KR101183204B1 - 생물적 및 비생물적 스트레스에 대한 증가된 저항성을 나타내는 유전자 도입 식물 및 이를 생산하는 방법 - Google Patents

생물적 및 비생물적 스트레스에 대한 증가된 저항성을 나타내는 유전자 도입 식물 및 이를 생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 분비성 포스포리파아제 A2 단백질(예컨대, sPLA2-a 또는 sPLA2-b)을 과생산(overproducing)하고 광범위한 비생물적(예컨대, 삼투압 스트레스) 또는 생물적(예컨대, 세균 또는 진균 감염) 스트레스 조건에 대하여 강화된 저항성을 가질 뿐만 아니라 조기 개화(early flowering)를 유도하는 식물, 특히 유전자 도입 식물, 식물 일부 및 식물 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 분비성 포스포리파아제 A2 또는 그 기능적 이소폼(isoforms)을 코딩하는 핵산 서열들, 및 비생물적 및 생물적 스트레스 조건에 대한 저항성을 식물에 부여하는 이러한 서열들의 용도를 포함한다. 본 발명은 폭넓고 다양한 병원체 감염 및 스트레스 조건에 의한 농작물 피해를 완화시키고 개화시기를 빠르게 하는데 유용하다.

Description

생물적 및 비생물적 스트레스에 대한 증가된 저항성을 나타내는 유전자 도입 식물 및 이를 생산하는 방법 {Transgenic plants exhibiting increased resistance to biotic and abiotic stresses and methods for producing the same}
본 발명은 분비성 포스포리파아제 A2(secretory phospholipase A2, sPLA2) 단백질을 과생산(overproducing)하고 광범위한 생물적 또는 비생물적 스트레스 조건에 대하여 강화된 저항성을 가질 뿐만 아니라 조기 개화(early flowering)를 유도하는 식물, 특히 유전자 도입 식물, 식물 일부 및 식물 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 sPLA2 또는 그 기능적 변이체들을 코딩하는 핵산 서열들, 및 식물이 비생물적 및 생물적 스트레스 조건에 대한 저항성 뿐 아니라 조기 개화를 나타내게 하는 상기 서열들의 용도를 포함한다.
식물의 서로 다른 성장 단계 동안, 식물들은 매우 광범위한 생물적 및 비생물적 스트레스 조건에 노출된다. 비생물적 및 생물적 스트레스의 결과로서 농작물 피해는 농업 지역에서 중요한 문제가 되고 있다. 따라서 비생물적 및 생물적 스트레스 모두에 대하여 동시에 강화된 저항성을 갖는 새로운 농작물을 개발하는 것이 높은 경제적 의미에 있어 매우 중요한 일이다. 대부분의 기능적 유전자들은 이러한 측면들 중 하나에만 한정되어 있다. 최근 트렌드는 비생물적 및 생물적 스트레스 둘 다로부터 식물을 보호하는 다기능 유전자(multifunctional genes)를 찾는 것이다. 광범위한 비생물적 및 생물적 산화 스트레스 조건에 대한 강화된 저항성을 유도하는 “페리틴(ferritin)” 유전자를 포함하는 다기능 유전자들의 몇 가지 예가 있다 (US 6,563,019). 그러나, 비생물적 및 생물적 스트레스에 대한 강화된 저항성 뿐 아니라 조기 개화를 유도하는 다기능 유전자의 예는 거의 없다. 이러한 모든 측면이 농작물 개량에 있어서 중요한 요소이다.
식물 스트레스에 대한 개선된 저항성을 나타내는 식물 및 농작물을 개발에 대한 지속적인 요구로 인하여, 불리한 조건에서 농작물 수확량을 증가시키고 흉작의 위험을 줄이게 된다. 예를 들어, 극한의 기온 및 고염 조건인, 가뭄에 대한 증가된 내성을 갖는 식물은 이미 농작물 생존이 불가한 반사막기후(semi-desert climates)에서 농업의 가능성을 열 수 있다. 또한, 저온 또는 동결 온도에 대한 개선된 내성을 갖는 새로운 농작물의 개발은 더 추운 기후를 가진 지역에서 식물의 생장기를 현저하게 연장할 수 있다.
다수의 식물 유전자들은 스트레스에 노출되면 증가된 발현 수준을 나타내는 것으로 알려져 있다. 그러나 증가된 스트레스 내성을 갖는 유전적으로 변형된 농작물을 개발하기 위한 상당한 노력에도 불구하고, 지금까지 상업적인 시장에서 이러한 농작물은 거의 없다.
환경적 손상에 대해 증가된 내성을 갖는 신규한 식물들을 개발하는데 있어서 전망은 임계 스트레스(critical stress) 내성 제어 유전자들의 조절, 및 그들의 기능적 조절 특성의 연구에 달려 있다. 본 출원의 발명자들은, 및 연구자들은, 관련된 생화학 경로들에 대한 이해의 도출을 기대하여 식물 스트레스 내성의 메커니즘을 풀기 위해 노력하였다. 그럼에도 불구하고, 식물 스트레스 반응에 관련된 유전자 및 단백질의 특성은 많은 중요한 도전과제를 보여주고 있다.
식물 스트레스 반응에 대한 더 나은 이해를 도출하기 위한 지속적인 요구가 있으므로, 그에 대응하는 방법들이 개발됨으로써 식물에 이로운 특성을 제공할 수 있다. 이러한 요구는 과도한 기온, 가뭄, 및 고염도의 조건과 같은 불리한 기후조건에 의한 손상에 저항성을 나타내는 농작물의 생산에 이른다. 식물 스트레스 내성의 점진적 획득이라도 곡물, 오일 씨드(oil seed) 및 원예(horticulture)의 품질과 공급을 안정화하는데 현저한 경제적 파급효과를 나타낼 수 있다. 발아, 생장 및 개화의 증대는 짧거나 다른 까다로운 식물의 생장기를 갖는 지역에서 매우 중요하다.
아라비돕시스(Arabidopsis) 게놈에는, 2개의 서로 다른 PLA2 그룹이 있다: 1) 분비성 저분자량 PLA2(sPLA2) 및 2) PLA1과 PLA2 활성이 결합된 파타틴(patatin)-유사 비특이적 PLAs. 4개의 저분자량 PLA2 이소폼(isoforms) 및 10개의 파타틴-유사 PLAs들이 아라비돕시스 게놈 서열 데이터베이스로부터 확인되었다 (Ryu et al., 2005 Progress in Lipid Research).
PLA2의 다기능 이소폼(들)을 동정하기 위하여, 본 발명자들은 우선 4개의 sPLA2s 이소폼들에 집중하였는데, 이는 그들이 진정한 PLA2s이고 소포체(endoplasmic reticulum) 및 나아가 세포외 공간(extracellular spaces)과 액포(vacuoles) 내로 분비되는 것으로 예상되기 때문이다. 소포체와 세포외 공간은 식물 및 동물에서 다기능 시그널링(multifunctional signaling)의 주요 조절 위치인 것으로 증명되었다. 4개의 sPLA2 이소폼 중, sPLA2-a 및 sPLA2-b만이 전체 식물 조직에 걸쳐 발현된다. 이에 반해, sPLA2-e 및 sPLA2-g는 꽃조직(flower tissues)에서만 발현되는 것으로 나타난다. sPLA2-a 또는 sPLA2-b 단백질을 과발현하는 식물은 비생물적 및 생물적 스트레스에 대하여 강화된 저항성을 나타내었다. 흥미롭게도, sPLA-b 단백질을 과생산하는 상기 유전자 도입 식물 역시 빨라진 개화시기의 표현형을 나타내었다. 현재까지, 본 발명자들이 알고 있는 한, 하나의 유전자가 비생물적 및 생물적 스트레스 둘 다에 대한 저항성 뿐 아니라 빨라진 개화시기와 같은 3개의 서로 다른 측면의 농업 특성을 동시에 강화시킨다는 보고는 전혀 없다. 주목할 만한 것은 비특이적 파타틴-유사 PLA가 병원체의 공격에 대항한 식물의 방어 반응에 관련되어 있는 것으로 알려져 있다는 사실이다 (WO0183788).
종래 방법들의 상기-언급된 문제를 극복하기 위하여, 본 발명자들은 식물 스트레스에 대한 개선된 저항성을 나타내는 식물 및 농작물을 개발하는데 노력하였다. 그리하여, 본 발명자들은 강화된 개화 능력 및 비생물적 및 생물적 스트레스에 대하여 더 내성을 갖는 상업적으로 요구되는 식물이 유전자 도입 식물에서 sPLA2 유전자의 발현을 조작함으로써 생산될 수 있음을 확인하고 본 발명을 성공적으로 완성하였다.
