KR101182758B1

KR101182758B1 - Method for differentiating neural stem cell using agarose gel

Info

Publication number: KR101182758B1
Application number: KR1020120006385A
Authority: KR
Inventors: 최용문; 박규희; 남연주
Original assignee: 재단법인 경기과학기술진흥원
Priority date: 2012-01-19
Filing date: 2012-01-19
Publication date: 2012-09-14

Abstract

PURPOSE: A method for proliferation and differentiation of neural stem cells is provided to form neural groove and to enhance selective differentiation and proliferation of the neural stem cells. CONSTITUTION: A method for differentiating neural stem cells to nerve cells comprises a step of culturing the neural stem cells in a culture dish coated with agarose gel. The concentration of the agarose gel is 1.5%(w/v). The culture dish is DMEM/F12/Glutamax medium. The inoculation concentration of the neural stem cells is 0.5x10^5/mL to 5x10^5/mL. The neural stem cells are derived from rodent embryo.

Description

Differentiation method of neural stem cells using agarose gel {METHOD FOR DIFFERENTIATING NEURAL STEM CELL USING AGAROSE GEL}

본 발명은 신경전구세포의 증식과 분화 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 아가로스 겔이 코팅된 배양접시에서 신경줄기세포를 신경구(neurosphere)의 형태로 배양함으로써 높은 효율로 신경세포의 분화를 유도하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method of proliferation and differentiation of neural progenitor cells. More specifically, the present invention relates to a method of inducing differentiation of neurons with high efficiency by culturing neural stem cells in the form of neurospheres in agarose gel-coated culture dishes.

최근에 신경재생이 필요한 중추신경계 질환에 대해 줄기세포를 이용한 세포치료법을 적용하려는 연구가 많이 진행되고 있다. 즉, 배아줄기세포, 역분화줄기세포, 성체줄기세포 또는 신경줄기세포를 특정 신경전구세포로 분화시켜 이를 손상된 조직에 이식함으로써, 손상된 중추신경계의 기능을 회복시키는 가능성을 연구하는 것이다.Recently, many studies have been conducted to apply cell therapy using stem cells to central nervous system diseases that require neuronal regeneration. In other words, embryonic stem cells, dedifferentiated stem cells, adult stem cells, or neural stem cells to study the possibility of restoring the function of the damaged central nervous system by differentiating them into specific neural precursor cells and transplanting them into damaged tissues.

신경줄기세포는 미분화된 상태로 자가 갱신(self renewal)하는 능력과 신경계에 존재하는 신경세포(neuron), 성상세포(astrocyte), 핍지교세포(oligodendrocyte) 등으로 분화할 수 있는 다분화 능력을 동시에 갖춘 미분화 세포이다. 이러한 신경줄기세포는 태아의 초기발생단계(fetus)의 중추신경계에 존재하는 것으로 보고되고 있으며, 또한 성체에서도 뇌실하 영역(Subventricular zone) 및 해마(Hippocampus)에 신경줄기세포가 존재하는 것으로 보고되고 있다(Gage, F. H., Science 287:1433-1438, 2000). 신경줄기세포는 신경전구세포와 글리아(성상세포 및 핍지교세포) 전구세포의 단계를 거쳐 최종적으로 신경계를 구성하는 신경세포, 성상세포/핍지교세포 등으로 분화된다. 설치류의 경우, 배아 발생 18일 이전까지 신경줄기세포는 대부분 신경세포로 분화되는 반면, 배아 발생 18일 이후부터 신경줄기세포는 주로 성상세포와 핍지교세포로 분화된다고 보고되고 있다.Neural stem cells have the ability to self-renewal in an undifferentiated state and to differentiate into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes in the nervous system. Undifferentiated cells. These neural stem cells are reported to exist in the central nervous system of the fetus's early developmental stage (fetus), and it is also reported that neural stem cells exist in the subventricular zone and hippocampus in adults (Gage , FH, Science 287: 1433-1438, 2000). Neural stem cells are differentiated into neural cells, astrocytic cells / oligodendrocytes, etc., which finally form the nervous system through the stages of neural progenitor cells and glia (astrocytic and oligodendrocyte) progenitor cells. In rodents, neural stem cells are mostly differentiated into neural cells until 18 days before embryonic development, whereas neural stem cells are mainly differentiated into astrocytes and oligodendrocytes after 18 days of embryonic development.

