KR101194443B1 - Composition for promoting bone formation - Google Patents
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Abstract
본 발명은 20(S)-진세노사이드 Rh2를 유효성분으로 함유하는 골형성 촉진용 조성물, 치열교정용 조성물 및 골다공증, 골절, 골형성 장애, 또는 부정교합 중에서 선택된 하나 이상의 골 관련 질환 치료(개선) 또는 예방용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 골형성 촉진, 치열교정에 효과적이고, 골다공증, 골절, 골형성 장애, 또는 부정교합 중에서 선택된 하나 이상의 골 관련 질환 치료(개선) 또는 예방에 효과적이라는 장점을 갖는다.The present invention is a composition for promoting bone formation, orthodontic composition and osteoporosis, fracture, bone formation disorder, or malocclusion treatment (improved) containing 20 (S)-ginsenoside Rh2 as an active ingredient (improvement) Or a prophylactic composition.
The compositions of the present invention have the advantage of being effective in promoting bone formation, orthodontics, and in the treatment (improvement) or prevention of one or more bone related diseases selected from osteoporosis, fractures, bone formation disorders, or malocclusion.
Description
본 발명은 골형성 촉진용 조성물에 관한 것으로, 바람직하게는 골형성 촉진 작용에 의한 골형성 촉진용 약학 조성물, 식품 조성물, 치열교정용 약학 조성물, 식품 조성물 및 골 관련 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물, 개선 또는 예방용 식품 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for promoting bone formation, preferably a pharmaceutical composition for promoting bone formation by promoting bone formation, food composition, orthodontic pharmaceutical composition, food composition and pharmaceutical composition for treating or preventing bone-related diseases, It relates to a food composition for improvement or prevention.
인체의 골(bone)은 형성(bone modeling)과 재형성(bone remodeling) 과정을 통하여 그 항상성을 유지하게 된다. 골의 형성은 태생기부터 시작하여 골격이 성숙되어 성장이 끝나는 청장년기까지 지속되며 조골세포(osteoblast)의 활동으로 인한 골형성이 파골세포(osteoclast)의 활동으로 인한 골흡수 보다 훨씬 많게 된다. 그러나, 연령 증가에 따라 여러 가지 원인에 의해 골 흡수가 증가하게 되면 골 조직이 취약해져 골 다공증, 골절 등의 각종 골 질환을 발생시키게 된다. 따라서, 항상성을 유지하기 위해 골 형성 촉진제를 개발할 필요가 있다.The bone of the human body maintains its homeostasis through the process of bone modeling and bone remodeling. Bone formation begins in the early stages and lasts until the young adult period when the skeleton matures and the growth ends. Osteoblast activity is greater than bone resorption due to the activity of osteoclasts. However, when bone absorption increases due to various causes as age increases, bone tissue becomes vulnerable and causes various bone diseases such as osteoporosis and fractures. Thus, there is a need to develop bone formation promoters to maintain homeostasis.
골 관련 질환은 골다공증, 골절, 골형성 장애, 부정교합 등이 있다. 골다공증(osteoporosis)은 낮은 골양과 골기질의 파괴로 골절의 위험과 골의 취약성이 증가되는 골격질환으로, 여러 가지 원인에 의하여 뼈의 질량이 감소하고 뼈 조직의 미세구조 퇴화로 골절 위험이 지속적으로 증가하게 된다. 골다공증은 뼈를 구성하는 미네랄(특히 칼슘)과 기질이 감소한 상태이며, 골재형성의 균형이 깨져서 파골작용이 조골작용보다 증가된 상태에서 발생한다. 정상적인 뼈 내부는 그물망처럼 치밀한 구조를 이루고 있으나, 골다공증의 경우에는 구조 사이의 간격이 넓어지고 미세구조가 얇아져 약해짐으로써 조그만 충격에도 뼈가 쉽게 골절된 수 있는 상태로 진행된다.Bone-related diseases include osteoporosis, fractures, bone formation disorders, malocclusion, and the like. Osteoporosis is a skeletal disease that increases the risk of fractures and bone fragility due to low bone marrow and destruction of the bone matrix. Done. Osteoporosis is a condition in which bone constituents (particularly calcium) and substrates are reduced, and osteoclasts are increased than osteoclasts due to the balance of aggregate formation. The normal bone inside has a dense structure like a net, but in the case of osteoporosis, the gap between the structures is widened and the microstructure is thinned and weakened, so that the bone can be easily broken even in the small impact.
골다공증에는 포사맥스(Fosamax, 성분명: alendronate)와 악토넬(Actonel, 성분명: risedronate)과 같은 비스포스포네이트(bisphosphonate) 계열의 치료제가 이용되고 있으나, 이들 비스포스포네이트 제제들은 대부분 뼈를 파괴하는 파골세포의 기능을 약화하고 사멸을 유도해 뼈의 손실을 느리게 하거나 멈추는 작용을 한다. 그러나 이들 약물은 새로운 골의 형성을 촉진시키는 작용을 가지고 있지 않아, 골의 형성을 촉진시키는 작용을 하는 약물 또는 식품의 개발이 필요하다.In osteoporosis, bisphosphonate-based therapies such as Fosamax (alendronate) and Actonel (risedronate) are used, but most of these bisphosphonate agents weaken and kill osteoclasts that destroy bone. Induces slowing or stopping bone loss. However, these drugs do not have a function of promoting the formation of new bones, so the development of drugs or foods that act to promote the formation of bone is necessary.
골절은 뼈나 골 단판 또는 관절면의 연속성이 비정상적으로 끊어진 상태로, 골의 깨짐을 일컫는다. 골절을 유발하는 원인으로는 교통사고 등의 외상, 산업장에서 일어나는 안전사고, 골다공증, 골암, 대사이상 등의 질병으로 인한 골의 변화 및 스포츠나 하중으로 인한 반복적인 골에 대한 스트레스 등이 있다.Fracture refers to the fracture of bone with abnormally broken continuity of bone, bone plate, or joint surface. The causes of the fracture include trauma such as traffic accidents, safety accidents in the workplace, bone changes caused by diseases such as osteoporosis, bone cancer, metabolic disorders, and stress on the bones repeatedly caused by sports or loads.
골형성 장애(osteodystrophy)는 골이영양증이라고도 하며, 만성 신부전 등에 의해 발생되는 뼈의 질환이다. 선천적으로 비정상적인 신장기능에 의해 발생하며, 신장이 약해질 때 투성을 하지 않으면 사망한다. 이와 같은 뼈 질환을 신성 골이영양증(Renal Osteodystrophy)이라고 불리운다. 골이영양증과 관계있는 뼈 질환으로는 골연화증(osteomalacia), 섬유성 골염(osteitis fivrosa) 등이 있다.Osteodystrophy, also known as osteotrophy, is a disease of bone caused by chronic kidney failure. It is caused by congenital abnormal kidney function and dies when the kidneys are weak and not brittle. This bone disease is called Renal Osteodystrophy. Bone diseases related to osteotrophy include osteomalacia and osteotease fivrosa.
한편, 부정교합과 같이 불규칙한 치열 등을 치료 또는 예방하기 위해 치열교정을 시행한다. 치열교정을 위한 교정적 치아이동에는 치조골 교체(turnover)가 수반되며 교정력에 의해 생리적인 치조골 교체가 변화된다고 알려져 있다. 교정적 치아이동 중 치조골 교체과정은 긴장측에서의 골형성과 압박측에서의 골흡수가 반복되며, 치아이동 중 초기(3-5일)에는 골흡수가 일어나고 그 후에는 역전기, 후기(7-14일)에는 골형성이 치조골 뿐만 아니라 치주조직 전체에서 일어나는 것으로 알려져 있다. 교정력에 의해 유발된 골흡수는 1-14일 동안 지속되고 골수의 간세포로부터 유래되는 파골세포는 치아이동시 압박측에서 12시간 후 나타나 7일간 존재하며 acid phosphatase(ACP)와 tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP) 활성이 높게 나타나고, 골형성과 관련되어 있는 세포들은 높은 alkaline phosphatase(ALP) 활성을 보이며 교정력에 의한 골형성은 21일까지 지속된다고 알려져 있다. 이와 같은 치열교정시 교정력에 의한 골형성 촉진 작용에 의해 빠르고 효과적으로 치열교정이 가능하므로 골형성 촉진에 의한 치열교정이 가능한 약물 또는 식품의 개발이 필요하다.On the other hand, orthodontic treatment is performed to treat or prevent irregular dentition, such as malocclusion. Orthodontic tooth movement for orthodontics involves turnover and changes in physiological alveolar bone replacement by orthodontic forces. During orthodontic tooth movement, alveolar bone replacement process involves bone formation on the tension side and bone absorption on the compression side. Bone absorption occurs early (3-5 days) during the tooth movement, and then reverse and later (7-14 days). It is known that bone formation occurs not only in the alveolar bone but also throughout the periodontal tissue. Bone resorption induced by orthodontic power lasts for 1-14 days, and osteoclasts derived from bone marrow stem cells appear after 12 hours on the compression side during tooth movement and exist for 7 days. Acid phosphatase (ACP) and tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) It is known that high activity, bone formation-related cells show high alkaline phosphatase (ALP) activity and orthodontic bone formation lasts up to 21 days. Since orthodontic correction can be performed quickly and effectively by orthodontic force promoting bone formation by orthodontic force, it is necessary to develop a drug or food that can be orthodontized by promoting bone formation.
한편, 20(S)-진세노사이드 Rh2는 골형성 촉진과 관련하여 알려진 바가 없다.On the other hand, 20 (S) -ginsenoside Rh2 is not known with respect to promoting bone formation.
본 발명이 해결하고자 하는 하나의 기술적 과제는 골형성 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.One technical problem to be solved by the present invention is to provide a composition for promoting bone formation.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 하나의 기술적 과제는 치열교정용 조성물을 제공하는 것이다.Another technical problem to be solved by the present invention is to provide a composition for orthodontics.
본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 하나의 기술적 과제는 골다공증, 골절, 골형성 장애, 부정교합 중에서 선택된 하나 이상의 골 관련 질환 치료(개선) 또는 예방용 조성물을 제공하는 것이다.Another technical problem to be solved by the present invention is to provide a composition for the treatment (improvement) or prevention of one or more bone-related diseases selected from osteoporosis, fracture, bone formation disorder, malocclusion.
본 발명은 20(S)-진세노사이드 Rh2를 유효성분으로 함유하는 골형성 촉진용 약학 조성물을 제공한다.The present invention provides a pharmaceutical composition for promoting bone formation containing 20 (S) -ginsenoside Rh2 as an active ingredient.