본 출원서 전반에 걸쳐, 여러 등록특허 및 공개특허는 참조로서 인용된다. 이러한 등록특허 및 공개특허의 상세한 설명은 본 출원서에 편입되어 본 발명 및 본 발명이 속하는 기술수준을 더 충분히 설명한다.
본 발명의 주된 목적은 광범위한 비생물적 및 생물적 스트레스 조건 둘 다에 대한 강화된 저항성 뿐 아니라 빨라진 개화시기를 갖는, 농작물, 특히 유전자 도입 농작물을 제공하는데 적합한 신규하고 전반적인 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 광범위한 비생물적 및 생물적 스트레스 조건 모두에 대한 증가된 저항성 및 증가된 조기 개화를 갖는 농작물, 육종소재(breeding material), 바람직하게는 유전자 도입 식물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 이하 상세한 설명, 특허청구범위 및 도면으로부터 명확해질 것이다.
본 발명의 접근법은 sPLA2 또는 sPLA2-유사 단백질을 과발현 또는 이소발현(ectopically expressing)시키는 것으로, 예를 들어 식물의 서로 다른 기관에서 트랜스퍼링(transferring)은, 세포내 리소인지질(lysophospholipid) 농도를 증가시켜서, 비생물적 및 생물적 스트레스의 손상 효과를 감소시키고 개화를 빠르게 한다.
따라서 본 발명의 상기-특정된 목적을 달성하기 위해, 본 발명자들은 애기장대(Arabidopsis thaliana) Col-O 생태형(ecotype)으로부터 4개의 서로 다른 sPLA2 이소폼 유전자(sPLA2-a, sPLA2-b, sPLA2-e, sPLA2-g)를 클로닝하고 이를 아라비돕시스 식물의 조직에서 과생산하였다.
본 발명자들은 전체 식물 조직에 걸쳐 발현되는, sPLA2-a (sPLA2-알파) 또는 sPLA2-b (sPLA2-베타) 유전자를 과발현하는 유전자 도입 식물이 비생물적 및 생물적 스트레스에 대한 강화된 저항성을 나타냄을 확인하였다. 또한, sPLA-b를 과생산하는 상기 유전자 도입 식물은 조기 개화의 표현형을 나타내었다. 반면에, sPLA2-e 및 sPLA2-g는 꽃조직에서만 발현되는 것으로 나타난다. 또한 sPLA2-a 및 sPLA2-b 단백질 둘 다는 시험관내 분석에서 그 자체로 항-진균 활성을 보이는 것으로 확인되었다 (실시예 3).
본 발명은, 따라서, sPLA2-a 및/또는 sPLA2-b 단백질을 과발현하고 비생물적 및 생물적 스트레스에 대한 강화된 저항성 뿐 아니라 빨라진 개화시기를 갖는 식물을 제공한다. 본 발명에 따른 식물은, 예컨대 sPLA2 단백질, 바람직하게는 sPLA2-a 및/또는 sPLA2-b의 발현을 코딩(coding)하는 핵산을 벡터의 형태로 도입하여 형질전환된 유전자 도입 세포이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 첨부된 서열목록에 나타난 바와 같이 서열번호 2 및/또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 sPLA2, 또는 그 기능적 변이체를 과생산하는 식물 세포가 제공된다. 상기 기능적 변이체는 서열번호 5에 나타난 바와 같이 상기 sPLA2 폴리펩티드를 위한 촉매 모티프(catalytic motifs)에 있어서 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 85% 상동성이다.
본 발명은 식물, 바람직하게는 유전자 도입 식물, 및 본 발명에 따른 세포를 포함하는 그 일부를 제공한다. 본 발명에 따른 식물, 식물 일부 또는 식물 세포는 바람직하게는 염 스트레스(salt stress) 및/또는 세균 또는 진균원(fungal origin)의 감염을 포함하는 비생물적 스트레스에 대한 강화된 저항성 및 빨라진 개화시기를 갖는다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 식물 세포, 식물 일부 및 식물의 제조를 위한 sPLA2 (서열번호 5)의 보존된 아미노산 부위를 포함하는 폴리펩티드의 용도를 포함한다.
본 발명의 상세한 설명 및 실시예는 식물의 생장하는 조직에서 sPLA2 단백질의 합성이 비생물적 및 생물적 스트레스에 대한 저항성 뿐 아니라 조기 개화를 제공함을 이하 설명한다. sPLA2-a 및/또는 sPLA2-b 단백질의 이소발현(ectopic expression)에 기초한 본 발명에 따른 이러한 신규한 기술은, 따라서, 생물적 또는 비생물적 스트레스 조건으로 유발된 농작물의 1차적인 막 손상을 감소시키고 또한 개화시기를 빠르게 할 수 있다는 점에서 잠재적으로 높은 재배학적 중요성(agronomic significance)을 갖는다.
본 발명은 폭넓고 다양한 스트레스 조건에 의한 농작물 손상을 완화시켜 농작물 피해의 회복을 촉진시키고 조기 개화를 유도하는데 유용하다.
본 발명의 명세서 및 특허청구범위에 관하여, 본 발명자들은 다음의 기술 용어를 제공된 정의에 따라 사용한다. 본 발명의 해석(interpretation)에 대해서는, 상기 정의가 상기 기술 용어의 보통의 해석과 완벽하게 조화를 이루지 않더라도, 이하 특정된 용어가 제공된 정의에 따라 사용되는 것으로 이해되어야 한다.
“폴리뉴클레오티드”는 둘 이상의 데옥시리보뉴클레오티드(DNA에서) 또는 리보뉴클레오티드(RNA에서)의 서열이다.
“폴리펩티드”는 다수의 일련의 중합된 아미노산 잔기, 예컨대 적어도 약 15개의 일련의 중합된 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열이다.
“재조합 폴리펩티드”는 재조합 폴리뉴클레오티드의 번역으로 생성된 폴리펩티드이다. “합성 폴리펩티드”는 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 방법을 이용하여 분리된 아미노산 잔기들의 일련의 중합에 의해 만들어진 폴리펩티드이다.
“재조합 폴리뉴클에오티드”, 예를 들어 재조합 DNA 분자는, 둘 이상의 비상동성 DNA 분자의 접합(ligation)을 통해 형성된 신규한 핵산 서열이다 (예를 들어 내부에 외래 DNA가 클로닝된 하나 이상의 삽입을 포함하는 재조합 플라스미드).
“발현”은 구조 RNA(rRNA, tRNA) 또는 메신저 RNA(mRNA)로 유전자의 전사에 이어서 일어나는 mRNA의 경우 단백질로 번역을 나타낸다.
2개의 DNA 서열들은 그 연결이 2개의 서열 서로에 대하여 그들의 정상 기능을 수행하는 경우에 “작동가능하게 연결”된다. 예를 들어, 프로모터 영역은 프로모터가 코딩 서열의 전사를 실행시키고, 상기 코딩 서열이 프로모터의 활성에 반응하여 발현될 산물(product)을 코딩하는 경우에, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.
“프로모터” 또는 전사 조절 영역은 시스-액팅(cis-acting) DNA 서열로서, 일반적으로 유전자의 개시 부위의 상류(upstream)에 위치하는데 여기에 RNA 중합효소가 결합할 수 있어 정확한 전사를 개시한다.
“형질전환”은 서로 다른 유전형의 다른 세포로부터 재조합 DNA의 외부 적용(external application)에 의한 세포 게놈의 유도된 변형을 의미하고, 대상 세포의 게놈에 재조합 DNA의 수용(uptake) 및 통합(integration)을 일으킨다.
단백질의 “기능적 변이체”는 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 삭제 및/또는 부가에 의해 원래 단백질(original protein)로부터 유래될 수 있는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 아미노산 서열의 변화에도 불구하고, 상기 기능적 변이체는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 검출 가능한 원래 단백질의 생물학적 활성들 중 적어도 일부 또는 적어도 하나를 간직하고 있다. 기능적 변이체는 그것이 유래될 수 있는 단백질에 대한 칼슘 결합 루프(calcium binding loop) 및 활성 부위와 같은 촉매 모티프(서열번호 5에 나타남)에 있어서 보통 적어도 70% 상동성, 바람직하게는 적어도 80% 상동성, 더욱 바람직하게는 적어도 85% 상동성이다. 단백질 또는 그 기능적 변이체의 임의의 기능적 일부(functional part) 또한 기능적 변이체라 한다.
상동(homology) 또는 유사(similarity)의 퍼센트는 다음에 의해 계산된다: (a) 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 양쪽 서열에 나타나는 위치의 수를 계산하여 매치되는 위치(matched positions)의 수를 산출하는 것; (b) 비교에 제시된 위치의 총 수로 매치된 위치의 수를 나누는 것; 및 (c) 100으로 상기 결과를 곱하여 서열 동일성(sequence identity)의 퍼센트를 산출하는 것.
