 더 얇으며 더 작았으며, 12 시간 배양 후에도 핵형성의 형태로부터 변하지 않았다. SM-DPBS 용액 중 아파타이트의 형성 속도는 DPBS 용액 중에서에 비해 더 느렸다. SM 용액 중에서 시로리무스의 시료 고정화 동안 날카로은 가장자리의 얇은 판으로 만든 것과 같은 결정 형태가 계속 유지되었다. XRD 패턴은 SM-DPBS 및 SM 용액 중에서의 배양 시 아파타이트 구조를 보여주었다. 1 시간 이내에 아파타이트로부터 Ca^{2 +}의 파열 방출이 일어나는 것을 제외하고, DPBS 용액 중 시료 상에 증착된 Ca^{2 +}의 양은 항상 각각의 시간 지점에서 SM-DPBS 용액 중에 침지된 시료 상보다 더 많았다 (도 8). SM-DPBS 용액 중 시로리무스는 분리된 단량체 또는 CaP와의 복합체로서 주로 존재하였다. SM-DPBS 용액 중에 배양시킨 후, 표면 상에 증착된 칼슘 포스페이트의 일부가 아파타이트 핵 또는 아파타이트 전구체로서 제공되었으며, 자발적으로 성장하여, 시로리무스를 고정화시켜 시로리무스-아파타이트 복합체를 형성하였다. 이는 SM-DPBS 용액이 아파타이트로 과포화되어 있고 아파타이트가 더 낮은 용해도를 가지기 때문이다 [Elliot JC, Amsterdam: Elsevier Science BV, 1994, p. 1-61]. 공침전 도중 시로리무스는 아파타이트 성장과 최종적인 구조에 영향을 주었다. 그러므로 시로리무스 고정화는 아파타이트 형성 속도를 감소시키나 아파타이트 형성을 억제할 수는 없다.

생체모방의 기술로 형성된 아파타이트는 Co-Cr 합금 상의 시로리무스의 방출을 제어하기 위한 전달 시스템으로서 제공된다. 그러므로, 임플란트로 사용될 때, 시로리무스가 방출되게 되고 EDS로서 영향을 주게 된다. 그러므로, 고정화 과정 중에 시로리무스의 효과가 유지되는 것이 필요하다. SEM, XPS 및 HPLC 방법을 기초로 한 약물 분석 결과 시로리무스가 SM-DPBS 용액 및 SM 용액 중에서 Co-Cr 합금의 아파타이트 층으로 성공적으로 결합되었음을 확인하였다(표 1). SMC의 증식이 3일 및 7일 배양 후 현저하게 억제되었으므로 아파타이트 내에 결합된 시로리무스가 그 기능을 계속 유지함을 알 수 있었다(도 10). 모든 실험 결과들은 아파타이트 성장 과정 중 시로리무스가 그 기능을 잃지 않음을 보여주었다.

본 발명에서는 시로리무스가 고정화된 아파타이트 층을 포함하는 시로리무스의 제어 방출용 스텐트가 지속적이고 끊임없는 약물 방출 거동 즉, 서방형 약물 방출 거동을 보임을 확인하였다.

생분해 속도는 아파타이트 형성 도중 알칼리-처리, 침지 시간 및 DPBS 용액의 농도에 의해 변화할 수 있다. 또한, 약물-방출 프로파일은 아파타이트의 생분해 프로파일 변경에 의해 조정될 수 있다.

SEM 조사는 아파타이트 코팅된 시료, 시로리무스 결합된 시료의 생분해 변화를 보여주었다(도 7). 시로리무스의 고정화는 생리식염수 중에서 아파타이트 코팅 생분해 형태 변화에 영향을 주었다. 생분해 이후 형태는 구부러져 있고, 더 얇으며 더 작았고, 이는 핵형성의 형태와 유사하였다.

또한, 약물 방출 곡선을 확인한 결과 1일 이내에 버스트 방출이 있고 이후 적어도 40일 동안 지속적인 약물 방출을 보임을 알 수 있었다(도 9).