상기 20(S)-진세노사이드 Rh2는 하기 화학식 I로 표시될 수 있다.The 20 (S) -ginsenoside Rh2 may be represented by the following formula (I).
<화학식 I> <Formula I>
상기 20(S)-진세노사이드 Rh2는 공지의 방법으로 제조하거나, 구입할 수 있다.The 20 (S) -ginsenoside Rh2 may be prepared or purchased by a known method.
상기 20(S)-진세노사이드 Rh2는 그대로 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태일 수 있으며, 약제학적으로 허용 가능한 염이면 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어 염산, 황산, 질산, 인산, 불화수소산, 브롬화수소산, 포름산, 아세트산, 타르타르산, 젖산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 또는 나프탈렌술폰산 등의 염 형태일 수 있다.The 20 (S) -ginsenoside Rh2 may be intact or in the form of a pharmaceutically acceptable salt, and is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable salt. For example, hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, hydrofluoric acid, Salts such as hydrobromic acid, formic acid, acetic acid, tartaric acid, lactic acid, citric acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, toluenesulfonic acid, or naphthalenesulfonic acid.
상기 골형성은 골조직의 바탕에 석회염이 침착하여 골조직을 이루는 것을 의미하며, 골모세포의 분화 유도 또는 석화작용 촉진 중에서 선택된 하나 이상에 의한 것일 수 있다.The bone formation refers to the formation of bone tissue by the deposition of lime on the bone tissue, may be due to one or more selected from the induction of differentiation or calcification of osteoblasts.
상기 골형성 촉진에 의해 골다공증, 골절, 골형성 장애, 또는 부정교합 중에서 선택된 하나 이상의 골 관련 질환 치료 또는 예방이 가능하다.By promoting bone formation, it is possible to treat or prevent one or more bone-related diseases selected from osteoporosis, fracture, bone formation disorder, or malocclusion.
또한, 본 발명은 20(S)-진세노사이드 Rh2를 유효성분으로 함유하는 치열교정용 약학 조성물을 제공한다. 치열교정은 불규칙한 치열 등을 교정하는 것을 의미한다. 상기 조성물은 치아이동 촉진에 의해 치열교정 효과를 나타내는 치아이동 촉진용일 수 있으며, 상기 치아이동 촉진은 교정적 치아이동 중 골형성 촉진에 의한 것일 수 있다. 바람직하게는 교정적 치아이동 중 긴장측에서의 골형성을 촉진함으로써 치조골과 치주조직 전체에서 교정력에 의한 골형성이 가능하도록 한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition for orthodontics containing 20 (S) -ginsenoside Rh2 as an active ingredient. Orthodontics means to correct irregular teeth. The composition may be for promoting tooth movement that exhibits orthodontic effect by promoting tooth movement, and the tooth movement promoting may be due to bone formation promotion during orthodontic tooth movement. Preferably, by promoting bone formation on the tension side during orthodontic tooth movement, bone formation by orthodontic force is possible in the alveolar bone and the entire periodontal tissue.
또한, 본 발명은 20(S)-진세노사이드 Rh2를 유효성분으로 함유하는 골다공증, 골절, 골형성 장애, 또는 부정교합 중에서 선택된 하나 이상의 골 관련 질환 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition for treating or preventing one or more bone-related diseases selected from osteoporosis, fracture, bone formation disorder, or malocclusion containing 20 (S) -ginsenoside Rh2 as an active ingredient.
상기 치료 또는 예방은 골형성 촉진에 의한 것일 수 있다(대한골절학회지 23권 3호 1225-1682, 의약정보 제 35권 제4호 통권 406호 25-35, 대한내과학회지 470권 477-481 참조).The treatment or prevention may be by promoting bone formation (see Korean Society for Fractures Vol. 23, No. 3, 1225-1682, Medical Information Vol. 35, No. 4, No. 406, 25-35, Korean Journal of Internal Medicine, Vol. 470, 477-481). .
또한, 본 발명은 20(S)-진세노사이드 Rh2를 유효성분으로 함유하는 골형성 촉진용 식품 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a food composition for promoting bone formation containing 20 (S) -ginsenoside Rh2 as an active ingredient.
또한, 본 발명은 20(S)-진세노사이드 Rh2를 유효성분으로 함유하는 치열교정용 식품 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a food composition for orthodontics containing 20 (S) -ginsenoside Rh2 as an active ingredient.
또한, 본 발명은 20(S)-진세노사이드 Rh2를 유효성분으로 함유하는 골다공증, 골절, 골형성 장애, 또는 부정교합 중에서 선택된 하나 이상의 골 관련 질환 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a food composition for improving or preventing one or more bone-related diseases selected from osteoporosis, fracture, bone formation disorder, or malocclusion, containing 20 (S) -ginsenoside Rh2 as an active ingredient.
본 발명의 식품 조성물에 있어서, 본 발명의 약학 조성물에서 언급한 사항이 모순되지 않는 한 동일하게 적용된다.In the food composition of the present invention, the same applies as long as there is no contradiction mentioned in the pharmaceutical composition of the present invention.
본 발명에 있어서, 식품조성물은 건강기능식품일 수 있으며, 제형은 통상의 방법에 따라 제조하며, 담체와 함께 건조한 후 캡슐화하거나 기타 정제, 과립, 분말, 음료, 죽 등의 형태로 제형화할 수 있으며, 상기 기재한 것 외에도 모든 식품 형태로 제조 가능하다.In the present invention, the food composition may be a health functional food, the formulation is prepared according to a conventional method, and may be encapsulated after drying with a carrier or in the form of other tablets, granules, powders, beverages, porridge and the like. In addition to the above, it can be produced in any food form.
본 발명의 조성물에 함유된 유효성분은 골형성 촉진 효과, 치열교정효과, 골다공증, 골절, 골형성 장애, 또는 부정교합 중에서 선택된 하나 이상의 골 관련 질환 치료(개선) 또는 예방 효과를 나타낸다. The active ingredient contained in the composition of the present invention exhibits an osteogenic effect, orthodontic effect, osteoporosis, fracture, bone formation disorder, or at least one bone related disease treatment (improvement) or prevention effect.
따라서, 본 발명은 본 발명의 조성물에 함유된 유효성분의 골형성 촉진 용도, 치열교정 용도, 골다공증, 골절, 골형성 장애, 또는 부정교합 중에서 선택된 하나 이상의 골 관련 질환 치료(개선) 또는 예방 용도를 제공한다.Accordingly, the present invention is directed to the treatment (improvement) or prevention of one or more bone-related diseases selected from the use of promoting active bone formation, orthodontic use, osteoporosis, fracture, bone formation disorder, or malocclusion of the active ingredient contained in the composition of the present invention to provide.
또한, 본 발명은 본 발명의 조성물에 함유된 유효성분을 포유류(인간을 포함함)에게 투여하는 단계를 포함하는 골형성 촉진법, 치열교정법, 골다공증, 골절, 골형성 장애, 또는 부정교합 중에서 선택된 하나 이상의 골 관련 질환 치료(개선) 또는 예방법을 제공한다.In addition, the present invention is one selected from the method of promoting bone formation, orthodontics, osteoporosis, fracture, bone formation disorder, or malocclusion, comprising administering to the mammal (including human) the active ingredient contained in the composition of the present invention. Provided are treatments (improvements) or preventive methods for abnormal bone related diseases.
별도의 언급이 없는 한, 본 발명의 조성물에 관한 내용은 본 발명의 용도, 방법에도 동일하게 적용된다.Unless otherwise stated, the content of the composition of the present invention is equally applicable to the uses and methods of the present invention.
본 발명의 조성물 중 유효성분은 인간을 포함한 포유류에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며, 유효성분을 약학적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 제제화하여 투여할 수 있다. 제제화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및/또는 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 및/또는 젤라틴 등을 첨가하여 제조한다. 또한, 마그네슘, 탈크 등 윤활제도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및/또는 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 주사가능한 액제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 비강세척제, 또는 좌제가 포함된다. 주사가능한 액제, 현탁제, 유제는 물, 비수성용제나 현탁용제와 유효성분을 혼합하여 제조할 수 있으며, 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등일 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및/또는 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 약학조성물은 비경구 투여시 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사로 투여가능하다.The active ingredient in the composition of the present invention can be administered orally or parenterally to mammals including humans, and the active ingredient can be formulated in combination with a pharmaceutically acceptable carrier. When formulated, diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents and / or surfactants can be used. Solid form preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid form preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, and And / or by adding gelatin or the like. Lubricants such as magnesium and talc are also used. Liquid preparations for oral administration include suspensions, liquid solutions, emulsions and syrups, and various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances and / or preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. May be included. Formulations for parenteral administration include injectable solutions, suspensions, emulsions, lyophilizers, nasal washes, or suppositories. Injectable solutions, suspensions and emulsions can be prepared by mixing water, non-aqueous solvents or suspending solvents with the active ingredient. As non-aqueous solvents and suspending solvents, vegetable oils such as propylene glycol, polyethylene glycol and olive oil, and ethyl oleate Injectable esters such as and the like. As a suppository base, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerol and / or gelatin may be used. The pharmaceutical composition of the present invention can be administered by subcutaneous injection, intravenous injection or intramuscular injection during parenteral administration.
본 발명의 조성물, 용도 및 방법에서는, 유효성분 기준으로 성인 기준 1일 5 ~ 10 mg/kg의 용량으로 사용가능하다.In the compositions, uses and methods of the present invention, it can be used in a dose of 5 to 10 mg / kg per day on an adult basis.
상기 유효성분은 약학적으로 또는 식품학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제 등을 첨가하여 제제화할 수 있으며, 제제화에 관한 내용은 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA 등의 문헌을 참조할 수 있다.The active ingredient may be formulated by adding a pharmaceutically or food-acceptable carrier, excipient or diluent, etc., and the formulation may be found in Remington's Pharmaceutical Science (Recent Edition), Mack Publishing Company, Easton PA et al. Reference may be made.
본 발명의 조성물 중 유효성분은 총 중량에 대하여 40~80 중량%, 바람직하게는 50~80%로 포함될 수 있다.The active ingredient in the composition of the present invention may be included in 40 to 80% by weight, preferably 50 to 80% with respect to the total weight.
