KR101178415B1 - Attenuated Salmonella mutants transformed with adhesin gene of pathogenic Escherichia coli in pigs and Vaccine composition comprising thereof for protection and treatment against pathogenic Escherichia coli and Salmonella in pigs - Google Patents

Attenuated Salmonella mutants transformed with adhesin gene of pathogenic Escherichia coli in pigs and Vaccine composition comprising thereof for protection and treatment against pathogenic Escherichia coli and Salmonella in pigs Download PDF

Info

Publication number
KR101178415B1
KR101178415B1 KR1020090080020A KR20090080020A KR101178415B1 KR 101178415 B1 KR101178415 B1 KR 101178415B1 KR 1020090080020 A KR1020090080020 A KR 1020090080020A KR 20090080020 A KR20090080020 A KR 20090080020A KR 101178415 B1 KR101178415 B1 KR 101178415B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
salmonella
escherichia coli
coli
vaccine
pathogenic
Prior art date
Application number
KR1020090080020A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR20110022428A (en
Inventor
이존화
허진
송석오
임재삼
김성복
김삼웅
윤인중
유성식
Original Assignee
주식회사 중앙백신연구소
충청남도
전북대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 중앙백신연구소, 충청남도, 전북대학교산학협력단 filed Critical 주식회사 중앙백신연구소
Priority to KR1020090080020A priority Critical patent/KR101178415B1/en
Priority to PCT/KR2010/005806 priority patent/WO2011025310A2/en
Publication of KR20110022428A publication Critical patent/KR20110022428A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR101178415B1 publication Critical patent/KR101178415B1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/36—Adaptation or attenuation of cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0258—Escherichia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0275—Salmonella
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

본 발병은 돼지의 병원성 대장균의 8개의 각 부착인자 (adhesin)와 돼지의 병원성 대장균의 LTB(heat-labile enterotoxin B subunit) 유전자, 즉, 총 9개 각각의 유전자를 asd 유전자를 포함하고 있는 플라스미드 pBP244에 각각 클로닝하여 lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실된 살모넬라균 변이주를 각각 형질전환시킨 9개의 살모넬라균 변이주로 구성된 군중에서 어느 하나 이상의 유전자를 포함하는 살모넬라균 혼합백신으로, 돼지의 병원성 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료용 백신 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 살모넬라균 변이주의 제조방법 및 상기 살모넬라균 변이주를 생균 또는 사균 백신으로 준비하여, 모돈 또는 자돈에 접종하는 것을 특징으로 하는, 돼지의 병원성 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료를 위한 백신화 방법을 제공한다. 본 발명의 백신은 상기 발현?분비된 각 부착인자 항원과 약독화 살모넬라균이 돼지의 점막에서 점막 및 전신 면역반응을 유도하여 야외 병원성 대장균 및 살모넬라균을 동시에 방어할 수 있다. 또한, 본 발명의 백신은 기존의 돼지 병원성 대장균 백신보다 안전하며 면역반응 유도 및 병원성 대장균에 대한 방어효과가 훨씬 우수함을 확인하였다.The onset is caused by the plasmid pBP244, which contains asad genes for each of eight adhesion factors (adhesin) of pig pathogenic E. coli and the heat-labile enterotoxin B subunit (LTB) gene of pig pathogenic E. coli, ie, a total of nine genes. It is a mixed Salmonella vaccine containing any one or more genes from a population consisting of nine Salmonella strains, each cloned into and transformed with Salmonella strains lon, cpxR and asd genes, respectively, which are pathogenic Escherichia coli and Salmonella spp. It provides a vaccine composition for the prevention and treatment of. In addition, the present invention is characterized in that the preparation method of the Salmonella mutant strain and the Salmonella mutant strain prepared by viable or dead bacteria vaccine, inoculated into sows or piglets, for the prevention and treatment of pathogenic Escherichia coli and Salmonella bacterium in pigs Vaccination methods are provided. In the vaccine of the present invention, each of the above-described secreted adhesion factor antigens and attenuated Salmonella can induce mucosal and systemic immune responses in porcine mucosa and simultaneously defend against outdoor Escherichia coli and Salmonella. In addition, it was confirmed that the vaccine of the present invention is safer than the existing Swine Escherichia coli vaccine and has a much better protective effect against inducing immune response and Escherichia coli.

병원성 대장균, 살모넬라균, 약독화, 백신, 부착인자 Escherichia coli, Salmonella, Attenuated, Vaccine, Attachment factor

Description

돼지의 병원성 대장균의 부착인자가 형질전환된 약독화 살모넬라균 변이주 및 이를 포함하는 돼지의 병원성 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료용 백신 조성물{Attenuated Salmonella mutants transformed with adhesin gene of pathogenic Escherichia coli in pigs and Vaccine composition comprising thereof for protection and treatment against pathogenic Escherichia coli and Salmonella in pigs}Attenuated Salmonella mutants transformed with adhesin gene of pathogenic Escherichia coli in pigs and Vaccine with attenuated Salmonella mutant strain transformed with an attachment factor of Escherichia coli of pigs and the same composition comprising particular for protection and treatment against pathogenic Escherichia coli and Salmonella in pigs}

본 발명은 돼지의 병원성 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료용 백신에 관한 것이다. The present invention relates to a vaccine for the prevention and treatment of pathogenic E. coli and Salmonella in pigs.

동물에 있어 포유시기의 폐사 원인 중 약 80% 이상이 소화기 질병에 의해 발생한다. 또한 육성시기에는 소화기 질병에 의해 증체율이 현저하게 감소하여 양돈가에 심각한 경제적 손실을 일으킨다. 특히 포유자돈에서의 1회 설사는 출하시기를 약 1주일 정도 지연시키기 때문에 자돈에서의 소화기 질병은 양돈 산업에 막대한 경제적 손실을 초래하는 중요한 질병이다. 자돈에서 병원성 대장균과 살모넬라균에 의한 소화기 질병은 전체 소화기 질병 원인균 중에서 약 30%와 20% 정도를 차지한다. 더욱이 세균성 소화기 질병 원인균 중에서는 거의 대부분을 이들이 차지할 정 도로 그 발생이 빈번하다. 이처럼 양돈 산업에 있어 심각한 경제적 손실을 초래하는 세균성 소화기 질병을 예방하기 위하여 전 세계적으로 효과적인 예방백신을 개발하고자 많은 심혈을 기울이고 있다. 소화기 점막은 대다수의 소화기 및 호흡기 질병 유발 병원균과 처음으로 접하는 장소임과 동시에 이들 세균의 감염을 제일 먼저 방어하는 장소이기 때문에 매우 중요한 곳이다. 하지만 기존 상용화 백신의 대부분은 주로 병원성 대장균을 포르말린으로 불활화시킨 사균백신이거나 정제한 항원을 오일이나 겔 등 적합한 면역증강제와 혼합하여 판매되고 있다. 더욱이 이런 종류의 백신은 근육으로 접종하여 점막에서의 방어보다는 전신성 면역화에 중점을 두고 있다. 이런 전신 백신은 전신 면역 유도는 높지만 점막에서의 항체 유도에는 별다른 영향을 주지 못해 점막에서의 항체 역가는 매우 낮아 병원균 방어에 실패하는 경우가 종종 발생하는 것으로 보고되고 있다. 그래서 미국을 비롯한 선진국에서는 점막면역을 유도할 수 있는 백신 및 면역증강제 개발에 많은 연구가 진행 중에 있다. 하지만 아직까지 이는 사람의 질병 및 실험동물인 마우스를 대상으로 한 기초 연구가 주종을 이루고 있을 뿐이다. 최근에는 수의학분야에서도 일부의 질병에 대해서 특히, 조류 및 돼지를 대상으로 점막면역에 대한 연구가 수행 중에 있다. 그렇지만 아직 국내외적으로 연구실 수준의 연구가 진행되고 있을 뿐 현장에서는 아직 활용되지 못하고 있다.In animals, more than 80% of the causes of mortality in mammals are caused by digestive diseases. In addition, during the growing season, the weight gain rate is greatly reduced by digestive diseases, causing serious economic losses to pigs. In particular, single diarrhea in mammalian pigs delays delivery for about one week, so digestive disease in piglets is an important disease causing significant economic losses to the pig industry. Gastrointestinal disease caused by Escherichia coli and Salmonella in piglets accounts for about 30% and 20% of all causative organisms. Moreover, most of the bacterial causes of bacterial digestive disease occur so frequently. In order to prevent bacterial digestive diseases causing serious economic losses in the swine industry, much effort is being made to develop effective vaccines worldwide. The gastrointestinal mucosa is very important because it is the first place to encounter the majority of the gastrointestinal and respiratory disease-causing pathogens, as well as the first place to defend against infection by these bacteria. However, most of commercialized vaccines are mainly sold by mixing E. coli vaccines or purified antigens with inactivated Escherichia coli with formalin and suitable immunopotentiators such as oils and gels. Moreover, this type of vaccine is given by intramuscular inoculation, which focuses on systemic immunization rather than on mucosal defenses. Such systemic vaccines have high systemic immunity, but have little effect on antibody induction in mucosa, and thus, antibody titers in mucosa are very low, and it is often reported that pathogen defense fails. Therefore, in the developed countries including the United States, a lot of research is underway to develop vaccines and immunostimulants that can induce mucosal immunity. However, this is still mainly due to basic research on human diseases and experimental animals, mice. Recently, veterinary medicine has been studied for some diseases, particularly mucosal immunity in birds and pigs. However, research at the laboratory level is still in progress at home and abroad, and it is not yet utilized in the field.

　병원성 대장균은 돼지에서 주로 설사 및 부종병과 같은 다양한 장관 감염을 일으키는 병원체로서 주로 장독성 대장균 (entrotoxigenic Escherichia coli; ETEC)에 의해 야기되며 또한 장병원성 대장균 (enteropathogenic Escherichia coli; EPEC)에 의해서도 야기된다. 돼지에서 지금까지 알려진 ETEC의 주요 부착인자(fimbriae)에는 F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P), F18, F41이 있으며 EPEC의 부착인자로는 intimin이 알려져 있다. 세균이 숙주 세포에 부착하는데 사용하는 모든 인자를 부착인자라하며 이에는 세균의 fimbria와 같은 세포 표면 단백질이 포함되어 있다. 세균은 이들 부착인자를 이용하여 숙주의 장관 세포 표면에 안정적으로 부착하여 증식을 시작하면서 질병을 일으킨다. 따라서 이들 병원성 세균의 부착인자에 대한 면역반응이 유도된다면 세균에 감염되었을 경우 유도 항체가 이들 부착인자와 결합하여 세균이 숙주의 장관 표면에 부착하여 증식할 수 있는 기회를 미연에 차단함으로써 병원성 세균에 의한 질병 발생을 예방할 수 있을 것이다.Escherichia coli is a pathogen that causes various intestinal infections in pigs, such as diarrhea and edema, mainly enterotoxigenic Escherichia. coli ; ETEC) and also by enteropathogenic Escherichia coli (EPEC). The main EFI fimbriae known to date in pigs are F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P), F18 and F41. Intimin is known as EPEC. All factors that bacteria use to attach to host cells are called adhesion factors, which include cell surface proteins such as bacterial fimbria. Bacteria use these adhesion factors to stably adhere to the surface of the intestinal cells of the host to start proliferation, causing disease. Therefore, if an immune response against these pathogenic bacteria is induced, then when infected, the inducing antibody binds to these adhesion factors and blocks the opportunity for bacteria to attach to and proliferate on the surface of the host's intestine. Disease outbreaks can be prevented.

현재 상용화되어 있는 양돈용 대장균 백신은 주요 ETEC의 부착인자 즉, F4 (K88ab, K88ac, K88ad), F5 (K99), F6 (987P), F41을 발현하는 대장균을 배양한 후 이들 세균을 포르말린 등으로 불활화 하거나 또는 이들 부착인자를 정제하여 임신 모돈에 근육 접종하는 예방백신 접종 방법을 사용하고 있다. 하지만 사균을 이용한 근육 접종은 세균막에 있는 많은 비특이적인 물질로 인해 특이 항원에 대한 면역반응이 잘 유도되지 않는 경우가 많다. 특히 사균을 이용한 근육 접종은 전신 면역반응은 어느 정도 유도를 하지만 실질적으로 ETEC가 병변을 일으키는 점막에서의 항체 유도는 효과적이지 않아 종종 방어에 실패하는 경우가 있다. 또한 살모넬라균을 불활화하여 근육 접종하는 경우에는 점막면역과 세포 매개성 면역반응이 잘 유도되지 않아 야외균주의 방어에 있어서 생균 백신에 비해 효과적이지 못하다고 알려져 있으며, 더욱이 현재 국내에서 상용화 되어 있는 양돈용 살모넬라균에 대한 예방백 신은 전무한 실정이다. 그러나 많은 연구를 통해 살모넬라균 유전자 및 그 유전자에 의한 발현 단백질에 대한 정보가 많이 밝혀져 살모넬라균에 대한 유전체 조작이 가능하게 되었다. 따라서 일부 유전자 결손 기술을 이용하여 보다 효과적인 약독화 백신 개발 연구에 관심이 집중되고 있다. 더욱이 펩티도글리칸 합성과 관계가 있는 asd 유전자가 결여된 살모넬라균과 asd 유전자를 갖고 있는 플라스미드 제작이 가능해 졌다. 따라서 asd 유전자를 갖고 있는 플라스미드에 원하는 항원 유전자를 cloning한 후 이 플라스미드에 의한 변이 균주의 형질전환이 기능하게 되었다. 따라서 원하는 외래 단백질을 발현할 수 있는 전달계 (delivery system)로서 이 시스템을 이용하여 살모넬라균과 동시에 다른 세균에 대한 방어가 가능한 예방백신 개발을 위한 연구가 활발히 수행되고 있다. Swine E. coli vaccines, which are currently commercialized, are cultured for E. coli expressing major ETEC attachment factors, namely F4 (K88ab, K88ac, K88ad), F5 (K99), F6 (987P), and F41, and then these bacteria are inactivated with formalin. Or vaccination methods are used to inoculate muscle sows into pregnant sows. However, the inoculation of the muscles using the bacterium often does not elicit an immune response to a specific antigen due to many nonspecific substances in the bacterial membrane. In particular, intramuscular inoculation with Bacillus induces a systemic immune response to some extent, but the induction of antibodies in the mucosal membrane where ETEC actually causes lesions is often ineffective and thus the defenses fail. In addition, mucosal immunity and cell-mediated immune responses are not well induced in inoculating muscles by inactivating Salmonella bacteria, which are not as effective as viable vaccines in the protection of outdoor strains. There is no vaccine against the bacteria. However, many studies have revealed much information about Salmonella genes and expression proteins by the genes, and genome manipulation of Salmonella bacteria is possible. Therefore, attention has been focused on the development of more effective attenuated vaccines using some gene deletion techniques. Moreover, it is possible to construct plasmids with Salmonella and asd genes that lack the asd gene, which is related to peptidoglycan synthesis. Therefore, after cloning the desired antigen gene into the plasmid containing the asd gene, the transformation of the mutant strain by this plasmid was able to function. Therefore, studies are being actively conducted to develop preventive vaccines capable of protecting against Salmonella and other bacteria at the same time using this system as a delivery system capable of expressing a desired foreign protein.