신경줄기세포를 중추신경계 질환을 치료하는데 이용하기 위해서는 신경줄기세포의 분화유도기술이 우선 정립되어야 한다. 그 이유는, 손상된 신경조직에 이식된 신경줄기세포가 손상된 신경세포를 기능적으로 대체할 수 있기 위해서는 신경줄기세포가 적합한 기능을 가진 세포로 분화되어야 하기 때문이다. 시험관 또는 이식된 조직 내에서 신경줄기세포는 대부분 성상세포로 분화되거나 미분화된 상태로 남아 있고, 신경세포로의 자발적인 분화는 극히 제한적인 것으로 알려졌다. 이와 관련하여, 신경줄기세포로부터 신경세포를 분화시키는 수많은 배양 조건이 연구되고 있다. 대부분의 상기 배양 조건은 화합물의 조합물 또는 신경세포의 성장인자인 단백질을 사용하여 신경줄기세포로부터 신경세포의 분화를 유도하는 방법이다. 예를 들어, TSA(히스톤 데아세틸라제 억제제), 레티노산, 발프로산 나트륨(항전간제), BDNF(뇌유래신경영양인자) 등이 알려져 있다(Balasubramaniyan, V., et al., Neuroscience 143: 939-951, 2006).In order to use neural stem cells to treat central nervous system diseases, techniques for inducing differentiation of neural stem cells must first be established. The reason is that neural stem cells must be differentiated into cells with suitable functions in order for the neural stem cells transplanted into the damaged neural tissues to replace functionally damaged nerve cells. In vitro or transplanted tissue, neural stem cells are mostly differentiated or undifferentiated into astrocytic cells, and spontaneous differentiation into neurons is known to be extremely limited. In this regard, numerous culture conditions for differentiating neurons from neural stem cells have been studied. Most of the above culture conditions are methods of inducing differentiation of neurons from neural stem cells using a combination of compounds or proteins which are growth factors for neurons. For example, TSA (histone deacetylase inhibitors), retinoic acid, sodium valproate (anti-intermediate), BDNF (brain-derived quantum factor) and the like are known (Balasubramaniyan, V., et al., Neuroscience 143: 939). -951, 2006).

이에, 본 발명자들은 신경줄기세포로부터 신경세포의 분화를 조절하는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 아가로스 겔이 코팅된 배양접시에서 배양된 신경줄기세포가 높은 효율로 신경세포로 자발적인 분화가 이루어진다는 점을 확인하였으며, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have made diligent efforts to develop a method for regulating the differentiation of neurons from neural stem cells. As a result, the neural stem cells cultured in an agarose gel-coated culture dish are spontaneously differentiated into neural cells with high efficiency. It was confirmed that, based on this, the present invention was completed.

본 발명의 목적은 신경줄기세포의 선택적 분화율을 향상시키고 신경전구세포의 증식율을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a method for improving the selective differentiation rate of neural stem cells and increasing the proliferation rate of neural progenitor cells.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 분화 방법은 아가로스 겔이 코팅된 배양접시에서 신경줄기세포를 분화시키는 것을 특징으로 한다.In order to achieve the above object, the differentiation method of the present invention is characterized by differentiating neural stem cells in agarose gel-coated culture dish.

바람직한 일구현예에서, 상기 아가로스 겔의 농도는 0.5%(w/v) 이상, 더 바람직하게는 1.0%(w/v) 이상, 더욱더 바람직하게는 1.5%(w/v) 이상이다.In a preferred embodiment, the concentration of the agarose gel is at least 0.5% (w / v), more preferably at least 1.0% (w / v), even more preferably at least 1.5% (w / v).

또다른 바람직한 일구현예에서, 상기 아가로스 겔이 코팅된 배양접시에서 DMEM/F12/Glutamax 배지가 사용된다. 특히, B27 및 N2가 보충된 DMEM/F12/Glutamax 배지가 사용된다.In another preferred embodiment, DMEM / F12 / Glutamax medium is used in the agarose gel coated culture dish. In particular, DMEM / F12 / Glutamax medium supplemented with B27 and N2 is used.

또다른 바람직한 일구현예에서, 상기 신경줄기세포의 농도는 0.5x10⁵개/mL 내지 5x10⁵개/mL, 더 바람직하게는 1.0x10⁵개/mL 내지 5x10⁵개/mL, 더욱더 바람직하게는 2.5x10⁵개/mL 내지 5x10⁵개/mL이다.In another preferred embodiment, the concentration of the neural stem cells 0.5x10 ⁵ gae / mL to 5x10 ⁵ gae / mL, further preferably 1.0x10 ⁵ gae / mL to 5x10 ⁵ gae / mL, still more preferably 2.5x10 ⁵ pieces / mL to 5x10 ⁵ pieces / mL.

또다른 바람직한 일구현예에서, 상기 신경줄기세포는 설치류의 배아로부터 유래된 것이다. 다만, 이에 한정되는 것은 아니고, 상기 신경줄기세포는 예를 들어 인간으로부터 유래된 것을 사용할 수도 있다.In another preferred embodiment, the neural stem cells are derived from rodent embryos. However, the present invention is not limited thereto, and the neural stem cells may be, for example, those derived from humans.