비교를 위한 서열들의 최적 정렬은 공지의 알고리즘의 컴퓨터 실행(computerized implementation), 또는 열람(inspection)에 의해 수행될 수 있다. 쉽게 사용가능한 서열 비교 및 다중 서열 정렬 알고리즘은, 각각, BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(Altschul, S. F. et al 1990. J. Mol. Biol. 215:403; Altschul, S. F. et al 1997. Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402) 및 ClustalW 프로그램이다. BLAST는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov에서 인터넷상으로 이용가능하고 ClustalW 버전은 http://www2.ebi.ac.uk에서 이용가능하다. 또 다른 적합한 프로그램은 위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package)(Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis.)에 있는 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA를 포함한다. 확실하게, 본 명세서 및 특허청구범위에 사용된 바와 같이, 아미노산 서열들의 “서열 동일성의 퍼센트” 또는 “서열 상동의 퍼센트”는 상기 언급된 이용 가능한 BLASTX 프로그램의 디폴트값(default value)에 따라 결정된 최적 서열에 기초하여 결정된다.
상기 용어 “식물”은 전체 식물, 생장 영양기관/구조 (예를 들어, 잎, 줄기 및 덩이줄기(tubers)), 뿌리, 꽃 및 꽃 기관/구조 (예를 들어, 포(bracts), 꽃받침(sepals), 꽃잎(petals), 수술(stamens), 심피(carpels), 꽃밥(anthers) 및 배주(ovules)), 종자 (배(embryo), 배유(endosperm) 및 종피(seed coat)를 포함), 과실 (성숙한 씨방), 식물 조직 (예를 들어, 유관속조직(vascular tissue) 또는 기본조직(ground tissue)), 세포 (예를 들어, 공변세포(guard cells), 난세포(egg cells) 및 그 유사물), 및 식물의 후대(progeny)를 포함한다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 식물의 분류는 일반적으로 형질전환 기술을 적용할 수 있는 고등 및 하등 식물의 분류와 같이 넓으며, 속씨식물(angiosperms) (단자엽 및 쌍자엽 식물), 겉씨식물(gymnosperms), 양치식물(ferns), 속새류(horsetails), 솔입란(psilophytes), 석송류(lycophytes), 선태식물(bryophytes) 및 다세포 조류(multicellular algae) (Daly et al. (2001) Plant Physiol. 127: 1328-1333에서 변형된 도 1; Ku et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 97: 9121-9126에서 변형된 도 2; 및 Tudge in The Variety of Life. Oxford University Press, New York, NY (2000) pp. 547-606에서도 나타남)를 포함한다.
“유전자 도입 식물”은 동일종의 야생형 식물에서는 발견되지 않는 유전 물질을 포함하는 식물, 즉 변종(variety) 또는 재배종(cultivar)을 지칭한다. 상기 유전 물질은 이식유전자(transgene), 삽입 돌연변이 유발(insertional mutagenesis event)(트랜스포손(transposon) 또는 T-DNA 삽입 돌연변이 유발에 의한 것과 같은), 활성화 표지 서열(activation tagging sequence), 돌연변이된 서열(mutated sequence), 상동성 재조합(homologous recombination event) 또는 키메라 성형(chimeraplasty)에 의해 변형된 서열을 포함할 수 있다. 대체로, 외래 유전 물질은 인간의 조작에 의해 식물에 도입되어 왔으나, 본 발명이 속하는 기술분야에 기술 중 하나로서 사용될 수 있는 임의의 방법은 공지되어 있다.
유전자 도입 식물은 발현 벡터 또는 카세트(cassette)를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 일반적으로 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하는 적당한 유도성 또는 구조성(constitutive) 조절 서열들에 작동가능하게 연결된(즉, 조절 통제 하에 있는) 폴리펩티드-코딩 서열을 포함한다. 상기 발현 카세트는 형질전환 또는 부모 식물의 형질전환 후 번식(breeding)에 의해 식물에 도입될 수 있다. 식물은 전체 식물 뿐 아니라 종자, 과실, 잎, 또는 뿌리와 같은 식물 일부, 식물 조직, 식물 세포 또는 임의의 다른 식물 물질, 예컨대 식물 절편(explant)은 물론 그 후대(progeny), 및 세포에서 생화학적 또는 세포 구성 요소들 또는 과정들을 모방한 시험관내 시스템을 지칭한다. 본 명세서에 사용된, “야생형”은 유전학적으로 변형되거나 실험적 방식(experimental sense)으로 처리되지 않은 식물 세포, 종자, 식물 구성요소(plant component), 식물 조직, 식물 기관 또는 전체 식물을 지칭한다.
식물, 식물 일부, 식물 조직 또는 식물 세포는, 어떠한 검출 가능한 손상도 격지 않고 그 자연적 대응물(natural counterpart)보다, 현저하고 검출 가능한(예컨대, 적어도 20%) 더 강력한 손상 효과, 예컨대 손상제의 투여량 또는 강도에 내성이 있는 경우, 손상 효과, 즉 손상제(damaging agent)에 대하여 “증가된 저항성”을 갖는다고 한다.
본 발명의 상세한 설명의 테두리 내에서 “분비성 포스포리파아제 A2(sPLA2)”는, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적인 것으로, 소포체(endoplasmic reticulum) 또는 세포외 공간(extracellular spaces)에서 분비되고 인지질(phospholipids)을 가수분해하여 리소인지질(lysophospholipids) 및 유리지방산을 생성할 수 있는 단백질로 정의된다 (Reviewed by Ryu, S.B. 2004 Trends in Plant Sci. 9:229-235). sPLA2 패밀리의 구성원들은 칼슘 결합 루프 및 활성 부위를 포함하는 촉매 모티프(서열번호 5)에서 그들의 아미노산 서열이 높게 보존된다.
상기 용어 “비생물적 및 생물적 스트레스”는 손상 효과의 조짐(manifestation)이 있는 여러 종류의 비생물적(예컨대, 서로 다른 화학제로 처리 또는 고염, 고온, 저온 또는 가뭄과 같은 극한의 환경 조건에 노출) 및 생물적 스트레스(예컨대, 세균, 진균 또는 바이러스로 감염) 조건을 포함하는 매우 일반적인 관념으로 사용된다.
이하, 본 발명은 다음과 같이 더욱 명확하게 설명된다.
본 발명의 한 양태에서, 본 발명은 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 sPLA2 단백질 또는 그 기능적 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 유전자 도입 식물로서, 상기 발현벡터는 상기 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 조절인자(regulatory element)를 더 포함하고; 상기 유전자 도입 식물에서 sPLA2 단백질의 발현 수준은 형질전환되지 않은 야생형 식물 보다 더 높은 것을 특징하는 유전자 도입 식물을 제공한다. 서열번호 1 및 서열번호 2는 sPLA2-a cDNA의 뉴클레오티드 서열 및 추정된(deduced) 아미노산 서열에 해당한다. 서열번호 3 및 서열번호 4는 sPLA2-b cDNA의 뉴클레오티드 서열 및 추정된(deduced) 아미노산 서열에 해당한다.
유전자 도입 식물의 바람직한 구현예에서, 상기 sPLA2 단백질의 기능적 변이체는 서열번호 5와 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 촉매 모티프(catalytic motif)를 포함할 수 있다.
유전자 도입 식물의 바람직한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
유전자 도입 식물의 바람직한 구현예에서, 상기 조절인자(regulatory element)는 구조성 프로모터(constitutive promoter), 유도성 프로모터(inducible promoter), 강력한 프로모터(strong promoter), 약한 프로모터(weak promoter), 조직 특이적 프로모터(tissue specific promoter), 조직-비특이적 프로모터(tissue-inspecific promoter), 및 기관 특이적 프로모터(organ specific promoter), 세포-특이적 프로모터(cell-specific promoter)로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 조절인자는 sPLA2 단백질을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드를 과발현하는 구조성 프로모터이다. 더욱 바람직하게는 상기 발현벡터는 도 1에 도시된 바와 같은 CaMV 35S 프로모터의 조절 하에 있는 pBIG-HYG 벡터일 수 있다.
유전자 도입 식물의 바람직한 구현예에서, 상기 유전자 도입 식물은 형질전환되지 않은 야생형 식물 보다 비생물적 및 생물적 스트레스에 대하여 더 저항성일 수 있다.
유전자 도입 식물의 바람직한 구현예에서, 상기 유전자 도입 식물은 적어도 하나의 진균병(fungal disease)에 대하여 저항성일 수 있다.