결론적으로, 본 발명에서는 첫째로 37 ℃에서 DPBS 용액 중에 침지시킨 후, 생체모방의 아파타이트 층이 알칼리-처리된 Co-Cr 합금 기질 상에 쉽고 빠른 속도로 형성됨을 확인하였다. DPBS 용액 중의 Ca^{2 +} 농도는 아파타이트 층의 핵형성 및 성장과 함께 지속적으로 감소하였고 12 시간 침지 후 Ca^{2 +}의 최대 농도에 이르렀다. 둘째로 본 발명에서는 시로리무스가 폴리머-프리의 생체모방 아파타이트 층 형성 과정 중에 성공적으로 고정화됨을 확인하였다. 상기 시로리무스의 고정화는 아파타이트 형성 및 생분해 형태에 영향을 주었다. 셋째로 본 발명에서는 시로리무스의 방출 동력학이 선형이며 신생내막 과형성증을 억제하기 위한 요구조건을 충족함을 확인하였다. 마지막으로 본 발명에서는 시로리무스가 고정화되어 있는 새로운 약물 용출 시스템이 시험관 내에서 효과적으로 SMCs에 대한 항증식 효과를 나타냄을 확인하였다.

본 발명은 알칼리 처리된 코발트-크롬 합금 기질을 DPBS 용액 중에 일정 시간 동안 침지시킨 후 시로리무스를 함유하는 DPBS 용액 중에서 배양시킴으로써 알칼리 처리된 코발트-크롬 합금 기질 상에, 시로리무스가 고정화된 아파타이트 층을 형성시킨 시로리무스/아파타이트 복합체를 제공할 수 있고 이를 시로리무스의 제어 방출용 스텐트 소재로 사용함으로써 재발협착증을 억제하면서 장기간의 시로리무스 제어 방출이 가능하게 하는 효과가 있다.

도 1은 Co-Cr 합금의 표면에 대한 SEM 이미지이다. 이때 (a)는 혼합 산으로 에칭한 후 대조구 기질, (b)는 알칼리-처리 후 기질, (c)는 6 시간 동안 DPBS 중에 침지시킨 후 기질, (d)는 12 시간 동안 SM-DPBS 용액 중에 배양시킨 다음, (e)는 12 시간 동안 DPBS 중에 침지시킨 후, (f)는 12 시간 동안 SM 용액 중에 배양시킨 다음, (g)는 Co-Cr 기질 상의 아파타이트 코팅의 횡단면, (h)는 상기 횡단면의 EDS를 나타낸다.
도 2는 아파타이트로 코팅된 Co-Cr 합금 스텐트의 SEM 이미지이다. 이때 (a) 및 (b)는 팽창 전 이미지이고 (c) 및 (d)는 팽창 후 이미지이다.
도 3은 Co-Cr 합금 상에 형성된 아파타이트 코팅의 XRD 패턴이다. 이때 (a)는 알칼리 처리 후 대조구 시료, (b)는 12 시간 동안 37 ℃에서 DPBS 용액 중에 침지시킨 후, (c)는 12 시간 동안 SM 용액 중에 배양시킨 후, (d)는 12 시간 동안 SM-DPBS 용액 중에 배양시킨 후 기질을 보여준다.
도 4는 Co-Cr 합금 시료의 FT-IR 스펙트럼이다. 이때 (a)는 알칼리 처리 전, (b)는 케틀 내 NaOH 용액 중에서 6 시간 동안 알칼리 처리한 후이다.
도 5는 다른 시간 간격(1h, 2h, 3h, 6h, 12h, 24h, 48h, 72h, 168h, 264h, 360h)으로 침지한 후의 Ca^{2 +} 농도를 나타낸다. 이때 (a)는 DPBS 용액 중에서의 침지, (b)는 생리식염수 중에서의 침지를 의미한다.
도 6은 (a) 2 시간, (b) 3 시간, (c) 6 시간, (d) 12 시간 동안 37 ℃에서 DPBS 용액 중에 침지된 시료의 SEM 사진, 및 (e) 상기 6 시간 동안 침지된 시료의 횡단면과, (f) 상기 12 시간 동안 침지된 시료의 횡단면의 SEM 사진을 나타낸다. 스케일 바는 1 ㎛이다.
도 7은 시료를 37℃에서 3일, 11일 및 20일 동안 생리식염수 중에 침지시킨 후 관찰한 시료 표면의 SEM 현미경 사진이다. 이때 (a)(b)(c)(d)는 아파타이트 코팅된 시료, (e)(f)(g)(h)는 SM-DPBS 용액 중에 배양시킨 후 시로리무스로 결합시킨 시료, (i)(g)(k)(l)은 SM 용액 중에 배양시킨 후 시로리무스로 결합시킨 시료를 나타낸다. 모든 스케일은 1 ㎛ 길이이다.
도 8은 다른 시간 간격 (0.5h, 1h, 3h, 6h, 12h, 24h 및 48h) 이후의 침지용 SM-DPBS 용액 중 Ca^{2 +} 농도를 나타낸다.
도 9는 SM 용액(그룹 A) 또는 SM-DPBS 용액(그룹 B) 중에서 시로리무스를 결합시키는 2가지 방법에 대한 시로리무스의 방출 프로파일을 나타낸다.
도 10은 시료의 시로리무스가 결합된 코팅 상에서 SMC 세포를 배양시켰을 때 상기 세포의 상대적인 부착 정도를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