본 발명에 따른 분화방법에서, 상기 신경줄기세포는 신경구를 형성한다. 상기 신경구는 신경전구세포를 포함하며, 상기 신경전구세포는 신경세포로 분화된다.In the differentiation method according to the present invention, the neural stem cells form neurospheres. The neurospheres comprise neuroprogenitor cells, which are differentiated into neurons.

본 발명에서 "한천"과 "아가로스 겔"이라는 용어는 동일한 의미를 나타내는 것으로서 상호교환적으로 사용된다.In the present invention, the terms "agar" and "agarose gel" are used interchangeably as indicating the same meaning.

본 발명에 대해서는 하기의 실시예와 첨부된 도면에 기초하여 보다 상세하게 설명될 것이지만, 이는 본 발명의 권리범위를 제한하려는 것이 아니다. 또한, 당업계에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 취지를 해하지 않는 범위내에서 다양한 변형 및 수정을 가할 수 있을 것이다.The present invention will be described in more detail based on the following examples and the accompanying drawings, which are not intended to limit the scope of the invention. In addition, those skilled in the art will be able to add various modifications and modifications without departing from the spirit of the present invention.

본 발명에 따라 신경줄기세포를 배양할 경우 형성되는 신경구는 매우 높은 수준으로 신경전구세포를 포함한다. 이와 같이 신경구를 형성하는 대부분의 신경줄기세포가 글리아 전구세포로 분화되지 않고 신경전구세포로 선택적으로 분화될 수 있으므로, 중추신경계 질환 치료와 같은 다양한 분야에서 필요시되는 신경세포의 수요를 저렴한 비용과 간단한 과정에 의해 충족시킬 수 있다.Neurospheres formed when the neural stem cells are cultured according to the present invention include neuroprogenitor cells at very high levels. Since most neural stem cells that form neurospheres can be selectively differentiated into neural progenitor cells rather than into glia progenitor cells, the neural cells that are needed in various fields, such as the treatment of central nervous system diseases, can be used at low cost. It can be satisfied by a simple process.

도 1은 신경구를 형성하기 위한 배양접시의 준비 및 분화과정을 모식적으로 보여준다.
도 2a는 아가로스 겔이 코팅된 배양접시에서 단일세포의 농도에 따른 신경구의 형성 정도를 비교한 것이다.
도 2b는 아가로스 겔과 히드로겔이 각각 코팅된 배양접시에서 형성된 신경구를 비교한 것이다.
도 3은 아가로스 겔과 히드로겔이 각각 코팅된 배양접시에서 형성된 신경구로부터 신경세포의 분화를 확인할 수 있는 현미경사진이다. 여기에서, 신경세포는 β-III 튜불린에 의해 녹색으로 면역염색되었으며, 성상세포는 GFAP에 의해 적색으로 면역염색되었다.
도 4는 신경줄기세포로부터 신경구가 형성되는 과정을 모식적으로 보여주며, 또한 신경줄기세포로부터 신경전구세포와 글리아전구세포로 분화되는 과정을 모식적으로 보여준다.
도 5는 아가로스 겔과 히드로겔이 각각 코팅된 배양접시에 형성된 신경구로부터 전체 RNA를 추출한 후 Nestin, Ngn1 및 GAPDH 유전자의 발현양을 RT-PCR에 의해 분석한 결과를 나타낸다. 여기서, A는 아가로스 겔을 나타내고, H는 히드로겔을 나타낸다.
도 6a는 아가로스 겔의 농도차에 따른 신경구 형성과 신경세포 분화율을 분석하기 위하여, 다른 농도의 아가로스 겔을 각각 배양접시에 코팅하고 신경구의 형성을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 6b는 도 6a에서 수득된 신경구에서 전체 RNA를 추출한 후 Nestin, Ngn1 및 GAPDH 유전자의 발현양을 RT-PCR에 의해 분석한 결과를 나타낸다. 여기서, A는 아가로스 겔을 나타내고, H는 히드로겔을 나타낸다.
도 7a는 다른 배지 조건, 즉 B27/N2/DMEM/F12/Glutamax 배지와STEMPRO/DMEM/F12/Glutamax 배지 조건하에서 신경구의 형성율을 비교한 현미경사진이다.
도 7b는 도 7a에서 수득된 신경구에서 전체 RNA를 추출한 후 Nestin, Ngn1 및 GAPDH 유전자의 발현양을 RT-PCR에 의해 분석한 결과를 나타낸다. 여기서, A는 아가로스 겔을 나타내고, H는 히드로겔을 나타내고, S는 STEMPRO를 나타내고, B는 B27/N2를 나타낸다.Figure 1 schematically shows the preparation and differentiation of the culture dish to form neurospheres.
Figure 2a compares the formation of neurospheres according to the concentration of single cells in agarose gel-coated culture dish.
Figure 2b is a comparison of neurospheres formed in the culture dish coated with agarose gel and hydrogel, respectively.
Figure 3 is a micrograph that can confirm the differentiation of nerve cells from neurospheres formed in agarose gel and hydrogel coated culture dish, respectively. Here, neurons were immunostained green by β-III tubulin and astrocytes were immunostained red by GFAP.
4 schematically shows the process of forming neurospheres from neural stem cells, and also shows the process of differentiation from neural stem cells into neural progenitor cells and glia precursor cells.
Figure 5 shows the results of analyzing the expression of Nestin, Ngn1 and GAPDH genes by RT-PCR after extracting the total RNA from the neurospheres formed in the culture plate coated with agarose gel and hydrogel, respectively. Where A represents agarose gel and H represents hydrogel.
FIG. 6A shows the results of observing neurosphere formation by coating different concentrations of agarose gel in a culture dish to analyze neurosphere formation and neuronal differentiation rate according to the concentration difference of agarose gel.
Figure 6b shows the results of analyzing the expression of Nestin, Ngn1 and GAPDH genes by RT-PCR after extracting the total RNA from the neurosphere obtained in Figure 6a. Where A represents agarose gel and H represents hydrogel.
FIG. 7A is a micrograph comparing the formation of neurospheres under different media conditions, ie, B27 / N2 / DMEM / F12 / Glutamax medium and STEMPRO / DMEM / F12 / Glutamax medium.
Figure 7b shows the result of analyzing the expression of Nestin, Ngn1 and GAPDH genes by RT-PCR after extracting the total RNA from the neurosphere obtained in Figure 7a. Here, A represents agarose gel, H represents hydrogel, S represents STEMPRO, and B represents B27 / N2.