또한, 최근 병원성 대장균의 LTB(heat-labile enterotoxin B subunit)는 CTB(cholera toxin B subunit)와 더불어 강력한 면역증강제로서 많은 연구가 수행되고 있다. 따라서 이들 면역증강제를 포함하여 특이적으로 대장균 부착인자 항원을 보조하고 살모넬라 항원들과 결합하여 sIgA를 비롯한 체액성 면역반응을 강력하게 유도하여 경구접종용 백신의 효능을 증가시킬 수 있는 경구용 면역증강제에 대한 연구가 필요하다.In recent years, many studies have been performed on the heat-labile enterotoxin B subunit (LTB) of Escherichia coli as a powerful immunopotentiator along with the cholera toxin B subunit (CTB). Therefore, these oral adjuvants, which specifically support E. coli adhesion factor antigens and bind with Salmonella antigens, induce a humoral immune response including sIgA to increase the efficacy of the vaccine for oral vaccination. There is a need for research.

본 발명은 우선 ETEC와 EPEC의 주요 부착인자 유전자를 SecA, SecB 그리고 LepB 시스템을 이용하여 발현되는 항원의 분비가 증가되도록 개발된 대장균 및 살모넬라균 셔틀 플라스미드인 pBP244에 각각 클로닝한 다음 이들 플라스미드를 lon, cpxR 및 asd 세 유전자를 인위적으로 결실시킨 약독화 살모넬라균에 형질전환시켰 으며, 상기 형질전환된 살모넬라 변이 균주를 포함한 백신 조성물을 돼지에 접종한 결과 돼지의 점막에서 각 부착인자를 안정적으로 분비하여 점막 및 전신 면역을 유도함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. The present invention first cloned the major adhesion factor genes of ETEC and EPEC into E. coli and Salmonella shuttle plasmids pBP244, which were developed to increase the secretion of antigens expressed using the SecA, SecB and LepB systems . cpxR and asd Attenuated Salmonella bacteria, which had three genes artificially deleted, were transformed, and the vaccine composition containing the transformed Salmonella mutant strain was inoculated into pigs, resulting in stable secretion of each adhesion factor from the mucosa of the pigs. The present invention was completed by confirming that induction.

본 발명의 목적은 돼지의 병원성 대장균의 부착인자 유전자를 포함하는 살모넬라균 변이주 및 이를 제조하는 방법을 제공하는 것이다. It is an object of the present invention to provide a Salmonella mutant strain comprising an attachment factor gene of Escherichia coli of swine and a method of producing the same.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 살모넬라균 변이주를 포함하는 돼지의 병원성 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료용 백신 조성물 및 이를 이용한 백신화 방법을 제공하는 것이다. Still another object of the present invention is to provide a vaccine composition for preventing and treating pathogenic Escherichia coli and Salmonella bacterium in pigs including the Salmonella mutant strain and a vaccine method using the same.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 돼지의 병원성 대장균의 부착인자 F4(K88ab), F4(K88ac), F5(K99), F6(FasA), F18(FedA), F18(FedF), F41 및 Intimin으로 구성된 군 중에서 선택된 어느 하나의 유전자, 및 asd 유전자를 포함하는, lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실된 살모넬라균 변이주를 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention is an attachment factor of the pathogenic E. coli F4 (K88ab), F4 (K88ac), F5 (K99), F6 (FasA), F18 (FedA), F18 (FedF), F41 and Intimin Provided are Salmonella mutant strains that have the lon, cpxR and asd genes deleted, including any one gene selected from the group consisting of, and asd genes.

또한, 본 발명은 상기 변이주 중 어느 하나 이상을 포함하는 혼합 살모넬라균 변이주를 제공한다. The present invention also provides a mixed Salmonella mutant strain comprising any one or more of the above mutant strains.

또한, 본 발명은 돼지의 병원성 대장균의 LTB(heat-labile enterotoxin B subunit) 유전자, 및 asd 유전자를 포함하는, lon, cpxR 및 asd 유전자가 결실된 살모넬라균 변이주를 제공한다. In addition, the present invention provides a Salmonella mutant strain deleted from the lon, cpxR and asd genes, including the heat-labile enterotoxin B subunit (LTB) gene, and the asd gene of Escherichia coli of swine.

또한, 본 발명은 돼지의 병원성 대장균의 부착인자 F4(K88ab), F4(K88ac), F5(K99), F6(FasA), F18(FedA), F18(FedF), F41 및 Intimin으로 구성된 군 중에서 선택된 어느 하나의 유전자를 포함하는 상기 살모넬라균 변이주 중 어느 하나 이상 을 포함하는 혼합 살모넬라균 변이주와 돼지의 병원성 대장균의 LTB(heat-labile enterotoxin B subunit) 유전자를 포함하는 상기 살모넬라균 변이주를 포함하는 혼합 살모넬라균 변이주를 제공한다. In addition, the present invention is selected from the group consisting of adhesion factors F4 (K88ab), F4 (K88ac), F5 (K99), F6 (FasA), F18 (FedA), F18 (FedF), F41 and Intimin Mixed Salmonella comprising a mixed Salmonella strain comprising any one or more of the Salmonella strain containing any one gene and the Salmonella strain comprising the heat-labile enterotoxin B subunit (LTB) gene of pathogenic Escherichia coli To provide a bacterial strain.

또한, 본 발명은 돼지의 병원성 대장균의 부착인자 F4(K88ab), F4(K88ac), F5(K99), F6(FasA), F18(FedA), F18(FedF), F41 또는 Intimin 유전자를 각각 포함하는 8개의 살모넬라균 변이주 모두를 포함하는 혼합 살모넬라균 변이주와 돼지의 병원성 대장균의 LTB(heat-labile enterotoxin B subunit) 유전자를 포함하는 살모넬라균 변이주를 포함하는 혼합 살모넬라균 변이주를 제공하며, 본 발명자들은 이 혼합 살모넬라균 변이주를 기탁기관(한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC))에 기탁하였다(기탁번호 KCTC11541BP).In addition, the present invention includes the genes for the attachment of pathogenic E. coli F4 (K88ab), F4 (K88ac), F5 (K99), F6 (FasA), F18 (FedA), F18 (FedF), F41 or Intimin gene, respectively. Provided are mixed Salmonella strains comprising a mixed Salmonella strain comprising all eight Salmonella strains and a Salmonella strain comprising the heat-labile enterotoxin B subunit (LTB) gene of Escherichia coli of pigs, and the present inventors Mixed Salmonella mutant strains were deposited in a depository institution (KCTC), Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (Accession No. KCTC11541BP).

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 살모넬라균 변이주를 포함하는, 돼지의 병원성 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료용 백신 조성물를 제공한다. In another aspect of the present invention, the present invention provides a vaccine composition for preventing and treating Escherichia coli and Salmonella bacterium, comprising the Salmonella mutant strain.

상기 돼지의 병원성 대장균증은, 이것에 한정되는 것은 아니지만, 소화기 질환, 부종병 (edema disease), 호흡기 질환 또는 비뇨생식기계 질환을 포함한다. The pathogenic Escherichia coli of the pig includes, but is not limited to, digestive disease, edema disease, respiratory disease or urogenital disease.

상기 소화기 질환은, 이것에 한정되는 것은 아니지만, 신생자돈 설사병, 조발성 설사병, 3주령 설사병, 백리, 포유자돈 설사병, 또는 이유자돈 설사병을 포함한다.The gastrointestinal disorders include, but are not limited to, neonatal pig diarrhea, precocious diarrhea, three-week old diarrheal disease, white matter, mammal pig diarrheal disease, or weaning pig diarrheal disease.

상기 병원성 대장균은 바람직하게는 장독성 대장균 (entrotoxigenic Escherichia coli .; ETEC) 또는 장병원성 대장균 (enteropathogenic Escherichia coli;; EPEC)이다. The pathogenic Escherichia coli is preferably enterotoxigenicEscherichia coli .; ETEC) or enteropathogenic Escherichia coliEscherichia coli;; EPEC).

상기 살모넬라균은, 이것에 한정되는 것은 아니지만, 살모넬라균은 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 타이피(Salmonella typhi), 살모넬라 파라타이피(Salmonella paratyphi), 살모넬라 센다이(Salmonella sendai), 살모넬라 갈리나리움(Salmonella gallinarium) 및 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나가 숙주세포로서 이용될 수 있다. Salmonella is not limited to this, Salmonella is Salmonella typhimurium ( Salmonella typhimurium ), Salmonella typhi ( Salmonella paratyphi ), Salmonella sendai ( Salmonella sendai ), Salmonella gallina Any one selected from the group consisting of Salmonella gallinarium and Salmonella enteritidis can be used as a host cell.

상기 백신 조성물에서, 살모넬라균 변이주는 생균 또는 사균으로 사용할 수 있으며, 사균은, 이것에 한정되는 것은 아니지만, 가열 또는 포르말린으로 불활화시킬 수 있다. In the vaccine composition, Salmonella mutant strains can be used as live or dead bacteria, and the dead bacteria can be inactivated by heating or formalin, although not limited thereto.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 백신 조성물을 포함하는, 돼지의 면역증강 또는 성장촉진을 위한 사료 첨가제를 제공한다. In another aspect of the present invention, the present invention provides a feed additive for immuno-stimulation or growth promotion of pigs, comprising the vaccine composition.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 (i) 돼지의 병원성 대장균의 부착인자 F4(K88ab), F4(K88ac), F5(K99), F6(FasA), F18(FedA), F18(FedF), F41 및 Intimin으로 구성된 군 중에서 선택된 어느 하나의 유전자를 증폭시키는 단계; (ii) 상기 부착인자 유전자를 asd 유전자를 가진 플라스미드에 클로닝하는 단계; (iii) 살모넬라 균주의 염색체 DNA에서 lon, cpxR 및 asd 유전자를 결실시켜 약독화 살모넬라 균주를 제조하는 단계; (iv) 단계 (ii)의 클로닝된 플라스미드로 단계 (iii)의 약 독화 살모넬라 균주를 형질전환시키는 단계; 및 (iv) 형질전환된 살모넬라균 변이주를 선별하는 단계를 포함하는 살모넬라균 변이주를 제조하는 방법을 제공한다. In another embodiment of the present invention, the present invention provides a method for adjuvant Escherichia coli F4 (K88ab), F4 (K88ac), F5 (K99), F6 (FasA), F18 (FedA), F18 (FedF), Amplifying any one gene selected from the group consisting of F41 and Intimin; (ii) cloning said adherent gene into a plasmid with an asd gene; (iii) deleting the lon, cpxR and asd genes from the chromosomal DNA of the Salmonella strain to prepare the attenuated Salmonella strain; (iv) transforming the weakly poisoned Salmonella strain of step (iii) with the cloned plasmid of step (ii); And (iv) selecting the transformed Salmonella strains.

또한, 본 발명은 (i) 돼지의 병원성 대장균의 LTB(heat-labile enterotoxin B subunit) 유전자를 증폭시키는 단계; (ii) 상기 LTB 유전자를 asd 유전자를 가진 플라스미드에 클로닝하는 단계; (iii) 살모넬라 균주의 염색체 DNA에서 lon, cpxR 및 asd 유전자를 결실시켜 약독화 살모넬라 균주를 제조하는 단계; (iv) 단계 (ii)의 클로닝된 플라스미드로 단계 (iii)의 약독화 살모넬라 균주를 형질전환시키는 단계; 및 (iv) 형질전환된 살모넬라균 변이주를 선별하는 단계를 포함하는 살모넬라균 변이주를 제조하는 방법을 제공한다. In addition, the present invention comprises the steps of: (i) amplifying the heat-labile enterotoxin B subunit (LTB) gene of Escherichia coli of swine; (ii) cloning said LTB gene into a plasmid with an asd gene; (iii) deleting the lon, cpxR and asd genes from the chromosomal DNA of the Salmonella strain to prepare the attenuated Salmonella strain; (iv) transforming the attenuated Salmonella strain of step (iii) with the cloned plasmid of step (ii); And (iv) selecting the transformed Salmonella strains.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 살모넬라균 변이주를 생균 또는 사균 백신으로 준비하여, 모돈 또는 자돈에 접종하는 것을 특징으로 하는, 돼지의 병원성 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료를 위한 백신화 방법을 제공한다.As another aspect of the present invention, the present invention is characterized in that the Salmonella mutant strain prepared by viable or dead bacteria vaccine, inoculated into sows or piglets, vaccination for the prevention and treatment of pathogenic E. coli and Salmonella in pigs Provide a method.

상기 백신화 방법에서, 이것에 한정되는 것은 아니지만, 경구, 경피, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내 또는 비강 경로로 백신을 접종할 수 있다. 바람직하게는, 1차 및 2차 접종시 생균 백신을 경구로 접종할 수 있다. 보다 바람직하게는, 1차 및 2차 접종시 생균 백신을 경구로 접종하되, 2차 접종시 LTB를 발현 분비하는 살모넬라 변이균주를 제외한 생균 백신을 접종할 수 있다. In the above vaccination method, the vaccine can be inoculated by oral, transdermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous or nasal route. Preferably, live vaccines can be inoculated orally at the first and second inoculations. More preferably, live vaccines are orally inoculated at the first and second inoculations, but live vaccines other than Salmonella mutant strains expressing and secreting LTB at the second inoculation may be inoculated.

　　　　　　본 발명의 변이균주는 항원 발현?분비 능력을 향상시킨 플라스미드에 클로닝 된 돼지의 병원성 대장균의 주요 부착인자 유전자가 전달계인 약독화 살모넬라균에 의해 발현?분비되도록 제작되었다. 본 발명의 백신은 상기 발현?분비된 각 부착인자 항원과 약독화 살모넬라균이 돼지의 점막에서 점막 및 전신 면역반응을 유도하여 야외 병원성 대장균 및 살모넬라균을 동시에 방어할 수 있다. 또한, 본 발명의 백신은 기존의 돼지 병원성 대장균 백신보다 안전하며 면역반응 유도 및 병원성 대장균에 대한 방어효과가 훨씬 우수함을 확인하였다. 더욱이 본 발명의 백신의 경구접종방법은 주사기가 필요하지 않아 주사기에 의한 모돈의 스트레스 감소 효과뿐만 아니라 주사기에 의한 접종에서의 부작용도 없으며 주사기 접종에 필요한 특별한 전문가의 도움도 필요하지 않아 누구나 간편하고 손쉽게 접종할 수 있는 장점이 있다.The mutant strain of the present invention was produced so that the major adhesion factor gene of Escherichia coli cloned in the cloned plasmid with improved antigen expression and secretion ability was expressed and secreted by attenuated Salmonella bacteria as a delivery system. In the vaccine of the present invention, each of the above-described secreted adhesion factor antigens and attenuated Salmonella can induce mucosal and systemic immune responses in porcine mucosa and simultaneously defend against outdoor Escherichia coli and Salmonella. In addition, it was confirmed that the vaccine of the present invention is safer than the existing Swine Escherichia coli vaccine and has a much better protective effect against inducing immune response and Escherichia coli. Moreover, the oral vaccination method of the vaccine of the present invention does not require a syringe, so that not only the effect of reducing the stress of the sows caused by the syringe, but also no side effects in the inoculation by the syringe, and does not require the help of a special expert required for the inoculation of the syringe, anyone can easily and easily There is an advantage to inoculation.

이하, 본 발명의 구성요소와 기술적 특징을 다음의 실시예들을 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 하기 실시예들은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 인용된 문헌은 본 발명의 명세서에 참조로서 통합된다.Hereinafter, the components and technical features of the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are merely to illustrate the content of the present invention is not limited to the scope of the invention. The documents cited in the present invention are incorporated herein by reference.

