KR101192063B1 - 염증성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 2-클로로-N⁶-(3-아이오도벤질)-4′-싸이오아데노신-5′-N-메칠유로나마이드 (thio-Cl-IB-MECA) 또는 약제학적으로 허용가능한 이것의 염을 활성 성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 종래의 A₃ 아데노신 수용체 효능제에 비하여 독성이 현저히 낮아서 염증성 질환의 예방 및 치료에 유용하다.

Description

염증성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물{Pharmaceutical Composition for Treating Inflammatory Disease}

본 발명은 염증성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물, 보다 구체적으로, 2-클로로-N⁶-(3-아이오도벤질)-4'-싸이오아데노신-5'-N-메칠유로나마이드 (이하 'thio-Cl-IB-MECA'라 약칭함) 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염을 활성 성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

염증 (inflammation)은 외상이나 화상과 같은 물리화학적인 요인 또는 세균이나 바이러스와 같은 생물학적인 요인에 의해 생체 조직이 손상을 입었을 때에 체내에서 일어나는 방어적 반응으로, 충혈, 부종, 발열, 통증 등의 증상이 특징적이다. 생화학적으로는, 염증은 염증유발 인자가 생체에 작용할 때 염증소에서의 항체나 히스타민, 세로토닌 등의 화학물질을 함유한 혈장 성분이나 조직액의 국소적 삼출, 백혈구의 침윤, 회복을 위한 섬유 증생 등의 생체 측에서 생기는 반응 현상을 말한다. 염증유발 인자의 종류, 양이나 생체 측의 면역 상태에 따라서 염증 반응이 생기는 양상은 다르다.

염증 반응을 조절하는 인자들은 종류에 따라서 크게 혈관의 투과성을 증대시키는 물질과 백혈구 유주를 촉진하는 화학 전달 물질 등으로 나눌 수 있다 (Rubin. Lippincott Williams and wilkins, 24-46, 2001). 또한 염증은 체내 다양한 기관에서 발생할 수 있으며 만성 염증 질환의 경우 암화 (carcinogenesis)와 밀접한 관련이 있기 때문에 암으로 발전할 가능성이 있다고 알려져 있다 (Shacter et al., Oncology, 16, 217-26, 229, 2002; Coussens et al ., Nature, 420, 860-7, 2002).

아데노신 (adenosine)은 세포 내에서 ATP 분해에 의해 생성되는 것으로 세포내의 아데노신이 축적이 되면 세포 외로 방출되는데 염증성 질환, 허혈성 심질환 및 조직 손상과 같은 병태 생리학적 과정이 있을 경우 세포 내에서 ATP의 대사는 더 활발해 지고 그 결과 아데노신의 방출이 증가한다고 알려져 있다 (Linden et al ., Annu Rev Pharmacol Toxicol, 41, 775-787, 2001; Stiles, Clin Res, 38, 10-18, 1990). 아데노신 수용체는 G-단백질-결합 수용체로 A₁, A_2A, A_2B 그리고 A₃의 총 4가지 서브타입이 존재하는데 A_2A, A_2B는 환형 아데노신 모노인산(cyclic adenosine monophosphate: cAMP)을 증가시키는 반면, A₁와 A₃는 cAMP를 감소시키기 때문에 어떤 수용체가 발현하느냐에 따라 세포 내 신호전달이 영향을 받게 된다 (Fredholm BB et al., Pharmacol Rev, 53, 527-552, 2001; Jacobson KA et al., Trends pharmacol Sci, 19, 184-191, 1998).

아데노신 수용체들은 대식 세포에서도 발현되며 아데노신과 그에 선택적인 수용체들의 상호 관계에 영향을 주는 물질은 이러한 대식 세포의 기능인 식세포 (phagocytosis) 작용이나 NO생성에 영향을 줄 수 있으며 TNF-α, IL-1ß, IL-6 과 같은 염증성 사이토킨의 발현도 저하시킨다 (Hasko Get et al ., J Immunol, 157, 4634-40, 1996; Sajjadi FGet et al ., J Immunol, 156, 3435-42, 1996). 또한 대표적인 염증성 질환인 류마티스 관절염을 유도한 동물 모델에서도 A₃AR 효능제 (agonist)가 NF-κB 신호 전달 과정을 매개하는 항염증 활성을 가지는 것으로 밝혀졌다 (Fishman Pet et al ., Arthritis Res Ther, 8, R33. 2006; Baharav E et al ., J Rheumatol, 32:469-76, 2005). 아데노신 수용체는 다양한 세포에서 많이 발현하고 있는 수용체이고 여러 아데노신 유도체 중 A₃ 아데노신 수용체 (A₃AR)에 선택적인 A₃AR 효능제가 다른 서브타입 수용체 관련 효능제 보다 A₃ 아데노신 수용체를 활성화시키는 내인적 활성이 좀 더 우수하므로 (Gao ZG et al ., Biochem Pharmacol, 65, 1675-84, 2003) 약물로서의 개발 가능성이 높다고 여겨진다.