본 발명의 조성물은 골형성 촉진, 치열교정에 효과적이고, 골다공증, 골절, 골형성 장애, 또는 부정교합 중에서 선택된 하나 이상의 골 관련 질환 치료(개선) 또는 예방에 효과적이다.The composition of the present invention is effective for promoting bone formation, orthodontics, and for treating (improvement) or preventing one or more bone-related diseases selected from osteoporosis, fractures, bone formation disorders, or malocclusion.
도 1은 20(S)-진세노사이드 Rh2에 의한 골형성 촉진 효과 확인하기 위한 ALP 활성측정 및 석화작용 측정 결과(A)와 Von Kossa와 Alizarin Red 염색 결과(B)이다.
도 2는 20(S)-진세노사이드 Rh2에 의한 골분화촉진 유전자 발현 변화 확인 결과이다.
도 3은 20(S)-진세노사이드 Rh2에 의한 PKD 활성 변화를 확인한 웨스턴블럿 결과(A~C), 골분화촉진 유전자 발현 변화 확인 결과(D) 및 ALP활성측정 및 석화작용 측정 결과(E)를 나타낸다.
도 4는 20(S)-진세노사이드 Rh2에 의한 p38 활성 변화를 확인한 웨스턴블럿 결과(A~D)와 ALP활성측정 및 석화작용 측정 결과(E)를 나타낸다.
도 5는 20(S)-진세노사이드 Rh2에 의한 AMPK와 ACC 활성 변화를 확인한 웨스턴블럿결과(A~C, E)와 ALP활성측정 및 석화작용 측정 결과(D)를 나타낸다.1 is a result of ALP activity measurement and calcification (A) and Von Kossa and Alizarin Red staining results (B) to confirm the effect of promoting the formation of bone by 20 (S) -ginsenoside Rh2.
Figure 2 shows the results of confirming changes in bone differentiation gene expression by 20 (S) -ginsenoside Rh2.
Figure 3 Western blot results (A ~ C) confirming the change in PKD activity by 20 (S)-ginsenoside Rh2, bone differentiation promoter expression change results (D) and ALP activity measurement and calcification activity measurement results (E ).
Figure 4 shows the Western blot results (A ~ D) and ALP activity measurement and calcification measurement results (E) confirming the change in p38 activity by 20 (S) -ginsenoside Rh2.
Figure 5 shows the Western blot results (A ~ C, E) and ALP activity measurement and petrification measurement results (D) confirming the change in AMPK and ACC activity by 20 (S)-ginsenoside Rh2.
이하, 실시예 및 제조예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하나, 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐으로 본 발명의 내용이 하기 실시예나 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Preparation Examples, but the following Examples and Preparation Examples are only for illustrating the present invention, and the content of the present invention is not limited to the following Examples or Preparation Examples.
하기 실시예 중 실험결과에 대한 T-검정을 실시하여 유의차가 5% 미만 (p<0.05) 또는 1% 미만 (p<0.01) 일 때 통계적 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
T-tests on the experimental results of the following examples were performed to determine statistical significance when the difference was less than 5% (p <0.05) or less than 1% (p <0.01).
<실시예 1> 20(S)-진세노사이드 Rh2의 골형성 촉진 효과와 치열교정 효과 확인Example 1 Confirmation of Bone Formation Promoting Effect and Orthodontic Effect of 20 (S) -ginsenoside Rh2
1-1. 20(S)-진세노사이드 Rh2의 준비1-1. Preparation of 20 (S) -ginsenoside Rh2
20(S)-진세노사이드 Rh2를 엠보연구소(대한민국 대전광역시 유성구 봉명동 536-9 홍인타워 1511호)에서 구입하여 준비하였다.20 (S) -ginsenoside Rh2 was prepared by purchasing from the Embossing Research Institute (Hongin Tower 1511, 536-9 Bongmyeong-dong, Yuseong-gu, Daejeon, Korea).
준비된 20(S)-진세노사이드 Rh2는 시료에 처리시, 0.1 % DMSO (dimethylsulfoxide)에 용해하여 사용하였다.The prepared 20 (S) -ginsenoside Rh2 was used by dissolving in 0.1% DMSO (dimethylsulfoxide) when treating the sample.
1-2. 세포의 준비 및 처리1-2. Preparation and Processing of Cells
골모세포로 알려진 MC3T3-E1 세포주(Riken 세포주은행)를 10% 우태아혈청과 1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen Corporation, CA, USA)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 배지(Gibco BRL, USA)에 섭씨 37 도, 5 % CO2 배양기에서 3일 마다 계대배양을 하였다. 그 후 6-웰 플레이트에 각각 5X105 세포수로 접종한 후, 50ug/ml 아스코르브산(Sigma-Aldrich Inc., MO, USA)과 10mM 베타-글리세로포스페이트(Sigma-Aldrich Inc., MO, USA)가 첨가된 DMEM 배지에서 14일간 분화를 유도하였다.The MC3T3-E1 cell line (Riken Cell Line Bank), known as osteoblasts, was prepared with Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) medium (Gibco BRL, USA) supplemented with 10% fetal calf serum and 1% penicillin / streptomycin (Invitrogen Corporation, CA, USA). ) Were passaged every 3 days in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator. 6-well plates were then inoculated with 5 × 10 5 cell numbers, respectively, followed by 50 ug / ml ascorbic acid (Sigma-Aldrich Inc., MO, USA) and 10 mM beta-glycerophosphate (Sigma-Aldrich Inc., MO, USA). ) Differentiation was induced for 14 days in DMEM medium.
1-3. 분화촉진에 관여하는 유전자 발현 변화 측정 실험1-3. Experiment for measuring changes in gene expression involved in differentiation promotion
검체(세포) 중 Total RNA는 TRIzol reagent(Invttrogen Corporation, CA, USA)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 분리하였다. 구체적으로, 배양된 세포를 차가운 PBS로 2회 세척한 다음 TRIzol reagent 1ml를 넣어 용해시켰다. 200μl의 chloroform을 넣어 흔들어 준 다음 섭씨 4도에서 12000rpm 으로 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 분리된 상층액에 동량의 이소프로판올을 넣어 흔들어준 다음 섭씨 4도에서 12000rpm으로 다시 원심분리하였다. 상층액은 버리고 남은 pallet 을 70% 에탄올로 2회 세척한 다음 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA는 260nm의 흡광도측정법으로 정량하고 확인하였다. 분리된 total RNA 5μg에 RT-PCR 증폭 kit 중 시약을 첨가하여 섭씨 45도에서 60분간 반응시킨 후 섭씨 4도에서 10분간 반응을 종결시켜 cDNA를 제조하였다. cDNA는 표 1의 프라이머를 이용한 PCR방법으로 증폭되었다. PCR 반응은 SYBR Green reagent(Roche, Basel, Switzerland)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 실시하였다. 구체적으로 동량의 cDNA에 SYBR green을 25μl 넣은후 섭씨 95도에서 30초, 섭씨 50도에서 1시간 반응을 시켜 증폭하였다.Total RNA in the samples (cells) was isolated using the TRIzol reagent (Invttrogen Corporation, CA, USA) according to the manufacturer's instructions. Specifically, the cultured cells were washed twice with cold PBS and then lysed with 1 ml of TRIzol reagent. After shaking 200μl of chloroform and centrifuged at 12000rpm at 4 degrees Celsius, the supernatant was separated. The same amount of isopropanol was added to the separated supernatant, shaken, and then centrifuged again at 12000 rpm at 4 degrees Celsius. The supernatant was discarded and the remaining pallet was washed twice with 70% ethanol and RNA was isolated. The isolated RNA was quantified and confirmed by absorbance measurement at 260 nm. 5 μg of the isolated total RNA was added to the reagent in the RT-PCR amplification kit and reacted for 60 minutes at 45 degrees Celsius, and the reaction was terminated at 4 degrees Celsius for 10 minutes to prepare cDNA. cDNA was amplified by the PCR method using the primers of Table 1. PCR reactions were carried out using SYBR Green reagent (Roche, Basel, Switzerland) according to the manufacturer's instructions. Specifically, 25 μl of SYBR green was added to the same amount of cDNA, and then amplified by reacting for 30 seconds at 95 degrees Celsius and 1 hour at 50 degrees Celsius.
[표 1][Table 1]
상기 표에서 HPRT는 정량 분석시 필요한 control gene이다.In the above table, HPRT is a control gene required for quantitative analysis.
1-4. ALP(alkaline phosphatase) 활성 측정 실험1-4. Alkaline phosphatase (ALP) activity measurement experiment
ALP는 골 형성의 지표가 되는 효소로써, 세포분화 초중기에 발현된다. 검체(세포)를 0.1% Triton X-100로 현탁시킨 후 초음파기계(Branson, USA)로 용해(lysis)시켰다. 용해된 세포를 원심분리(12000 g, 섭씨 4도)한 후 상층액을 브래드포드법으로 정량하고, 동량의 단백질을 ALP kit(Sigma-Aldrich co. MO, USA)로 제조사의 지침에 따라 ALP 활성도를 측정하였다. 구체적으로 배양된 세포를 차가운 PBS buffer로 세척한 다음 0.1% Triton-X 용액을 넣어 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 sonication 하여 세포막을 깨어준 다음 섭씨 4도, 12000rpm 에서 20분간 원심분리하였다. 상층액을 회수하여 동량으로 정량한 다음 ALP kit 중 시약을 넣어405nm에서 흡광도를 측정하여 활성을 측정하였다.ALP is an enzyme that is an indicator of bone formation and is expressed in the early and mid-cell differentiation. Samples (cells) were suspended in 0.1% Triton X-100 and lysed by an ultrasound machine (Branson, USA). The lysed cells were centrifuged (12000 g, 4 degrees Celsius), the supernatant was quantified by the Bradford method, and the same amount of protein was purified using ALP kit (Sigma-Aldrich co. MO, USA) according to the manufacturer's instructions. Was measured. Specifically, the cultured cells were washed with cold PBS buffer, and then 0.1% Triton-X solution was added to recover the cells. The recovered cells were sonicated to break the cell membrane, and then centrifuged at 4 ° C. and 12000 rpm for 20 minutes. The supernatant was collected and quantified in the same amount, and then the reagent was added to the ALP kit to measure the absorbance at 405 nm.