실시 예Example

실시예Example 1:  One: 부착인자Attachment factor 유전자의 준비 및 확인 Gene Preparation and Verification

1-1. 1-1. 실시예에Example 사용된 균주 Strains Used

단백질 항원 발현과 백신 클로닝 제작을 위한 각 부착인자 발현 유전자는 병원성 대장균인 JOL416 (K88ab 발현), JOL417 (K88ac 발현), JOL412 (K99 발현), JOL415 (987P 발현), JOL500 (F18 발현), JOL413 (F41 발현), JOL206 (intimin 발현)로부터 확보되었다. 그리고 병원성 대장균 야외 분리주인 JOL599 (F4 발현), JOL489 (F5와 F41 발현), JOL564 (F6 발현), JOL500과 살모넬라균 야외 분리주인 JOL389 (S. Typhimurium)는 도전감염 균주로 사용하였다. 이들 균주는 Luria-Bertani (LB) broth에서 배양되었다. Escherichia coli χ6212 [F-λ- Φ80Δ(lacZYA - argF) endA1 recA1 hsdR17 deoR thi -1 glnV44 gyrA96 relA1 Δ asdA4]와 약독화 살모넬라 티피무리움 (JOL912) (Δlon Δ cpxR Δ asd)(기탁번호 KCTC11540BP)은 DAP(diaminopimellic acid)(50 ㎍/ml)이 포함된 LB broth에서 배양되었다. asd 유전자를 발현하는 플라스미드 pBP244를 이용하여 병원성 대장균의 각 부착인자를 발현 및 분비하는 약독화 살모넬라 티피무리움을 선택할 때에는 DAP을 포함하지 않은 LB 아가(agar)에서 선택되었다. (표 1, 도 2)Each of the adhesion factor expression genes for protein antigen expression and vaccine cloning was expressed in the pathogenic E. coli JOL416 (K88ab expression), JOL417 (K88ac expression), JOL412 (K99 expression), JOL415 (987P expression), JOL500 (F18 expression), JOL413 ( F41 expression), JOL206 (intimin expression). In addition, JOL599 (F4 expression), JOL489 (F5 and F41 expression), JOL564 (F6 expression), JOL500 and JOL389 ( S. Typhimurium), the isolates of pathogenic Escherichia coli, were used as the challenge strain. These strains were cultured in Luria-Bertani (LB) broth. Escherichia coli χ6212 [F-λ- Φ80Δ ( lacZYA - argF ) endA1 recA1 hsdR17 deoR thi -1 glnV44 gyrA96 relA1 Δ asdA4 ] and attenuated Salmonella typhimurium (JOL912) ( Δlon Δ cpxR Δ asd ) (Accession No. KCTC11540BP) were incubated in LB broth containing diaminopimellic acid (DAP) (50 μg / ml). When attenuated Salmonella typhimurium expressing and secreting each adhesion factor of Escherichia coli using the plasmid pBP244 expressing the asd gene was selected from LB agar without DAP. Table 1, FIG. 2

실시예에 사용된 균주 및 플라스미드 Strains and Plasmids Used in the Examples 균주Strain 설명Explanation 입수방법How to get









클로닝 제작용









For cloning production JOL416JOL416 F4 (K88ab) fimbria를 발현하는 Escherichia coli 야생형 분리주 Escherichia expressing F4 (K88ab) fimbria coli Wild type isolate 국립수의과학검역원 (E. Coli G.C.V. K88ab)National Veterinary Research and Quarantine Service (E. Coli G.C.V.K88ab) JOL417JOL417 F4 (K88ac) fimbria를 발현하는 Escherichia coli 야생형 분리주 Escherichia expressing F4 (K88ac) fimbria coli Wild type isolate 국립수의과학검역원 (ETEC E-126 O149:K91, K88ac)National Veterinary Research and Quarantine Service (ETEC E-126 O149: K91, K88ac) JOL412JOL412 F5 (K99) fimbria를 발현하는 Escherichia coli 야생형 분리주 Escherichia expressing F5 (K99) fimbria coli Wild type isolate E. coli G.C.V. K99E. coli G.C.V. K99 JOL415JOL415 F6 (987P) fimbria를 발현하는 Escherichia coli 야생형 분리주 Escherichia expressing F6 (987P) fimbria coli Wild type isolate 국립수의과학검역원 (ETEC E-127 O141:K88ab, 987P)National Veterinary Research and Quarantine Service (ETEC E-127 O141: K88ab, 987P) JOL500JOL500 F18 fimbria를 발현하는 Escherichia coli 야생형 분리주 Escherichia expressing F18 fimbria coli Wild type isolate 야외 분리 주Outdoor separation note JOL413JOL413 F41 fimbria를 발현하는 Escherichia coli 야생형 분리주 Escherichia expressing F41 fimbria coli Wild type isolate 국립수의과학검역원 (ETEC E-92 O9:K35, K99, F41)National Veterinary Research and Quarantine Service (ETEC E-92 O9: K35, K99, F41) JOL206JOL206 intimin fimbria를 발현하는 Escherichia coli 야생형 분리주 Escherichia expressing intimin fimbria coli Wild type isolate ATCC 43890ATCC 43890 JOL908JOL908 pBP244 (Asd 발현 플라스미드)를 가진 Escherichia coli χ7213 Escherichia coli χ7213 with pBP244 (Asd expression plasmid) Kim 등 J. Microbiol. Biotechnol. 2007, 17:1316-1323. 참조Kim et al. J. Microbiol. Biotechnol. 2007, 17: 1316-1323. Reference
숙주
세포
host
cell JOL767JOL767 Escherichia coli χ7213 Δ asd Escherichia coli χ7213 Δ asd Kim 등 J. Microbiol. Biotechnol. 2007, 17:1316-1323 참조Kim et al. J. Microbiol. Biotechnol. See 2007, 17: 1316-1323 JOL912JOL912 Salmonella Typhimurium CK110 Δlon Δ cpxR Δ asd Salmonella Typhimurium CK110 Δlon Δ cpxR Δ asd KCTC11540BPKCTC11540BP


백신
균주


vaccine
Strain JOL940JOL940 Escherichia coli의 K88ab를 발현하는 JOL912 Escherichia JOL912 expressing K88ab of coli JOL941JOL941 Escherichia coli의 K88ac를 발현하는 JOL912 Escherichia JOL912 expressing K88ac of coli JOL946JOL946 Escherichia coli의 K99를 발현하는 JOL763 Escherichia JOL763 expressing K99 of coli JOL937JOL937 Escherichia coli의 FasA를 발현하는 JOL763 Escherichia JOL763 expressing FasA of coli JOL934JOL934 Escherichia coli의 FedA를 발현하는 JOL763 Escherichia JOL763 expressing coli FedA JOL935JOL935 Escherichia coli의 FedF를 발현하는JOL912 Escherichia JOL912 to express coli FedF of JOL947JOL947 Escherichia coli의 F41를 발현하는 JOL763 Escherichia JOL763 expressing coli F41 JOL948JOL948 Escherichia coli의 intimin을 발현하는 JOL912 Escherichia JOL912 expressing intimin of coli JOL906JOL906 Escherichia coli의 LTB를 발현하는 JOL912 Escherichia JOL912 expressing coli LTB



도전
감염
균주



challenge
infection
Strain JOL599JOL599 F4 fimbria를 발현하는 Escherichia coli 야생형 분리주 Escherichia expressing F4 fimbria coli Wild type isolate 국립수의과학검역원 (ETEC E-26 O149:K91, K88ac)National Veterinary Research and Quarantine Service (ETEC E-26 O149: K91, K88ac) JOL489JOL489 F5 및 F41 fimbriae를 발현하는 Escherichia coli 야생형 분리주 Escherichia expressing F5 and F41 fimbriae coli Wild type isolate 국립수의과학검역원 (ETEC E-92 O9:K35, K99, F41)National Veterinary Research and Quarantine Service (ETEC E-92 O9: K35, K99, F41) JOL564JOL564 F6 fimbria를 발현하는 Escherichia coli 야생형 분리주 Escherichia expressing F6 fimbria coli Wild type isolate 국립수의과학검역원 (ETEC E-127 O141:K88ab, 987P)National Veterinary Research and Quarantine Service (ETEC E-127 O141: K88ab, 987P) JOL389JOL389 Salmonella Typhimurium 야생형 분리주 Salmonella Typhimurium Wild Type Isolate 국립수의과학검역원 (Salmonella Typhimurium ST302)National Veterinary Research and Quarantine Service ( Salmonella Typhimurium ST302)

약독화 살모넬라 티피무리움(JOL912)(Δlon Δ cpxR Δ asd)에서 결실된 유전자 서열정보는, lon은 GenBank FJ609803.1; cpxR은 GenBank AE006468.1; asd는 GenBank AF015781.1에서 용이하게 입수할 수 있다. 본 발명자들은 상기 약독화 살모넬라 티피무리움(Δlon Δ cpxR Δ asd) 균주를 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하였다(기탁번호 KCTC11540BP, Samonella enterica serovar Typhimurium strain JOL912, 2009년 8월 3일 기탁).Gene sequence information deleted in attenuated Salmonella typhimurium (JOL912) ( Δlon Δ cpxR Δ asd ), lon is GenBank FJ609803.1; cpxR is GenBank AE006468.1; asd is readily available from GenBank AF015781.1. The present inventors have attenuated Salmonella typhimurium (Δlon Δ cpxR Δ asd) strains were deposited with the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Biological Resource Center (KCTC) (Accession No. KCTC11540BP, Samonella enterica serovar Typhimurium strain JOL912, deposited 3 August 2009).

1- 2. 병원성 대장균의 총 DNA 추출 및 1-2. Total DNA Extraction of Escherichia Coli 부착인자Attachment factor 유전자 증폭 Gene amplification

병원성 대장균의 총 DNA 추출은 통상적인 방법에 따라 준비하였다. 즉, -70℃에 보관 중인 병원성 대장균을 LB 아가에 접종하여 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 배양된 콜로니들 중에서 한 콜로니를 선택하여 1.5㎖ LB broth에 접종하여 하룻밤 배양한 후 원심분리하여 상층액을 제거한 다음 멸균 증류수를 1㎖ 첨가하여 재부유시켰다. 이 부유액을 원심분리한 후 상청액을 제거한 다음 멸균 증류수 50㎕를 첨가하여 다시 부유시켰다. 그리고 95℃에서 20분간 가열한 후 원심분리하여 상청액을 조심스럽게 멸균 소형관으로 옮겨 병원성 대장균의 총 DNA로 추출하였다.Total DNA extraction of Escherichia coli was prepared according to conventional methods. In other words, Escherichia coli stored at -70 ℃ was inoculated in LB agar and incubated overnight at 37 ℃. One colony was selected from the cultured colonies, inoculated in 1.5 ml LB broth, incubated overnight, centrifuged to remove supernatant, and then resuspended by adding 1 ml of sterile distilled water. The suspension was centrifuged, the supernatant was removed, and then 50 µl of sterile distilled water was added and the suspension was suspended again. Then, after heating at 95 ° C. for 20 minutes, the supernatant was carefully transferred to a sterile small tube and extracted with total DNA of Escherichia coli.

ETEC 및 EPEC의 각 부착인자 유전자는 제한효소 절단 부위를 가진 특이 프라이머(표 2)를 이용하여 PCR 기법으로 증폭하였다. 증폭된 각 부착인자 유전자는 아가로스 겔을 이용하여 해당 크기를 확인한 다음 AccuPrep 겔 정제키트(Bioneer, Korea)를 이용하여 정제하였다. (도 2)Adhesion genes of ETEC and EPEC were amplified by PCR using specific primers with restriction enzyme cleavage sites (Table 2). Each amplification factor gene was amplified using an agarose gel and then purified using AccuPrep gel purification kit (Bioneer, Korea). (Figure 2)

실시예에 사용된 프라이머들Primers Used in the Examples 부착인자Attachment factor 프라이머 (5'→3')Primer (5 '→ 3') 제한효소Restriction enzyme





ETEC





ETEC F4F4 K88abK88ab CCGC GGA TCC GGC ACA TGC CTG GAT GACCCGC GGA TCC GGC ACA TGC CTG GAT GAC BamHIBamHI CCGC AAG CTT CCA GCA ACT TTA GTA ATA ACCGC AAG CTT CCA GCA ACT TTA GTA ATA A HindIIIHindIII K88acK88ac CCGC GGA TCC GGC ACA TGC CTG GAT GAC TCCGC GGA TCC GGC ACA TGC CTG GAT GAC T BamHIBamHI CCGC AAG CTT AAT TGG CAG CTC ATC ACGCCGC AAG CTT AAT TGG CAG CTC ATC ACG HindIIIHindIII F5F5 K99K99 GAA TCC AT AAA AAA ACA CTG CTA GAA TCC AT AAA AAA ACA CTG CTA EcoRIEcoRI AAG CTT TTA CAT ATA AGT GAC TAA GAA AAG CTT TTA CAT ATA AGT GAC TAA GAA HindIIIHindIII F6F6 FasAFasA CCGC GGA TCC AGC GCC CGC TGA AAA CAACCGC GGA TCC AGC GCC CGC TGA AAA CAA BamHIBamHI CCGC AAG CTT ATT ACG GTG TAC CTG CTG ACCGC AAG CTT ATT ACG GTG TAC CTG CTG A HindIIIHindIII F18F18 FedAFedA CCGC GAA TTC CAG CAA GGG GAT GTT AAA TCCGC GAA TTC CAG CAA GGG GAT GTT AAA T EcoRIEcoRI CCGC AAG CTT GAT GAT TAC TTG TAA GTACCGC AAG CTT GAT GAT TAC TTG TAA GTA HindIIIHindIII FedFFedF CCGC GAA TTC GCG TCT ACT CTA CAA GTACCGC GAA TTC GCG TCT ACT CTA CAA GTA EcoRIEcoRI CCGC AAG CTT TTA CTG TAT CTC GAA AAC AACCGC AAG CTT TTA CTG TAT CTC GAA AAC AA HindIIIHindIII F41F41 F41F41 GAA TTC ATG AAA AAG ACT CTG ATT GC GAA TTC ATG AAA AAG ACT CTG ATT GC EcoRIEcoRI AAG CTT TTA ACT ATA AAT AAC GGT GA AAG CTT TTA ACT ATA AAT AAC GGT GA HindIIIHindIII EPECEPEC IntiminIntimin CCG GGA TCC GAT GAA AAA CGG TCA GCC AGTCCG GGA TCC GAT GAA AAA CGG TCA GCC AGT BamHIBamHI CCG AAG CTT TAT TTT AGC CGG GGT GGT TATCCG AAG CTT TAT TTT AGC CGG GGT GGT TAT HindIIIHindIII AdjuvantAdjuvant LTBLTB CCGC GAA TTC GCT CCC CAG TCT ATT ACA GCCGC GAA TTC GCT CCC CAG TCT ATT ACA G EcoRIEcoRI CCGC AAG CTT CTA GTT TTC CAT ACT GAT TGCCGC AAG CTT CTA GTT TTC CAT ACT GAT TG HindIIIHindIII

상기 프라이머를 이용하여 증폭시킨 유전자의 서열정보는, F4(K88ab)는 GenBank V00292.1; F4(K88ac)는 GenBank AJ616256.1; F5(K99)는 GenBank M35282.1; F6(FasA)는 GenBank U50547.1; F18(FedA)는 GenBank AY569976.1; F18(FedF)는 GenBank AY970818.1; F41은 GenBank X14354.1; Intimin(Eae)은 GenBank FJ609803.1; LTB는 GenBank EU113255.1에서 용이하게 입수할 수 있다.Sequence information of the gene amplified using the primer, F4 (K88ab) is GenBank V00292.1; F4 (K88ac) is shown by GenBank AJ616256.1; F5 (K99) is GenBank M35282.1; F6 (FasA) is shown by GenBank U50547.1; F18 (FedA) is described by GenBank AY569976.1; F18 (FedF) is shown by GenBank AY970818.1; F41 is GenBank X14354.1; Intimin (Eae) is described in GenBank FJ609803.1; LTB is readily available from GenBank EU113255.1.