그러나 종래 알려진 Cl-IB-MECA 등의 A₃AR 효능제는 염증성 질환 치료에 고농도로 사용되어야 해서 세포독성 등의 부작용이 발생하는 등 사용에 제한이 따랐다.

상술된 종래의 기술의 문제점을 해결하고자 본 발명자들이 꾸준히 연구한 결과, 저농도에서도 우수한 항염증 효능을 가지고 독성 등의 부작용이 없는 A₃AR 효능제를 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은 저농도에서도 우수한 항염증 효능을 가지고 독성 등의 부작용이 없는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공하기 위한 것이다.

상술된 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

2-클로로-N⁶-(3-아이오도벤질)-4'-싸이오아데노신-5'-N-메칠유로나마이드(thio-Cl-IB-MECA) 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염을 활성 성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에서 활성 성분인 thio-Cl-IB-MECA는 하기 화학식 (I)로 표시된다:

[화학식 I]

상기 화합물, thio-Cl-IB-MECA는 다음과 같은 반응식 1 ~ 3에 따라 합성함에 의해 제조될 수 있으나 이에 한정되지는 않으며, 당업계의 기술자에 의해 변형된 합성법에 의해 합성될 수도 있다. 반응식 1 ~ 3에 따른 합성법은 미국특허 제7199172호에 상세히 기재되어 있으며, 이 특허의 기재사항은 모두 본 발명에 참조로서 편입된다.

[반응식 1]

[반응식 2]

[반응식 3]

본 발명에서 약제학적으로 허용가능한 염의 예에는 하기와 같은 생리적으로 허용가능한 음이온을 형성하는 산과의 형성된 thio-Cl-IB-MECA의 유기 부가염이 있다: 토실레이트, 메탄술포네이트, 말레이트, 아세테이트, 시트레이트, 말로네이트, 타르타레이트, 숙시네이트, 벤조에이트, 아스코르베이트, α-케토글루타레이트 및 α-글리세로포스페이트. 또한 히드로클로라이드, 술페이트, 니트레이트, 비카르보네이트 및 카르보네이트 염을 포함하는 무기염이 또한 사용될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염은 당 분야에 잘 알려진 표준 절차, 예를 들면 아민과 같은 염기성 화합물을 생리적으로 허용가능한 음이온을 공급하는 적합한 산과 충분히 반응시켜 수득될 수 있다. 카르복실산의 알칼리 금속 (예컨대, 나트륨, 칼륨 또는 리튬) 또는 알칼리토금속(예컨대 칼슘) 염이 또한 만들어질 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물로 치료될 수 있는 염증성 질환은 발병 원인에 무관하며 염증 반응을 매개로 한 질환을 포함하는 개념이다. 구체적으로는 패혈증, 패혈성 쇼크; 류마티스 관절염, 골관절염, 강직척추염; 혈관염, 흉막염, 심장막염, 허혈 관련 염증(associated inflammation), 염증성 동맥류; 신장염; 간염; 만성 폐염증 질환; 기관지 염증, 비염; 피부염; 위염; 대장염, 과민성대장증후군; 감염에 의한 열 및 근육통 등이 있다.

패혈증(sepsis)은 세균 감염에 의해 발생한 전신 염증 반응 증후군 (systemic inflammatory response syndrome; SIRS)으로 감염에 의한 독소의 국소적 혹은 전신적 확산으로 발생할 수 있으며, 화농균, 연쇄상구균, 폐렴균과 같은 미생물에 의해 유발될 수 있다. 리포폴리사카라이드 (Lipopolysaccharides; LPS)는 패혈증을 유발할 수 있는 주요 인자 중 하나로 염증 반응을 매개하는 물질들을 분비하는 등 염증 반응을 촉발시키는 작용을 한다. 체내에 세균이 침입될 경우 LPS를 매개하는 신호 전달의 증폭 및 염증 반응의 진행에 따라서 혈관 내피 세포의 활성화, 내피 세포에서 분비되는 일산화질소(NO)에 의한 저혈압 및 패혈성 쇼크 등의 반응이 일어나게 된다.