1-5. 석화작용(mineralization) 측정 실험1-5. Mineralization Measurement Experiment
골형성시 세포외부로 축적되는 칼슘을 Alizarin Red S(Sigma-Aldrich Co., MO, USA)와 VonKossa(Invitrogen Corporation, CA, USA) 염색을 통해 확인하였다. 검체(세포)를 10% 포르말린으로 1시간 동안 고정시킨 후, 1% Alizarin Red 용액 또는 1% Von Kossa 용액을 넣어 10분간 염색하였다.Calcium accumulated extracellularly during bone formation was confirmed by staining with Alizarin Red S (Sigma-Aldrich Co., MO, USA) and VonKossa (Invitrogen Corporation, CA, USA). Samples (cells) were fixed with 10% formalin for 1 hour, and then stained for 10 minutes with 1% Alizarin Red solution or 1% Von Kossa solution.
1-6. 단백질 발현 측정 실험1-6. Protein expression measurement experiment
세포 분화촉진관련 신호전달물질의 발현 변화를 확인하기 위해 웨스턴 블랏법을 실시하였다.Western blotting was performed to confirm the expression changes of the signal transduction mediators related to cell differentiation.
단백질 분석을 위해 검체(세포)를 lysis buffer로 균질화 하였다. 단백질 정량은 Bio Rad assay reagent (Bio-Rad, USA)를 이용하여 측정하였으며, 정량한 단백질 20 μg을 8% SDS-PAGE로 분리하였다. 이 후 gel을 membrane (Milipore, Cat. No: IPVH00010)에 transfer 하고 5% skim milk로 상온에서 1시간 blocking하였으며 1:1000 비율로 희석시킨 primary antibody(PPKD, Cell Signaling, 2054; PKD, Cell Signaling 2052; PP38, Cell Signaling, 9212; phospho-p38; Cell Signaling, 4631; P-AMPK, Cell Signaling, 2531; AMPK, Cell Signaling, 2532; P-ACC, Cell Signaling, 3661; ACC, Cell Signaling, 3662; Actin, Santacruz, sc-1616)와 4℃에서 overnight 반응하였다. Tris-buffered saline tween-20 (TBST)로 3번 washing 한 후 1:2000 비율로 희석시킨 secondary antibody(Santa Cruz, sc-2313)와 상온에서 1시간 반응시켰다. 이후 TBST로 3번 washing하고 ECL solution (Amersham, Sweden)을 이용하여 X-ray 필름에 developing하였다.Samples (cells) were homogenized with lysis buffer for protein analysis. Protein quantification was measured using a Bio Rad assay reagent (Bio-Rad, USA), and 20 μg of the quantified protein was isolated by 8% SDS-PAGE. Afterwards, the gel was transferred to a membrane (Milipore, Cat.No: IPVH00010), blocked with 5% skim milk for 1 hour at room temperature, and diluted with a 1: 1000 ratio of primary antibody (PPKD, Cell Signaling, 2054; PKD, Cell Signaling 2052). ; PP38, Cell Signaling, 9212; phospho-p38; Cell Signaling, 4631; P-AMPK, Cell Signaling, 2531; AMPK, Cell Signaling, 2532; P-ACC, Cell Signaling, 3661; ACC, Cell Signaling, 3662; Actin , Santacruz, sc-1616) and reacted overnight at 4 ℃. After washing three times with tris-buffered saline tween-20 (TBST), the mixture was reacted with secondary antibody (Santa Cruz, sc-2313) diluted at a ratio of 2000 to 1 hour at room temperature. After washing 3 times with TBST and using the ECL solution (Amersham, Sweden) was developed on the X-ray film.
1-7. 20(S)-진세노사이드 Rh2의 골 형성 촉진 효과 확인1-7. Confirmation of bone formation promoting effect of 20 (S) -ginsenoside Rh2
1-2.와 동일한 방법으로 준비한 세포에 대해, 분화유도 개시시 20(S)-진세노사이드 Rh2(0, 10, 20, 40uM)를 처리하고, 분화유도 7일째에 1-4.의 실험방법에 따라 ALP 활성을 측정하였다. 그 결과를 도 1 A에 나타내었다. 배수(fold increase)는 대조군(20(S)-진세노사이드 Rh2 무처리군)에 대한 결과를 1로 한 상대적인 비율을 의미한다.The cells prepared in the same manner as in 1-2 were treated with 20 (S) -ginsenoside Rh2 (0, 10, 20, 40 uM) at the onset of differentiation induction, and the experiment of 1-4. At 7 days of differentiation induction. ALP activity was measured according to the method. The results are shown in FIG. 1A. Fold increase means the relative ratio of 1 to the control (20 (S) -ginsenoside Rh2 untreated group).
또한, ALP 활성 측정과 동일한 방법으로 20(S)-진세노사이드 Rh2(0, 10, 20, 40uM)를 처리하고, 분화유도한 세포에 대하여 1-5.의 실험방법에 따라 석화정도를 Alizarin Red염색법과 von Kossa 염색법을 이용해 측정하였다. 그 결과를 도 1 B에 나타내었고 Alizarin red (Sigma-Aldrich. Inc. MO, USA) 염색은 ethylpyridium chloride (Sigma-Aldrich. Inc. MO, USA)로 탈염색하여 550nm에서 흡광도를 측정하는 방법으로 수치화하여 도 1 A에 그래프로 나타내었다.In addition, 20 (S) -ginsenoside Rh2 (0, 10, 20, 40 uM) was treated in the same manner as the ALP activity measurement, and Alizarin was petrified according to the experimental method of 1-5. Red staining and von Kossa staining were used. The results are shown in FIG. 1B and Alizarin red (Sigma-Aldrich. Inc. MO, USA) staining was quantified by destaining with ethylpyridium chloride (Sigma-Aldrich. Inc. MO, USA) and measuring the absorbance at 550 nm. It is shown graphically in Figure 1A.
그 결과 20(S)-진세노사이드 Rh2가 농도 의존적으로 ALP 활성을 증가시킴을 알 수 있다. 또한, 칼슘의 축적여부를 확인하는 Alizarin Red 염색과 Von Kossa 염색을 통해 20(S)-진세노사이드 Rh2가 농도 의존적으로 칼슘 축적을 증가시킴을 알 수 있다.As a result, it can be seen that 20 (S) -ginsenoside Rh2 increases ALP activity in a concentration-dependent manner. In addition, Alizarin Red staining and Von Kossa staining confirmed the accumulation of calcium, indicating that 20 (S) -ginsenoside Rh2 increases calcium accumulation in a concentration-dependent manner.
따라서, 20(S)-진세노사이드 Rh2에 의해 골형성이 촉진됨을 확인할 수 있었으며, 그 결과 골형성 촉진 작용에 의해 골다공증, 골절, 골형성 장애, 부정교합 등에 효과적임을 알 수 있다. 또한, 교정적 치아이동 중 20(S)-진세노사이드 Rh2의 골형성 촉진 작용에 의해 빠르고 효과적인 치열교정이 가능하다. 즉, 교정적 치아이동 중 긴장측에서의 골형성을 촉진함으로써 치조골과 치주조직 전체에서 교정력에 의한 골형성이 가능하도록 한다. 특히, 긴장측에 선택적으로 20(S)-진세노사이드 Rh2를 적용(도포)함으로써 그 효과를 더욱 증가시킬 수 있다.Therefore, it was confirmed that the bone formation is promoted by 20 (S) -ginsenoside Rh2, and as a result, it can be seen that the bone formation promoting effect is effective in osteoporosis, fracture, bone formation disorder, malocclusion and the like. In addition, fast and effective orthodontic treatment is possible by the bone formation promoting action of 20 (S) -ginsenoside Rh2 during orthodontic tooth movement. In other words, by promoting bone formation on the tension side during orthodontic tooth movement, bone formation by orthodontic force is possible in the alveolar bone and the entire periodontal tissue. In particular, the effect can be further increased by selectively applying (coating) 20 (S) -ginsenoside Rh2 to the tension side.
1-8. 20(S)-진세노사이드 Rh2의 골 형성 분화 촉진 유전자 발현 변화 확인1-8. Confirmation of Gene Expression Changes Promoting Bone Formation Differentiation of 20 (S) -ginsenoside Rh2
1-2.와 동일한 방법으로 준비한 세포에 대해 분화유도 개시시 20(S)-진세노사이드 Rh2(40uM)를 처리한 군(+)과 미처리군(-)에 대해, 분화유도 0, 3, 7, 14일째에 1-3.의 실험방법에 따라 골 형성 분화 촉진 유전자{ALP, OCN(osteocalcin), OPN(osteopontin), Osx(osterix), Col-I(collagen type I)}의 mRNA 발현량을 측정하였다. 그 결과를 도 2 A에 나타내었다. 도에서 배수(fold increase)는 분화유도 개시시(분화유도 0일째)의 mRNA 발현량을 1로 한 상대적인 비율을 의미한다. 그 결과 분화초기에 발현하는 것으로 알려진 ALP가 분화유도 3일째 발현이 증가하였고, 분화 중기 이후 발현하는 것으로 알려진 OCN, OPN, Osx, Col-I의 발현은 분화유도 7일 이후로 발현이 증가됨을 확인하였다.Differentiation induction was 0, 3, for the group treated with 20 (S) -ginsenoside Rh2 (40 uM) and the untreated group (-) at the onset of differentiation induction for cells prepared in the same manner as in 1-2. MRNA expression levels of bone formation differentiation promoting genes {ALP, OCN (osteocalcin), OPN (osteopontin), Osx (osterix), Col-I (collagen type I)} Was measured. The results are shown in FIG. 2A. In the figure, a fold increase means a relative ratio where the mRNA expression level at the start of differentiation induction (
또한, 1-2.와 동일한 방법으로 준비한 세포에 대해 분화유도 개시시 20(S)-진세노사이드 Rh2(0, 10, 20, 40uM)를 처리한 후, 분화유도 7일째에 1-3.의 실험방법에 따라 골 형성 분화 촉진 유전자(ALP, OCN, OPN, Osx, Col-I)의 mRNA 발현량을 측정하였다. 그 결과를 도 2 B에 나타내었다. 도에서 배수(fold increase)는 분화유도 개시시(분화유도 0일째)의 mRNA 발현량을 1로 한 상대적인 비율을 의미한다. 그 결과 20(S)-진세노사이드 Rh2는 골 형성 분화 촉진 유전자의 발현을 농도의존적으로 증가시킴을 알 수 있다.In addition, the cells prepared in the same manner as in 1-2. Were treated with 20 (S) -ginsenoside Rh2 (0, 10, 20, 40 uM) at the onset of differentiation induction, and then differentiated induction at 1-3 days. MRNA expression levels of bone formation differentiation promoting genes (ALP, OCN, OPN, Osx, Col-I) were measured according to the experimental method. The results are shown in FIG. 2B. In the figure, a fold increase means a relative ratio where the mRNA expression level at the start of differentiation induction (
상기 실험에서 프라이머 서열로 정방향 서열(5'-GCCGGGAATGATGAGAACTA-3'; 서열번호 13)과 역방향 서열(5'-GGACCGTCCACTGTCACTTT-3'; 서열번호 14)을 사용한 것을 제외하고, 1-3.과 동일한 방법으로 골형성의 초기 중요 유전자인 Runx2에 대한 mRNA발현량도 측정하였다. 도2 A와 B를 보면 Runx2의 발현 변화는 없으나 Runx2의 아래신호물질인 Osx의 발현변화가 증가하는 것으로부터 Runx2가 20(S)-진세노사이드 Rh2에 의해 transactivity가 증가됨을 확인할수 있었다.The same method as in 1-3, except that the forward sequence (5'-GCCGGGAATGATGAGAACTA-3 '; SEQ ID NO: 13) and the reverse sequence (5'-GGACCGTCCACTGTCACTTT-3'; SEQ ID NO: 14) as the primer sequence in the experiment In addition, mRNA expression for Runx2, an early important gene of bone formation, was also measured. 2A and B, there was no change in the expression of Runx2, but it was confirmed that Runx2 increased the transactivity by 20 (S) -ginsenoside Rh2 from the increase in the expression of Osx, which is a lower signal of Runx2.