재료 및 방법

실시예 1: 알칼리 처리된 코발트-크롬 합금 기질 제조

본 발명의 실시예에서 사용되는 코발트-크롬 합금(ASTM.90, C 0.079，Si 0.18, P <0.010, S<0.002, Mn 1.20, Ni 10.57, Cr 20.52, Fe 0.69, Co BAL., W 14.80)은 연세대학교에서 제공받았다. 합금 시료는 2 mm의 두께 및 10 mm의 직경을 가진 디스크-타입 시료로 절단하였다.

상기 디스크를 500# 방수 연마지로 닦은 다음, 10 분 동안 아세톤 중에서, 10 분 동안 알코올 중에서, 그리고 10 분 동안 탈이온수 중에서 초음파 처리하여 세척하였다(도 1a).

그 다음 모든 디스크를 초음파 세척기 내에서 1 시간 동안 혼합 산(HNO₃:HF:H₂O₂=1:1:1)으로 에칭하였다(도 1b). 상기 세척된 Co-Cr 합금 디스크를 1 M 농도의, 10ml NaOH 용액에서 일괄적으로 알칼리 처리한 후, 오토클레이브 내에서 140 ℃의 온도로 6 시간 동안 처리하였다. 상기 처리에 이어, 시편을 증류수로 부드럽게 세척하고 전기 오븐에서 37 ℃로 건조시켰다.

실시예 2: 아파타이트 층의 형성

둘베코 인산염 완충용액 (Calcium/Magnesium free, Gibco-brl Life Technologies, USA) 및 시약-등급 CaCl₂ (100 mg/L)를 초순수 중에 용해시켜 DPBS 용액을 제조하였다.

상기 실시예 1에서 제조된 시료를 최대한 12 시간 동안 37 ℃에서 5.0 ml의 상기 DPBS 용액에 침지시켜 아파타이트를 형성시켰다.

아파타이트 코팅의 생분해 테스트를 위하여, 코팅된 시료를 10 ml의 생리 식염수에 침지시키고, 수조 내에서 90일 동안 37℃에서 방치하였다. 상기 생리 식염수는 초순수에 시약-등급의 NaCl(142 mM)을 용해시키고 TRIS (50mM) 및 1M HCl을 이용하여 37 ℃의 온도에서 pH 7.4로 완충시켜 제조하였다.

실시예 3: 시로리무스의 고정화

1) 실시예 3-1

시로리무스(라파마이신)을 Genoss Co.로부터 입수하였다. 코팅 내 시로리무스의 고정화를 위하여, 실시예 2의 시료를 12 시간 동안 DPBS 용액 중에서 침지시킨 후 농도가 1mg/ml인, 0.1 ml의 시로리무스-메틸렌 클로라이드 (SM) 용액을 떨어뜨렸다. 다음으로, 상기 시료를 37 ℃에서 대기 중에 건조시켰다.