염증성 질환에서 염증 반응에는 여러 인자가 관여하고 있다. 염증 반응에 관련된 효소 및 사이토킨의 유전자 발현은 주로 NF-κB가 조절한다. NF-κB는 Rel 패밀리의 구성요소인 RelA (p65), RelB, c－Rel, NF-κB 1（p50), NF-κB2（p52)가 각기 결합하여 동형 이합체 (homodimer) 혹은 이형 이합체 (heterodimer) 형태를 이루고 있는 전사인자이다. NF-κB라고 알려진 대부분은　RelA／NF-κB 1 (p65/p50)의　결합으로　이뤄진　이형 이합체의 형태로　세포질에서 존재하고 있다.

NF-κB는 세포질에서 κB (IκBs) 저해제와 결합하여 불활성화 상태로 존재하는데, LPS나 염증성 물질에 의한 자극이 가해지면 NF-κB가 활성화된다. 그 과정은 IκB를 조절하는 세 가지 물질인 IκB 키나제 (IKK), 유비퀴틴 리가제 및 26s 프로테오솜에 의해 일어난다. IκB가 IKK에 의해 인산화가 된 후, 유니퀴틴 리가제에 의해 NF-κB가 유비퀴틴화 되고 마지막으로 26s 프로테오솜과 IκB와　분리되어NF-κB가 따로 떨어져 나오게 된다. 유리 NF-κB가 핵 안으로 이동하여 κB-결합부위에 결합하게 되면 유전자 전사가 일어나서 염증에 관련하는 효소인 iNOS와 COX-2, 염증성 사이토킨인 TNF-α, IL-1β 등의 유전자의 발현을 조절하게 된다. 따라서 NF-κB, 염증 관련 효소 iNOS, COX-2 및 염증성 사이토킨 TNF-α, IL-1β의 발현/억제 시험으로 염증성 질환 치료 물질의 효과를 분석할 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제, 예를 들면 당업계에서 통상적으로 사용되는 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제, 및 방부제로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있으며, 액제, 정제, 과립제, 캅셀제, 산제 등으로 제제화될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 정맥내 투여, 복강내 투여 또는 경구투여의 경로로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 치료효과를 증강시키기 위하여, 본 발명에 따른 활성 성분 이외에, 다른 공지의 항-염증 약제와 함께 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여량 및 투여 횟수는 환자의 연령, 상태, 체중, 질환의 중증도, 약물 형태, 투여 경로, 및 기간에 따라 당업자에 의하여 적절하게 조절될 수 있다. 바람직하기는, 약제학적 조성물의 활성 성분은 환자의 체중 당 1 내지 50 mg/kg(대상체)으로 1회 내지 수회/1일 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 종래 A₃ 아데노신 수용체 효능제에 비해 저농도 (약 1/4)에서도 독성 등의 부작용이 없이 우수한 항염증 효능을 발휘한다.

도 1a 및 1b는 본 발명 조성물의 유효성분인 thio-Cl-IB-MECA의 NO 생성 억제 효능(도 1a) 및 세포 독성 효과 (도 1b)를 나타낸 그래프이다.
도 2a 및 2b는 본 발명 조성물의 유효성분인 thio-Cl-IB-MECA의 iNOS 단백질 발현 저해 효과 (도 2a) 및 iNOS 유전자 발현 저해 효과 (도 2b)를 나타낸 사진이다.
도 3a 및 3b는 본 발명 조성물의 유효성분인 thio-Cl-IB-MECA의 TNF-α 분비 저해 효과 (도 3a) 및 TNF-α 유전자 발현 저해 효과 (도 3b)를 나타낸 그래프 및 사진이다.
도 4a 및 4b는 본 발명 조성물의 유효성분인 thio-Cl-IB-MECA의 IL-1β 유전자 발현 저해 효과 (도 4a) 및 IL-1β 단백질 발현 저해 효과 (도 4b)를 나타낸 사진이다.
도 5는 본 발명 조성물의 유효성분인 thio-Cl-IB-MECA의 IκBα 단백질 분해에 대한 발현 저해 효과를 나타낸 사진이다.
도 6은 본 발명 조성물의 유효성분인 thio-Cl-IB-MECA의 NF-κB의 DNA 결합 그리고 NF-κB의 서브유니트인 p65의 단백질 결합을 저해 효능을 EMSA로 확인하여 본 결과 사진이다.
도 7a 및 7b는 본 발명 조성물의 유효성분인 thio-Cl-IB-MECA의 NF-κB 신호전달체계의 활성화 억제 작용을 Raw 264.7 세포에서 본 웨스턴 블롯팅 결과 사진이다.
도 8a 및 8b는 본 발명 조성물의 유효성분인 thio-Cl-IB-MECA의 LPS로 패혈증을 유발한 동물 모델에서 생존율 (도 8) 및 몸무게 변화 (도 8b)를 보여주는 그래프이다.
도 9는 본 발명 조성물의 유효성분인 thio-Cl-IB-MECA의 폐조직에서의 염증성 단백질의 발현의 저해 효과를 보여주는 결과 사진이다.