이와 같은 결과로부터, 20(S)-진세노사이드 Rh2에 의해 골 형성 분화 촉진 유전자 발현이 촉진되어 골형성이 촉진됨을 확인할 수 있었으며, 그 결과 골형성 촉진 작용에 의해 골다공증, 골절, 골형성 장애, 부정교합 등에 효과적임을 알 수 있다. 또한, 교정적 치아이동 중 20(S)-진세노사이드 Rh2의 골형성 촉진 작용에 의해 빠르고 효과적인 치열교정이 가능하다. 즉, 교정적 치아이동 중 긴장측에서의 골형성을 촉진함으로써 치조골과 치주조직 전체에서 교정력에 의한 골형성이 가능하도록 한다. 특히, 긴장측에 선택적으로 20(S)-진세노사이드 Rh2를 적용함으로써 그 효과를 더욱 증가시킬 수 있다.From these results, it was confirmed that the bone formation differentiation promoting gene expression is promoted by 20 (S) -ginsenoside Rh2 to promote bone formation. As a result, osteoporosis, fracture, bone formation disorder, It can be seen that it is effective for malocclusion. In addition, fast and effective orthodontic treatment is possible by the bone formation promoting action of 20 (S) -ginsenoside Rh2 during orthodontic tooth movement. In other words, by promoting bone formation on the tension side during orthodontic tooth movement, bone formation by orthodontic force is possible in the alveolar bone and the entire periodontal tissue. In particular, the effect can be further increased by selectively applying 20 (S) -ginsenoside Rh2 on the tension side.
1-9. 20(S)-진세노사이드 Rh2의 PKD(Protein kinase D) 활성화 효과 확인1-9. Confirmation of PKD (Protein Kinase D) Activation Effect of 20 (S) -ginsenoside Rh2
20(S)-진세노사이드 Rh2가 PKD의 활성화에 미치는 영향을 파악하여 20(S)-진세노사이드 Rh2의 골형성작용기전을 확인하고자 하였다.To investigate the effect of 20 (S) -ginsenoside Rh2 on the activation of PKD, we tried to confirm the bone formation mechanism of 20 (S) -ginsenoside Rh2.
1-2.와 동일한 방법으로 준비한 세포에 대해 분화유도 개시시 20(S)-진세노사이드 Rh2(40uM)를 처리한 후, 분화유도 0, 15, 30, 60분째에 1-6.의 실험방법에 따라 웨스턴 블랏을 실시하여 pPKD와 PKD의 발현량 변화를 확인하였다.The cells prepared in the same manner as in 1-2 were treated with 20 (S) -ginsenoside Rh2 (40 uM) at the onset of differentiation induction, followed by experiments of 1-6. At 0, 15, 30 and 60 minutes of differentiation induction. Western blot was performed according to the method to confirm the expression changes of pPKD and PKD.
그 결과를 도 3 A에 나타내었다. 도에서 pPKD는 인산화된 PKD 단백질양을 의미하고, PKD는 base level의 PKD 단백질양을 의미한다. Actin은 loading control로서 대조군 단백질을 의미한다. 도에서 보는 바와 같이 20(S)-진세노사이드 Rh2는 시간의존적으로 PKD를 활성화 시킴을 알 수 있다.The results are shown in FIG. 3A. In the figure, pPKD means the amount of phosphorylated PKD protein, PKD means the amount of PKD protein of the base level. Actin refers to a control protein as a loading control. As shown in Figure 20 (S)-ginsenoside Rh2 it can be seen that activates PKD in a time-dependent manner.
또한, 1-2.와 동일한 방법으로 준비한 세포에 대해 분화유도 개시시 20(S)-진세노사이드 Rh2(0, 10, 20, 40uM)를 처리한 후, 분화유도 60분째에 1-6.의 실험방법에 따라 웨스턴 블랏을 실시하여 pPKD와 PKD의 발현량 변화를 확인하였다.In addition, the cells prepared in the same manner as in 1-2. Were treated with 20 (S) -ginsenoside Rh2 (0, 10, 20, 40 uM) at the start of differentiation induction, and then 1-6. Western blot was carried out according to the experimental method of to determine the expression changes of pPKD and PKD.
그 결과를 도 3 B에 나타내었다. 도에서 pPKD는 인산화된 PKD 단백질양을 의미하고, PKD는 base level의 PKD 단백질양을 의미한다. Actin은 loading control로서 대조군 단백질을 의미한다. 도에서 보는 바와 같이 20(S)-진세노사이드 Rh2는 농도의존적으로 PKD를 활성화 시킴을 알 수 있다.The results are shown in FIG. 3B. In the figure, pPKD means the amount of phosphorylated PKD protein, PKD means the amount of PKD protein of the base level. Actin refers to a control protein as a loading control. As shown in the figure, 20 (S) -ginsenoside Rh2 can be seen to activate PKD in a concentration-dependent manner.
또한, 1-2.와 동일한 방법으로 준비한 세포에 대해 분화유도 개시시 20(S)-진세노사이드 Rh2(40uM)를 처리한 군(+)과 미처리군(-)에 대하여 각각 PKD 활성억제제인 Go6976(Calbiochem, CA, USA)를 처리(10, 20uM)하거나 미처리(-)한 후, 분화유도 60분째에 1-6.의 실험방법에 따라 웨스턴 블랏을 실시하여 pPKD와 PKD의 발현량 변화를 확인하였다.In addition, PKD activity inhibitors were applied to the cells prepared in the same manner as described in 1-2. For the group treated with 20 (S) -ginsenoside Rh2 (40 uM) and the untreated group (-) at the onset of differentiation induction. After treatment with Go6976 (Calbiochem, CA, USA) (10, 20uM) or untreated (-), Western blot was performed at 60 minutes of differentiation induction according to the experimental method of 1-6. To change the expression level of pPKD and PKD. Confirmed.
그 결과를 도 3 C에 나타내었다. 도에서 pPKD는 인산화된 PKD 단백질양을 의미하고, PKD는 base level의 PKD 단백질양을 의미한다. Actin은 loading control로서 대조군 단백질을 의미한다. 도에서 보는 바와 같이, 20(S)-진세노사이드 Rh2와 Go6976를 모두 처리하지 않은 경우(-, -)이거나 Go6976만을 처리한 경우(20uM) PKD가 인산화되지 않아 활성화 되지 않았고, 20(S)-진세노사이드 Rh2만을 처리한 경우 PKD가 인산화되어 활성화 되었으나, 20(S)-진세노사이드 Rh2와 Go6976를 모두 처리한 경우 Go6976에 농도의존적으로 PKD 활성이 억제됨을 알 수 있다.The results are shown in Figure 3C. In the figure, pPKD means the amount of phosphorylated PKD protein, PKD means the amount of PKD protein of the base level. Actin refers to a control protein as a loading control. As shown in the figure, when both 20 (S) -ginsenoside Rh2 and Go6976 were not treated (-,-) or only Go6976 was treated (20uM), PKD was not phosphorylated and was not activated, and 20 (S) -When only ginsenoside Rh2 was treated, PKD was phosphorylated and activated, but when both 20 (S) -ginsenoside Rh2 and Go6976 were treated, it was found that PKD activity was inhibited in a concentration-dependent manner on Go6976.
또한, 1-2.와 동일한 방법으로 준비한 세포에 대해 분화유도 개시시 20(S)-진세노사이드 Rh2(40uM)를 처리한 군(+)과 미처리군(-)에 대하여 각각 PKD 활성억제제인 Go6976를 처리(10, 20uM)하거나 미처리(-)한 후, 분화유도 7일째에 1-3.의 실험방법에 따라 골 형성 분화 촉진 유전자(ALP, OCN, OPN, Osx, Col-I)의 mRNA 발현량을 측정하였다. 그 결과를 도 3 D에 나타내었다. 도에서 배수(fold increase)는 20(S)-진세노사이드 Rh2와 Go6976 미처리시의 mRNA 발현량을 1로 한 상대적인 비율을 의미한다. 그 결과 20(S)-진세노사이드 Rh2에 의해 증가된 ALP, OCN, OPN, Osx, Col-I의 발현이 Go6976에 농도의존적으로 억제됨을 확인하였다.In addition, PKD activity inhibitors were applied to the cells prepared in the same manner as described in 1-2. After treatment (10, 20uM) or untreated (-) of Go6976, mRNA of osteogenic differentiation promoting genes (ALP, OCN, OPN, Osx, Col-I) according to the experimental method of 1-3. Expression level was measured. The results are shown in FIG. 3D. The fold increase in the figure means a relative ratio of the mRNA expression level of 20 (S) -ginsenoside Rh2 and Go6976 untreated. As a result, it was confirmed that the expression of ALP, OCN, OPN, Osx, and Col-I increased by 20 (S) -ginsenoside Rh2 was suppressed in Go6976 in a concentration-dependent manner.