2) 실시예 3-2

시로리무스(라파마이신)을 Genoss Co.로부터 입수하였다. 코팅 내 시로리무스의 고정화를 위하여, 실시예 2의 시료를 12 시간 동안 DPBS 용액 중에서 침지시킨 후 농도가 1mg/ml인, 0.1 ml의 시로리무스-메틸렌 클로라이드 (SM) 용액을 떨어뜨렸다. 다음으로 상기 시료를, 12 시간 동안 5.0 ml DPBS 용액 중에서 배양한 후, 세척 없이 건조시키고, 0.1 ml의 약물 용액을 상기 시료에 다시 떨어뜨렸다. 다음으로, 상기 시료를 37 ℃에서 대기 중에 건조시켰다.

실시예 4: 시료 및 용액의 분석

시료의 표면을 주사전자현미경(SEM, S-4200, Hitachi, Japan)으로 관찰하였다. 코팅 내의 Ca/P 비율을 조사하기 위하여 SEM 조사를 에너지 분산 분광학(EDS) 장비와 결합하여 실시하였다. X-선 회절(XRD, Rigaku, Tokyo), 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR)을 사용하여 시료 표면의 구조를 평가하였다. 추가적으로, SM/SM-DPBS 용액에 침지하기 전후의 시료 표면을 Al Ka X-선을 사용하여 X-선 광전자 분광기(XPS, PHI 5700)로 분석하였다. 광전자 이륙각은 45°로 조정하였다.

시료를 침지한 후 시로리무스 농도를 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)로 측정하였다. 시로리무스의 양을 시료의 용액 배양 후 감소된 시로리무스 농도에 따라 계산하였다. 다른 시간에서, DPBS 용액, 생리 식염수 및 SM-DPBS 용액 내의 칼슘 이온(Ca^{2 +}) 농도의 변화를 QuantiChrom™칼슘 분석 키트(DICA-500, BioAs-say Systems, USA)를 이용하여 측정하였다. 분석을 위하여, 200 ㎕의 작용 시약을 96-웰 플레이트 내 5 ㎕의 시료 또는 표준물질의 앨리쿼트에 첨가하였다. 상기 플레이트를 실온에서 3 분 동안 배양시킨 후, 상기 플레이트를 마이크로플레이트 리더(Tecan Sunrise, Switzerland)를 이용하여 595 nm에서 측정하였다. CaCl₂의 일련의 희석액(0-200 μg/ml)을 사용하여 표준 곡선을 작성하였다. 칼슘 손실을 어떠한 시료도 없이 배양된 용액의 Ca^{2 +} 농도를 참고하여 계산하였다. 용액 중 칼슘의 모든 감소량은 티타늄 기질 상에 모두 증착된 것으로 가정하였다.

실시예 5: 시험관 내 세포 배양

폐동맥 평활근 세포(PASMC)를 PromoCell (Heidelberg, Germany)로부터 입수하고 인간 제대 동맥 내피 세포 (ECs)를 BD Biosciences (San Jose, CA, USA)로부터 입수하였다. SMCs 및 ECs를 2×10⁴ 세포/ml의 최종 농도로 멸균 96-웰 플랫-버텀 조직 배양 플레이트에 접종하고 5% 가습 CO₂ 중에서 37 ℃로 배양시켰다. 각각 SMCs 및 ECs를 위하여 혈소판-유래의 성장 인자(PDGF, 50 ng/ml) 또는 내피세포 성장 인자(ECGF, 50 ng/ml)를 이용하여 미토겐성 자극으로 세포 증식을 유도하였다. 4개 그룹 시료를 사용하였다: 폴리머, 그룹 A(실시예 3 참조), 약물과 결합된 폴리머, 약물을 사용한 그룹 B(실시예 3 참조). Magellan ELISA Reader and Software (Tecan Systems Inc., San Jose, CA, USA)를 이용하여 490 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

실시예 6: 통계학적 분석

모든 정량적인 데이터는 평균±표준편차로 기재하였다. 유의성 테스트는 스튜던트 t-테스트를 이용하여 수행하였다. P < 0.05 값을 통계적으로 유의미한 것으로 고려하였다.