다음의 실시예들에 의해 본 발명이 더 상세히 설명된다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되어서는 안된다.

실시예

본 발명에 따른 약제학적 조성물에 대하여 마우스 유래 대식세포인 RAW 264.7 세포 및 염증성 동물 모델 등에서 항염증 활성 시험을 행하였다.

실시예 1: NO 생성 저해 활성 검색 ( iNOS assay )

염증 반응 및 외상이 있을 때 발현이 증가하는 효소 iNOS (inducible nitric oxide synthase)에 대한 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 저해 활성을 시험하였다.

구체적으로는 RAW 264.7 (5 x 10⁵cells/ml) 세포를 10% FBS 가 포함된 DMEM 배지로 24-웰 플레이트의 각 웰에 1ml씩 넣고 24시간 배양하였다. 24시간 후 부착된 세포를 PBS (phosphate-buffered saline)으로 세척 후 10% FBS-DMEM (페놀 레드 없는) 배지와 본 발명의 조성물 (thio-Cl-IB-MECA를 각각 5, 10, 20 μM로 한)로 처리하고 30분 후 1 μg/ml LPS를 넣어 주고 37℃, 5% CO₂에서 20시간 배양하였다 (실험군). 블랭크로서 LPS 및 본 발명에 따른 조성물 첨가없이 배양된 RAW 세포와 대조군으로서 LPS만 첨가되어 배양된 RAW 세포를 사용하였다.

각 웰의 상징액을 100 μl씩 취하여 술파닐아미드 (Sulfanilamide) 용액 및 N-(1-나프틸)-에틸렌디아민 (N-(1-naphtyl)-ethylenediamine) 용액과 각각 90μl씩과 반응시킨 후 540nm에서 흡광도를 측정하여 배양액에 생성된 질산염(nitrate) 또는 아질산염(nitrite)의 양을 확인하여 그 결과를 도 1에 나타내었다.

NaNO₂ 용액을 이용하여 표준 검량선을 작성하고 측정한 흡광도를 바탕으로 하기 수학식 1에 의해 대조군에 대한 실험군의 각 실험 물질 처리에 따른 NaNO₂ 농도로 환산하여 LPS만 처리한 군과 비교하는 방법으로 시료의 NO 생성 저해 활성을 평가하였다. 하기식을 이용하여 질산염 농도로 저해율(%)을 구한 후 IC₅₀ 값을 산출하였다.

<수학식 1>

도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 조성물 (thio-Cl-IB-MECA)을 5, 10, 20 μM의 농도를 처리한 결과 NO 생성은 농도 의존적으로 억제되었고 (도 1a 참조). IC₅₀ 은 16.23 μM이었다. 본 발명의 조성물의 IC₅₀ 값은, 종래의 A₃AR 효능제인 IB-MECA의 IC₅₀ 값 (65.7 μM: 측정값)에 비해 약 1/4인 바, 본 발명의 조성물은 저농도에서도 NO 생성 저해율이 뛰어남을 알 수 있었다.

iNOS 생성 저해 효과가 시료 자체 (본 발명의 조성물, thio-Cl-IB-MECA)의 독성에 의한 것인지를 확인하기 위해서 MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) 분석을 수행한 결과, 본 발명의 조성물의 최고 농도인 20 μM에서도 RAW 264.7 세포가 80%이상 살아있었던바 (도 1b), 본 발명의 효과가 독성에 의한 것이 아님을 확인할 수 있었다.