또한, 1-2.와 동일한 방법으로 준비한 세포에 대해 분화유도 개시시 20(S)-진세노사이드 Rh2(40uM)를 처리한 군(+)과 미처리군(-)에 대하여 각각 PKD 활성억제제인 Go6976를 처리(10, 20uM)하거나 미처리(-)한 후, 분화유도 7일째에 1-4.의 실험방법에 따라 ALP 활성을 측정하였다. 그 결과를 도 3 E에 나타내었다. 배수(fold increase)는 20(S)-진세노사이드 Rh2와 Go6976 미처리시의 mRNA 발현량을 1로 한 상대적인 비율을 의미한다.In addition, PKD activity inhibitors were applied to the cells prepared in the same manner as described in 1-2. After Go6976 was treated (10, 20 uM) or untreated (-), ALP activity was measured according to the experimental method of 1-4. The results are shown in FIG. 3E. Fold increase means the relative ratio of the mRNA expression level of 20 (S) -ginsenoside Rh2 and Go6976 untreated as 1.
또한, 1-2.와 동일한 방법으로 준비한 세포에 대해 분화유도 개시시 20(S)-진세노사이드 Rh2(40uM)를 처리한 군(+)과 미처리군(-)에 대하여 각각 PKD 활성억제제인 Go6976를 처리(10, 20uM)하거나 미처리(-)한 후, 분화유도 14일째에 1-5.의 실험방법에 따라 석화정도를 측정하였다. Alizarin Red 염색을 통해 석화정도를 염색한후 탈염색하여 흡광도를 측정하는 방법으로 수치화하여 도 3 E에 그래프로 나타내었다. 배수(fold increase)는 20(S)-진세노사이드 Rh2와 Go6976 미처리시의 mRNA 발현량을 1로 한 상대적인 비율을 의미한다.In addition, PKD activity inhibitors were applied to the cells prepared in the same manner as described in 1-2. After Go6976 was treated (10, 20 uM) or untreated (-), the degree of petrification was measured according to the experimental method of 1-5. After staining the degree of petrification through Alizarin Red staining and destaining was numerically measured by the method of measuring the absorbance is shown graphically in Figure 3E. Fold increase means the relative ratio of the mRNA expression level of 20 (S) -ginsenoside Rh2 and Go6976 untreated as 1.
도 3 E에서 보는 바와 같이, 20(S)-진세노사이드 Rh2에 의해 증가된 ALP 활성과 석화정도(mineralization)가 Go6976에 농도의존적으로 억제됨을 확인하였다.As shown in FIG. 3E, it was confirmed that increased ALP activity and mineralization by 20 (S) -ginsenoside Rh2 were inhibited concentration-dependently in Go6976.
이와 같은 결과로부터 20(S)-진세노사이드 Rh2에 의해 골형성 시작의 중요 신호물질인 PKD의 활성화가 촉진되어 골형성이 촉진됨을 확인할 수 있었으며, 그 결과 골형성 촉진 작용에 의해 골다공증, 골절, 골형성 장애, 부정교합 등에 효과적임을 알 수 있다. 또한, 교정적 치아이동 중 20(S)-진세노사이드 Rh2의 골형성 촉진 작용에 의해 빠르고 효과적인 치열교정이 가능하다. 즉, 교정적 치아이동 중 긴장측에서의 골형성을 촉진함으로써 치조골과 치주조직 전체에서 교정력에 의한 골형성이 가능하도록 한다. 특히, 긴장측에 선택적으로 20(S)-진세노사이드 Rh2를 적용함으로써 그 효과를 더욱 증가시킬 수 있다.From these results, it was confirmed that 20 (S) -ginsenoside Rh2 promotes activation of PKD, an important signal substance for initiating bone formation, and promotes bone formation. As a result, osteoporosis, fracture, It can be seen that it is effective in bone formation disorder, malocclusion, and the like. In addition, fast and effective orthodontic treatment is possible by the bone formation promoting action of 20 (S) -ginsenoside Rh2 during orthodontic tooth movement. In other words, by promoting bone formation on the tension side during orthodontic tooth movement, bone formation by orthodontic force is possible in the alveolar bone and the entire periodontal tissue. In particular, the effect can be further increased by selectively applying 20 (S) -ginsenoside Rh2 on the tension side.
1-10. 20(S)-진세노사이드 Rh2의 p38 활성 증가 효과 확인1-10. 20 (S) -ginsenoside Rh2 confirmed the effect of increasing p38 activity
PKD의 아래신호인자로 알려진 p38의 활성 증가에 미치는 20(S)-진세노사이드 Rh2의 효과를 확인함으로써, 20(S)-진세노사이드 Rh2에 의한 골형성 촉진 신호기전을 확인하기 위해 하기 방법으로 실험하였다.To determine the effect of 20 (S) -ginsenoside Rh2 on the increased activity of p38, the lower signaling factor of PKD, the following method to identify the signaling mechanism promoting bone formation by 20 (S) -ginsenoside Rh2 Experiment with.
1-2.와 동일한 방법으로 준비한 세포에 대해 분화유도 개시시 20(S)-진세노사이드 Rh2(40uM)를 처리한 후, 분화유도 0, 15, 30, 60분째에 1-6.의 실험방법에 따라 웨스턴 블랏을 실시하여 pp38과 p38의 발현량 변화를 확인하였다.The cells prepared in the same manner as in 1-2 were treated with 20 (S) -ginsenoside Rh2 (40 uM) at the onset of differentiation induction, followed by experiments of 1-6. At 0, 15, 30 and 60 minutes of differentiation induction. Western blot was performed according to the method to confirm the change in the expression level of pp38 and p38.
그 결과를 도 4 A에 나타내었다. 도에서 pp38은 인산화된 p38 단백질양을 의미하고, p38은 base level의 p38 단백질양을 의미한다. Actin은 loading control로서 대조군 단백질을 의미한다. 도에서 보는 바와 같이 20(S)-진세노사이드 Rh2는 시간의존적으로 p38을 활성화 시킴을 알 수 있다.The results are shown in FIG. 4A. In the figure pp38 refers to the amount of phosphorylated p38 protein, p38 refers to the amount of p38 protein of the base level. Actin refers to a control protein as a loading control. As shown in Figure 20 (S)-ginsenoside Rh2 can be seen to activate p38 in a time-dependent manner.
또한, 1-2.와 동일한 방법으로 준비한 세포에 대해 분화유도 개시시 20(S)-진세노사이드 Rh2(0, 10, 20, 40uM)를 처리한 후, 분화유도 60분째에 1-6.의 실험방법에 따라 웨스턴 블랏을 실시하여 pp38과 p38의 발현량 변화를 확인하였다.In addition, the cells prepared in the same manner as in 1-2. Were treated with 20 (S) -ginsenoside Rh2 (0, 10, 20, 40 uM) at the start of differentiation induction, and then 1-6. Western blot was performed according to the experimental method of to confirm the change in the expression level of pp38 and p38.
그 결과를 도 4 B에 나타내었다. 도에서 pp38은 인산화된 p38 단백질양을 의미하고, p38은 base level의 p38 단백질양을 의미한다. Actin은 loading control로서 대조군 단백질을 의미한다. 도에서 보는 바와 같이 20(S)-진세노사이드 Rh2는 농도의존적으로 p38을 활성화 시킴을 알 수 있다.The results are shown in FIG. 4B. In the figure pp38 refers to the amount of phosphorylated p38 protein, p38 refers to the amount of p38 protein of the base level. Actin refers to a control protein as a loading control. As shown in Figure 20 (S)-ginsenoside Rh2 It can be seen that the activation of p38 in a concentration-dependent.
또한, 1-2.와 동일한 방법으로 준비한 세포에 대해 분화유도 개시시 20(S)-진세노사이드 Rh2(40uM)를 처리한 군(+)과 미처리군(-)에 대하여 각각 PKD 활성억제제인 Go6976를 처리(10, 20uM)하거나 미처리(-)한 후, 분화유도 60분째에 1-6.의 실험방법에 따라 웨스턴 블랏을 실시하여 pp38과 p38의 발현량 변화를 확인하였다.In addition, PKD activity inhibitors were applied to the cells prepared in the same manner as described in 1-2. After Go6976 was treated (10, 20uM) or untreated (-), Western blot was performed according to the experimental method of 1-6. At 60 minutes of differentiation induction to confirm the change in the expression level of pp38 and p38.
그 결과를 도 4 C에 나타내었다. 도에서 pp38은 인산화된 p38 단백질양을 의미하고, p38은 base level의 p38 단백질양을 의미한다. Actin은 loading control로서 대조군 단백질을 의미한다. 도 4 C에서 보는 바와 같이, 20(S)-진세노사이드 Rh2와 Go6976를 모두 처리하지 않은 경우(-, -)이거나 Go6976만을 처리한 경우(20uM) p38이 인산화되지 않아 활성화 되지 않았고, 20(S)-진세노사이드 Rh2만을 처리한 경우 p38이 인산화되어 활성화 되었으나, 20(S)-진세노사이드 Rh2와 Go6976를 모두 처리한 경우 Go6976에 농도의존적으로 p38 활성이 억제됨을 알 수 있다.The results are shown in Figure 4C. In the figure pp38 refers to the amount of phosphorylated p38 protein, p38 refers to the amount of p38 protein of the base level. Actin refers to a control protein as a loading control. As shown in FIG. 4C, when both 20 (S) -ginsenoside Rh2 and Go6976 were not treated (-,-) or only Go6976 was treated (20 uM), p38 was not phosphorylated and was not activated. When only S) -ginsenoside Rh2 was treated, p38 was phosphorylated and activated, but when both 20 (S) -ginsenoside Rh2 and Go6976 were treated, the concentration of p38 was inhibited in Go6976.
또한, 1-2.와 동일한 방법으로 준비한 세포에 대해 분화유도 개시시 20(S)-진세노사이드 Rh2(40uM)를 처리한 군(+)과 미처리군(-)에 대하여 각각 p38 억제제인 SB294002(Calbiochem, CA, USA)를 처리(10, 20uM)하거나 미처리(-)한 후, 분화유도 60분째에 1-6.의 실험방법에 따라 웨스턴 블랏을 실시하여 pp38과 p38의 발현량 변화를 확인하였다.In addition, SB294002, which is a p38 inhibitor, was applied to the cells prepared in the same manner as in 1-2, to the group treated with 20 (S) -ginsenoside Rh2 (40 uM) and the untreated group (-) at the onset of differentiation induction. After treatment (Calbiochem, CA, USA) (10, 20uM) or untreated (-), Western blot was performed at 60 minutes of differentiation induction according to the experimental method of 1-6. To confirm the change in the expression level of pp38 and p38. It was.