1- 3. 1- 3. 부착인자를Attachment factor 발현하는 대장균의 제작 Production of E. coli

실시예 1-2에서 정제된 PCR 증폭산물과 pQE9 (EcoRI과 HindIII), pQE10 (BamHI과 HindIII) 또는 pET28a (EcoRI과 HindIII) 플라스미드를 표 2에서 기술된 제한 효소로 각각 절단한 후 아가로스 겔에서 전기영동하였다. 절단된 각 절편을 AccuPrep 겔 정제 키트를 이용하여 정제한 다음 T4 DNA 리가아제(Takara, Japan)로 두 산물을 라이게이션한 후 E. coli JM109 또는 E. coli Top 10으로 형질전환하였다. 이들 형질전환된 균주를 앰피실린(pQE9 또는 pQE10을 발현 플라스미드로 사용하였을 경우) 또는 카나마이신(pET28a를 발현 플라스미드로 사용하였을 경우)이 각각 첨가된 LB 아가에 골고루 펴서 말린 다음 37℃에서 하룻밤 배양하여 발현 플라스미드로 형질전환 된 E. coli JM109 또는 E. coli Top 10을 선택하였다. PCR amplification products purified in Example 1-2 and pQE9 (EcoRI and HindIII), pQE10 (BamHI and HindIII) or pET28a (EcoRI and HindIII) plasmid were digested with the restriction enzymes described in Table 2, respectively, and then Electrophoresis. Each digested section was purified using AccuPrep gel purification kit and then ligated to two products with T4 DNA ligase (Takara, Japan) and transformed with E. coli JM109 or E. coli Top 10. These transformed strains were evenly dried over LB agar containing ampicillin (when pQE9 or pQE10 was used as the expression plasmid) or kanamycin (when pET28a was used as the expression plasmid), and then cultured overnight at 37 ° C. E. coli JM109 or E. coli Top 10 transformed with plasmid was selected.

각 부착인자유전자가 삽입된 플라스미드는 E. coli JM109 또는 E. coli Top 10으로부터 AccuPrep 플라스미드 추출 키트 (Bioneer, Korea)를 이용하여 플라스미드를 분리하여 표 2에 제시된 바와 같이 제한 효소로 절단하여 아가로스 겔 에서 전기영동하여 확인하였다. 그리고 이렇게 확인된 해당 콜로니를 각 발현 플라스미드에 맞는 항생제가 첨가된 LB broth 5㎖에 접종하여 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 배양된 균액 중 250㎕를 각 항생제가 첨가된 새로운 5㎖ LB broth에 재접종하여 45분간 배양한 후 이중 1㎖는 유도 전 대조군으로 사용하기 위해 멸균 소형관으로 옮겼다. 나머지 4㎖에는 IPTG(isopropyl-βD-thiogalactopyranoside)의 최종 농도가 1mM이 되도록 첨가하여 3시간 동안 배양한 후 이중 1㎖는 유도 후 발현 여부를 확인하기 위해 멸균 소형관에 옮겼다. 그리고 나머지 3㎖는 발현 단백질이 가용성인지 또는 불용성인지를 확인하기 위해 4,000×g에서 20분간 원심분리한 후 멸균 PBS(phosphate buffered saline) 500㎕로 재부유시켰다. 이를 초음파처리 (sonication)하여 세포를 분쇄한 다음 10,000×g에서 20분간 원심분리하여 상층액은 새로운 멸균 소형관에 옮기고 침전물 (pellet)은 500㎕의 멸균 PBS로 재부유시켰다. 이들 상층액 (발현 단백질이 가용성일 경우)과 재부유액 (발현 단백질이 불용성일 경우) 그리고 유도전,후에 준비한 샘플들을 SDS-PAGE로 전기영동하여 각 부착인자의 발현 여부 및 발현 상태를 확인하였다. Plasmids to which each adjuvant gene was inserted were separated from E. coli JM109 or E. coli Top 10 using AccuPrep plasmid extraction kit (Bioneer, Korea) and digested with restriction enzymes as shown in Table 2 to agarose gel. It was confirmed by electrophoresis at. The colonies thus identified were inoculated in 5 ml of LB broth to which antibiotics for each expression plasmid were added and incubated overnight at 37 ° C. 250 μl of the cultured bacteria was re-inoculated into fresh 5 ml LB broth with each antibiotic and incubated for 45 minutes, of which 1 ml was transferred to a sterile tube for use as a control before induction. The remaining 4ml was added so that the final concentration of IPTG (isopropyl- β D-thiogalactopyranoside) was 1mM and incubated for 3 hours, 1ml of which was transferred to a sterile small tube to confirm expression after induction. The remaining 3 ml was centrifuged at 4,000 × g for 20 minutes to determine whether the expressed protein was soluble or insoluble and then resuspended in 500 μl of sterile PBS (phosphate buffered saline). The cells were sonicated and crushed, and then centrifuged at 10,000 × g for 20 minutes, the supernatant was transferred to a new sterile small tube, and the pellet was resuspended in 500 μl of sterile PBS. These supernatants (when the expressed protein is soluble), resuspension (when the expressed protein is insoluble), and samples prepared before and after induction were electrophoresed by SDS-PAGE to confirm the expression and expression status of each adhesion factor.

1-4. 각 1-4. bracket 부착인자Attachment factor 항원 및 항혈청 준비 Antigen and Antiserum Preparation

실시 예 1-3에서 확인된 콜로니를 LB broth 200㎖에 접종하여 30℃에서 150rpm의 속도로 흔들어 주면서 하룻밤 배양하였다. 이 배양액에 IPTG의 최종농도가 1mM이 되도록 첨가하여 같은 조건으로 4시간 재배양한 후 8,000rpm, 4℃에서 15분간 원심분리하였다. 상층액은 버리고 침전물은 PMSF(phenylmethanesulfonyl fluoride)가 1mM이 되도록 첨가된 10㎖의 멸균 PBS로 재부유시켰다. 이 부유액을 -70℃에서 냉동한 다음 37℃ 수욕조 내에서 해동하였다. 이와 같이 냉동과 해동의 과정을 2~3회 반복한 다음 마지막으로 해동한 후 부유액을 초음파처리하여 세포들을 분쇄하였다. 이 초음파처리된 액을 15,000rpm, 4℃에서 20분간 원심분리하여 상층액을 멸균관에 옮겼다. 발현 단백질이 가용성일 경우에는 버퍼 B (100mM NaH2PO4, 10mM Tris?Cl, 8M urea, pH 8.0) 4㎖를 상층액과 혼합하였고 불용성일 경우에는 6㎖의 버퍼 B로 침전물을 재부유시킨 후 실온에서 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 이 반응액을 15,000rpm, 4℃에서 20분간 원심분리한 후 상층액을 레진(resin)이 들어 있는 관으로 옮겨 단백질이 레진과 결합하도록 30분간 교반하였다. 이 반응액을 준비된 칼럼에 충전시키고 천천히 흘려보낸 다음 버퍼 C (100mM NaH2PO4, 10mM Tris?Cl, 8M urea, pH 6.3)를 6㎖씩 충전하여 칼럼을 3회 세정하여　 레진과 결합하지 않은 기타 불필요한 단백질을 제거하였다. 2㎖의 용리 버퍼(100mM NaH2PO4, 10mM Tris?Cl, 8M urea, pH 4.5)로 칼럼을 충전시킨 후 20분간 반응시켜 발현 단백질을 레진으로부터 분리시킨 다음 용리 버퍼를 1㎖씩 첨가하여 단백질을 회수하였다. 회수된 단백질을 SDS-PAGE에서 전기영동하여 발현 단백질을 확인하였으며 단백질량을 정량한 후 -70℃에 보관하며 ELISA 항원으로 사용하였다. Colonies identified in Examples 1-3 were inoculated in 200 ml of LB broth and incubated overnight while shaking at a speed of 150 rpm at 30 ° C. The final concentration of IPTG was added to the culture solution so as to be 1mM, followed by 4 hours of incubation under the same conditions, followed by centrifugation at 8,000rpm and 4 ° C for 15 minutes. The supernatant was discarded and the precipitate was resuspended in 10 ml of sterile PBS with 1 mM PMphenyl (phenylmethanesulfonyl fluoride). The suspension was frozen at −70 ° C. and then thawed in a 37 ° C. water bath. As described above, the processes of freezing and thawing were repeated two to three times, and then thawed, and the suspension was sonicated to pulverize cells. The sonicated solution was centrifuged at 15,000 rpm for 20 minutes at 4 ° C, and the supernatant was transferred to a sterile tube. If the expressed protein is soluble, 4 ml of buffer B (100 mM NaH 2 PO 4 , 10 mM Tris®Cl, 8 M urea, pH 8.0) was mixed with the supernatant and, if insoluble, the precipitate was resuspended with 6 ml of buffer B. After the reaction was stirred for 1 hour at room temperature. The reaction solution was centrifuged at 15,000 rpm for 20 minutes at 4 ° C., and then the supernatant was transferred to a tube containing a resin and stirred for 30 minutes to bind the protein to the resin. The reaction solution was charged to the prepared column and slowly flowed. Then, the column was washed three times with 6 ml of buffer C (100 mM NaH 2 PO 4 , 10 mM TrisCl, 8 M urea, pH 6.3). Other unnecessary proteins were removed. Fill the column with 2 ml of elution buffer (100 mM NaH 2 PO 4 , 10 mM Tris Cl, 8 M urea, pH 4.5), react for 20 minutes to separate the expressed protein from the resin, and add 1 ml of elution buffer to the protein. Was recovered. The recovered protein was identified by electrophoresis on SDS-PAGE, and the amount of protein was quantified and stored at -70 ° C and used as an ELISA antigen.

1주일 정도의 적응기간을 거친 약 2Kg 정도의 암컷 뉴질랜드 흰토끼(New Zealand white rabbit)에 위에서 준비된 각 부착인자 항원이 200㎍이 되도록 멸균 PBS로 희석 한 후 프로인트 완전면역증강제(Freund's complete adjuvant)과 동량 혼합하여 피하 접종하였다. 1차 접종 14일 후에 동량의 항원을 프로인트 불완전면역증강제(Freund's incomplete adjuvant)과 같은 방법으로 혼합하여 피하 접종하여 부스팅(boosting)하였다. 2차 접종 후 14일째에 채혈하여 혈청을 분리한 다음 -70℃에 보관하며 각 부착인자 항혈청으로 사용하였다. After approximately one week of adaptation, approximately 2 kg of female New Zealand white rabbits were diluted with sterile PBS so that each of the adhesion factor antigens prepared above was 200 µg and then Freund's complete adjuvant. Inoculated subcutaneously by mixing in equal amounts. 14 days after the first inoculation, the same amount of antigen was mixed and boosted by subcutaneous inoculation in the same manner as Freund's incomplete adjuvant. Blood was collected on the 14th day after the second inoculation, and serum was separated and stored at -70 ° C and used as anti-serum of each attachment factor.

실시예Example 2: 각  2: each 부착인자를Attachment factor 발현?분비하는  Manifestation and secretion 약독화Attenuation 살모넬라  Salmonella 티피무리움의Typhimurium 제작 및 확인 Build and verify

2-1. 병원성 대장균의 2-1. Escherichia coli 부착인자Attachment factor 유전자를  Gene asdasd 유전자를 포함한 플라스미드에 클로닝 Cloning into Plasmids Containing Genes

부착인자 유전자의 발현이 확인된 각 플라스미드와 pBP244를 표 2에서 제시한 제한효소로 절단한 후 아가로스 겔에서 전기영동하였다. 펩티도글리칸 합성과 관련된 asd 유전자를 갖고 있는 플라스미드인 pBP244의 제작은 문헌(Kim et al., 2007, Journal of Microbiology and Biotechnology, 17: 1316-1323)에 상세히 기술되어 있다. pBP244는 SecA, SecB 및 LepB 시스템을 이용하여 발현되는 항원의 분비가 증가되도록 개발된 셔틀 플라스미드이다. AccuPrep 겔 정제 키트를 이용하여 아가로스 겔로부터 절단된 부착인자와 pBP244 절편을 정제하고 T4 DNA 리가아제를 이용하여 4℃에서 하룻밤 라이게이션하였다. 이 라이게이션된 반응액으로 E. coli χ6212 (JOL767)를 형질전환시켜 DAP을 첨가하지 않은 LB 아가에 골고루 펴서 말린 다음 하룻밤 배양하여 pBP244에 의하여 형질전환된 균주를 선택하였다. 각 부착인자의 확인은 E. coli χ6212로부터 플라스미드를 분리하여 각 부착인자에 해당하는 제한 효소로 절단한 후 아가로스 겔에서 전기영동하여 최종 확인하였다.　　　 Each plasmid and pBP244 whose expression of the adhesion factor gene was confirmed were digested with the restriction enzymes shown in Table 2 and electrophoresed on an agarose gel. The construction of pBP244, a plasmid with an asd gene associated with peptidoglycan synthesis, is described in detail in Kim et al., 2007, Journal of Microbiology and Biotechnology, 17: 1316-1323. pBP244 is a shuttle plasmid developed to increase secretion of antigens expressed using the SecA, SecB and LepB systems. Attachment factor and pBP244 fragments cleaved from agarose gels were purified using AccuPrep gel purification kit and ligated at 4 ° C. overnight using T4 DNA ligase. The ligated reaction solution was transformed into E. coli χ6212 (JOL767), spread evenly over LB agar without DAP, and then cultured overnight to select strains transformed with pBP244. Confirmation of each adhesion factor was confirmed by final plasmid separation from E. coli χ6212, digestion with restriction enzymes corresponding to each attachment factor, and electrophoresis on agarose gel.

2-2. 병원성 대장균의 2-2. Escherichia coli 부착인자Attachment factor 유전자를 포함한 플라스미드를  Plasmids containing genes 약독화Attenuation 살모넬라  Salmonella 티피무리움에In Typhimurium 형질전환 Transformation

위에서 최종 확인된 각 정제 플라스미드를 일렉트로포레이션(electropoartion)방법에 의하여 JOL912에 형질전환시켜 JOL940 (K88ab 발현?분비), JOL941 (K88ac 발현?분비), JOL946 (K99 발현?분비), JOL937 (FasA 발현?분비), JOL934 (FedA 발현?분비), JOL935 (FedF 발현?분비), JOL947 (F41 발현?분비), JOL948 (intimin 발현?분비)를 얻었다. 즉, JOL 912를 DAP (50㎍/㎖)이 포함된 LB broth에서 중간-로그 단계(mid-log phase)까지 배양한 후 멸균된 ice-cold 10% 글리세롤 함유 증류수로 두 번 세척하였다. 준비된 JOL912를 0.2 ㎝ 큐벳에 넣고 플라스미드 0.1 ㎍과 섞은 후 Bio-Rad MicroPulser (Bio-Rad, USA)의 사전 프로그램 세팅 중 Ec2에 따라 전기충격을 가하였다. 반응된 균을 큐벳에서 회수한 다음 DAP을 넣지 않은 LB broth 1㎖를 첨가하여 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 형질전환된 살모넬라균을 선별하기 위해 배양된 균액 100㎕를 다시 DAP을 첨가하지 않은 LB 아가에 골고루 펴서 말린 다음 37℃에서 하룻밤 배양한 후 형성된 균주를 선별하였다. (표 1, 도 2)Each purified plasmid finally identified above was transformed into JOL912 by an electropoartion method to express JOL940 (expressed and secreted K88ab), JOL941 (expressed and secreted K88ac), JOL946 (expressed and secreted K99), and JOL937 (FasA expressed). Secretion), JOL934 (FedA expression and secretion), JOL935 (FedF expression and secretion), JOL947 (F41 expression and secretion), and JOL948 (intimin expression and secretion) were obtained. That is, JOL 912 was incubated in a LB broth containing DAP (50 μg / ml) until the mid-log phase and washed twice with sterile ice-cold 10% glycerol-containing distilled water. The prepared JOL912 was placed in a 0.2 cm cuvette, mixed with 0.1 μg of plasmid, and subjected to electric shock according to Ec2 during pre-program setting of Bio-Rad MicroPulser (Bio-Rad, USA). The reacted bacteria were recovered from the cuvette and then incubated at 37 ° C. for 1 hour by adding 1 ml of LB broth without DAP. In order to screen for transformed Salmonella bacteria, 100 μl of the culture solution was spread evenly over LB agar without DAP, and then dried overnight at 37 ° C., and the strains formed were selected. Table 1, FIG. 2

또한 백신의 면역반응 유도를 강화하기 위해 E. coli의 열민감독소 서브유닛(heat-labile toxin subnuit B; LTB)를 클로닝하여 위와 동일한 방법으로 형질전환시켜 JOL 906 (LTB 발현?분비)을 얻어 경구접종용 면역증강제로 사용하였다.In addition, E. coli heat-labile toxin subnuit B (LTB) was cloned and transformed in the same manner to enhance the induction of immune response of the vaccine to obtain JOL 906 (LTB expression and secretion). It was used as an immunopotentiator for inoculation.