실시예 2: iNOS 단백질 및 유전자 발현 저해 효능 평가

본 발명의 조성물의 iNOS 단백질 및 mRNA의 발현을 웨스턴 블럿 (Western blot analysis)와 RT-PCR를 통해 확인하였다. 구체적으로는 RAW 264.7 세포를 10% FBS가 포함된 배지로 100mm 배양 접시 당 1 ⅹ 10⁶가 되도록 희석하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간을 배양한 후 PBS로 2회 세척하였다. 10% FBS가 포함된 배지에 세포 독성을 나타내지 않는 최고 농도인 thio-Cl-IB-MECA 20, 10, 및 5 μM의 본 발명의 조성물로 전처리하고 LPS (1μg/ml)로 염증반응을 유도하여 18시간 배양하였다. 세포 배지 내에 부착되지 않은 세포와 부착된 세포를 모아 PBS로 2회 세척한 후 끓고 있는 세포 용해 완충액을 넣어 세포를 현탁시키고 이를 100℃ 중에 5분간 가열하였다. 이를 식힌 후 20°C에서 보관하였고 사용 직전에 37°C에서 녹여 단백질 정량 및 전기영동에 이용하였다.

단백질 정량은 BCA 법을 이용하였고 30~50 mg의 단백질을 8~12% SDS-폴리아크릴아미드 겔을 이용하여 150 V 에서 110분 동안 전기영동하였다. 원하는 부위의 겔을 잘라 1시간 동안 PVDF(polyvinylidene fluoride) 막으로 이동시킨 후 PBST로 2회 세척하고 블로킹 완충액에 넣어 상온에서 1시간 동안 교반하였다. 그 다음 PBST로 5분간 3회씩 세척한 후 다음의 1차 항체를 3% 탈지유/PBST로 1:1,000 ~1:2,000의 비율로 희석하여 막과 함께 밀봉하여 4℃에서 교반하면서 12시간 이상 배양하였다. 막을 PBST로 5분간 2-3회씩 세척한 후 HRP-결합된 2차 항체를 1:1,500~1:2,000으로 희석하여 막과 함께 상온에서 2-3시간 배양하였다. 이를 PBST로 5분간 3회 세척한 후 웨스턴 블랏팅 기질 (WESTSAVE Up ^TM)을 처리하여 생성된 발광(luminescence)을 LAS-3000을 이용하여 확인하였다. 대조군으로는 LPS만 처리한 군 (+control) 과 LPS와 본 발명의 조성물을 모두 처리하지 않은 군 (-control)을 사용하여 단백질 발현을 비교하였고, 그 결과를 도 2a에 나타내었다.

RAW 264.7 세포를 10% FBS가 포함된 배지로 100mm 배양 접시 당 1 ⅹ 10⁶가 되도록 희석하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간을 배양한 후 PBS로 2회 세척하였다. 10% FBS가 포함된 배지에 thio-Cl-IB-MECA 20, 10, 5 μM 농도로 본 발명의 조성물을 희석한 후, 100 mm 배양 접시에 준비된 배지를 10 ml 첨가하여 일정 시간 배양하였다. 세포 배지 내에 부착되지 않은 세포와 부착된 세포를 모아 PBS로 2회 세척한 후, TRI 시약(TRIzol)을 이용하여 세포를 깨서 모은 후 CHCl₃를 첨가하여 RNA를 추출하고, 이소프로필알코올을 이용하여 침전시켰다. RNA 침전물을 70% 에탄올로 세척한 후 공기 중에서 건조시킨 후 뉴클레아제로 오염되지 않은 물(nuclease-free water)에 현탁시켰다. 55℃에서 10분간 가열하고, 70℃에서 5분간 가열하여 RNA가 단일 사슬 상태로 존재하게끔 하였다. 총 RNA를 나노 드롭으로 정량한 후, 1 μg/μl 농도로 희석하여 조류 골수아세포증 바이러스 (avian myeloblastosis virus: AMV) 역전사효소와 올리고(dT)₁₅ 프라이머를 이용하여 cDNA를 만들었다. 0.2 mM dNTP 혼합물, 10pmol 표적 유전자-특이적 프라이머 (표 1), 및 0.25 유니트 Taq DNA 폴리머라제를 GeneAmp PCR 시스템 2400에서 증폭시킨 후 생성된 PCR 생성물을 2% 아가로스 겔에서 100V, 40분간 전기영동하고 SYBR Safe로 염색시킨 후 Alpha Imager를 이용하여 염색된 RNA를 확인하였고 그 결과를 도 2b에 나타내었다.