실시예 1: 아가로스 겔이 코팅된 배양접시에서 신경구의 형성Example 1 Formation of Neurospheres in an Agarose Gel-Coated Culture Dish

1-1. 아가로스 겔이 코팅된 배양접시의 제작1-1. Preparation of Agarose Gel-coated Culture Dish

한천 파우더를 물에 현탁시킨 후, 온도 121℃ 및 압력 15lbs의 조건하에 이를 20분 동안 멸균하면서 완전히 용해시켰다. 그 후, 상기 용액을 같은 부피의 Dulbecco's Modified Eagle's Medium/F12(DMEM/F12) 배지에 희석한 후, 직경이 10cm인 플라스틱 배양접시에 10mL를 부었으며, 자외선이 켜진 생물안전대(Biosafety cabinet)에서 완전히 고형화시켰다. 고체 상태의 아가로스 겔이 바닥에 도포된 배양접시에 DMEM/F12 10mL를 첨가하여, 37℃의 5% CO₂ 인큐베이터에서 하루 정도를 보관하였다.
The agar powder was suspended in water and then completely dissolved under sterilization for 20 minutes under conditions of temperature 121 ° C. and pressure 15 lbs. The solution was then diluted in the same volume of Dulbecco's Modified Eagle's Medium / F12 (DMEM / F12) medium, then poured 10 mL into a 10 cm diameter plastic culture dish and completely in a UV-lit Biosafety cabinet. Solidified. 10 mL of DMEM / F12 was added to the culture dish coated with the solid agarose gel at the bottom, and stored for about one day in a 5% CO ₂ incubator at 37 ° C.

1-2. 신경줄기세포의 배양 및 신경구의 형성1-2. Culture of Neural Stem Cells and Formation of Neurospheres

임신한지 18일째의 SD 래트의 배아에서 전뇌 피질(forebrain cortex)을 별도로 분리하여 HBSS 용액으로 세척하였다. 그 후, 2% B27, 1% N2, 1mM Glutamax가 첨가된 DMEM/F12 배지에서 물리적인 방법(즉, 1mL 피펫으로 피펫팅을 20회 반복함)에 의해 신경조직을 파쇄하였다. 부유된 세포 2mL를 약 5분 동안 15mL 튜브에 방치하였으며, 40μm 나일론 여과기로 상등액 1mL를 여과시켜 단일 세포(single cell suspension)들을 획득하였다. 상기 세포를 2% B27, 1% N2, 1mM Glutamax, 20ng/mL EGF, 20ng/mL FGF가 첨가된 DMEM/F12 10mL에 부유시켜, 37℃의 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다.Forebrain cortex was isolated from embryos of SD rats on day 18 of pregnancy and washed with HBSS solution. Neural tissues were then disrupted by physical methods (ie, pipetting 20 times in 1 mL pipette) in DMEM / F12 medium supplemented with 2% B27, 1% N2, 1 mM Glutamax. 2 mL of suspended cells were left in a 15 mL tube for about 5 minutes and 1 mL of the supernatant was filtered with a 40 μm nylon filter to obtain single cell suspensions. The cells were suspended in 10 mL of DMEM / F12 supplemented with 2% B27, 1% N2, 1 mM Glutamax, 20 ng / mL EGF, 20 ng / mL FGF and incubated in a 37% 5% CO ₂ incubator.