유전자 도입 식물의 바람직한 구현예에서, 상기 유전자 도입 식물은 푸자리움(Fusarium), 페로노스포라(Peronospora), 알터나리아(Alternaria) 또는 보트리티스(Botrytis) 속에 대하여 저항성일 수 있다.
유전자 도입 식물의 바람직한 구현예에서, 상기 유전자 도입 식물은 하나 이상의 세균 병원체 또는 질병에 대하여 저항성일 수 있다.
유전자 도입 식물의 바람직한 구현예에서, 상기 유전자 도입 식물은 슈도모나스(Pseudomonas) 또는 에르비니아(Erwinia) 속에 대하여 저항성일 수 있다.
유전자 도입 식물의 바람직한 구현예에서, 상기 유전자 도입 식물은 적어도 하나의 비생물적 스트레스에 대하여 내성(tolerant)일 수 있다.
유전자 도입 식물의 바람직한 구현예에서, 상기 유전자 도입 식물은 고염-유도성 삼투압 스트레스(high salt-induced osmotic stress)에 대하여 더 내성일 수 있다.
유전자 도입 식물의 바람직한 구현예에서, 상기 유전자 도입 식물은 더 빠른 개화시기를 가질 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 비생물적 및 생물적 스트레스에 대하여 저항성 및/또는 조기 개화시기를 갖는 유전자 도입 식물을 제조하는 방법을 제공한다: (a) 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 sPLA2 단백질 또는 그 기능적 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터로 목적 식물을 형질전환 시키는 단계로서; 상기 발현벡터는 상기 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 조절인자(regulatory element)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단계; 및 (b) 형질전환되지 않은 야생형 식물 보다 비생물적 및 생물적 스트레스에 더 저항성이거나 및/또는 더 빠른 개화시기를 갖는 유전자 도입 식물을 선택하는 단계.
유전자 도입 식물을 제조하는 방법의 바람직한 구현예에서, 상기 sPLA2 단백질의 기능적 변이체는 서열번호 5와 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 촉매 모티프(catalytic motif)를 포함할 수 있다.
유전자 도입 식물을 제조하는 방법의 바람직한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
유전자 도입 식물을 제조하는 방법의 바람직한 구현예에서, 상기 조절인자(regulatory element)는 구조성 프로모터(constitutive promoter), 유도성 프로모터(inducible promoter), 강력한 프로모터(strong promoter), 약한 프로모터(weak promoter), 조직 특이적 프로모터(tissue specific promoter), 조직-비특이적 프로모터(tissue-inspecific promoter), 및 기관 특이적 프로모터(organ specific promoter), 세포-특이적 프로모터(cell-specific promoter)로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 조절인자는 sPLA2 단백질을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드를 과발현하는 구조성 프로모터이다. 더욱 바람직하게는 상기 발현벡터는 도 1에 도시된 바와 같은 CaMV 35S 프로모터의 조절 하에 있는 pBIG-HYG 벡터일 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 비생물적 및 생물적 스트레스에 대하여 식물의 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다: (a) 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 sPLA2 단백질 또는 그 기능적 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터로 목적 식물을 형질전환 시키는 단계로서; 상기 발현벡터는 상기 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 조절인자(regulatory element)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단계; 및 (b) 형질전환되지 않은 야생형 식물 보다 비생물적 및 생물적 스트레스에 더 저항성인 유전자 도입 식물을 선택하는 단계.
비생물적 및 생물적 스트레스에 대하여 식물의 저항성을 증가시키는 방법의 바람직한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 식물의 개화시기를 빠르게 하는 방법을 제공한다: (a) 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 sPLA2 단백질 또는 그 기능적 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터로 목적 식물을 형질전환 시키는 단계로서; 상기 발현벡터는 상기 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 조절인자(regulatory element)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단계; 및 (b) 형질전환되지 않은 야생형 식물 보다 더 빠른 개화시기를 갖는 유전자 도입 식물을 선택하는 단계.
식물의 개화시기를 빠르게 하는 방법의 바람직한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 제 13-15항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 유전자 도입 식물에 의해 생산되는 종자(seed)로서, 상기 종자는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 sPLA2 단백질 또는 그 기능적 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 종자를 제공한다.
본 발명의 종자의 바람직한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 sPLA2 단백질 또는 그 기능적 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 식물의 비생물적 및 생물적 스트레스에 대한 저항성 증가용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 sPLA2 단백질 또는 그 기능적 변이체를 포함하는 조성물의 유효량을 저항성을 필요로 하는 식물에 적용시키는 단계를 포함하는, 식물의 비생물적 및 생물적 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 sPLA2 단백질 또는 그 기능적 변이체를 포함하는, 식물의 개화시기를 빠르게 하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 sPLA2 단백질 또는 그 기능적 변이체를 포함하는 조성물의 유효량을 빨라진 개화시기를 필요로 하는 식물에 적용시키는 단계를 포함하는, 식물의 개화시기를 빠르게 하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명의 상기 조성물은 물과 같은, sPLA2 단백질을 위한 허용가능한 담체를 포함한다. 그러나 유기용매(organic solvents)와 같은 다른 담체들 또한 사용될 수 있다. 상기 조성물에 포함되는 sPLA2 단백질의 양은 비생물적 및 생물적 스트레스로부터 피해(injury)를 예방 및/또는 식물의 개화시기를 빠르게하는데 효과적인 양이다. 바람직하게는, 상기 조성물에서 sPLA2 단백질의 양은 본 발명에 따르면 조성물 1 리터 당 약 1.0 내지 약 400 mg 범위이다.
상기 조성물은 식물에 어떤 형태로도 적용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 조성물은 스프레이로 또는 단순히 식물을 용액에 살짝 담금으로서 적용될 수 있다.
본 발명은 본 명세서의 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 재조합 구성물(constructs)을 포함한다. 상기 구성물은 전형적으로 본 발명의 핵산 서열이 삽입된, 플라스미드, 코스미드, 파지, 바이러스(예컨대, 식물 바이러스), 세균인공염색체(bacterial artificial chromosome, BAC), 효모인공염색체(yeast artificial chromosome, YAC) 또는 그 유사물과 같은, 벡터를 포함한다. 이러한 구현예의 바람직한 양태에서, 상기 구성물은, 예를 들어, 프로모터, 작동가능하게 연결된 서열을 포함하는, 조절 서열(regulatory sequences)을 더 포함한다. 다수의 적당한 벡터들 및 프로모터들은 본 발명이 속하는 기술분야에 공지되어 있으며, 상업적으로 입수가능하다.
벡터, 프로모터 및 다른 많은 관련된 주제의 용도 및 생산을 포함하여, 본 명세서에 유용한 분자 생물학적 기술들을 설명하는 일반적인 내용(General texts)은, Berger and Kimmel (1987) Guide to Molecular Cloning Techniques, Sambrook (1989) Molecular Cloning, 및 Ausubel (1997, 2000) Current Protocols in Molecular Biology를 포함한다. 상기 모든 확인된 서열은, 예컨대 식물에서 발현을 위한 카세트 또는 벡터에 도입될 수 있다. 식물 세포의 안정한 형질전환 또는 유전자 도입 식물의 수립을 위한 다수의 적절한 발현 벡터는 Weissbach and Weissbach (1989) Methods for Plant Molecular Biology. Academic Press, 및 Gelvin et al. (1990) Plant Molecular Biology Manual. Kluwer Academic Publishers에 기술된 것을 포함하여 개시되어 있다. 특정 예들은 Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303: 209, Bevan (1984) Nucleic Acids Res. 12: 8711-8721, Klee (1985) Bio/Technology 3: 637-642, for dicotyledonous plants에 발표된 것과 함께 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 Ti 플라스미드에서 유래된 것을 포함한다. 다른 방법으로, 비-Ti 벡터들은 자유 DNA 전달 기술(free DNA delivery techniques)을 사용함으로서 단자엽 식물 및 세포에 DNA를 도입시키는데 사용될 수 있다. 이러한 방법들은, 예를 들어, 리포솜(liposomes), 전기천공(electroporation), 유전자총(microprojectile bombardment), 탄화규소 휘스커(silicon carbide whiskers), 및 바이러스의 사용을 포함할 수 있다. 이러한 방법들을 사용함으로서 밀, 쌀(Christou (1991) Bio/Technology 9: 957-962) 및 옥수수(Gordon-Kamm (1990) Plant Cell 2: 603-618)와 같은 유전자 도입 식물을 제조할 수 있다. 또한 미성숙 배아(immature embryo)도 입자총(particle gun)을 사용하는 직접 DNA 전달 기술에 있어 외떡잎식물을 위한 좋은 표적 조직이 될 수 있다 (Weeks et al. (1993) Plant Physiol. 102: 1077-1084; Vasil (1993) Bio/Technology 10: 667-674; Wan and Lemeaux (1994) Plant Physiol. 104: 37-48, and for Agrobacterium-mediated DNA transfer (Ishida et al. (1996) Nature Biotechnol. 14: 745-750).