<프라이머>

유전자		서열
iNOS	센스	5'-ATGTCCGAAGCAAACATCAC-3'
	안티센스	5'-TAATGTCCAGGAAGTAGGTG-3'
COX-2	센스	5'-CCC CCA CAG TCA AAG ACA CT-3'
	안티센스	5'-CCC CAA AGA TAG CAT CTG GA-3'
IL-1β	센스	5'-TGCAGAGTTCCCCAACTGGTACATC-3'
	안티센스	5'-GTGCTGCCTAATGTCCCCTTGAATC-3'
TNF-α	센스	5'-ATGAGCACAGAAAGCATGATC-3'
	안티센스	5'-TACAGGCTTGTCACTCGAATT-3'
β-actin	센스	5'-TGTGATGGTGGGAATGGGTCAG-3'
	안티센스	5'-TTTGATGTCACGCACGATTTCC-3'

도 2a에서 알 수 있듯이, 본 발명의 조성물 (thio-Cl-IB-MECA)은 농도 의존적으로 iNOS 단백질 발현을 저해시켰다. 또한 본 발명의 조성물 (thio-Cl-IB-MECA) 20 μM만 (LPS^-) 처리한 것의 단백질 발현을 보면 (도 2a에서 왼쪽에서 3번째 참조), iNOS 발현은 본 발명의 조성물의 독성이 아니라 LPS에 의한 것임을 알 수 있었다.

도 2b에 나타난 바와 같이, LPS만 (본 발명의 조성물^-) 처리한 대조군(도 2b에서 왼쪽에서 2번째 참조)과 비교하였을 때, 본 발명의 조성물( thio-Cl-IB-MECA 5, 10, 20 μM)은 농도 의존적으로 iNOS 유전자 발현을 저해한다는 것을 확인할 수 있다.

이러한 결과로부터 본 발명의 조성물 (thio-Cl-IB-MECA)의 항염증 활성은 염증반응 관련 효소인 iNOS를 직접적으로 저해한다는 것을 알 수 있었다.

실시예 3: TNF -α 발현에 미치는 영향

TNF-α는 LPS에 의해 자극 받은 세포에서 발현이 증가하는 사이토킨으로 IL-1β의 발현 및 염증 반응의 진행에 영향을 주므로 TNF-α 의 발현 여부에 본 발명의 조성물이 미치는 영향을 시험하였다. 구체적으로는 RAW 264.7 세포에 본 발명의 조성물을 thio-Cl-IB-MECA 20, 10, 5 μM의 농도로 미리 전 처리하고 LPS (1 μg/ml)로 염증반응을 유도하여 6 시간 배양한 후 상등액을 취해 ELISA (electrophoresis mobility shift assay) 키트를 이용하여 상징액으로 분비되는 TNF-α의 양을 측정하였고 그 결과를 도 3a에 나타내었다.

또한 유전자 수준에서 발현이 저해되는지 알아보기 위해 추가적으로 RT-PCR 방법을 이용하여 TNF-α mRNA 발현에 대해 미치는 영향도 시험하였고 그 결과를 도 3b에 나타내었다.

도 3a에 나타난 바와 같이, ELISA 결과 TNF-α의 양은 본 발명의 조성물 (thio-Cl-IB-MECA)의 처리에 의해 농도 의존적으로 저해되었다. TNF-α mRNA 발현 또한 본 발명의 조성물 (thio-Cl-IB-MECA)에 의해 억제되었다 (도 3b 참조).

실시예 4: IL -1β 발현에 미치는 영향

IL-1β도 염증에 관련하는 주요인자 중에 하나로 염증과 조직 손상에 관련한 여러 유전자 발현을 유도하는 역할을 하는 바, 본 발명의 조성물이 IL-1β의 mRNA 유전자 발현과 단백질 발현에 미치는 영향을 시험해 보았다. 구체적으로는 RAW 264.7 세포에 본 발명의 조성물을 thio-Cl-IB-MECA 20, 10, 5 μM의 농도로 미리 전 처리하고 LPS (1 μg/ml) 로 염증반응을 유도하여 4시간 배양한 후 RNA 분획을 모으고, 8 시간 배양 후 단백질을 모아서 RT-PCR 및 웨스턴 블럿을 수행하였고 그 결과를 도 4a 및 도 4b에 나타내었다.