본 발명자들은 돼지의 병원성 대장균의 부착인자 F4(K88ab), F4(K88ac), F5(K99), F6(FasA), F18(FedA), F18(FedF), F41 또는 Intimin 유전자를 각각 포함하는 8개의 살모넬라균 변이주 모두를 포함하는 혼합 살모넬라균 변이주와 돼지의 병원성 대장균의 LTB(heat-labile enterotoxin B subunit) 유전자를 포함하는 살모넬라균 변이주를 포함하는 혼합 살모넬라균 변이주를 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하였다(기탁번호 KCTC11541BP, Samonella Typhymurium strain JOLPV9(mix), 2009년 8월 3일 기탁).The present inventors have identified eight genes of the E. coli F4 (K88ab), F4 (K88ac), F5 (K99), F6 (FasA), F18 (FedA), F18 (FedF), F41 or Intimin genes. Mixed Salmonella strains containing both Salmonella strains containing both Salmonella strains and Salmonella strains containing the heat-labile enterotoxin B subunit (LTB) gene of the pathogenic Escherichia coli of pigs were selected from the Korea Institute of Biotechnology and Biotechnology Center (KCTC). ) it was deposited with the (accession number KCTC11541BP, Samonella Typhymurium strain JOLPV9 (mix), deposited August 3, 2009).

2-3. 2-3. 약독화Attenuation 살모넬라  Salmonella 티피무리움Typhimurium 배양액 내에서 발현?분비된 각  Each expressed and secreted in the culture medium 부착인자Attachment factor 확인 Confirm

실시예 2-2에서 제작된 백신 균주가 해당 부착인자를 발현하여 세포 밖으로 분비하는지를 확인하기 위하여 각 백신 후보균주를 100㎖ LB broth에 하룻밤 배양 한 후 7,000 rpm에서 원심분리하여 상청액 샘플을 준비하였다. 이 상청액은 ice-cold 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid)이 10%가 되도록 첨가하여 얼음 위에서 30분간 반응시킨 후 원심분리하여 침전물은 세포 내에 남아 있는 발현 항원을 검출하는데 사용하였다. 각 샘플을 94℃에서 5분간 끓인 후 SDS-PAGE를 수행한 다음 PVDF 멤브레인으로 옮겨 블로킹 버퍼(3% skim milk in PBST)로 하룻밤 반응시켰다. 다음 날 실시예 1-4에서 준비한 각 부착인자에 대한 항혈청 (폴리클로날 항체)을 1:200내지는 1:250으로 희석하여 1시간 반응시킨 후 1:40,000으로 희석된 2차 항체 (goat anti-rabbit IgG(H+L) HRP)로 1시간 반응시켰다. WEST-oneTM Western Blotting System (Intron Biotechnology, Korea)으로 발색하여 발현을 확인하였다. 웨스턴 블롯의 결과 각 부착인자가 잘 발현되어 분비되는 것이 확인되었으며 일부의 부착인자는 발현 부착인자끼리 서로 결합하여 이량체(dimer) 또는 폴리머를 형성하는 경우가 있음이 확인되었다. 그리고 대조군의 경우에는 각 부착인자에 상응하는 항원을 발현하지 않았다. (도 3 참조)In order to confirm whether the vaccine strain prepared in Example 2-2 expresses the adhesion factor and secretes it out of the cells, the supernatant samples were prepared by incubating each vaccine candidate strain overnight in 100 ml LB broth and centrifuging at 7,000 rpm. The supernatant was added to 10% ice-cold trichloroacetic acid, reacted for 30 minutes on ice, and centrifuged to precipitate the remaining antigen. Each sample was boiled at 94 ° C. for 5 minutes, followed by SDS-PAGE, and then transferred to a PVDF membrane and reacted overnight with blocking buffer (3% skim milk in PBST). The next day, the antiserum (polyclonal antibody) for each adhesion factor prepared in Examples 1-4 was diluted at 1: 200 to 1: 250 for 1 hour, followed by a secondary antibody diluted at 1: 40,000 (goat anti- rabbit IgG (H + L) HRP) for 1 hour. The expression was confirmed by color development with WEST-oneTM Western Blotting System (Intron Biotechnology, Korea). As a result of the Western blot, it was confirmed that each adhesion factor was well expressed and secreted, and that some adhesion factors were combined with each other to form dimers or polymers. And in the case of the control group did not express the antigen corresponding to each attachment factor. (See Fig. 3)

　

실시 예 3: 백신 조성물의 제조Example 3: Preparation of Vaccine Composition

3-1. 생균 백신의 제조　　　　　　3-1. Preparation of Probiotic Vaccine

생균 백신을 준비하기 위해서는 실시예 2-3에서 각 부착인자의 발현?분비가 확인된 약독화 살모넬라 티피무리움을 10㎖ LB Broth에 접종하여 37℃에서 200 rpm의 속도로 16시간 배양하였다. 이 배양액을 1/100 (부피)의 비율로 100㎖ LB broth에 첨가하여 같은 조건에서 3~5 시간 동안 재배양하였다. 이 재배양액을 4℃에서 4,000 rpm으로 원심분리하여 상층액은 버리고 침전물은 멸균 PBS로 재부유시키는 방법으로 세척하였다. 같은 방법으로 2번 더 세척한 후 마지막 침전물은 수크로즈가 20% 함유된 멸균 PBS (PBS-수크로즈) 소량으로 부유시켜 OD600값을 측정하여 균수를 확인하였다. 10㎖ PBS-수크로즈에 각 부착인자를 발현?분비하는 약독화 살모넬라 티피무리움 및 LTB를 발현?분비하는 약독화 살모넬라 티피무리움이 각각 2.5×109 cfu가 되도록 혼합하여 생균백신으로 준비하였다. 단 생균백신으로 1차 및 2차 모두를 경구로 접종할 경우에는 2차 접종시에는 LTB를 발현?분비하는 약독화 살모넬라 티피무리움을 제외한 생균백신을 접종하였다.In order to prepare a live vaccine, attenuated Salmonella typhimurium in which the expression and secretion of each adhesion factor was confirmed in Example 2-3 was inoculated in 10 ml LB Broth and incubated at 37 ° C. at a speed of 200 rpm for 16 hours. This culture was added to 100 ml LB broth at a rate of 1/100 (volume) and re-cultured for 3 to 5 hours under the same conditions. The culture was centrifuged at 4,000 rpm at 4 ° C to discard the supernatant and the precipitate was washed by resuspension with sterile PBS. After washing twice more in the same way, the final precipitate was suspended in a small amount of sterile PBS (PBS-Sucrose) containing 20% sucrose to determine the bacterial count by measuring the OD 600 value. Attenuated Salmonella typhimurium expressing and secreting each adhesion factor in 10 ml PBS-Sucrose and attenuated Salmonella typhimurium expressing and secreting LTB were mixed to be 2.5 × 10 9 cfu, respectively. . However, when inoculated orally with both primary and secondary vaccines, live vaccines were inoculated except for attenuated Salmonella typhimurium, which expresses and secretes LTB during the second inoculation.

3-2. 사균 백신의 제조　　　　　　3-2. Preparation of Bacillus Vaccine

사균백신을 준비하기 위해서는 상기와 같은 방법으로 약독화 살모넬라 티피무리움을 준비하고 세척하였다. 마지막 세척 후 침전물을 멸균 PBS로 109 cfu/ml가 되도록 희석한 후 포르말린의 최종 농도가 1%가 되도록 첨가하였다. 실온에서 24시간 동안 반응시켜 불활화시킨 다음 멸균 PBS로 3번 세척하였다. 이 부유액 100㎕를 트립틱 소이 아가(Tryptic Soy Agar)에 접종한 후 37℃에서 하룻밤 배양하여 균의 사멸 여부를 확인하였다. 백신균주의 불활화 여부를 확인한 후 각 약독화 살모넬라 티피무리움이 2.5×109 세포가 되도록 수산화 알미늄겔 10mg/ml에 혼합하여 사균 백신으로 준비한 다음 4℃에 보관하면서 실험에 사용하였다.　To prepare the bacteriophage vaccine, the attenuated Salmonella typhimurium was prepared and washed in the same manner as described above. After the last wash the precipitate was diluted to 10 9 cfu / ml with sterile PBS and then added to a final concentration of formalin of 1%. The reaction was inactivated for 24 hours at room temperature and then washed three times with sterile PBS. 100 μl of the suspension was inoculated in Tryptic Soy Agar and then cultured overnight at 37 ° C. to confirm whether the bacteria were killed. After confirming the inactivation of the vaccine strain, each attenuated Salmonella typhimurium was mixed with 10 mg / ml of aluminum hydroxide gel so that 2.5 × 10 9 cells were prepared as a vaccinated vaccine and stored at 4 ° C. and used for the experiment.

　

실시 예 4:　백신 조성물의 효과 확인Example 4 Confirmation of Effect of Vaccine Composition

4-1. 4-1. 모돈에서In sows 접종경로별By inoculation route 백신 효능 시험 Vaccine efficacy test

　　　　　　　

4-1-1. 4-1-1. 모돈에서In sows 백신의  Vaccine 접종경로Inoculation Path 및 방법 And method

접종 경로 및 방법을 달리하여 예방접종을 실시한 후 각 부착인자 및 살모넬라 티피무리움의 지다당류 (lipopolysaccharide; LPS)에 대한 특이 면역반응 유도 여부를 알아보기 위해 임신 모돈 12두를 한 그룹 당 3두씩 총 4 그룹 (그룹 A, B, C, D)으로 나누어 실험하였다. After the immunization with different inoculation routes and methods, three heads of 12 pregnant sows, three for each group, were examined to determine whether a specific immune response against lipopolysaccharide (LPS) of each attachment factor and Salmonella typhimurium was induced. Experiments were divided into four groups (groups A, B, C, D).

그룹 A는 분만 예정일 8주 전인 임신 모돈에 사균백신을 1차 근육 접종 (intramuscular injection; IM) 한 다음 3주 후 (분만 예정일 5주 전)에 생균백신을 경구로 2차 접종하였다. Group A was given an intramuscular injection (IM) of the first injection of the bacteriophage vaccine into gestation sows 8 weeks prior to the onset of delivery, followed by oral vaccination of the live vaccine three weeks later (5 weeks before the onset of delivery).

그룹 B는 임신 모돈이 분만 예정일 8주 전일 때 생균백신을 경구로 1차 접종 한 다음 3주 후에 LTB를 발현?분비하는 약독화 살모넬라 티피무리움을 제외한 생균백신을 2차 경구접종하였다. Group B was orally inoculated with the live vaccine first when 8 weeks before gestational sows, and then, after 3 weeks, the mice were orally inoculated with the live vaccine except for the attenuated Salmonella typhimurium, which expresses and secretes LTB.

그룹 C는 분만 예정일 8주 전 임신 모돈에 생균 백신을 경구로 1차 접종 한 다음 3주 후에 사균백신을 근육으로 2차 접종하였다. Group C was given an oral first dose of live vaccine to pregnant sows 8 weeks before the expected delivery date, and then 2 weeks later to a second dose of vaccinated vaccine.

그룹 D는 모돈이 분만 예정일 8주전 및 5주전 일 때 PBS-수크로즈를 각각 경구로 접종하여 대조군으로 사용하였다. Group D was orally inoculated with PBS-sucrose when sows were given 8 and 5 weeks before the scheduled delivery date and used as controls.

백신 접종 전, 1차 백신 접종 후 3주, 2차 접종 후 2주, 분만 시점에 모돈에서 그리고 자돈이 태어난 후 6일째 (1주령)에 각각 혈액을 채취하여 분리한 혈청을 대상으로 각 부착인자 항원 및 살모넬라 티피무리움의 LPS에 대한 혈청 IgG 및 IgA 그리고 분만 동안에 채취된 초유에서 같은 항원에 대한 sIgA 및 점막 IgG의 항체 역가를 간접 ELISA 방법으로 측정하였다. 예방접종 된 모돈에서 출생한 자돈이 1주령이 되었을 때 국내에서 분리된 병원성 대장균 야외 분리주 (JOL599, 489, 564, 500) 또는 살모넬라 티피무리움 야외 분리주 (JOL398)를 경구 감염시킨 후 설사 유무로 방어 효과를 측정하였다. (표 3)Each attachment factor was obtained from serum collected and separated from sows before vaccination, 3 weeks after the first vaccination, 2 weeks after the second vaccination, at the time of delivery and 6 days (1 week of age) after the piglets were born. Antibody titers of sIgA and mucosal IgG against the same antigen in serum IgG and IgA against LPS of antigen and Salmonella typhimurium and colostrum taken during delivery were measured by indirect ELISA method. When piglets born from vaccinated sows were 1 week old, they were protected by diarrhea after oral infection with an isolated strain of Escherichia coli (JOL599, 489, 564, 500) or Salmonella typhimurium field isolate (JOL398). The effect was measured. (Table 3)

접종 경로별 백신접종 및 도전감염 실험 개요Overview of Vaccination and Challenge Infection by Inoculation Pathway 그룹group 접종 두수Inoculation head 예방접종Vaccination 도전감염Challenge 모돈Sows 자돈Piglets 분만 8주전8 weeks before delivery 분만 5주전5 weeks before delivery 1주령1 week old AA 33 근육접종　
사균백신Inoculation
Bacillus vaccine 경구접종　
생균백신Oral vaccination
Live vaccine JOL599, 489, 564, 500이
각각 1×109 cfu가 되도록 혼합하여 경구접종,
JOL389를 1×109 cfu로
경구접종JOL599, 489, 564, 500
Oral inoculation by mixing to 1 × 10 9 cfu,
JOL389 to 1 × 10 9 cfu
Oral vaccination BB 33 경구접종　
생균백신Oral vaccination
Live vaccine 경구접종　
생균백신Oral vaccination
Live vaccine CC 33 경구접종　
생균백신Oral vaccination
Live vaccine 근육접종　
사균백신Inoculation
Bacillus vaccine DD 33 20% 수크로즈20% sucrose 20% 수크로즈20% sucrose

4-1-2. 4-1-2. 접종경로별By inoculation route 혈청에서의 대장균  Escherichia coli in serum 부착인자에On the attachment factor 대한 항체  Against antibodies 역가Potency

살모넬라 티피무리움의 LPS는 LPS 추출 키트 (Intron Biotechnology, Korea) 판매제조회사에서 추천하는 방법에 따라 야외 분리균주인 JOL389 (Salmonella Typhimurium 야외균주)로부터 정제하여 -70℃에 보관하며 ELISA 항원으로 사용하였다. 간접 ELISA는 각 부착인자 항원 및 LPS를 플랫 버텀 96웰 고결합 ELISA 플레이트 (Greiner, Germany)에 흡착시킨 후 돼지 IgG (또는 IgA) ELISA 정량 키트 (Bethyl, Tx, USA)를 사용하여 사용설명서의 방법에 따라 실시하였다. Salmonella typhimurium LPS was purified from the outdoor isolate strain JOL389 (Salmonella Typhimurium field strain) according to the method recommended by the LPS extraction kit (Intron Biotechnology, Korea) sales company, stored at -70 ℃ and used as ELISA antigen. . Indirect ELISA was carried out using the porcine IgG (or IgA) ELISA quantification kit (Bethyl, Tx, USA) after adsorbing each attachment antigen and LPS to a flat bottom 96 well high binding ELISA plate (Greiner, Germany). It was carried out according to.