그 결과를 도 4 D에 나타내었다. 도에서 pp38은 인산화된 p38 단백질양을 의미하고, p38은 base level의 p38 단백질양을 의미한다. Actin은 loading control로서 대조군 단백질을 의미한다. 도에서 보는 바와 같이, 20(S)-진세노사이드 Rh2와 SB294002를 모두 처리하지 않은 경우(-, -)이거나 SB294002만을 처리한 경우(20uM) p38이 인산화되지 않아 활성화 되지 않았고, 20(S)-진세노사이드 Rh2만을 처리한 경우 p38이 인산화되어 활성화 되었으나, 20(S)-진세노사이드 Rh2와 SB294002를 모두 처리한 경우 SB294002에 농도의존적으로 p38 활성이 억제됨을 알 수 있다.The results are shown in FIG. 4D. In the figure pp38 refers to the amount of phosphorylated p38 protein, p38 refers to the amount of p38 protein of the base level. Actin refers to a control protein as a loading control. As shown in the figure, when neither 20 (S) -ginsenoside Rh2 nor SB294002 was treated (-,-) or only SB294002 was treated (20 uM), p38 was not phosphorylated and was not activated, and 20 (S) When only ginsenoside Rh2 was treated, p38 was phosphorylated and activated, but 20 (S) -ginsenoside Rh2 and When all of SB294002 was treated, it can be seen that p38 activity was suppressed in a concentration-dependent manner to SB294002.
또한, 1-2.와 동일한 방법으로 준비한 세포에 대해 분화유도 개시시 20(S)-진세노사이드 Rh2(40uM)를 처리한 군(+)과 미처리군(-)에 대하여 각각 p38 억제제인 SB294002를 처리(10, 20uM)하거나 미처리(-)한 후, 분화유도 7일째에 1-4.의 실험방법에 따라 ALP 활성을 측정하였다. 그 결과를 도 4 E에 나타내었다. 배수(fold increase)는 20(S)-진세노사이드 Rh2와 SB294002 미처리시의 ALP 활성도를 1로 한 상대적인 비율을 의미한다.In addition, SB294002, which is a p38 inhibitor, was applied to the cells prepared in the same manner as described in 1-2. After treatment (10, 20uM) or untreated (-), ALP activity was measured according to the experimental method of 1-4. The results are shown in FIG. 4E. Fold increase refers to the relative ratio of 20 (S) -ginsenoside Rh2 and SB294002 untreated with ALP activity equal to 1.
또한, 1-2.와 동일한 방법으로 준비한 세포에 대해 분화유도 개시시 20(S)-진세노사이드 Rh2(40uM)를 처리한 군(+)과 미처리군(-)에 대하여 각각 p38 억제제인 SB294002를 처리(10, 20uM)하거나 미처리(-)한 후, 분화유도 14일째에 1-5.의 실험방법에 따라 석화정도를 측정하였다. Alizarin Red 염색을 통해 석화정도를 염색한후 탈염색하여 흡광도를 측정하는 방법으로 수치화하여 도 4 E에 그래프로 나타내었다. 배수(fold increase)는 20(S)-진세노사이드 Rh2와 SB294002 미처리시의 석회화 정도를 1로 한 상대적인 비율을 의미한다.In addition, SB294002, which is a p38 inhibitor, was applied to the cells prepared in the same manner as in 1-2, to the group treated with 20 (S) -ginsenoside Rh2 (40 uM) and the untreated group (-) at the onset of differentiation induction. After treatment (10, 20uM) or untreated (-), the degree of petrification was measured according to the experimental method of 1-5. After staining the degree of petrification through the Alizarin Red staining is destained and numerically measured by the method of measuring the absorbance is shown graphically in Figure 4E. Fold increase refers to the relative ratio of calcification of 1 with 20 (S) -ginsenoside Rh2 and SB294002 untreated.
도 4 E에서 보는 바와 같이, 20(S)-진세노사이드 Rh2에 의해 증가된 ALP 활성과 석화정도(mineralization)가 SB294002에 농도의존적으로 억제됨을 확인하였다.As shown in FIG. 4E, it was confirmed that the ALP activity and mineralization increased by 20 (S) -ginsenoside Rh2 was suppressed concentration dependently in SB294002.
이와 같은 결과로부터 20(S)-진세노사이드 Rh2에 의해 골형성촉진 기전에 관여하는 신호물질인 p38의 활성화가 촉진되어 골형성이 촉진됨을 확인할 수 있었으며, 그 결과 골형성 촉진 작용에 의해 골다공증, 골절, 골형성 장애, 부정교합 등에 효과적임을 알 수 있다. 또한, 교정적 치아이동 중 20(S)-진세노사이드 Rh2의 골형성 촉진 작용에 의해 빠르고 효과적인 치열교정이 가능하다. 즉, 교정적 치아이동 중 긴장측에서의 골형성을 촉진함으로써 치조골과 치주조직 전체에서 교정력에 의한 골형성이 가능하도록 한다. 특히, 긴장측에 선택적으로 20(S)-진세노사이드 Rh2를 적용함으로써 그 효과를 더욱 증가시킬 수 있다.
From these results, it was confirmed that 20 (S) -ginsenoside Rh2 promotes the activation of p38, a signaling substance involved in the mechanism of promoting bone formation, thereby promoting bone formation. As a result, osteoporosis, It can be seen that it is effective in fractures, bone formation disorders, malocclusion, and the like. In addition, fast and effective orthodontic treatment is possible by the bone formation promoting action of 20 (S) -ginsenoside Rh2 during orthodontic tooth movement. In other words, by promoting bone formation on the tension side during orthodontic tooth movement, bone formation by orthodontic force is possible in the alveolar bone and the entire periodontal tissue. In particular, the effect can be further increased by selectively applying 20 (S) -ginsenoside Rh2 on the tension side.
1-11. 20(S)-진세노사이드 Rh2의 AMPK, ACC(Acetyl-CoA carboxylase) 활성 증가 효과 확인1-11. Effect of 20 (S) -ginsenoside Rh2 on AMPK and ACC (Acetyl-CoA carboxylase)
세포분화 촉진 신호물질로 알려진 AMPK의 활성 증가에 미치는 20(S)-진세노사이드 Rh2의 효과를 확인함으로써, 골모세포의 골세포로 분화 촉진에 의한 골형성 촉진효과를 확인하기 위해 하기 방법으로 실험하였다. AMPK의 활성증가는 AMPK의 인산화여부 확인 및 아래신호물질인 ACC의 인산화정도를 통해 확인하였다.By confirming the effect of 20 (S) -ginsenoside Rh2 on the increase in the activity of AMPK, known as a cell differentiation promoting signal, experiments were carried out by the following method to confirm the effect of promoting the formation of osteoblasts by differentiation into osteoblasts of osteoblasts. It was. The increase of AMPK activity was confirmed by confirming the phosphorylation of AMPK and the degree of phosphorylation of ACC, a signaling material below.
1-2.와 동일한 방법으로 준비한 세포에 대해 분화유도 개시시 20(S)-진세노사이드 Rh2(40uM)를 처리한 후, 분화유도 0, 15, 30, 60분째에 1-6.의 실험방법에 따라 웨스턴 블랏을 실시하여 pAMPK, AMPK, pACC, 및 ACC의 발현량 변화를 확인하였다.The cells prepared in the same manner as in 1-2 were treated with 20 (S) -ginsenoside Rh2 (40 uM) at the onset of differentiation induction, followed by experiments of 1-6. At 0, 15, 30 and 60 minutes of differentiation induction. Western blot was performed according to the method to confirm the change in the expression level of pAMPK, AMPK, pACC, and ACC.
그 결과를 도 5 A에 나타내었다. 도에서 pAMPK는 인산화된 AMPK 단백질양을 의미하고, AMPK는 base level의 AMPK 단백질양을 의미하고, pACC는 인산화된 ACC 단백질양을 의미하고, ACC는 base level의 ACC 단백질양을 의미한다. Actin은 loading control로서 대조군 단백질을 의미한다. 도에서 보는 바와 같이 20(S)-진세노사이드 Rh2는 시간의존적으로 AMPK와 ACC를 활성화 시킴을 알 수 있다.The results are shown in FIG. 5A. In the figure, pAMPK means the amount of phosphorylated AMPK protein, AMPK means the amount of AMPK protein at base level, pACC means the amount of phosphorylated ACC protein, and ACC means the amount of ACC protein at base level. Actin refers to a control protein as a loading control. As shown in Figure 20 (S)-ginsenoside Rh2 it can be seen that the time-dependent activation of AMPK and ACC.
또한, 1-2.와 동일한 방법으로 준비한 세포에 대해 분화유도 개시시 20(S)-진세노사이드 Rh2(0, 10, 20, 40uM)를 처리한 후, 분화유도 60분째에 1-6.의 실험방법에 따라 웨스턴 블랏을 실시하여 pAMPK, AMPK, pACC, 및 ACC의 발현량 변화를 확인하였다.In addition, the cells prepared in the same manner as in 1-2. Were treated with 20 (S) -ginsenoside Rh2 (0, 10, 20, 40 uM) at the start of differentiation induction, and then 1-6. Western blot was performed according to the experimental method of to determine the expression changes of pAMPK, AMPK, pACC, and ACC.
그 결과를 도 5 B에 나타내었다. 도에서 pAMPK는 인산화된 AMPK 단백질양을 의미하고, AMPK는 base level의 AMPK 단백질양을 의미하고, pACC는 인산화된 ACC 단백질양을 의미하고, ACC는 base level의 ACC 단백질양을 의미한다. Actin은 loading control로서 대조군 단백질을 의미한다. 도에서 보는 바와 같이 20(S)-진세노사이드 Rh2는 농도의존적으로 AMPK와 ACC를 활성화 시킴을 알 수 있다.The results are shown in FIG. 5B. In the figure, pAMPK means the amount of phosphorylated AMPK protein, AMPK means the amount of AMPK protein at base level, pACC means the amount of phosphorylated ACC protein, and ACC means the amount of ACC protein at base level. Actin refers to a control protein as a loading control. As shown in Figure 20 (S)-ginsenoside Rh2 it can be seen that the activation of AMPK and ACC in a concentration-dependent manner.