일반적으로, 식물 형질전환 벡터는 5' 및 3' 조절 서열 및 우성 선별 마커(dominant selectable marker)의 전사 조절 하에서 하나 이상의 클로닝된 식물 코딩 서열(게놈 또는 cDNA)을 포함한다. 또한 이러한 식물 형질전환 벡터들은 전형적으로 프로모터(예컨대;, 유도성 또는 구조성(constitutive), 환경적으로- 또는 발달상으로 조절된, 또는 세포- 또는 조직-특이적 발현을 통제하는 조절 영역), 전사 개시점 부위(transcription initiation start site), 및 RNA 프로세싱 신호(인트론 스플라이싱 부위와 같은), 전사 종결 부위(transcription termination site), 및/또는 폴리(A) 형성 신호(polyadenylation)를 포함한다. 상기 프로모터 서열들은 본 발명이 속하는 기술분야에 공지된 방법에 따라 분리될 수 있다. sPLA2 단백질을 발현하는데 유용할 수 있는 구조성(constitutive) 식물 프로모터의 예들은 다음을 포함한다: 대부분의 식물 조직에서 고농도 발현으로, 구조성을 부여하는, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 35S 프로모터 (예를 들어, Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812); 노팔린 합성효소(nopaline synthase) 프로모터 (An et al. (1988) Plant Physiol. 88: 547-552); 및 옥토파인 합성효소(the octopine synthase) 프로모터 (Fromm et al. (1989) Plant Cell 1: 977-984).
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 특이적 프로모터와 작동가능하게 연결되어 상기 폴리뉴클레오티드가 환경적, 조직-특이적 또는 시간적 신호(temporal signals)에 반응하여 발현될 수 있게 한다. 다양한 식물 유전자 프로모터들은 환경의, 호르몬의, 화학적, 발달상의 신호들, 및 조직-활성의 수단에 반응하여 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. 프로모터의 선택은 관심 있는 표현형에 크게 기초하여 조직(예컨대, 종자, 과실, 뿌리, 꽃가루, 유관속조직, 꽃, 심피 등), 유도성(inducibility)(예컨대, 상처, 열, 냉해, 가뭄, 빙, 병원체 등), 시기(timing), 발달상의 단계, 및 그와 같은 것으로서 이러한 요소들에 의해 결정된다. 다수의 공지된 프로모터는 특성화되어 있어 관심 있는 유전자 도입 식물 또는 세포에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 촉진시키는데 편리하게 사용될 수 있다. 예를 들어, 조직 특이적 프로모터들은 다음을 포함한다: 종자-특이적 프로모터 (US Pat. No. 5,773,697에 개시된 나핀(napin), 파세올린(phaseolin) 또는 DC3 프로모터와 같은), dru 1 프로모터(US Pat. No. 5,783,393) 또는 2Al 1 프로모터 (US Pat. No. 4,943,674) 및 토마토 폴리갈락투로네이즈(polygalacturonase) 프로모터 (Bird et al. (1988) Plant MoI Biol. 11: 651-662)와 같은 과실 숙성 시 활성화되는 과실-특이적 프로모터, ARSKl 및 US Patent Nos. 5,618,988, 5,837,848 및 5,905,186에 개시된 것과 같은 뿌리-특이적 프로모터, CUTl (Kunst et al. (1999) Biochem. Soc. Trans. 28: 651-654)를 포함하는 표피-특이적 프로모터, PTA29, PTA26 및 PTA13 (US Pat. No. 5,792,929)와 같은 꽃가루-활성 프로모터, 유관속조직에서 활성을 갖는 프로모터 (Ringli and Keller (1998) Plant MoI. Biol. 37: 977-988), 꽃-특이적 (Kaiser et al. (1995) Plant MoI. Biol. 28: 231-243), 꽃가루 (Baerson et al. (1994) Plant MoI. Biol. 26: 1947-1959), 심피(carpels) (OhI et al. (1990) Plant Cell 2: 837-848), 꽃가루와 배주(ovules) (Baerson etal. (1993) Plant MoI. Biol. 22: 255-267), 옥신(auxin)-유도성 프로모터 (van der Kop et al. (1999) Plant MoI. Biol. 39: 979-990 또는 Baumann et al. (1999) Plant Cell 11 : 323-334에 개시된 바와 같은), 사이토키닌(cytokinin)-유도성 프로모터 (Guevara-Garcia (1998) Plant MoI. Biol. 38: 743-753), 지베렐린(gibberellin)에 반응하는 프로모터 (Shi et al. (1998) Plant MoI. Biol. 38: 1053-1060, W[upsilon]lmott et al. (1998) Plant MoI. Biol. 38: 817-825) 및 그와 유사한 것. 추가적인 프로모터들은 열 (Ainley et al. (1993) Plant MoI. Biol. 22: 13-23), 빛 (예컨대, Kuhlemeier et al. (1989) Plant Cell 1: 471-478에 개시된 완두콩 rbcS-3A 프로모터, 및 Schaffher and Sheen (1991) Plant Cell 3: 997-1012에 개시된 옥수수 rbcS 프로모터); 상처 (예컨대, Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1: 961-968에 개시된, wunl), 병원체 (Buchel et al. (1999) Plant MoI. Biol.40: 387-396에 개시된 PR-1 프로모터 및 Manners et al. (1998) Plant MoI. Biol.38: 1071-1080에 개시된 PDFl.2 프로모터와 같은), 및 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate) 또는 살리실산(salicylic acid)과 같은 화학제 (Gatz (1997) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant MoI. Biol. 48: 89-108)에 반응하여 발현을 유도하는 것들이다. 또한, 상기 발현의 시기(timing)는 노화 (Gan and Amasino (1995) Science 270: 1986- 1988); 또는 늦은 종자발달(late seed development) (Odell et al. (1994) Plant Physiol. 106: 447-458)에 작용하는 것과 같은 프로모터를 이용함으로서 조절될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 또한 발현 카세트가 없는 경우에는, 예를 들어; T-DNA 활성 표지(T-DNA activation tagging)에 의해 유전자를 이소발현(ectopically expressing)시키는 방법(Ichikawa et al. (1997) Nature 390 698-701; Kakimoto et al. (1996) Science 21 A: 982-985)과 같은, 다른 방법에 의해 내재유전자(endogenous gene)의 활성 또는 발현 수준을 조작함으로서 식물에서 발현될 수 있다. 이러한 방법은 다중의 전사 인헨서(transcriptional enhancer)를 포함하는 유전자 태그(gene tag)로 식물을 형질전환하는 것을 수반하고 가끔은 상기 태그는 게놈에 삽입되어 플랭킹 유전자 코딩 서열(flanking gene coding sequence)의 발현이 하향조절 되게 한다. 다른 실시예에서, 식물에서 상기 전사 장치(transcriptional machinery)는 변형되어 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 전사 수준을 증가시킬 수 있다 (예를 들어, PCT Publications WO 96/06166 및 WO 98/53057에서 DNA-결합 모티프에서 특정 아미노산을 변화에 의한 징크 핑거 단백질(zinc finger proteins)의 DNA-결합 특이성의 변형을 개시한다).
또한 상기 유전자 도입 식물은 내재유전자에 의해, 예를 들어, 활성화된 상태로 폴리펩티드를 유지시키기 위해 폴리펩티드의 인산화 상태(phosphorylation state)를 변경하는 것에 의해, 코딩된 폴리펩티드의 활성을 발현 또는 변경시키는데 필요한 장치를 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 편입 및/또는 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 유전자 도입 식물 (또는 식물 세포, 또는 식물 절편(explants), 또는 식물 조직)은 상술한 바와 같이 잘 확립된 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다. 벡터의 구성물로서, 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 본 발명의, 가장 전형적인 발현 카세트, 예컨대 sPLA-2 단백질 또는 그 동등물(homolog)을 코딩하는 발현 카세트에 이어, 표준 기술은 관심 있는 식물, 식물 세포, 식물 절편 또는 식물 조직에 폴리뉴클레오티드를 도입하는데 사용될 수 있다. 선택적으로, 상기 식물 세포, 절편 또는 조직을 재생하여 유전자 도입 식물을 생산할 수 있다.