대조군으로 사용한 배양접시는 Corning사에서 구입한 것으로서, 이는 바닥이 히드로겔(hydrogel)로 코팅되어 있기 때문에 신경줄기세포가 신경구를 형성할 때 배양접시 표면에 부착되지 못하게 하는 특징을 갖고 있다(도 1).The culture dish used as a control was purchased from Corning, which has a feature of preventing the neural stem cells from attaching to the surface of the culture dish when forming a neurosphere because the bottom is coated with a hydrogel (FIG. 1). .

분리된 단일 세포로부터 신경구를 형성할 때 접종시킨 세포의 농도는 각각 0.5x10⁵개/mL, 1x10⁵개/mL, 2.5x10⁵개/mL, 5x10⁵개/mL이다.When forming a singyeonggu from the separated single cells the concentration of the inoculated cells are each 0.5x10 ⁵ gae / mL, 1x10 ⁵ gae / mL, 2.5x10 ⁵ gae / mL, 5x10 ⁵ gae / mL.

신경구를 형성하기 위한 세포를 접종시킨 후 5일 동안 배양하였으며, 이를 세포분화 실험 또는 RT-PCR 실험에 사용하였다.Cells were seeded for inoculation to form neurospheres and cultured for 5 days, and used for cell differentiation experiments or RT-PCR experiments.

접종된 세포의 농도 차이에 따른 신경구의 형성을 관찰한 결과에 따르면, 2.5x10⁵개/mL의 농도로 배양된 조건에서 신경구가 가장 많이 생성되었으며, 2.5x10⁵개/mL보다 낮은 농도 또는 높은 농도에서는 상대적으로 적은 수의 신경구가 형성되었음을 확인하였다. 따라서, 신경구를 형성하는데 가장 적합한 세포의 농도는 약 2.5x10⁵개/mL인 것으로 나타난다(도 2).
According to the observation of the singyeonggu formed according to the concentration difference between the inoculated cells results, 2.5x10 ⁵ pieces / under the conditions of the culture to a concentration mL it was singyeonggu is generated most frequently, 2.5x10 ⁵ pieces / mL or higher concentration than the low concentration Esau confirmed that a relatively small number of neurospheres were formed. Thus, the concentration of cells most suitable for forming neurospheres appears to be about 2.5 × 10 ⁵ cells / mL (FIG. 2).

실시예 2. 신경구의 분화Example 2. Differentiation of Neurospheres

2-1. 자발적인 분화 유도2-1. Induced Spontaneous Differentiation

상기 실시예 1에서 형성된 신경구를 HBSS 용액으로 세척한 후, 2% B27, 1% N2, 1mM Glutamax가 첨가된 DMEM/F12 배지에서 물리적인 방법(즉, 1mL 피펫으로 피펫팅을 30회 반복함)에 의해 파쇄하였다. 분리된 단일세포를 원심분리에 의해 침전시킨 후, 2% B27, 1% N2, 1mM Glutamax가 첨가된 DMEM/F12 배지에서 5000개/90L의 세포농도로 희석하였으며, 폴리-D-리신이 코팅된 384-웰 플레이트에 분주하였다. 약 72시간 동안 배양한 후, 분화된 신경세포와 성상세포를 면역염색법에 의해 확인하였다.
After washing the neurospheres formed in Example 1 with HBSS solution, the physical method in the DMEM / F12 medium to which 2% B27, 1% N2, 1mM Glutamax was added (ie, repeated pipetting 30 times with 1mL pipette) By crushing. The isolated single cells were precipitated by centrifugation and then diluted to 5000/90 L cell concentration in DMEM / F12 medium supplemented with 2% B27, 1% N2, 1 mM Glutamax, and coated with poly-D-lysine. Dispense into 384-well plates. After incubation for about 72 hours, differentiated neurons and astrocytes were identified by immunostaining.