LPS만 처리한 대조군에 비해서 본 발명의 조성물 (thio-Cl-IB-MECA)을 처리한 실험군에서의 IL-1β의 유전자 (도 4a 참조) 및 단백질 (도 4b 참조) 발현이 농도 의존적으로 저해되었다.

실시예 5: NF - kB 신호전달에 미치는 영향

NF-κB는 p65/p50으로 이뤄진 전사 인자로 세포질 내에서 IκB와 결합하여 불활성화 상태로 존재하지만 LPS와 같은 자극이 가해지면 IκB 키나제 (IKK)에 의해 IκB가 인산화되고 분해되는 일련의 과정을 거쳐 활성화된다. 유리 NF-κB 상태가 되면 핵 안으로 이동하여 κB-결합 부위에 결합하여 염증반응에 관련하는 iNOS, TNF-α, IL-1β 등의 유전자의 발현을 조절한다. 따라서 본 발명의 조성물의 NF-κB 신호전달 체계에 미치는 영향을 웨스턴 블럿 및 EMSA를 이용하여 시험하였다.

실험 결과, LPS만 처리한 대조군에서 시간대별로 IκB 단백질의 분해를 확인한 결과 15분 이내에 최대로 분해되는데 (도 5 참조), 동 시간에서 본 발명의 조성물 (thio-Cl-IB-MECA 20 μM)을 처리한 실험군에서는 IKK가 저해되어 IκB 단백질 분해가 억제되었다 (도 5 참조).

NF-κB가 핵 내로 이동하여 DNA와 결합하는지 EMSA로 확인하여 본 결과, 본 발명의 조성물 (thio-Cl-IB-MECA)이 NF-κB의 DNA 결합 그리고 NF-κB의 서브유니트인 p65의 단백질 결합을 저해하는 것을 확인할 수 있었다 (도 6 참조).

실시예 6: Wnt 단백질 발현 및 β- 카테닌 발현에 미치는 영향

RAW 264.7 세포에서의 NF-κB 신호 전달 경로에 영향을 주는 PI-3 키나제와 Wnt 신호 전달 관련 단백질의 발현에 미치는 영향을 시험해 보았다. 구체적으로는 본 발명의 조성물 (thio-Cl-IB-MECA 20 μM)을 RAW 264.7 세포에 처리하고 30분 후 LPS로 자극을 주었다. 배양 후 5, 15, 30, 60 분 간격으로 모은 세포에서 단백질을 추출하여 LPS만 처리한 대조군과 비교하여 단백질의 발현에 미치는 영향을 확인하였고 그 결과를 도 7a에 나타내었다. 도 7a에 나타낸 바와 같이, LPS 자극에 의해 인산화된 p-GSK 3α/β는 30분과 60분에서 발현이 억제되었으며, p-AKT의 발현도 30분과 60분에서 저하되었다 (도 7a).

β-카테닌의 핵 내 유입 및 세포질 내 축적을 알아보기 위해서 본 발명의 조성물 (thio-Cl-IB-MECA 5, 10, 20 μM의 농도)을 RAW 264.7 세포에 처리하고 30분 후 LPS로 자극을 주었다. 1시간 배양 후 세포를 모아핵 추출물과 세포질 추출물로 분리하여 웨스턴 블럿 방법을 통해 세포질과 핵 내 부분의 β-카테닌 단백질 발현을 확인해 보았고 그 결과를 도 7b에 나타내었다. 도 7b에 나타난 바와 같이, 세포질과 핵 내 부분에서 β-카테닌 발현이 LPS 처리군에 비해 농도 의존적으로 저하되었다. LPS 자극이 없을 경우 β-카테닌은 인산화되어 분해되는데 p-β-카테닌의 경우는 LPS만 처리한 군에 비해 본 발명의 조성물 (thio-Cl-IB-MECA)을 처리한 군에서 역시 농도 의존적으로 발현이 저하되어 있었다.