상기 식물은 겉씨식물(gymnosperm), 단자엽(monocotyledonous) 및 쌍자엽(dicotyledonous) 식물을 포함하여 어떠한 고등 식물일 수 있다. 적절한 프로토콜이 콩과(Leguminosae)(알팔파(alfalfa), 대두(soybean), 토끼풀(clover) 등), 미나리과(Umbelliferae)(당근(carrot), 샐러리(celery), 파스닙(parsnip)), 십자화과(Cruciferae)(양배추(cabbage), 무(radish), 유채(rapeseed), 브로콜리(broccoli) 등), 박과(Curcurbitaceae) (멜론(melons) 및 오이(cucumber)), 벼과(Gramineae) (밀, 옥수수, 쌀, 보리, 기장 등), 가지과(Solanaceae) (감자, 토마토, 담배, 고추(peppers) 등) 및 다른 다양한 농작물에 이용 가능하다. 이러한 프로토콜의 예들은 Ammirato et al. eds., (1984) Handbook of PlantCell Culture - Crop Species, Macmillan Publ. Co., New York NY; Shimamoto et al. (1989) Nature 338: 274-276; Fromm et al. (1990) Bio/Technol. 8: 833-839; 및 Vasil et al. (1990) Bio/Technol. 8: 429-434에 개시되어 있다.
단자엽 및 쌍자엽 식물 세포 모두의 형질전환 및 재생은 현재 보편화되어 있으므로, 가장 적절한 형질전환 기술의 선택은 당업자에 의해 선택된다. 상기 방법의 선택은 형질전환되는 식물의 타입에 따라 다르다; 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 주어진 식물 타입에 대한 특정 방법의 적절함을 알 수 있다. 적절한 방법들은 다음을 포함하나 이에 한정되지는 않는다: 식물 원형질체(protoplasts)의 전기천공; 리포솜-매개 형질전환; 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 매개 형질전환; 식물 세포의 유전자총(micro-projectile bombardment); 진공 침투(vacuum infiltration); 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)-매개[알파] 형질전환. 형질전환은 뉴클레오티드 서열의 안정된 또는 일시적인 발현을 유발하는 방법으로 식물에 상기 서열을 도입하는 것을 의미한다. 본 발명의 기술분야의 현재의 지식을 설명하는데 도움이 되는 클로닝된 서열로 형질전환에 의하여 식물 특성화의 변형의 성공적인 예들은, 본 명세서에 참조로서 편입되며, 다음을 포함한다: U.S. Patent Nos. 5,571,706; 5,677,175; 5,510,471; 5,750,386; 5,597,945; 5,589,615; 5,750,871; 5,268,526; 5,780,708; 5,538,880; 5,773,269; 5,736,369 및 5,610,042. 형질전환 후, 식물들은 바람직하게는 형질전환 벡터에 편입된 우성 선택성 마커(dominant selectable marker)를 이용하여 선택된다. 일반적으로, 이러한 마커는 비생물적 또는 제초제 저항성을 형질전환된 식물에 부여하며, 형질전환체의 선택은 식물을 적절한 농도의 비생물적 또는 제초제에 노출시킴으로서 완성될 수 있다.
형질전환된 식물이 선택되어 성체로 성장한 후, 변형된 특성을 나타내는 이러한 식물들을 확인한다. 상기 변형된 특성은 상술된 이러한 특성 중 어떤 것일 수 있다. 추가적으로, 상기 변형된 특성이 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 발현 수준 또는 활성에 있어서 변화에 기인한 것인지를 확인하는 것은 노던 블롯(Northern blots), RT-PCR 또는 마이크로어레이(microarrays)를 이용한 mRNA 발현, 또는 면역블롯(immunoblots) 또는 웨스턴블롯(Western blots)을 이용한 단백질 발현 또는 겔시프트 분석(gel shift assays)을 분석함으로서 결정될 수 있다.
본 발명의 상기 및 다른 목적, 특징 및 다른 이점들은 첨부한 도면과 함께 제시된 다음의 상세한 설명으로부터 더욱 명확하게 이해될 것이다;
도 1은 식물 형질전환에 사용된 벡터 pBIG-HYG의 유전자 맵을 나타낸다.
도 2는 재조합 sPLA2-a 단백질의 슈도모나스 시린개(Pseudomonase syringae pv tomato)에 대한 항-세균 활성을 나타낸다.
도 3은 재조합 sPLA2-a 단백질의 알터나리아 브라시시콜라(Alternaria brassicicola)에 대한 항-진균 활성을 나타낸다.
도 4는 재조합 sPLA2-b 단백질의 푸사룸 옥시스포룸(Fusarum oxysporum)에 대한 항-진균 활성을 나타낸다.
도 5는 sPLA2-b를 과생산하는 형질전환된 식물의 진균(Botrytis cinerea) 감염에 대한 강화된 저항성을 나타낸다.
도 6은 sPLA2-a를 과생산하는 형질전환된 식물의 세균 병원체인 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000)에 대한 강화된 저항성을 나타낸다.
도 7은 sPLA2-b를 과생산하는 형질전환된 담배 식물의 세균(Pseudomonas syringae pv. tabaci) 감염에 대한 강화된 저항성을 나타낸다.
도 8은 sPLA2-a를 과생산하는 형질전환된 아라비돕시스 식물의 세균 병원체인 에르비니아(Erwinia)에 대한 강화된 저항성을 나타낸다.
도 9는 sPLA2를 과생산하는 형질전환된 아라비돕시스 식물의 진균 병원체인 페로노스포라 파라시티카(Peronospora parasitica)에 대한 강화된 저항성을 나타낸다.
도 10은 sPLA2-a를 과생산하는 형질전환된 아라비돕시스 식물의 진균 병원체인 보트리티스 시네레아(Botrytis cynerea)에 대한 강화된 저항성을 나타낸다.
도 11은 sPLA2-b를 과생산하는 형질전환된 식물의 비생물(염) 스트레스에 대한 강화된 저항성 및 촉진된 회복능을 나타낸다.
도 12는 sPLA2-b를 과생산하는 형질전환된 식물의 강화된 조기 개화 능력을 나타낸다.
본 발명의 실질적이고 바람직한 구현예들은 이하 실시예에서 나타난 바와 같이 설명된다. 그러나, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는, 이러한 상세한 설명을 고려하여, 본 발명의 의도 및 범위 내에서 변경 및 개선을 할 수 있는 것으로 인정될 것이다.
본 발명자들은 서열번호 1-4에 나타난 아라비돕시스(Arabidopsis) sPLA2 단백질(sPLA2-a 및 sPLA2-b)을 코딩하는 2개의 cDNA 클론을 분리하고 이러한 cDNA를 35S 프로모터의 전사 조절 하에서 유전자 도입된 아라비돕시스 식물의 조직에서 sPLA2을 발현하는데 사용하였다. 본 발명자들은 sPLA2 발현하는 유전자 도입 아라비돕시스 식물을 처음으로 생화학적으로 특성화하여 상기 유전자 도입 식물이 매우 다른 기원의 서로 다른 비생물적 및 생물적 스트레스 조건에 대하여 현저하게 강화된 저항성을 갖는다는 것을 증명하였다.
실시예 1
아라비돕시스로부터 sPLA2 cDNA 의 클로닝
쿼리(query)로서 이전에 개시된 느릅나무(elm) PLA2(Stahl et al., 1998)의 N-말단 아미노산 서열을 이용하여, 본 발명자들은 아라비돕시스 생태형 콜롬비아(Col-0) 데이터베이스(AtDB Stanford University; http://genome.www.stanford.edu/Arabidopsis/)에서 관련된 서열을 확인하였다. YESTrp2 (Invitrogen, Carlsbad, CA)에 구성된 애기장대(Arabidopsis thaliana) cDNA 라이브러리는 김수영(Kumho Life and Environmental Science Laboratory, Gwangju, Korea)으로부터 입수하였다. 2개의 PLA2-특이적 올리고뉴클레오티드(5'-TCGCACTTCATTGATGCG-3' 및 5'-TCATAGCTCTGTTTTCATATCATTACCT-3')를 T3 및 T7 프로모터-특이적 프라이머와 조합으로 사용하여 cDNA 라이브러리로부터 부분 PLA2 서열을 분리하였다. PCR은 6 pmol의 각 프라이머 및 1 유닛의 ExTaq 중합효소(Pan Vera, Madison, WI)를 포함하였고 94℃에서 30초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 1분간의 35 사이클로 구성되었다. 증폭된 산물은 8%(w/v) 아가로즈 겔에서 분리하였고 pGEM-T (Promega)에서 dideoxy-Sanger 방법을 이용하여 시퀀싱하였으며 이는 DNA 중합효소에 의한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 신장(extension)에 기초한다. 아라비돕시스 sPLA2-a 및 sPLA2-b 유전자의 DNA 서열은 NCBI GenBank에 AY344842 및 AF541915로 기탁하였다.