결과

실험예 1: 코팅의 형태 조사

도 1에 Co-Cr 합금의 표면 형태 및 해당 EDS 분석결과를 나타내었다. 디스크를 연마하고 혼합 산으로 에칭한 모습을 도 1a에 나타내었다. 도 1b에서 보여주듯이, 알칼리 처리 후에 고도로 거친 표면 형태를 얻었으며, 이는 코팅의 핵형성 및 이후 성장에 바람직하였다. 플레이트와 같은 결정 형태 및 얇은 판으로 만든 것(lamellate)과 같은 결정 형태를 가진 미발달된 코팅이, 기질을 각각 6 시간 및 12 시간 동안 DPBS 중에 침지시킨 후에 상기 합금 상에 형성되었다(도 1c 및 도 1e). 상기 결정은 100 nm 이하의 두께와 대략 500 nm 내지 2 mm의 너비 및 대략 수 마이크로미터의 길이를 가졌다. 도 1g에는 상기 코팅의 횡단면을 나타내었다. 대략 10 ㎛ 두께의 코팅층이 생성되었다. 상기 코팅층은 외부층 및 내부층의 2개 하위층으로 이루어졌다. 상기 외부층은 헐거웠고 내부층은 Co-Cr 기질에 가까울수록 치밀한 핵형성 하위층을 이루었다. 37 ℃에서 12 시간 동안 SM-DPBS 중에 배양시킨 후에, 상기 코팅 표면은 도 1d와 같이 새로운 아파타이트 형성을 나타내었다. 그러나, SM 용액 중에 배양시킨 후에는 도 1f에 나타나 있는 바와 같이 상기 표면에 형태학적 변화가 나타나지 않았다. 코팅 조성물을 분석하기 위하여 EDS를 사용하였다. Ca 피크, P 피크 및 O 피크가 EDS 스펙트럼 상에 명백하게 나타났다. 또한, EDS 결과는 6 시간 침지 후의 Ca/P 비율이 12 시간 침지 후보다 더 높음을 보여주었다. 이때 6 시간 침지 후의 Ca/P 비율은 약 1.9이고 12 시간 침지 후의 Ca/P 비율은 약 2.27이었다. 침지 시간을 장기화한 후에 더욱 더 HA의 결과(1.66)에 가까워졌다.

한편, 팽창 전후의 코팅된 스텐트의 표면 형태를 주사 전자 현미경(SEM, S-4200, Hitachi, Japan)으로 분석하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 스텐트 표면상의 코팅은 매우 균일하였다. 스텐트 지주 사이에 웨빙 및 크랙이 관찰되지 않았다. 4.00 mm로 팽창 후 SEM 현미경 사진을 도 2c 및 도 2d에 나타내었다. 혈관성형술 기구로 팽창시킨 후 상기 스텐트 상의 코팅의 적층 분리 또는 파괴 현상이 없음을 확인할 수 있었다. 이는 상기 스텐트 코팅이, 크랙을 형성하거나 지주로부터 벗겨지지 않고 상기 스텐트를 기구 팽창시키기에 충분히 유연하다는 것을 나타낸다. 상기 스텐트 상의 코팅은 스텐트 팽창 과정에서 크랙 형성 없이 주어지는 압축 변형 및 인장 변형을 견디는 능력을 가졌다. 코팅된 스텐트 플랫폼의 독특한 얇은 판으로 만든 것과 같은 결정 표면은 필수적인 폴리머의 사용 없이도 약물 증착을 가능하게 하고 약물 방출을 지연시키는 것으로 확인되었다.

실험예 2: 코팅의 조성 및 구조 분석

코팅의 조성 및 구조를 XRD, FTIR 및 XPS를 이용하여 분석하였다.