백신 접종군 (그룹 A, B, C) 모두에서 각 부착인자에 대한 특이 혈청 IgG는 백신을 1차 접종한 3주 후부터 증가하기 시작하여 대다수의 부착인자 (K88ac와 F41 제외)에 대한 항체역가는 분만시점에 최고의 역가가 관찰되었다. 혈청 IgA의 경우에는 모든 부착인자에서 백신 접종 후 분만 시점에 높은 항체 역가 유도되었다. 하지만 대조군에서의 혈청 IgG 및 IgA 항체 역가는 접종 전부터 분만시점까지 모든 부착인자에 대해 거의 변화가 없었다. 각 그룹에서 태어난 자돈이 초유 및 모유를 섭취한 후 6일째 (생후 1주령) 되는 날 채취한 혈청에서 각 부착인자에 대한 특이 항체 역가를 비교하여 보았다. 그룹 A에서 태어난 자돈의 혈청 IgG는 대조군에 비해 각 부착인자에 따라 차이는 있으나 최소 1.2배 (F41)에서 최고 2.6배 (K88ab) 이상 높은 항체 역가가 관찰되었다. 그리고 혈청 IgA는 대조군에 비해 최소 1.2배 (K99)에서 최고 10배 (intimin) 이상의 항체 역가가 관찰되었다. 그룹 B의 모돈에서 태어난 자돈에서의 각 부착인자에 대한 혈청 IgG 및 IgA는 그룹 A의 모돈에서 출생한 자돈에서의 항체 역가와 비슷하거나 높은 것으로 관찰되었다. 하지만 그룹 C의 경우에는 대조군과 비슷하거나 약간 높은 수준의 항체 역가가 관찰될 뿐이었다.(도 4a 내지 4c 참조)In all vaccinated groups (groups A, B, C), the specific serum IgG for each adhesion factor began to increase three weeks after the first vaccination of the vaccine, resulting in antibody titers for the majority of adhesion factors (except K88ac and F41). The highest titers were observed at delivery. In the case of serum IgA, high antibody titers were induced at all time points of delivery after vaccination. However, serum IgG and IgA antibody titers in the control group showed little change for all adhesion factors from pre-inoculation to delivery. The specific antibody titers of each attachment factor were compared in the serum collected from pigs born in each group 6 days (one week after birth) after ingesting colostrum and breast milk. The serum IgG of piglets born in group A was different for each attachment factor compared to the control group, but antibody titers of at least 1.2 fold (F41) and up to 2.6 fold (K88ab) were observed. Serum IgA showed antibody titers of at least 1.2-fold (K99) and at least 10-fold (intimin) compared to controls. Serum IgG and IgA for each attachment factor in piglets born from group B sows were observed to be comparable or higher than antibody titers in piglets born from group A sows. However, in group C, only similar or slightly higher levels of antibody titers were observed than in the control group (see FIGS. 4A-4C).

4-1-3. 4-1-3. 접종경로별By inoculation route 초유에서의 대장균  E. coli in colostrum 부착인자에On the attachment factor 대한 항체  Against antibodies 역가Potency

초유에서 점막 IgG의 경우 백신 접종군 (그룹 A, B, C)의 점막 IgG는 대조군 (그룹 D)에 비해 최소 1.3배 이상의 항체 역가가 관찰되었고 sIgA의 경우에는 백신 접종군이 대조군에 비해 최소 1.4배 이상의 항체 역가가 관찰되었다. 특히 1차와 2차 모두 경구로 접종한 그룹 B에서 전신 및 점막에서의 항체 역가가 그룹 A와 C에서의 항체 역가 보다 높거나 같은 수준으로 관찰되었다. (도 5a 및 5b 참조)In colostrum, the mucosal IgG of the vaccinated group (Groups A, B, C) had at least 1.3-fold higher antibody titer than that of the control group (Group D). More than doubled antibody titers were observed. In particular, the antibody titers in the systemic and mucosal groups were higher than or equal to the antibody titers in groups A and C in both group B and orally inoculated. (See Figures 5A and 5B)

그룹 A의 경우 살모넬라 티피무리움의 LPS에 대한 혈청 IgG 및 IgA는 1차 접종 3주 후부터 항체 역가가 증가하기 시작하여 2차 접종 후 2주 후에 최고의 항체 역가가 관찰되었다가 분만시점에 약간 감소하였다. 초유에서의 살모넬라 티피무리움의 LPS에 대한 점막 IgG는 그룹 D에 비해 약 1.3배가, sIgA는 약 2.8배의 항체역가가 관찰되었다. In Group A, serum IgG and IgA against LPS of Salmonella typhimurium began to increase in antibody titers three weeks after the first inoculation, with the highest antibody titers observed two weeks after the second inoculation and then slightly decreased at delivery. . Mucosal IgG against Salmonella typhimurium LPS in colostrum was about 1.3-fold higher than that of Group D, and sIgA was about 2.8-fold antibody titers.

그룹 B는 1차 접종 후 3주 후에 LPS에 대한 혈청 IgG 및 IgA는 그룹 A의 경우보다 월등히 높은 수준으로 증가하였다가 2차 접종 후 2주에는 그룹 A보다 약간 낮은 항체 역가로 관찰되었다. 그렇지만 분만 시점에 혈청 IgG는 그룹 A와 비슷한 수준의 항체역가가 그리고 혈청 IgA의 경우에는 그룹 A보다 높은 수준으로 다시 증가하였다. 더불어 초유에서 그룹 B의 점막 IgG는 그룹 A에 비해 높은 수준의 항체 역가가 그리고 sIgA의 경우에는 그룹 A보다 약간 낮은 수준의 항체 역가가 각각 관찰되었다. In group B, serum IgG and IgA for LPS increased significantly higher than that in group A three weeks after the first inoculation, with antibody titers slightly lower than group A two weeks after the second inoculation. At the time of delivery, however, serum IgG increased again to levels similar to that of group A and higher than group A for serum IgA. In colostrum, the antibody titers of mucosal IgG of group B were higher than that of group A and slightly lower than those of group A in sIgA.

그룹 C의 경우에는 혈청 IgG 및 IgA는 1차 접종 후부터 증가하기 시작하여 다른 그룹들과 마찬가지로 2차 후 2주째에 최고의 항체 역가를 보이다가 분만시점에는 다른 그룹들에 비해 낮은 항체 역가가 관찰되었다. 더불어 초유에서의 점막 IgG는 대조군에 비해 약 1.6배만이 그리고 sIgA는 오히려 대조군 보다 낮은 항체 역가가 관찰되었다. 그룹 A에서 태어난 자돈의 경우 혈청 IgG 및 IgA 모두 대조군에 비해 약 6배 높은 항체 역가가 관찰되었다. 그리고 그룹 B는 혈청 IgG 및 IgA 모두에서 그룹 A보다 약간 높은 항체 역가가 관찰되었다. 그렇지만 그룹 C의 경우에는 혈청 IgG는 그룹 A와 비슷한 수준의 항체 역가가, 그리고 혈청 IgA는 대조군에 비해 약간 높은 수준의 항체 역가만이 관찰되었다.(도 6 참조) In group C, serum IgG and IgA began to increase after the first inoculation and showed the highest antibody titers at 2 weeks after the second, as in the other groups, but at the time of delivery, lower antibody titers were observed compared to the other groups. In addition, mucosal IgG in colostrum was only about 1.6-fold higher than that of the control group, and sIgA showed lower antibody titers than the control group. For piglets born in group A, antibody titers approximately 6-fold higher were observed for both serum IgG and IgA compared to controls. And group B showed slightly higher antibody titers than group A in both serum IgG and IgA. However, in group C, only serum IgG showed similar antibody titers as group A, and serum IgA had only slightly higher levels of antibody titers than controls (see FIG. 6).

4-1-4. 다양한 경로로 4-1-4. In various ways 예방접종된Vaccinated 모돈에서In sows 출생한  Born 자돈의Piglets 병원성 대장균과 살모넬라균에 대한 방어 효과 Protective effect against pathogenic E. coli and Salmonella

모돈에 분만 8주와 5주 전에 각각 예방접종한 후 출생한 자돈이 1주령이 되었을 때 병원성 대장균 또는 살모넬라 티피무리움 야외분리주 (살모넬라균)로 각각 경구 감염시켜 폐사 및 설사 유무를 확인하여 백신의 효능을 비교하여 보았다. 그룹 A의 자돈에 병원성 대장균으로 도전감염 한 9두와 살모넬라균으로 도전감염 한 5두 모두에서 폐사뿐만 아니라 설사도 관찰되지 않았다. 그룹 B의 자돈 또한 병원성 대장균으로 도전감염 한 7두와 살모넬라균으로 도전감염 한 7두 모두에서 폐사 및 설사가 관찰되지 않았다. 하지만 그룹 C는 병원성 대장균으로 도전감염 한 8두 중 1두에서, 살모넬라균으로 도전감염 한 12두 중 4두에서 각각 설사가 관찰되었다. 그리고 대조군인 그룹 D는 병원성 대장균으로 도전감염 한 자돈 20두 중 5두가 폐사하였고 15두는 심한 설사가 관찰되었을 뿐만 아니라 살모넬라균으로 도전감염 한 6두 모두에서 심한 설사가 관찰되었다. 설사하는 자돈의 분변으로부터 균 분리 및 동정을 수행하여 도전감염 시킨 야외 분리균주가 각각 분리되었다. (표 4)When the sows born after 1 week of age were immunized with sows 8 and 5 weeks before delivery respectively, they were orally infected with Escherichia coli or Salmonella typhimurium field isolates (salmonella), respectively, to check for mortality and diarrhea. The efficacy was compared. Diarrhea as well as mortality were not observed in both group A pigs challenged with pathogenic E. coli and five cells challenged with Salmonella. Piglets from group B also had no mortality and diarrhea in both 7 challenged with pathogenic E. coli and 7 challenged with Salmonella. However, group C had diarrhea observed in 1 of 8 heads challenged with Escherichia coli and 4 of 12 heads challenged with Salmonella. In group D, 5 out of 20 piglets challenged with pathogenic E. coli died, 15 had severe diarrhea, and severe diarrhea was observed in all 6 infected with Salmonella. The isolates were challenged and isolated from the feces of diarrhea piglets. (Table 4)

다양한 경로로 예방접종된 모돈에서 출생한 자돈에서의 도전감염 후 병원성 대장균과 살모넬라균에 대한 방어 효과Protective effect against pathogenic E. coli and Salmonella after challenge infection in piglets born from sows vaccinated by various routes 그룹group 접종두수Inoculation head 도전감염Challenge 임상증상Clinical symptoms 설사 분변에서의
균 분리Diarrhea in the feces
Fungal separation 1주령 자돈1 week old piglets 폐사Our company 설사diarrhea AA 99 F4, F5, F6, F18, F41 발현 병원성 대장균 각각 1×109 cfu로 경구접종F4, F5, F6, F18, F41 expression Oral vaccination with 1 × 10 9 cfu 00 00 　 BB 77 00 00 　 CC 88 00 1One 병원성 대장균Escherichia coli DD 2020 55 1515 병원성대장균Escherichia coli AA 55 살모넬라 티피무리움 야외 분리주를 2×109 cfu로 경구접종Oral inoculation of Salmonella typhimurium outdoor isolate at 2 × 10 9 cfu 00 00 　 BB 77 00 00 　 CC 1212 00 44 살모넬라균Salmonella DD 66 00 66 살모넬라균Salmonella

국내 포유자돈에서 주로 발생하는 것으로 보고되고 있으며 또한 국내에서 시판되고 있는 병원성 대장균 예방백신과 관련된 병원성 대장균의 부착인자인 F4, F5, F6, F41과 포유자돈에서의 설사 원인균 중 하나인 살모넬라에 대한 방어여부를 확인하기 위해 K88ab, K88ac, K99, FasA, F41, Intimin을 각각 발현하는 백신균주를 실시 예 3-1에서와 같이 제조하여 실험에 사용하였다. 즉 준비된 예방백신을 모돈에 분만 8주와 5주 전에 실시 예 4-1-1의 그룹 B처럼 각각 경구로 예방접종한 후 출생한 자돈이 1주령이 되었을 때 병원성 대장균 또는 살모넬라 티피무리움 야외분리주 (살모넬라균)로 각각 경구 감염시켜 폐사 및 설사 유무를 확인하여 백신의 효능을 비교하여 보았다. 그룹 B-2의 자돈에 병원성 대장균으로 도전감염 한 7두와 살모넬라균으로 도전감염 한 3두 모두에서 폐사뿐만 아니라 설사도 관찰되지 않았다. 하지만 대조군인 그룹 D-2는 병원성 대장균으로 도전감염 한 5두 중 5두에서, 살모넬라균으로 도전감염 한 5두 중 5두에서 모두에서 심한 설사가 관찰되었다. 설사하는 자돈의 분변으로부터 균 분리 및 동정을 수행하여 도전감염시킨 야외 분리균주가 각각 분리되었다. (표 5) It is reported to occur mainly in domestic piglets and also to protect against Salmonella, one of the causative agents of diarrhea in mammalian pigs, F4, F5, F6, F41, which are the attachment factors of Escherichia coli, which are related to the commercially available pathogenic E. coli vaccine. In order to confirm whether the vaccine strains expressing K88ab, K88ac, K99, FasA, F41, Intimin respectively was prepared as in Example 3-1 and used in the experiment. In other words, E. coli or Salmonella typhimurium field isolates when the piglets were born at 1 week of age after oral vaccination of the prepared vaccines, such as group B of Example 4-1-1, 8 and 5 weeks before delivery to the sows. Oral infection with (Salmonella) confirmed mortality and diarrhea, and compared the efficacy of the vaccine. In both pigs of group B-2 challenged with Escherichia coli and three of them challenged with Salmonella, diarrhea as well as mortality was not observed. However, group D-2, a control group, had severe diarrhea in 5 out of 5 heads challenged with Escherichia coli and in 5 out of 5 heads challenged with Salmonella. The isolates were challenged and isolated from the feces of diarrhea piglets. (Table 5)

예방접종된 모돈에서 출생한 자돈에서의 도전감염 후 병원성 대장균과 살모넬라균에 대한 방어 효과Protective effect against pathogenic E. coli and Salmonella after challenge infection in piglets born from vaccinated sows 그룹group 접종두수Inoculation head 도전감염Challenge 임상증상Clinical symptoms 설사 분변에서의
균 분리Diarrhea in the feces
Fungal separation 1주령 자돈1 week old piglets 폐사Our company 설사diarrhea B-2B-2 77 F4, F5, F6, F41 발현 병원성
대장균 각각 1×109 cfu로
경구접종F4, F5, F6, F41 expression pathogenic
E. coli 1 × 10 9 cfu
Oral vaccination 00 00 D-2D-2 55 00 55 병원성 대장균Escherichia coli B-2B-2 33 살모넬라 티피무리움 야외 분리주를 2×1009 cfu로 경구접종Oral inoculation of Salmonella typhimurium outdoor isolate at 2 × 100 9 cfu 00 00 D-2D-2 55 00 55 살모넬라Salmonella

이상의 결과를 종합해 보면 경구로 1차 및 2차 모두를 예방접종한 경우가　탁월한 면역반응 유도와 더불어 병원성 대장균 및 살모넬라균에 대한 방어에 효과적임을 확인할 수 있었다Taken together, the results of oral immunization of both primary and secondary were shown to be effective in the defense against pathogenic E. coli and Salmonella, as well as inducing an excellent immune response.