실시예 2
유전자 도입 조직에서 이러한 단백질의 이소발현(Ectopic Expression)을 위한 아라비돕시스 식물에 sPLA2 cDNA의 도입
적용된 형질전환 기술은 Hinchee et al. "Plant Cell and Tissue Culture" pp. 231-270, eds. I. K. Vasil T. A Thorpe, Kluwer Academic Publisher 1994에 의해 검토된 아그로박테리움 유전자 전달 시스템(Agrobacterium gene delivery system)에 기초한다. 본 발명의 실시예에서, 본 발명자들은 CaMV 35S 프로모터의 조절 하에서 식물 형질전환 벡터 pBIG-HYG를 갖는 시스템을 사용하였다 (도 1). 상기 sPLA2-a(서열번호 1) 및 sPLA2-b(서열번호 3)의 PCR-증폭된 cDNA들은 CaMV 35S 프로모터 및 노팔린 합성효소 터미네이터(nopaline synthase terminator) 사이에 있는 바이너리 벡터 pBIC (a derivative of the binary vector pBI10, CLONTECH)의 XbaI 및 SacI 부위에 클로닝하여 재조합 바이너리 벡터 pBIG-HYG를 구성하였다 (도 1). 그렇게 구성된 바이너리 벡터는 아그로박테리움 균주에 넣었다. 다음으로 아라비돕시스(Col-0)의 꽃을 상기 아그로박테리움 세포와 공동 배양하고 하이그로마이신(hygromycin)-포함하는 배지에서 형질전환체를 선택하였다. T3 유전자 도입 호모라인(homolines)은 항생물질 하이그로마이신을 포함하는 배지에서 순차적 선택(sequential selection)에 의해 일차 형질전환체로부터 얻었으며 더욱 특성화 하였다.
실시예 3
sPLA2 의 재조합 단백질은 세균 및 진균에 대하여 항-미생물 활성을 갖는다.
이전에 개시된 바와 같이(Lee et al., 2005), BL21(DE3)PLys 세포에 제조된 재조합 PLA2α 단백질의 유리된 성숙형(free mature form)(3 μg)을, 10 mM CaCl2를 포함하는 100 μl의 Tris?HCl (50 mM, pH 8.0) 용액에 부유된 유해한 슈도모나스 시린개(Pseudomonase syringae pv tomato)(5×105 cfu ml-1) 또는 배양배지에 부유된 진균(Alternaria brassicicola)에 첨가하였다. 모의 대조군(mock control)은 PLA2α가 없는 용액에 부유된 세균으로 구성되었다. 도 2는 재조합 sPLA2-a 단백질의 슈도모나스 시린개에 대한 항-세균 활성을 나타낸다. 재조합 sPLA2-a 단백질은 배양 6시간 후 모의 대조군과 비교하여 유해한 세균(Pseudomonas syringae)의 수를 크게 감소시킨다. 도 3은 재조합 sPLA2-a 단백질의 알터나리아 브라시시콜라(Alternaria brassicicola)에 대한 항-진균 활성을 나타낸다. 재조합 sPLA2-a 단백질은 배양 72시간 후 모의 대조군과 비교하여 진균(Alternaria brassicicola)의 성장을 크게 저해하였다.
sPLA2-b의 재조합 단백질은 E. coli(BL21)에서 발현시켜 Lee et al (2003)에 개시된 융합 단백질-친화 크로마토그래피(fusion protein-affinity chromatography)로 정제하였다. 재조합 sPLA2-b 단백질(3 μg/100 μl)을 배양배지에 첨가하였을 때, 이들 단백질은 진균(Fusarum oxysporum)에 대해 강력한 항미생물 활성을 나타내었다.
[표 1]
Figure 112011092040056-pat00001

도 4는 재조합 sPLA2-b 단백질의 푸사룸 옥시스포럼(Fusarum oxysporum)에 대한 항-진균 활성을 나타낸다. 대조군(H20) 처리와 비교하여, sPLA2-b 단백질 처리는 72시간 후 진균류(Fusarum oxysporum)의 성장에서 유의한 감소를 초래하였다.
실시예 4
sPLA2 를 과생산하는 형질전환된 식물은 진균( Botrytis cinerea ) 감염에 대하여 강화된 저항성을 갖는다.
본 발명자들은 재조합 sPLA2 단백질이 강력한 항-미생물 활성을 가짐을 확인하였으므로, 미생물 감염에 대하여 sPLA2 유전자를 발현하는 형질전환된 식물의 강화된 저항성을 검토하였다. 첫째, 진균류 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea)로 유전자 도입 아라비돕시스 식물을 감염시켰다. 진균 부유 용액을 야생형 및 sPLA2-b로 형질전환된 식물의 잎에 접종하였다. 접종 4일 후, 잎 조직에서 괴사(necrotization)의 정도를 분석하였다.
[표 2]
Figure 112011092040056-pat00002

상기 데이터는 형질전환된 식물의 잎에서 괴사의 현저한 감소를 보여준다. 이러한 결과는 진균 감염에 의해 유발되는 손상에 대한 강화된 저항성을 보증한다. 도 5는 sPLA2-b를 과생산하는 형질전환된 식물의 진균(Botrytis cinerea) 감염에 대한 강화된 저항성을 나타낸다. sPLA2-b (S1-1)로 형질전환된 식물은 야생형(Col-0) 또는 RNAi-유전자 억제된(RNAi-silenced) 식물과 비교하여 잎에서 괴사의 현저한 감소를 나타내었다.
실시예 5
sPLA2 를 과생산하는 형질전환된 아라비돕시스 식물은 세균 병원체인 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000)에 대하여 강화된 저항성을 갖는다.
sPLA2-a 또는 sPLA2-b를 과발현하는 형질전환된 아라비돕시스 식물은 유해한 세균 병원체인 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000) 5×104 cfu/ml로 진공 침투(vacuum infilterate)시킨다. 침투 4일 후, 대조군과 형질전환된 식물 사이에서 세균 성장을 측정하고 비교하였다.
[표 3]
Figure 112011092040056-pat00003

도 6은 sPLA2-a를 과생산하는 형질전환된 식물의 세균 병원체인 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000)에 대한 강화된 저항성을 나타낸다. CaMV35S 프로모터(sPLA2-a OX)의 조절 하에서 sPLA2-a를 발현하는 상기 형질전환된 계열(lines)은 또한 세균 성장에서 현저한 감소를 나타내었다.
실시예 6
sPLA2 를 과생산하는 형질전환된 담배 식물은 세균( Pseudomonas syringae pv . tabaci) 감염에 대하여 강화된 저항성을 갖는다.
국부 형질전환된 식물을 만들기 위해, 5주령 담배 식물 잎을 sPLA2-b를 발현하는 바이너리 벡터 pBIC를 운반하는 아그로박테리움 투메파시엔스의 부유액(1×107 CFU/ml)으로 침투시켰다. 대조군 식물은 바이너리 벡터 pBIG 그 자체를 운반하는 아그로박테리움 투메파시엔스 부유액으로 침투시켰다. 상기 식물들은 온실에서 3일간 배양하였다. 다음으로, 국부 형질전환된 잎들은 일시적인 유전자 발현의 위치에서 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae pv. tabaci)(1×106 CFU/ml)를 포함하는 10 mM MgCl2로 접종하였다. 병원체 접종 5일 후 대조군과 sPLA2-b-과발현하는 잎 사이의 질병 증상을 비교하였다.
[표 4]
Figure 112011092040056-pat00004

상기 데이터는 sPLA2-b로 형질전환된 식물이 세균 감염에 의해 유발된 손상에 대하여 현저하게 강화된 저항성을 가짐을 증명한다. 도 7은 sPLA2-b를 과생산하는 형질전환된 담배 식물의 세균(Pseudomonas syringae pv. tabaci) 감염에 대한 강화된 저항성을 나타낸다. sPLA2-b가 일시적으로 발현되는 담배 식물은 벡터만으로 형질전환된 대조군과 비교하여 질병 증상(괴사)이 적게 나타났다.
실시예 7
sPLA2 -a를 과생산하는 형질전환된 아라비돕시스 식물은 세균 병원체인 에르비니아(Erwinia)에 대하여 강화된 저항성을 갖는다.
sPLA2-a를 과발현하는 형질전환된 아라비돕시스 식물은 유해한 세균 병원체인 에르비니아(Erwinia) 균주 (5×104 cfu/ml)로 진공 침투된다. 침투 4일 후, 대조군과 형질전환된 식물 사이에서 세균 성장을 측정하고 비교하였다. 도 8은 sPLA2-a를 과생산하는 형질전환된 아라비돕시스 식물의 세균 병원체인 에르비니아에 대한 강화된 저항을 나타낸다. sPLA2-a 유전자(sPLA2-a OX)를 발현하는 형질전환된 계열은 야생형(WS-O)과 비교하여 에르비니아 성장에서 현저한 감소를 나타내었다.