또한, 1-2.와 동일한 방법으로 준비한 세포에 대해 분화유도 개시시 20(S)-진세노사이드 Rh2(40uM)를 처리한 군(+)과 미처리군(-)에 대하여 각각 AMPK 억제제인 Ara.(Ara-A; adenine 9-β-D-arabinofuranoside; Sigma-Alcrich Inc. MO. USA)를 처리(0.05, 0.1mM)하거나 미처리(-)한 후, 분화유도 60분째에 1-6.의 실험방법에 따라 웨스턴 블랏을 실시하여 pAMPK, AMPK, pACC, 및 ACC의 발현량 변화를 확인하였다.In addition, Ara, an AMPK inhibitor, was applied to the cells prepared in the same manner as in 1-2. (Ara-A; adenine 9-β-D-arabinofuranoside; Sigma-Alcrich Inc. Mo. USA) after treatment (0.05, 0.1 mM) or untreated (-), eruption induction at 60 minutes of 1-6. Western blot was performed in accordance with the experimental method to confirm the expression changes of pAMPK, AMPK, pACC, and ACC.
그 결과를 도 5 C에 나타내었다. 도에서 pAMPK는 인산화된 AMPK 단백질양을 의미하고, AMPK는 base level의 AMPK 단백질양을 의미하고, pACC는 인산화된 ACC 단백질양을 의미하고, ACC는 base level의 ACC 단백질양을 의미한다. Actin은 loading control로서 대조군 단백질을 의미한다. 도에서 보는 바와 같이, 20(S)-진세노사이드 Rh2와 Ara.를 모두 처리하지 않은 경우(-, -)이거나, Ara.만을 처리한 경우 AMPK 및 ACC가 인산화되지 않아 활성화 되지 않았고, 20(S)-진세노사이드 Rh2만을 처리한 경우 AMPK 및 ACC가 인산화되어 활성화 되었으나, 20(S)-진세노사이드 Rh2와 Ara.를 모두 처리한 경우 Ara.에 농도의존적으로 AMPK 및 ACC 활성이 억제됨을 알 수 있다.The results are shown in Figure 5C. In the figure, pAMPK means the amount of phosphorylated AMPK protein, AMPK means the amount of AMPK protein at base level, pACC means the amount of phosphorylated ACC protein, and ACC means the amount of ACC protein at base level. Actin refers to a control protein as a loading control. As shown in the figure, when 20 (S) -ginsenosides Rh2 and Ara. Were not treated with (-,-) or only Ara. Was treated, AMPK and ACC were not phosphorylated and were not activated. When only S) -ginsenoside Rh2 was treated, AMPK and ACC were phosphorylated and activated, but when both 20 (S) -ginsenoside Rh2 and Ara. Were treated, the concentration-dependent AMPK and ACC activity was inhibited in Ara. Able to know.
또한, 1-2.와 동일한 방법으로 준비한 세포에 대해 분화유도 개시시 20(S)-진세노사이드 Rh2(40uM)를 처리한 군(+)과 미처리군(-)에 대하여 각각 AMPK 억제제인 Ara를 처리(0.05, 0.1 mM)하거나 미처리(-)한 후, 분화유도 7일째에 1-4.의 실험방법에 따라 ALP 활성을 측정하였다. 그 결과를 도 5(D)에 나타내었다. 배수(fold increase)는 20(S)-진세노사이드 Rh2와 Ara 미처리시의 ALP 활성도를 1로 한 상대적인 비율을 의미한다.In addition, Ara, an AMPK inhibitor, was applied to the cells prepared in the same manner as in 1-2. After treatment (0.05, 0.1 mM) or untreated (-), ALP activity was measured according to the experimental method of 1-4. The results are shown in FIG. 5 (D). Fold increase refers to the relative ratio of 20 (S) -ginsenoside Rh2 and Ara to 1 when Ara was not treated.
또한, 1-2.와 동일한 방법으로 준비한 세포에 대해 분화유도 개시시 20(S)-진세노사이드 Rh2(40uM)를 처리한 군(+)과 미처리군(-)에 대하여 각각 AMPK 억제제인 Ara를 처리(0.05, 0.1 mM)하거나 미처리(-)한 후, 분화유도 14분째에 1-5.의 실험방법에 따라 석화정도를 측정하였다. Alizarin Red 염색을 통해 석화정도를 염색한후 탈염색하여 흡광도를 측정하는 방법으로 수치화하여 도 5(D)에 그래프로 나타내었다. 배수(fold increase)는 20(S)-진세노사이드 Rh2와 Ara 미처리시의 석회화 정도를 1로 한 상대적인 비율을 의미한다.In addition, Ara, an AMPK inhibitor, was applied to the cells prepared in the same manner as in 1-2, to the group treated with 20 (S) -ginsenoside Rh2 (40 uM) and the untreated group (-) at the onset of differentiation induction. After treatment (0.05, 0.1 mM) or untreated (-), the degree of calcification was measured according to the experimental method of 1-5. After staining the degree of petrification through Alizarin Red staining is destained and numerically measured by the method of measuring the absorbance is shown in Figure 5 (D) as a graph. Fold increase means the relative proportion of 20 (S) -ginsenosides Rh2 with calcification of Ara as 1.
도 5 D에서 보는 바와 같이, 20(S)-진세노사이드 Rh2에 의해 증가된 ALP 활성과 석화정도(mineralization)가 Ara에 농도의존적으로 억제됨을 확인하였다.As shown in FIG. 5D, it was confirmed that the ALP activity and mineralization increased by 20 (S) -ginsenoside Rh2 was inhibited concentration-dependently in Ara.
또한, 1-2.와 동일한 방법으로 준비한 세포에 대해 분화유도 개시시 20(S)-진세노사이드 Rh2(40uM)를 처리한 군(+)과 미처리군(-)에 대하여 각각 PKD 활성억제제인 Go6976을 처리(10, 20uM)하거나 미처리(-)한 후, 분화유도 60분째에 1-6.의 실험방법에 따라 웨스턴 블랏을 실시하여 pAMPK, AMPK, pACC, 및 ACC의 발현량 변화를 확인하였다.In addition, PKD activity inhibitors were applied to the cells prepared in the same manner as described in 1-2, to the group treated with 20 (S) -ginsenoside Rh2 (40 uM) and the untreated group (-) at the start of differentiation induction. After Go6976 treatment (10, 20uM) or untreated (-), Western blot was performed at 60 minutes of differentiation induction according to the experimental method of 1-6. To confirm the expression changes of pAMPK, AMPK, pACC, and ACC. .
그 결과를 도 5 E에 나타내었다. 도에서 pAMPK는 인산화된 AMPK 단백질양을 의미하고, AMPK는 base level의 AMPK 단백질양을 의미하고, pACC는 인산화된 ACC 단백질양을 의미하고, ACC는 base level의 ACC 단백질양을 의미한다. Actin은 loading control로서 대조군 단백질을 의미한다.도에서 보는 바와 같이, 20(S)-진세노사이드 Rh2와 Go6976를 모두 처리한 경우 Go6976에 농도의존적으로 AMPK와 ACC 활성이 억제됨을 알 수 있다.The results are shown in FIG. 5E. In the figure, pAMPK means the amount of phosphorylated AMPK protein, AMPK means the amount of AMPK protein at base level, pACC means the amount of phosphorylated ACC protein, and ACC means the amount of ACC protein at base level. Actin refers to a control protein as a loading control. As shown in the figure, when both 20 (S) -ginsenoside Rh2 and Go6976 were treated, it can be seen that AMPK and ACC activities are inhibited in a concentration-dependent manner to Go6976.
이와 같은 결과로부터 20(S)-진세노사이드 Rh2에 의해 세포분화 촉진 신호물질로 알려진 AMPK의 활성화가 촉진되어 골형성이 촉진됨을 확인할 수 있었으며, 그 결과 골형성 촉진 작용에 의해 골다공증, 골절, 골형성 장애, 부정교합 등에 효과적임을 알 수 있다. 또한, 교정적 치아이동 중 20(S)-진세노사이드 Rh2의 골형성 촉진 작용에 의해 빠르고 효과적인 치열교정이 가능하다. 즉, 교정적 치아이동 중 긴장측에서의 골형성을 촉진함으로써 치조골과 치주조직 전체에서 교정력에 의한 골형성이 가능하도록 한다. 특히, 긴장측에 선택적으로 20(S)-진세노사이드 Rh2를 적용함으로써 그 효과를 더욱 증가시킬 수 있다.From these results, it was confirmed that 20 (S) -ginsenoside Rh2 promotes the activation of AMPK, which is known as a cell differentiation promoting signal, and promotes bone formation. As a result, osteoporosis, fracture, bone It can be seen that it is effective in formation disorders, malocclusion, and the like. In addition, fast and effective orthodontic treatment is possible by the bone formation promoting action of 20 (S) -ginsenoside Rh2 during orthodontic tooth movement. In other words, by promoting bone formation on the tension side during orthodontic tooth movement, bone formation by orthodontic force is possible in the alveolar bone and the entire periodontal tissue. In particular, the effect can be further increased by selectively applying 20 (S) -ginsenoside Rh2 on the tension side.
<제조예 1> 약학 조성물의 제조Preparation Example 1 Preparation of Pharmaceutical Composition
실시예 1-1의 20(S)-진세노사이드 Rh2 20mg, 옥수수 전분 100mg, 유당 100mg, 스테아린산 마그네슘 2mg을 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.20 (S) -ginsenoside Rh2 of Example 1-1, 100 mg of corn starch, 100 mg of lactose, 2 mg of magnesium stearate were filled into gelatin capsules to prepare a capsule.
<제조예 2> 식품 조성물의 제조Preparation Example 2 Preparation of Food Composition
실시예 1-1의 20(S)-진세노사이드 Rh2(4중량 %), 액상과당(0.5중량%), 올리고당(2중량%), 설탕(2중량%), 및 식염(0.5중량%)에 물을 추가하여 잔량을 맞춘 후 균질하게 배합하여 순간 살균을 하여 건강음료를 제조하였다.20 (S) -ginsenoside Rh2 (4 wt%), liquid fructose (0.5 wt%), oligosaccharide (2 wt%), sugar (2 wt%), and salt (0.5 wt%) of Example 1-1 After adding water to the remaining amount to adjust the homogeneous homogeneous sterilization to prepare a healthy drink.
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Claims (10)
A food composition for improving traumatic fracture, comprising 20 (S) -ginsenoside Rh2 as an active ingredient.
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Non-Patent Citations (1)
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Liu J 외 6인. Bioorg Med Chem Lett. 2009년 6월 15일, Volume 19, Issue 12, 제3320면 내지 제3323면* |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10286025B2 (en) | 2015-01-15 | 2019-05-14 | University-Industry Cooperation Group Of Kyung Hee University | Composition comprising combined extracts of Schisandra fructus, Eucommiae cortex and Lycii fructus for preventing or treating metabolic bone diseases |
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