2-2. 면역염색분석2-2. Immunostaining Assay

384-웰 플레이트에 부착된 세포를 3.7% 파라포름알데히드가 포함된 PBS 용액으로 37℃의 인큐베이터에서 20분 동안 고정하고, PBS로 세척하였다. 0.25% Triton X-100이 포함된 PBS 용액으로 상온에서 10분 동안 처리하고, 다시 PBS로 세척한 후, 10% BSA 용액을 첨가하여 37℃의 인큐베이터에서 30분 동안 반응시켰다. 5% BSA 용액으로 희석시킨 1차 항체(β-III 튜불린 항체와 GFAP 항체)를 384-웰 플레이트에 첨가하였으며, 37℃의 인큐베이터에서 90분 동안 반응시키고 다시 세척 단계를 수행한 후, 5% BSA 용액으로 희석시킨 2차 항체(Anti-mouse Alexa Fluor 488, anti-rabbit Alexa Fluor 594, Invitrogen사)를 첨가하였다. 이러한 384-웰 플레이트를 37℃의 인큐베이터에서 60분 동안 반응시킨 후, DAPI를 사용하여 염색시킨 세포를 공초점 현미경에 의해 관찰하였다.Cells attached to 384-well plates were fixed in an incubator at 37 ° C. with PBS solution containing 3.7% paraformaldehyde for 20 minutes and washed with PBS. After treatment with PBS solution containing 0.25% Triton X-100 for 10 minutes at room temperature, washed with PBS again, 10% BSA solution was added and reacted for 30 minutes in an incubator at 37 ℃. Primary antibodies (β-III tubulin antibody and GFAP antibody) diluted with 5% BSA solution were added to 384-well plates, reacted in an incubator at 37 ° C. for 90 minutes, followed by a wash step, and then 5% A secondary antibody (Anti-mouse Alexa Fluor 488, anti-rabbit Alexa Fluor 594, Invitrogen) diluted with BSA solution was added. These 384-well plates were reacted in an incubator at 37 ° C. for 60 minutes, and then the cells stained with DAPI were observed by confocal microscopy.

일반적인 플라스틱 배양접시에서 신경줄기세포를 FGF(섬유아세포성장인자) 및 EGF(상피세포성장인자)를 포함하는 배지에서 배양하여 신경구를 형성한 후 상기 2개의 성장인자 FGF 및 EGF를 제거하게 되면, 신경줄기세포는 자발적으로 성상세포, 신경세포, 희소돌기아교세포 등으로 분화한다. 이 때 분화되는 비율은 성상세포:신경세포:희소돌기아교세포의 순으로 25:5:1이다(Schwarz, S. C. and Schwarz, J., Translational Research 156: 155-160, 2010). 즉, 신경줄기세포는 대부분 성상세포로 분화하고, 신경세포로 분화되는 경우는 극히 제한적이다.In a general plastic dish, the neural stem cells are cultured in a medium containing FGF (fibroblast growth factor) and EGF (epithelial growth factor) to form neurospheres, and then the two growth factors FGF and EGF are removed. Spontaneously differentiate into astrocytes, neurons, and oligodendrocytes. At this time, the ratio of differentiation is 25: 5: 1 in the order of astrocytes: nerve cells: oligodendrocytes (Schwarz, S. C. and Schwarz, J., Translational Research 156: 155-160, 2010). In other words, neural stem cells are mostly differentiated into astrocytic cells, and the differentiation into neural cells is extremely limited.

아가로스 겔과 히드로겔이 코팅된 배양접시에서 각각 형성된 신경구로부터 신경세포로 분화되는 정도를 확인하기 위하여, 신경세포에 존재하는 β-III 튜불린과 성상세포에 존재하는 GFAP를 면역염색하였다. 면역염색한 결과, 도 3에서 신경세포는 녹색으로 나타난 반면, 성상세포는 적색으로 나타났다. 1.6% 아가로스 겔이 코팅된 배양접시에서 형성된 신경구로부터 신경세포의 분화율은 약 95% 이상이었으며, 이는 대조군(히드로겔이 코팅된 배양접시에서 형성된 신경구)에서 10% 미만으로 나타난 분화율보다 현저하게 높다는 것을 알 수 있다. 상기 대조군에서는 대부분의 신경구들이 성상세포로 분화되었다(도 3).
In order to determine the degree of differentiation of neurons from neurospheres formed in agarose gel and hydrogel coated culture dishes, β-III tubulin and neuron GFAP in astrocytes were immunostained. As a result of immunostaining, in Fig. 3, neurons appeared green, while astrocytes appeared red. The differentiation rate of neurons from neurospheres formed in 1.6% agarose gel-coated culture dish was about 95% or more, which was more pronounced than the differentiation rate of less than 10% in the control group (neurons formed in hydrogel-coated culture dish). You can see that it is high. In the control group, most neurospheres were differentiated into astrocytes (FIG. 3).