실시예 8
sPLA2 를 과생산하는 형질전환된 아라비돕시스 식물은 진균 병원체인 페로노스포라 파라시티카(Peronospora parasitica)에 대하여 강화된 저항성을 갖는다.
sPLA2-a 또는 sPLA2-b를 과발현하는 형질전환된 아라비돕시스 식물은 페로노스포라 파라시티카(Peronospora parasitica)의 부유물을 분사함으로서 감염된다. 감염 7일 후, 야생형(WT), 넉다운 돌연변히(KO; knockout mutant), 및 sPLA2 또는 sPLA2-b 과발현 식물(OX) 사이에서 진균 성장을 측정하여 비교하였다. 도 9는 sPLA2를 과생산하는 형질전환된 아라비돕시스 식물의 진균 병원체 페로노스포라 파라시티카에 대한 강화된 저항성을 나타낸다. sPLA2-a 또는 sPLA2-b 유전자(OX)를 발현하는 형질전환된 계열은 야생형(WT)과 비교하여 페로노스포라 파라시티카의 감염 7일 후 훨씬 더 낮은 비율의 포자낭병(sporangiophores)을 나타내었다. 괄호( )는 포자낭병/자엽(sporangiophores/cotyledon)의 평균수를 나타낸다. 자엽 당 포자낭병의 평균수는 야생형 식물의 약 20과 비교하여 유전자 도입 식물에서는 약 7이다.
실시예 9
sPLA2 -a를 과생산하는 형질전환된 아라비돕시스 식물은 진균 병원체인 보트리티스 시네레아(Botrytis cynerea)에 대하여 강화된 저항성을 갖는다.
sPLA2-a를 과발현하는 형질전환된 아라비돕시스 식물은 보트리티스 시네레아(Botrytis cynerea)의 부유물을 분사함으로서 감염된다. 감염 7-14일 후, 야생형(WT), 넉다운 돌연변이(KO) 및 sPLA2-a 과발현 식물(OX) 사이에서 진균 감염에 의해 부패된 잎들을 측정하고 비교하였다. 도 10은 sPLA2-a를 과생산하는 형질전환된 아라비돕시스 식물의 진균 병원체인 보트리티스 시네레아에 대한 강화된 저항성을 나타낸다. sPLA2-a 유전자(OX)를 발현하는 상기 형질전환된 계열은 야생형(WT) 및 넉다운 돌연변이(KO)와 비교하여 보트리티스 시네레아의 감염 7-14일 후 훨씬 낮은 부패 비율을 보였다.
실시예 10
sPLA2 를 과생산하는 형질전환된 식물은 비생물적 (염) 스트레스에 대한 강화된 저항성 및 촉진된 회복능을 갖는다.
sPLA2-b를 과발현하는 유전자 도입 아라비돕시스 식물을 20 mM NaCl을 포함하는 1×MS 배지에서 7일간 성장시켰다. 다음으로 상기 식물을 통상의 1×MS 배지에 옮겨 상기 식물이 염 스트레스(salt stress) 손상으로부터 회복하게 하고 12일간 더 성장시켰다.
[표 5]
Figure 112011092040056-pat00005

상기 데이터는 sPLA2-b를 과발현하는 유전자 도입 식물이 염 스트레스에 대한 상당히 강화된 저항성 뿐 아니라 정상 성장 조건으로 복귀 후 유의하게 강화된 회복 능력을 가짐을 증명한다. 도 11은 비생물적(염) 스트레스에 대한 강화된 저항성 및 sPLA2-b를 과생산하는 형질전환된 식물의 촉진된 회복능(accelerated recovery)을 나타낸다. sPLA-b 유전자(OX)를 발현하는 상기 형질전환된 계열은 야생형(WT)과 비교하여 염이 없는 배지에 옮겨지면 염 스트레스(200 mM NaCl)에 대하여 더 저항성을 나타내며 손상으로부터 더 나은 회복능을 나타냈다.
실시예 11
sPLA2 -b를 과생산하는 형질전환된 식물은 강화된 조기 개화 능력을 갖는다.
sPLA2-b를 과발현하는 유전자 도입 아라비돕시스 식물을 12시간 낮(light)(90 μE/m/s), 12시간 밤(dark) 사이클로 프로그램된 22℃의 성장실(growth rooms)에서 혼합 흙(vermiculite:perlite:peat 2:1:1 v/v/v)에서 성장시켰다. 상기 유전자 도입 식물의 개화시기를 Col-0 야생형 식물과 비교하였다.
[표 6]
Figure 112011092040056-pat00006

상기 데이터는 PLA2-b를 과발현하는 유전자 도입 식물이 현저히 강화된 조기 개화 능력을 가짐을 증명한다. 도 12는 sPLA2-b를 과생산하는 형질전환된 식물의 강화된 조기 개화 능력을 나타낸다. sPLA2-b 유전자(OX)를 발현하는 상기 형질전환된 계열은 야생형(WT)와 비교하여 더 빠른 개화를 나타내었다.
본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 상기 상세한 설명에 나타난 발명의 개념 및 구체적인 구현예가 본 발명의 동일한 목적을 수행하기 위해 변형 또는 또 다른 구현예를 디자인하는 기초로서 용이하게 사용될 수 있음을 알 수 있다. 또한 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 이러한 동등한 구현예가 첨부된 특허청구범위에서 설명되는 것으로서 본 발명의 개념 및 범위에서 벗어나지 않음을 알 수 있다.
본 발명은 분비성 포스포리파아제 A2 단백질(예컨대, sPLA2-a 또는 sPLA2-b)을 과생산(overproducing)하고 광범위한 비생물적(예컨대, 삼투압 스트레스) 또는 생물적(예컨대, 세균 또는 진균 감염) 스트레스 조건에 대하여 강화된 저항성을 가질 뿐만 아니라 조기 개화(early flowering)를 유도하는 식물, 특히 유전자 도입 식물, 식물 일부 및 식물 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 분비성 포스포리파아제 A2 또는 그 기능적 이소폼(isoforms)을 코딩하는 핵산 서열들, 및 비생물적 및 생물적 스트레스 조건에 대한 저항성을 식물에 부여하는 이러한 서열들의 용도를 포함한다. 본 발명은 폭넓고 다양한 병원체 감염 및 스트레스 조건에 의한 농작물 피해를 완화시키고 개화시기를 빠르게 하는데 유용하다.
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Claims (12)

  1. 하기 단계들을 포함하는 비생물적 및 생물적 스트레스에 대하여 저항성을 갖는 유전자 도입 식물을 제조하는 방법:
    (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 sPLA2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터로 목적 식물을 형질전환 시키는 단계로서; 상기 발현벡터는 상기 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 조절인자(regulatory element)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단계; 및
    (b) 형질전환되지 않은 야생형 식물 보다 비생물적 및 생물적 스트레스에 더 저항성을 갖는 유전자 도입 식물을 선택하는 단계.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 유전자 도입 식물은 적어도 하나의 진균병(fungal disease)에 대하여 저항성인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 유전자 도입 식물은 푸자리움(Fusarium), 페로노스포라(Peronospora), 알터나리아(Alternaria) 또는 보트리티스(Botrytis) 속에 대하여 저항성인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 유전자 도입 식물은 하나 이상의 세균 병원체 또는 질병에 대하여 저항성인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 유전자 도입 식물은 슈도모나스(Pseudomonas) 또는 에르비니아 (Erwinia) 속에 대하여 저항성인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 유전자 도입 식물은 고염-유도성 삼투압 스트레스(high salt-induced osmotic stress)에 대하여 더 내성인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 발현 벡터는 도 1에 도시된 바와 같은 CaMV 35 프로모터의 조절 하에 있는 pBIG-HYG 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 하기 단계들을 포함하는 비생물적 및 생물적 스트레스에 대하여 식물의 저항성을 증가시키는 방법:
    (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 sPLA2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터로 목적 식물을 형질전환 시키는 단계로서; 상기 발현벡터는 상기 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 조절인자(regulatory element)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단계; 및
    (b) 형질전환되지 않은 야생형 식물 보다 비생물적 및 생물적 스트레스에 더 저항성인 유전자 도입 식물을 선택하는 단계.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 sPLA2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 함유하는, 식물의 비생물적 및 생물적 스트레스에 대한 저항성 증가용 조성물.
  12. 삭제
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