　　　　　　

4-2. 4-2. 자돈에서In piglets 백신접종 후 특이 면역반응 유도 Induce specific immune responses after vaccination

4-2-1. 4-2-1. 자돈에서In piglets 백신의  Vaccine 접종경로Inoculation Path 및 방법 And method

자돈에서 예방접종 후 면역반응 유도 여부를 확인하기 위해 자돈을 4 그룹 (E, F, G, H)으로 나누어 그룹 E는 실시 예 4-1-1의 그룹 B에서와 같이 모돈에 각각 예방접종한 후 태어난 자돈을 대상으로 생후 2주령의 자돈에 사균백신을 근육으로 1㎖씩 접종하였다. 대조군에서 출생한 자돈 (그룹 F)은 멸균 PBS로 위와 같은 방법으로 각각 접종하였다. 그룹 G는 실시 예 4-1-1의 그룹 B에서와 같이 백신을 접종한 모돈에서 출생한 자돈이 2주령이 되었을 때 사균백신을 근육으로 1㎖씩 접종하고 5주령 때에 생균백신을 2㎖씩 경구접종하였다. 대조군에서 출생한 자돈 (그룹 H)은 멸균 PBS로 위와 같은 방법으로 각각 접종하였다. 백신 접종 후 각 부착인자 및 살모넬라 티피무리움의 LPS에 대한 특이 면역반응 유도 여부를 확인하기 위해 2주령 및 5주령째에 각각 혈액을 채취하여 혈청을 분리 한 후 혈청 IgG 및 IgA의 항체 역가를 간접 ELISA 방법으로 측정하였다. 그룹 E와 F의 자돈이 5주령이 되었을 대 병원성 대장균 (JOL599, 489, 564, 500)을 동량씩 섞어 혼합한 후 경구 감염시킨 후 설사 유무로 방어능에 대한 효과를 측정하였다. 그리고 그룹 G와 H의 자돈이 11주령이 되었을 때 살모넬라균 (JOL389)을 경구 감염시킨 후 설사 유무 및 분변에서의 균 분리동정으로 방어능에 대한 효과를 측정하였다. (표 6)In order to determine the induction of immune response after vaccination in piglets, piglets were divided into four groups (E, F, G, H) and group E was vaccinated into sows as in Group B of Example 4-1-1. Postnatal piglets were inoculated with 1 ml each of the mycobacterium vaccine into piglets at 2 weeks of age. Piglets born from the control group (group F) were inoculated in the same manner as above with sterile PBS. Group G was inoculated with 1 ml each of the vaccinated vaccine into muscle when piglets born from vaccinated sows were 2 weeks old, as in Group B of Example 4-1-1, and 2 ml each of live vaccines at 5 weeks of age. Oral inoculation. Piglets born from the control group (group H) were inoculated in the same manner as above with sterile PBS. After vaccination, blood samples were collected at 2 and 5 weeks of age to determine whether the specific factors of LPS of each attachment factor and Salmonella typhimurium were induced, and serum titers were used to indirect the antibody titers of serum IgG and IgA. It was measured by ELISA method. When group E and F piglets reached 5 weeks of age, pathogenic E. coli (JOL599, 489, 564, 500) were mixed in equal amounts and orally infected. In addition, when group G and H piglets were 11 weeks old, Salmonella (JOL389) was orally infected, and the effects of defense against diarrhea and bacterium isolation were measured. (Table 6)

　

자돈에서의 백신접종 및 도전감염 실험 개요Overview of Vaccination and Challenge Experiments in Piglets 그룹group 접종 두수Inoculation head 예방접종Vaccination 도전감염Challenge 모돈Sows 자돈Piglets 자돈Piglets 분만
예정일
8주전delivery
Due date
8 weeks ago 분만
예정일
5주전delivery
Due date
5 weeks ago 2주령2 weeks old 5주령5 weeks old 5주령5 weeks old 10주령10 weeks old EE 66 경구접종 생균백신Oral vaccination live vaccine 경구접종 생균백신Oral vaccination live vaccine 근육접종 사균백신Inoculated myococcal vaccine 　 JOL599, 489, 564, 500이 각각 1×109 cfu가 되도록 혼합하여 경구접종Oral inoculation with JOL599, 489, 564, 500 mixed to 1 × 10 9 cfu, respectively 　 FF 1616 20% sucrose20% sucrose 20% sucrose20% sucrose 멸균
PBSSterile
PBS 　 　 GG 1515 경구접종 생균백신Oral vaccination live vaccine 경구접종 생균백신Oral vaccination live vaccine 근육접종 사균백신Inoculated myococcal vaccine 경구접종 생균백신Oral vaccination live vaccine 　 JOL398를
5×109 cfu로
경구접종JOL398
With 5 × 10 9 cfu
Oral vaccination HH 1111 20% sucrose20% sucrose 20% sucrose20% sucrose 멸균
PBSSterile
PBS 20% sucrose20% sucrose 　

이유자돈에서 주로 발생하는 대장균증 (F4 발현 대장균과 F18 발현 대장균) 및 부종병 (F18발현 대장균)과 관련된 부착인자인 K88ab, K88ac 그리고 FedA와 FedF 및 이유 후 주로 발병하는 살모넬라증에 대한 방어 여부를 확인하기 위해 자돈을 4 그룹 (E-2, F-2, G-2, H-2)으로 나누어 그룹 E-2는 실시 예 4-1-1에서의 그룹 B에서와 같이 모돈에 각각 예방접종 (FedA 및 FedF는 제외) 한 후 태어난 자돈을 대상으로 생후 2주령의 자돈에 K88ab, K88ac,FedA 와 FedF 발현 백신균주로 제조된 사균백신을 근육으로 1㎖씩 접종하였고, 생후 4주령이 되었을 때 K88ab, K88ac,FedA 와 FedF 그리고 LTB 살모넬라 백신 균주가 각 2.5×109 cfu 가 되도록 2㎖ PBS-수크로즈에 혼합하여 경구로 각각 접종하였다. 대조군에서 출생한 자돈 (그룹 F-2)은 멸균 PBS로 위와 같은 방법으로 각각 접종하였다. 그룹 G-2는 실시 예 4-1-1의 그룹 B에서와 같이 백신(FedA 및 FedF는 제외)을 접종한 모돈에서 출생한 자돈이 2주령이 되었을 때 K88ab, K88ac,FedA 와 FedF 발현 백신균주로 제조된 사균백신을 근육으로 1㎖씩 접종하였고, 생후 5주령이 되었을 때 K88ab, K88ac,FedA 와 FedF 그리고 LTB 살모넬라 백신 균주가 각 2.5×109 cfu 가 되도록 2㎖ PBS-수크로즈에 혼합하여 경구로 각각 접종하였다. 대조군에서 출생한 자돈 (그룹 H-2)은 멸균 PBS로 위와 같은 방법으로 각각 접종하였다. 그룹 E-2와 F-2의 자돈이 5주령이 되었을 대 병원성 대장균 (JOL599, 500)을 동량씩 섞어 혼합한 후 경구 감염시킨 후 설사 유무로 방어능에 대한 효과를 측정하였다. 그리고 그룹 G-2와 H-2의 자돈이 11주령이 되었을 때 살모넬라균 (JOL389)을 경구 감염시킨 후 설사 유무 및 분변에서의 균 분리동정으로 방어능에 대한 효과를 측정하였다. (표 7) To determine the defense against K88ab, K88ac and FedA and FedF and the common post-weaning salmonella, associated with E. coli (F4 and E. coli), and edema (E. coli). The piglets were divided into four groups (E-2, F-2, G-2, H-2) and group E-2 was immunized with sows as in group B in Example 4-1-1 (FedA and Two-week-old piglets were inoculated with 1 ml each of the vaccinated vaccines prepared with K88ab, K88ac, FedA and FedF-expressing vaccine strains in muscle, and then, at 4 weeks of age, K88ab and K88ac. , FedA and FedF and LTB Salmonella vaccine strains were inoculated orally by mixing in 2ml PBS-Sucrose so that each 2.5 × 10 9 cfu. Piglets born from the control group (group F-2) were inoculated in the same manner as above with sterile PBS. Group G-2 is a K88ab, K88ac, FedA and FedF-expressing vaccine strain when piglets born from sows vaccinated with the vaccine (except FedA and FedF) were 2 weeks old as in Group B of Example 4-1-1. Inoculated with 1 ml each of the vaccinated vaccinated vaccine, and mixed with 2 ml PBS-sucrose so that the K88ab, K88ac, FedA and FedF and LTB Salmonella vaccine strains were 2.5 × 10 9 cfu at 5 weeks of age. Each was inoculated orally. Piglets born from the control group (group H-2) were inoculated in the same manner as above with sterile PBS. When the piglets of group E-2 and F-2 were 5 weeks old, pathogenic E. coli (JOL599, 500) were mixed in equal amounts and orally infected. When the piglets of group G-2 and H-2 were 11 weeks old, Salmonella (JOL389) was orally infected, and the effects of defense against diarrhea and bacterial separation in feces were measured. Table 7

자돈에서의 백신접종 및 도전감염 실험 개요Overview of Vaccination and Challenge Experiments in Piglets 그룹group 접종두수 Inoculation head 예방접종Vaccination 도전감염Challenge 모돈Sows 자돈Piglets 자돈Piglets 분만
예정일
8주전delivery
Due date
8 weeks ago 분만
예정일
5주전delivery
Due date
5 weeks ago 2주령2 weeks old 4주령4 weeks old 5주령5 weeks old 5주령5 weeks old 10주령10 weeks old E-2E-2 66 경구접종
생균백신
(단, FedA 및 FedF 제외)Oral vaccination
Live vaccine
(Except FedA and FedF) 경구접종
생균백신 (단, FedA 및 FedF 제외)Oral vaccination
Live vaccine (except FedA and FedF) 근육접종
사균백신 (K88ab, K88ac, FedA, FedF)Inoculation
Bacillus vaccine (K88ab, K88ac, FedA, FedF) 경구접종
생균백신 (K88ab, K88ac, FedA, FedF)Oral vaccination
Live vaccines (K88ab, K88ac, FedA, FedF) JOL599, 489, 564, 500이 각각 1×109 cfu가 되도록 혼합하여 경구접종
Oral inoculation with JOL599, 489, 564, 500 mixed to 1 × 10 9 cfu, respectively
FF 1616 20% sucrose20% sucrose 20% sucrose20% sucrose 멸균
PBSSterile
PBS 20% sucrose20% sucrose G-2G-2 1515 경구접종
생균백신
(단, FedA 및 FedF 제외)Oral vaccination
Live vaccine
(Except FedA and FedF) 경구접종
생균백신
(단, FedA 및 FedF 제외)Oral vaccination
Live vaccine
(Except FedA and FedF) 근육접종
사균백신 (K88ab, K88ac, FedA, FedF)Inoculation
Bacillus vaccine (K88ab, K88ac, FedA, FedF) 경구접종
생균백신
(K88ab, K88ac, FedA, FedF)Oral vaccination
Live vaccine
(K88ab, K88ac, FedA, FedF) JOL398를
5×109 cfu로
경구접종
JOL398
With 5 × 10 9 cfu
Oral vaccination
H-2H-2 1111 20% sucrose20% sucrose 20% sucrose20% sucrose 멸균
PBSSterile
PBS 20% sucrose20% sucrose

4-2-2. 4-2-2. 자돈에서In piglets 백신접종 후 대장균  Escherichia coli after vaccination 부착인자에On the attachment factor 대한 항체  Against antibodies 역가Potency

그룹 E의 경우 생후 2주령에서 모든 부착인자 항원에 대한 혈청 IgG는 그룹 F에 비해 최소 1.5배 (F41)에서 최고 30배 (FasA) 높은 항체 역가가 관찰되었다. 생후 5주령에서의 혈청 IgG는 K99을 제외한 다른 모든 부착인자에 대해 그룹 F에 비해 최소 1.2배 (K88ab)에서 약 3배 (FedA) 이상의 항체 역가가 관찰되었다. 그리고 FasA와 F41을 제외한 나머지 부착인자에 대한 IgG는 2주령에 비해 대체로 5주령일 때에 감소하는 경향을 보였다. (도 7)In group E, serum IgG for all adherent antigens at 2 weeks of age showed at least 1.5-fold (F41) up to 30-fold (FasA) higher antibody titers compared to group F. Serum IgG at 5 weeks of age showed antibody titers of at least 1.2 fold (K88ab) to about 3 fold (FedA) or more for all other attachment factors except K99. In addition, IgG for the other attachment factors except FasA and F41 tended to decrease at 5 weeks of age compared to 2 weeks of age. (Fig. 7)

4-2-3. 4-2-3. 자돈에서In piglets 백신접종 후 살모넬라  Salmonella after vaccination 티피무리움의Typhimurium LPSLPS 에 대한 항체 Antibody against 역가Potency

그룹 E의 경우 살모넬라 티피무리움의 LPS에 대한 혈청 IgG 및 IgA는 생후 2주령일 때에 그룹 F에 비해 각각 60배와 33.3배 높은 항체 역가가 관찰되었으며, 5주령일 때에 IgG는 75배 이상의 항체 역가가 관찰된 반면 혈청 IgA는 대조군과 비슷한 수준의 항체 역가가 관찰되었다.　(도 8) In group E, serum IgG and IgA against LPS of Salmonella typhimurium were 60-fold and 33.3-fold higher than those of group F at 2 weeks of age, respectively. In contrast, serum IgA showed similar antibody titers as controls. (Fig. 8)

　　　　　　

4-2-4. 4-2-4. 예방접종된Vaccinated 자돈의Piglets 병원성 대장균과 살모넬라균에 대한 방어 효과 Protective effect against pathogenic E. coli and Salmonella

자돈에 예방접종을 한 다음 도전감염 후의 임상증상을 보면 그룹 E 및 그룹 F의 자돈 모두에서 폐사는 관찰되지 않았다. 하지만 그룹 E 및 그룹 G는 병원성 대장균 또는 살모넬라균으로 도전감염 한 후 이들 균에 의한 설사가 관찰되지 않은 반면 그룹 F는 병원성 대장균으로 도전감염 한 16두 중 7두에서, 그룹 H는 살모넬라균에 의해 11두 중 4두에서 각각 설사가 관찰되었고 도전감염 한 균도 각각 분리되었다. (표 8) After vaccination of piglets, the clinical symptoms after challenge were not observed in both piglets of group E and group F. However, group E and group G were not challenged with pathogenic E. coli or Salmonella, and diarrhea by these bacteria was not observed, while group F was challenged with Salmonella and group F was found in 7 of 16 heads challenged with pathogenic E. coli. Diarrhea was observed in 4 of 11 heads, and one challenged isolate was isolated. Table 8