실시예 7: LPS 유도 패혈증 동물 모델

LPS로 패혈증을 유발한 동물 모델에서의 본 발명의 조성물 (thio-Cl-IB-MECA)의 효능을 시험해 보았다. 시험에 쓰인 S. marcenes 유래 LPS는 E. coli 유래 LPS보다 병원성이 강하다고 알려진 물질이며, LPS를 처음에는 저 용량 투여하여 개체의 면역 반응을 약화시킨 (attenuation) 후 일정 시간이 지난 후 두 번째에는 고 용량을 투여하여 신속하게 패혈증 및 패혈성 쇼크를 유발하게 하였다. 먼저 ICR 마우스 (20~25g, male)를 6마리씩 5개의 군으로 나누어서 어떠한 물질도 처리하지 않은 정상군, 식염수(saline) 만 투여한 대조군과 본 발명의 조성물 (thio-Cl-IB-MECA 200, 500 μg/kg) 그리고 비교 물질로 종래의 A₃ 아데노신 수용체 효능제 (IB-MECA 500 μg/kg)를 투여한 군으로 구분하였다. 이들 약물을 경구로 투여한 후 30분에 2mg/kg LPS (S. marcenes)를 식염수에 녹여 복강 투여하였다. 20시간 후, 약물을 재 투여한 후, 30분 후 LPS (S. marcenes)을 10 mg/kg의 농도로 재 투여하였다. 2번째 자극 이후, 6시간 까지 매 시간 관찰하였으며 7일 후까지 생존율을 관찰하여 본 발명의 조성물 (thio-Cl-IB-MECA)와 종래의 A₃ 아데노신 수용체 효능제 (IB-MECA)의 효과 및 본 발명의 조성물 (thio-Cl-IB-MECA)의 농도 (200, 500 μg/kg)에 따른 효과를 비교하였고 그 결과를 도 8a에 나타내었다.

도 8a에 나타낸 바와 같이, 1일 지난 후 대조군의 생존율은 0% 이었으나, 본 발명의 조성물 (thio-Cl-IB-MECA 200, 500 μg/kg)의 경우 각각 71.4%, 66.7%, 종래의 A₃ 아데노신 수용체 효능제 (IB-MECA 500 μg/kg)의 경우는 66.7% 였다.

몸무게 변화를 실험 시작 전, 두 번째 약물 투여 전, 그리고 마지막 7일 경과 후 측정한 결과, 정상군의 경우 몸무게가 꾸준히 늘어났으나 약물을 처리한 군에서는 감소 후 다시 증가하고 있음을 확인할 수 있었다 (도 8b). 시험 기간 동안 본 발명의 조성물 (Thio-Cl-IB-MECA) 투여에 의한 부작용 (몸무게 변화)은 관찰되지 않았다.

실시예 8: 폐 조직에서의 염증성 단백질 발현

폐 조직에서의 염증성 물질의 발현에 미치는 영향을 시험해 보았다. 구체적으로는 감염에 의한 염증 반응 시에 폐의 알네올라(alveolar) 대식세포가 중요 역할을 하므로 이 대식세포에서의 염증성 물질들의 발현을 알아보았다.

ICR mouse (25~30g, male)를 3마리씩 5개의 군으로 나누어서 어떠한 물질도 처리하지 않은 정상군, 식염수만 투여한 대조군과 본 발명의 조성물(thio-Cl-IB-MECA 500 μg/kg)을 투여한 군으로 구분하였다 LPS (E. coli)를 2.5 mg/kg으로 복강 투여하여 8시간이 지난 후 폐 조직을 적출한 후 단백질을 분리하여 웨스턴 블럿 방법으로 iNOS, TNF-α와 IL-1β의 발현을 확인하였고 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 조성물을 처리한 군에서 이들의 발현이 저하되어 있음을 알 수 있었다.

실시예 9: 동물 독성 실험

본 발명의 조성물의 독성을 알아보기 위하여 ICR 흰쥐(n=10, 25g)에 thio-Cl-IB-MECA 1500 mg/kg/체중의 농도로 경구 투여하여 행동 변화 및 상태를 관찰해 보았다.

모든 시험 동물이 본 발명의 조성물 투여 7일 후까지 체중 변화 등 특별한 이상 없이 건강하게 생존하였다. 따라서 본 발명의 조성물 (thio-Cl-IB-MECA)은 최대내성용량 (Maximum tolerance dose)이 1500 mg/kg 이상 (MTD > 1500 mg/kg/mouse)으로 안전한 약물로 확인되었다.

Claims (8)

1. 2-클로로-N⁶-(3-아이오도벤질)-4'-싸이오아데노신-5'-N-메칠유로나마이드(thio-Cl-IB-MECA) 또는 그것의 약제학적으로 허용가능한 염을 활성 성분으로 포함하는 폐혈증 또는 폐혈성 쇼크의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 이들의 혼합물을 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제

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