2-3. 유전자의 발현 분석2-3. Gene expression analysis

하나의 신경줄기세포가 2개의 세포로 분열될 때, 이 중 1개의 세포는 줄기세포와 같은 형태로 분화되고(자가 갱신(self renewal)) 다른 1개의 세포는 전구세포로 분화된다. 이러한 과정이 반복됨으로써 신경구가 형성되기 때문에, 신경구는 다양한 세포들로 구성되어 있다. 즉, 신경구는 신경줄기세포, 신경전구세포, 글리아전구세포, 및 분화가 더 진행된 세포들로 구성되어 있다(도 4). 이와 같이 형성된 신경구를 EGF 및 FGF가 없는 조건하에서 배양하면 완전한 분화가 유도된다(Diamandis, P. et al., Nature Chemical Biology 3: 268-276, 2007).When one neural stem cell divides into two cells, one of them differentiates into a stem-like form (self renewal) and the other one differentiates into progenitor cells. Since this process is repeated to form a neurosphere, the neurosphere is composed of various cells. In other words, neurospheres are composed of neural stem cells, neural progenitor cells, glia precursor cells, and cells with further differentiation (FIG. 4). Neurospheres thus formed are cultured under conditions free of EGF and FGF to induce complete differentiation (Diamandis, P. et al., Nature Chemical Biology 3: 268-276, 2007).

아가로스 겔이 코팅된 배양접시에서 형성된 신경구가 폴리-D-리신이 코팅된 384-웰 플레이트에서 높은 효율로 신경세포로 분화하는 이유는, 신경구가 형성되는 동안 신경줄기세포가 신경전구세포로 이미 어느 정도 분화가 진행되었기 때문인 것으로 추측된다. 이를 분자 수준에서 확인하기 위하여, 신경전구세포에서 특이적으로 발현되는 유전자의 양을 RT-PCR(역전사중합효소연쇄반응)에 의해 분석하였다.The reason why neurospheres formed in agarose gel-coated petri dishes differentiate into neurons with high efficiency in 384-well plates coated with poly-D-lysine is that neural stem cells have already become neuroprogenitor cells during neurosphere formation. It is assumed that this is due to the degree of differentiation. To confirm this at the molecular level, the amount of genes specifically expressed in neural progenitor cells was analyzed by RT-PCR (reverse transcriptase chain reaction).

전체 RNA는 신경구를 모아 트리졸 시약(Trizol reagent, Invitrogen)에 의해 추출하였으며, 역전사효소(Superscript reverse transcriptase, Invitrogen)와 올리고-디티(olifo-d(T)₂₀) 프라이머를 이용하여 65℃에서 5분, 50℃에서 50분, 85℃에서 5분 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다. Platinum Blue PCR SuperMix(Invitrogen사)를 이용하여 상기 cDNA로부터 해당 유전자를 증폭시켰으며, 그 구체적인 과정은 다음과 같다: 95℃에서 5분 동안 변성시키고, 그 이후의 단계부터는 95℃에서 30초 동안 변성, 55℃에서 30초 동안 결합, 72℃에서 30초 동안 합성의 사이클을 35회 반복하였다. 이와 같이 증폭된 cDNA를 1.5% 아가로스 겔(SEAKEM)에서 분리하고 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색한 후 확인하였다.Total RNA was collected by the neurospheres and extracted with Trizol reagent (Invitrogen), using a superscript reverse transcriptase (Invitrogen) and oligo-d (T) ₂₀ primer at 65 ℃ 5 CDNA was synthesized by reacting for 50 minutes at 50 ° C and 5 minutes at 85 ° C. The gene was amplified from the cDNA using Platinum Blue PCR SuperMix (Invitrogen), and the specific procedure is as follows: Denature for 5 minutes at 95 ° C., and denature for 30 seconds at 95 ° C. from thereafter. The cycle of synthesis was repeated 35 times for 30 seconds at 72 ° C., 30 seconds at 72 ° C. The cDNA thus amplified was separated on 1.5% agarose gel (SEAKEM) and stained with ethidium bromide.