XRD 패턴은 시료 표면의 결정 구조를 보여주었다(도 3). Co-Cr 합금 기질의 피크는 모든 XRD 패턴에 나타났다. 대조구 기질을 제외하고, 다른 3개의 시료는 아파타이트 결정 구조의 특징을 보였다. 코팅된 시료 및 시로리무스가 결합된 시료 모두에서 아파타이트의 반사에 해당하는 25.3° 근처의 강한 피크와 32° 근처의 더 약한 피크가 보였다. 새롭게 형성된 균질한 층은 12 시간 동안 SM 및 SM-DPBS 용액 중에 배양시킨 후 코팅된 표면 상에서 영향을 받지 않았다.

도 4에 나타난 바와 같이, 강하고 날카로운 흡수 피크는 히드록시기를 나타낸다. 알칼리 및 열 처리된 Co-Cr 합금에서, 아파타이트가 DPBS 중에서 처리된 표면 상에 형성될 수 있다. 알칼리 처리 중에, 표면의 비활성 Cr₂O₃ 층은 히드록시기의 부식성 공격으로 인하여 알칼리성 용액으로 부분적으로 용해된다. 결과적으로 표면 구조는 최외부 아파타이트 층으로부터 내부 Co-Cr 합금까지 점진적으로 변화되었다.

한편, 표 1에는 XPS에 의해 측정된, 시로리무스를 함유한 SM-DPBS/SM 용액 중에서 배양하기 전후의, 코팅된 시료 표면의 원소 조성을 나타내었다. C, N, Ca 및 P 함량만을 기초로 하여 퍼센트로 계산하였다.

표면	C%	N%	Ca%	P%
아파타이트	58	0	23.46	18.54
SM-DPBS 중에서 고정화	60.64	6.4	19.14	13.82
SM 중에서 고정화	76.66	1.58	11.93	9.83

본 발명에서 사용되는 시약 중에서 시로리무스에만 존재하는 질소는, 배양 이후에 검출되었다. 다양한 단계에서 표면의 화학 조성을 XPS로 측정하였다. 코팅된 시료, SM-DPBS 용액 중에서 배양된 시료 및 SM 용액 중에서 배양된 시료의 XPS wide scan 스펙트럼에 해당하는 표면 원소 조성을 표 1에 각각 나타내었다. 탄소는 전형적으로 불가피한 탄화수소 오염으로부터 생긴다. 식별할 수 있을 정도의 소량의 N이 또한 존재하며 이는 우발적으로 발생한 오염으로부터 생성된 것이다. 아파타이트 코팅 내 시로리무스의 성공적인 증착은 표 1에 나타난 바와 같이 N 및 C 함량의 증가로 나타났다. 질소-대 탄소 (N/C) 비율은 시로리무스에 대한 이론적인 N/C인 0.022와 유사하게 SM 중에서의 고정화에서 0.021이었다.

실험예 3: Co - Cr 합금 상에서의 아파타이트 형성 능력 조사

다양한 침지 시간 간격(1h, 2h, 3h, 6h, 12h, 24h, 48h, 72h, 168h, 264h 및 360h) 이후에 DPBS 용액 중의 Ca^{2 +} 농도를 도 5a에 나타내었다. Ca^{2 +} 농도는 12 시간 이후에 4.59 ㎍/㎖ 값까지 감소하고, 이후에는 천천히 감소하며 동일한 값을 기본적으로 유지하였다. 아파타이트 코팅의 생분해를 위하여, Ca^{2 +} 농도는 생리식염수 중에 침지된 후 지속적으로 증가하였다. Ca^{2 +}는 생리식염수 중에 침지되었을 때 시료의 표면 상에 새롭게 형성된 아파타이트 층으로부터 천천히 방출되었다. 상기 방출은 적어도 15 일 동안 지속되었다 (도 5b).

도 6은 일정 간격 동안 37℃에서 DPBS 용액 중에 침지시킨 시료의 형태를 나타낸다. 도 6a에 나타난 바와 같이, 2 시간 동안 DPBS 용액 중에 침지시킨 후 기질 상에 균일한 층이 형성되었다. 상기 층은 얇고 전체 표면을 덮었다. 아파타이트 결정은 작고, 얇은 단위로부터(도 6b) 장기간의 침지 이후에는 구부러진, 플레이크와 같은 단위로(도 6c), 마지막으로 단 12 시간 이후에는 날카로운 가장자리를 가지는 직선형으로(도 6d) 성장하였다. 도 6e는 6 시간 및 12 시간 동안 DPBS 용액 중에 침지시킨 시료의 횡단면을 보여주었다.

실험예 4: 시로리무스의 고정화 능력 및 방출 거동 조사

시료와 결합된 시로리무스의 양

12 시간 동안 SM-DPBS 및 SM 용액 중에 배양시킨 후, 새롭게 형성된 균질한 층을 코팅된 표면 상에서 SEM으로 관찰하였으며, 이를 도 1d 및 도 1f에 나타내었다. 용액 중 시로리무스의 농도는 37 ℃에서 12 시간 동안 시료를 배양시킨 후 감소하였다. 용액 중 시로리무스의 감소분이 전부 시료에 결합되었다고 간주하였다.

방출 이후 형태 변화

방출 전후 아파타이트와 방출 전후 약물을 가지는 아파타이트에 대해 방출 이후 형태의 변화를 조사하였다.

도 7은 생리식염수 중에 3, 11, 20일 침지시킨 후의, 시로리무스가 결합되어 있지 않은 아파타이트 코팅, 및 상기 2가지 방법으로 각각 시로리무스를 결합시킨 아파타이트 코팅의 형태 변화를 나타내었다. 상기 변화는 아파타이트 코팅의 생분해를 나타내었다. SM 용액을 이용한 시료의 형태는 생리식염수 중에서 침지시켰을 때 아파타이트 코팅의 형태와 유사하게 존재하였다. 반대로, SM-DPBS 용액 및 SM 용액에 침지시킨 시료들 간에는 아파타이트 생분해 거동상의 뚜렷한 차이가 관찰되었다. 3일 침지 후의 시료에서, 도 6f 내지 도 6h에서 보여주듯이 더욱 큰 플레이크와 같은 구조물이 나타났다.

SM-DPBS 용액 중에서 배양시킨 시료에서, Ca^{2 +} 농도는 1 시간 후에 최대값 37.79 ㎍/㎖까지 증가하였고, 이후에는 감소하기 시작하였다. 도 8은 일정 간격 동안 SM-DPBS 용액 중에 배양시킨 코팅된 시료 상의 칼슘 증착을 보여준다. 도 8의 Ca²⁺ 농도를 통해, 2가지 용액 중에서 배양 시간이 장기화됨에 따라 표면 상에 증착되는 Ca^{2 +}이 증가함을 알 수 있었다. 시료가 1 시간 동안 SM-DPBS 용액 중에 침지되었을 때, 시료로부터 용해된 Ca^{2 +}의 양은 시료 상에 증착되어 있는 Ca^{2 +}의 양보다 더 많았다. 그러나, 시료가 3 시간 동안 SM-DPBS 용액 중에 침지되었을 때에는, 더욱 많은 Ca^{2 +}가 상기 표면으로부터 용해되기보다는 시료 상에 증착되었다. 모든 배양 과정에서, 증착된 Ca^{2 +}의 양은 SM-DPBS 용액보다 DPBS 용액 중에서 유의적으로 더욱 컸다.

방출 곡선

생리식염수 중에 침지되었을 때, 시로리무스는 코팅된 시료의 표면 상에 새롭게 형성된 코팅으로부터 천천히 방출되었다. 상기 방출은 적어도 40일 동안 지속되었다 (도 9). 그룹 A의 방출 곡선에 따라, 1일 이내에 버스트 방출이 있고, 방출된 시로리무스의 양은 실시예 3-1의 경우 거의 63%에 이르고 실시예 3-2의 경우 거의 46%에 이르렀다. 그리고 40일 이후에, 실시예 3-1의 방출 속도는 97%까지 천천히 유지되었다. 이에 반하여, 실시예 3-2의 방출 속도는 1일째 버스트 방출 이후에 90일 이후에도 88%까지 다소 일정하게 유지되었다.