RT-PCR에 의해 발현양이 확인된 유전자는 Ngn1, Nestin, GAPDH이다. 이 중에서, Ngn1은 신경전구세포에서 특이적으로 발현되는 유전자로 선택되었으며, 나머지 2개의 유전자들은 신경구에 존재하는 모든 세포에 공통으로 발현하는 대조군 유전자로 이용되었다. 유전자의 발현양을 RT-PCR에 의해 분석한 결과, Ngn1은 히드로겔이 코팅된 배양접시에서 형성된 신경구에서보다 아가로스 겔이 코팅된 배양접시에서 형성된 신경구에서 그 발현양이 더 높게 나타났다(도 5). 대조군으로 사용된 Nestin과 GAPDH 유전자는 그 발현양에 차이가 없었다. 이러한 결과는 아가로스 겔이 코팅된 배양접시에서 형성된 신경구가 이미 신경전구세포를 많이 포함하고 있음을 시사하는 것이며, 이에 따라 신경세포로 분화되는 정도가 높은 현상이 설명될 수 있다.Genes whose expression levels were confirmed by RT-PCR are Ngn1, Nestin, and GAPDH. Among them, Ngn1 was selected as a gene specifically expressed in neural progenitor cells, and the other two genes were used as control genes commonly expressed in all cells present in the neurospheres. Analysis of gene expression by RT-PCR revealed that Ngn1 was higher in neurospheres formed in agarose gel-coated culture dishes than in neurospheres formed in hydrogel-coated culture dishes (FIG. 5). ). Nestin and GAPDH genes used as controls did not differ in expression levels. These results suggest that the neurospheres formed in the agarose gel-coated culture dish already contain a lot of neuroprogenitor cells, and thus a high degree of differentiation into neurons can be explained.

다음으로, 아가로스 겔의 농도에 따른 신경전구세포의 분화율을 확인하기 위하여, 배양접시에 각각 0.5%, 1.0%, 1.5%의 아가로스 겔을 코팅하고 신경구를 형성하였다. 전체 RNA 샘플을 추출하고 RT-PCR에 의해 Ngn1, Nestin, GAPDH 유전자의 발현양을 각각 분석하였다. 그 결과, 대조군(히드로겔이 코팅된 배양접시)에 비해 1.5% 아가로스 겔이 코팅된 배양접시에서 형성된 신경구에서 Ngn1의 발현양이 가장 높았으며, 1.5%보다 낮은 농도로 아가로스 겔이 코팅된 조건하에서는 Ngn1의 발현양이 점점 감소하였음이 확인되었다(도 6).Next, in order to confirm the differentiation rate of neural progenitor cells according to the concentration of agarose gel, 0.5%, 1.0%, 1.5% of agarose gel was coated on the culture dish, respectively, to form neurospheres. Total RNA samples were extracted and analyzed for expression levels of Ngn1, Nestin and GAPDH genes by RT-PCR, respectively. As a result, the expression level of Ngn1 was the highest in the neurospheres formed in the culture dish coated with 1.5% agarose gel compared to the control (hydrogel coated culture dish), and the agarose gel was coated at a concentration lower than 1.5%. Under the conditions, it was confirmed that the expression level of Ngn1 gradually decreased (FIG. 6).

마지막으로, 신경구를 형성하는데 사용된 배지의 조성에 따른 신경전구세포의 분화율을 비교하기 위하여, B27/N2 배지와 STEMPRO 배지를 사용하여 신경구를 형성하였다. 이 때 형성된 신경구의 수와 형태에는 큰 차이가 없었지만, B27/N2 배지 조성물에서 형성된 신경구로부터 신경전구세포로 분화되는 효율이 STEMPRO 배지보다 더 높았다(도 7a). 또한, Ngn1 유전자의 발현양도 STEMPRO 배지에 비해 B27/N2 배지에서 더 높게 나타났다(도 7b).Finally, neurospheres were formed using B27 / N2 medium and STEMPRO medium in order to compare the differentiation rate of neural progenitor cells according to the composition of the medium used to form neurospheres. There was no significant difference in the number and morphology of neurospheres formed at this time, but the efficiency of differentiation of neurospheres from neurospheres formed in B27 / N2 medium composition was higher than that of STEMPRO medium (FIG. 7A). In addition, the expression level of Ngn1 gene was also higher in B27 / N2 medium than in STEMPRO medium (FIG. 7B).

Claims

A method for differentiating neural stem cells into neurons, the method comprising differentiating neural stem cells in an agarose gel-coated culture dish.

The method of claim 1,
The concentration of the agarose gel is characterized in that more than 1.5% (w / v).

The method of claim 1,
DMEM / F12 / Glutamax medium is used in the culture dish.

The method of claim 3,
B27 and N2 supplemented to the DMEM / F12 / Glutamax medium.

The method of claim 1,
Characterized in that said neural stem cells are inoculated with 0.5x10 ⁵ gae / mL to 5x10 ⁵ gae / mL concentration in a petri dish.

The method of claim 1,
Wherein said neural stem cells are derived from rodent embryos.

The method of claim 1,
Before the neural stem cells are differentiated into nerve cells.

The method of claim 7, wherein
The neurospheres are characterized in that differentiation in the absence of FGF (fibroblast growth factor) and EGF (epithelial cell growth factor).

The method of claim 8,
Wherein said neurospheres are differentiated into neuronal progenitor cells and then into neurons.