실험예 5: 시험관 내 세포 배양

도 10은 1일, 3일 및 7일의 배양 관찰 기간 동안 SMC 세포의 상대적인 부착 정도를 보여준다. SMC 세포는 미처리되도록 방치된 경우 지속적인 증식을 보였다(도 10). 3일째, 시로리무스가 결합된 폴리머 및 아파타이트 코팅된 시료 모두에서 SMC 성장이 유의적으로 억제되었다. 동일한 변화가 7일째에 더욱 뚜렷해졌다. 그러나, 폴리머에 부착되어 있는 SMC 세포들이 더욱 많았음을 알 수 있었다. 이러한 시험관 내 결과를 통해 시로리무스가 결합된 칼슘 포스페이트 코팅이 EDS를 위한 잠재적인 응용물임을 확인할 수 있었다.

Claims (12)

1. 알칼리 처리된 코발트-크롬 합금 기질 상에, 시로리무스가 고정화된 아파타이트 층을 형성시킨 시로리무스/아파타이트 복합체.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 알칼리 처리는 NaOH 용액을 이용하여 수행된 시로리무스/아파타이트 복합체.
   
3. 코발트-크롬 합금 기질을 알칼리 처리시키는 단계;
   상기 알칼리 처리된 기질을 DPBS를 포함하는 용액 중에 침지시켜 아파타이트 코팅층을 형성시키는 단계; 및
   상기 아파타이트 코팅층이 형성된 기질을 시로리무스를 함유하는 DPBS 용액 중에서 침지시켜 시로리무스가 고정화된 아파타이트 층을 형성시키는 단계를 포함하는 시로리무스/아파타이트 복합체 제조방법.
   
4. 코발트-크롬 합금 기질을 알칼리 처리시키는 단계;
   상기 알칼리 처리된 기질을 DPBS를 포함하는 용액 중에 침지시켜 아파타이트 코팅층을 형성시키는 단계; 및
   상기 아파타이트 코팅층이 형성된 기질에 시로리무스를 함유하는 용액을 떨어뜨려 시로리무스가 고정화된 아파타이트 층을 형성시킨 후 건조하는 단계를 포함하는 시로리무스/아파타이트 복합체 제조방법.
   
5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 알칼리 처리는 NaOH 용액을 이용하여 수행되는, 시로리무스/아파타이트 복합체 제조방법.
   
6. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 DPBS 용액은 초순수에 둘베코 인산염 완충용액 및 CaCl₂를 용해시켜 제조된 것인, 시로리무스/아파타이트 복합체 제조방법.
   
7. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 DPBS 용액 중에 침지시키는 단계는 35 내지 40℃에서 2 내지 12 시간 동안 수행하는, 시로리무스/아파타이트 복합체 제조방법.
   
8. 제4항에 있어서, 상기 제조된 시로리무스/아파타이트 복합체를 DPBS를 포함하는 용액 중에 침지시켜 아파타이트 코팅층을 형성시키는 단계; 및
   상기 아파타이트 코팅층이 형성된 기질에 시로리무스를 함유하는 용액을 떨어뜨려 시로리무스가 고정화된 아파타이트 층을 형성시킨 후 건조하는 단계를 추가로 포함하는 시로리무스/아파타이트 복합체 제조방법.
   
9. 제1항 기재의 시로리무스/아파타이트 복합체를 포함하는 시로리무스의 제어 방출용 스텐트.
   
10. 제8항에 있어서, 상기 스텐트는 시로리무스의 서방형 방출 거동을 보이는 시로리무스의 제어 방출용 스텐트.
    
11. 제9항에 있어서, 상기 스텐트는 1일 이내에 버스트 방출을 나타내고 40일 내지 90일 동안 시로리무스의 지연 방출을 나타내는 시로리무스의 제어 방출용 스텐트.
    
12. 제9항에 있어서, 상기 스텐트는 재발협착증이 억제되는, 시로리무스의 제어 방출용 스텐트.

Images