예방접종된 자돈에서 도전감염한 후 병원성 대장균과 살모넬라균에 대한 방어 효과Protective effect against pathogenic E. coli and Salmonella after challenge in vaccinated piglets 그룹group 접종두수Inoculation head 도전감염Challenge 임상증상Clinical symptoms 설사 분변에서의 균 분리Isolation of bacteria from diarrhea 자돈Piglets 폐사Our company 설사diarrhea 5주령5 weeks old 10주령10 weeks old EE 66 F4, F5, F6, F18, F41 발현 병원성 대장균을 각각 1×109 cfu로
경구접종F4, F5, F6, F18, and F41 expressing Escherichia coli at 1 × 10 9 cfu, respectively.
Oral vaccination 　 00 00 　 FF 1616 　 00 77 병원성대장균Escherichia coli GG 1515 -- JOL389를
5×109 cfu로
경구접종JOL389
With 5 × 10 9 cfu
Oral vaccination 00 00 　 HH 1111 -- 00 44 살모넬라균Salmonella

자돈에 예방접종을 한 다음 도전감염 후의 임상증상을 보면 그룹 E-2 및 그룹 F-2의 자돈 모두에서 폐사는 관찰되지 않았다. 하지만 그룹 E-2 및 그룹 G-2는 병원성 대장균 또는 살모넬라균으로 도전감염 한 후 이들 균에 의한 설사가 관찰되지 않은 반면 그룹 F-2는 병원성 대장균으로 도전감염 한 3두 중 3두에서, 그룹 H-2는 살모넬라균에 의해 2두 중 1두에서 각각 설사가 관찰되었고 도전감염 한 균주도 각각 분리되었다. (표 9)      After vaccination of piglets, the clinical symptoms after challenge were not observed in both piglets of group E-2 and group F-2. However, group E-2 and group G-2 were not challenged with pathogenic E. coli or Salmonella, and diarrhea by these bacteria was not observed, whereas group F-2 was challenged with pathogenic E. coli in 3 out of 3 heads. Diarrhea was observed in 1 of 2 heads of H-2 by Salmonella, and one strain of challenge was isolated. (Table 9)

예방접종 된 자돈에서 도전감염한 후 병원성 대장균과 살모넬라균에 대한 방어 효과Protective effect against pathogenic E. coli and Salmonella after challenge in vaccinated piglets 그룹group 접종두수Inoculation head 도전감염Challenge 임상증상Clinical symptoms 설사 분변에서의 균 분리Isolation of bacteria from diarrhea 자돈Piglets 폐사Our company 설사diarrhea 5주령5 weeks old 10주령10 weeks old E-2E-2 44 F4, F18 발현 병원성 대장균을 각각 1×109 cfu로 경구접종Oral inoculation of F4 and F18 expressing Escherichia coli at 1 × 10 9 cfu, respectively. 00 00 F-2F-2 33 00 33 병원성대장균Escherichia coli G-2G-2 33 -- JOL389를 5×109 cfu로 경구접종JOL389 is orally inoculated with 5 × 10 9 cfu 00 00 H-2H-2 22 -- 00 1One 살모넬라균Salmonella

이상의 결과로 자돈에서의 예방접종 또한 모돈에서와 마찬가지로 탁월한 면역반응 유도와 더불어 병원성 대장균 및 살모넬라균에 대한 우수한 방어 효과를 확인할 수 있었다. As a result, vaccination in piglets also showed excellent protective effect against Escherichia coli and Salmonella, as well as induction of excellent immune response as in sows.

　　　　　　

4-3. 4-3. 모돈Sows 및  And 자돈에At one's expense 백신접종 후 부작용 관찰 실험 Experimental observation of side effects after vaccination

　실시예 4-1-1에서와 같이 모돈 (그룹 A, B, C)에 분만 예정일 8주와 5주 전에 생균 및 사균 백신으로 각각 예방접종하였고 대조군 (그룹 D)은 PBS-수크로즈로 같은 방법으로 모돈에 접종하였다. 백신접종 후 발열 여부, 분변의 변화, 식욕감퇴(anorexia), 의기소침 (depression)을 중심으로 건강상태를 관찰하였다. 백신 접종군 및 대조군 모두에서 백신접종 후 설사 (diarrhea), 식욕감퇴, 의기소침을 포함하여 아무런 임상증상도 관찰되지 않았다. As in Example 4-1-1, sows (groups A, B, C) were vaccinated with live and vaccinated vaccines 8 and 5 weeks before the expected date of delivery, respectively, and the control group (group D) was subjected to the same method with PBS-sucrose. Sows were inoculated. After vaccination, health status was observed mainly on fever, fecal changes, anorexia, and depression. No clinical symptoms were observed in both vaccinated and control groups, including diarrhea, decreased appetite, and depression.

실시 예 4-2-1에서와 같이 그룹 E는 생후 2주령 자돈에 사균 백신으로 근육으로 1차 접종하고 생후 5주령 자돈에 생균 백신을 경구로 2차 접종하였다. 대조군 (그룹 F)은 같은 시기에 멸균 PBS와 PBS-수크로즈로 각각 접종한 후 발열 여부, 분변의 변화, 식욕감퇴, 의기소침을 중심으로 건강상태를 관찰하였다. 그룹 E와 그룹 F 모두에서 설사, 식욕감퇴, 의기소침을 포함하여 아무런 임상증상도 관찰되지 않았다.　As in Example 4-2-1, Group E was firstly inoculated with the bacteriophage vaccine to 2 weeks old piglets by the bacteriophage vaccine and orally by the 2 weeks old piglets orally with the viable vaccine vaccine to the 5 week old piglets. The control group (Group F) was inoculated with sterile PBS and PBS-sucrose at the same time and observed health status centering on fever, fecal changes, loss of appetite and depression. No clinical symptoms were observed in both group E and group F, including diarrhea, loss of appetite and depression.

4-4. 본 발명의 백신과 기존 상업용 백신의 면역반응 유도 비교실험4-4. Comparison of Induction of Immune Responses between Vaccines of the Invention and Existing Commercial Vaccines

4-4-1. 본 발명의 백신과 기존 상업용 백신의 비교실험 개요4-4-1. Summary of comparative experiments between the vaccine of the present invention and existing commercial vaccines

본 발명의 백신과 기존에 상용화되어 판매되고 있는 한 백신인 porcine Escherichia coli bacterin (돼지에 분포되고 있는 병원성 대장균 중 4종의 혈청형 균을 배양한 후 포르말린으로 불활화하여 최종 제품의 균수가 1㎖ 당 100억 개의 대장균이 함유되도록 조정된 사균백신)과의 백신 효능을 상호 비교하였다. 즉, 본 발명의 백신 (그룹 I, L)은 분만 예정일 8주와 5주 전에 생균을 각각 경구접종하였으며, 기존 상업용 백신(그룹 J, M)은 백신 제조회사에서 추천하는 방법에 따라 분만 예정일 6주와 2주 전에 각각 근육으로 2ml씩 접종하였다. 그리고 대조군 (그룹 K, N)은 PBS-수크로즈로 본 발명의 백신 접종 시기와 같은 시기에 각각 경구로 접종하였다. 백신 접종 후 유도된 항체 역가를 상호 비교하기 위하여 분만 시점에 혈액 및 초유를 각각 채취하여 혈청 IgG 및 점막 IgG와 sIgA를 간접 ELISA로 측정하였다. 더불어 자돈에서의 이행 항체 역가를 비교하기 위해 자돈이 1일령, 1주령, 3주령일 때 각각 혈액을 채취하여 혈청 IgG 및 IgA 항체 역가를 간접 ELISA로 측정하였다. 예방접종 된 모돈에서 출생한 자돈이 1주령 및 3주령이 되었을 때 국내 돼지에서 분리한 병원성 대장균 (JOL599, 489, 564, 500)을 경구 감염시킨 후 설사 유무로 이 균에 대한 방어 효과를 측정하였다. (표 10) Porcine Escherichia coli bacterin, a vaccine that is commercially available and commercially available, is incubated with formalin after incubating four serotypes of pathogenic Escherichia coli distributed in pigs. The vaccine efficacy against the E. coli vaccine adjusted to contain 10 billion Escherichia coli was compared. That is, the vaccine of the present invention (Groups I and L) was orally inoculated with live bacteria 8 and 5 weeks before the scheduled delivery date, and the existing commercial vaccines (Groups J and M) were due to be delivered according to the method recommended by the vaccine manufacturer. Inoculated 2ml each week and two weeks before the muscle. The control group (groups K and N) was orally inoculated with PBS sucrose at the same time as the vaccination time of the present invention. To compare the antibody titers induced after vaccination, blood and colostrum were collected at delivery time and serum IgG, mucosal IgG and sIgA were measured by indirect ELISA. In addition, to compare the transition antibody titers in piglets, blood was collected at 1, 1, and 3 weeks of age, respectively, and serum IgG and IgA antibody titers were measured by indirect ELISA. When piglets born from vaccinated sows were 1 and 3 weeks old, the pathogenic E. coli (JOL599, 489, 564, 500) isolated from domestic pigs were orally infected and then diarrhea was measured to determine the protective effect against the bacteria. . Table 10

본 발명의 백신과 기존 상업용 백신의 예방접종 및 도전감염 실험 개요Overview of Vaccination and Challenge Experiments of Vaccines of the Invention and Existing Commercial Vaccines 그룹group 접종 두수Inoculation head 예방접종Vaccination 도전감염Challenge 모돈Sows 자돈Piglets 분만
예정일
8주전delivery
Due date
8 weeks ago 분만
예정일
6주전delivery
Due date
6 weeks ago 분만
예정일
5주전delivery
Due date
5 weeks ago 분만
예정일
2주전delivery
Due date
2 weeks ago 1주령1 week old 3주령3 weeks old II 33 경구접종 생균백신Oral vaccination live vaccine -- 경구접종 생균백신Oral vaccination live vaccine -- F4, F5, F6, F18, F41 발현 병원성 대장균이
각각 1×108 cfu가 되도록 혼합하여 경구접종Escherichia coli expressing F4, F5, F6, F18, F41
Oral inoculation to mix 1 × 10 8 cfu -- JJ 33 -- 2ml
근육접종2ml
Inoculation -- 2ml
근육접종2ml
Inoculation KK 33 20% sucrose20% sucrose -- 20% sucrose20% sucrose -- LL 33 경구접종 생균백신Oral vaccination live vaccine -- 경구접종 생균백신Oral vaccination live vaccine -- -- F4, F5, F6, F18, F41 발현 병원성 대장균이 각각
1×109 cfu가
되도록 혼합하여
경구접종F4, F5, F6, F18, F41 expressing Escherichia coli
1 × 10 9 cfu
Mix as much as possible
Oral vaccination MM 33 -- 2ml
근육접종2ml
Inoculation -- 2ml
근육접종2ml
Inoculation NN 33 20% sucrose20% sucrose -- 20% sucrose20% sucrose --

4-4-2. 본 발명의 백신과 기존 상업용 백신의 대장균의 4-4-2. E. coli of the vaccine of the present invention and the existing commercial vaccine 부착인자에On the attachment factor 대한 항체  Against antibodies 역가Potency 비교 compare

본 발명의 백신 접종군 (그룹 I, M)의 경우에는 각 부착인자에 대한 혈청 IgG 항체 역가는 기존 상업용 백신 (그룹 J, M)보다 K88ab를 제외하고 최소 2배 (K88ac, F41)에서 최고 10배 (FedA) 정도 높은 항체 역가가 관찰되었다. 하지만 상업용 백신의 경우에는 각 부착인자 (K88ab, K99 제외)에 대한 IgG의 항체 역가는 대조군 (그룹 K, N)에 비해 같거나 약간 높게 측정되었을 뿐이었다. 초유에서의 점막 IgG의 경우에는 모든 대장균 부착인자에 대해 개발 백신이 상업용 백신 보다 최소 2.5배 이상 높은 항체 역가가 관찰되었고 sIgA의 경우에도 모든 부착인자에 대해 상업용 백신보다 최소 1.3배 이상 높은 항체 역가가 관찰되었다.(도 9a 내지 9d) In the vaccinated group of the present invention (Groups I, M), serum IgG antibody titers for each attachment factor were at least 10 times higher than those of conventional commercial vaccines (Groups J, M) at least twice (K88ac, F41) except K88ab. As high as twice the FedA antibody titers were observed. However, for commercial vaccines, the antibody titers of IgG for each attachment factor (except K88ab, K99) were only measured at the same or slightly higher levels than the controls (groups K, N). For mucosal IgG in colostrum, antibody titers of at least 2.5-fold higher than those of commercial vaccines were observed for all E. coli attachment factors, and antibody titers of at least 1.3-fold higher than commercial vaccines for all adherents for sIgA. Was observed (FIGS. 9A-9D).

4-4-3. 본 발명의 백신과 기존 상업용 백신의 살모넬라 4-4-3. Salmonella of the Vaccines of the Invention and Existing Commercial Vaccines 티피무리움의Typhimurium LPSLPS 에 대한 항체 Antibody against 역가Potency 비교 compare

살모넬라 티피무리움의 LPS에 대한 항체 역가에서도 본 발명의 백신의 경우에는 1차 접종 후 3주 후부터 대조군 보다 무려 혈청 IgG는 110배가, 혈청 IgA는 17배 높은 항체 역가가 관찰되었다. 초유에서의 점막 IgG의 경우에는 약 30배가, sIgA는 10배 높은 항체 역가가 관찰되었으며 기존 상업용 백신 접종 군은 살모넬라에 대한 백신은 포함되어 있지 않아 대조군과 비슷한 수준의 항체 역가가 관찰되었다. 본 발명의 백신 접종군에서 태어난 3주령 자돈에서의 살모넬라 티피무리움의 LPS에 대한 항체 역가는 대조군의 자돈에 비해 혈청 IgG는 50배가, 혈청 IgA는 26.7배 정도 높은 항체 역가가 관찰되었다. 하지만 기존 상업용 백신접종 군은 살모넬라에 대한 백신은 포함되어 있지 않아 대조군과 비슷한 수준의 항체 역가가 관찰되었다.(도 10) In the antibody titers of Salmonella typhimurium against LPS, the antibody titers of serum IgG were 110-fold and serum IgA-17-fold higher than those of the control group 3 weeks after the first inoculation. About 30-fold higher antibody titers and 10-fold higher sIgA levels were observed in colostrum IgG, whereas the conventional commercial vaccination group did not contain vaccine against Salmonella. Antibody titers of Salmonella typhimurium to LPS in 3-week-old piglets born in the vaccinated group of the present invention were 50-fold higher in serum IgG and 26.7-fold higher in serum IgA than pigs in the control group. However, the existing commercial vaccination group did not include a vaccine against Salmonella, so that antibody titers similar to those of the control group were observed (FIG. 10).

4-4-4. 본 발명의 백신과 기존 상업용 백신의 병원성 대장균에 대한 방어 효과 비교4-4-4. Comparison of the Protective Effect of the Vaccine of the Present Invention and Existing Commercial Vaccines against Escherichia Coli

1주령 자돈에서 도전감염 후 방어 여부를 비교하여 본 결과 모든 실험군에서 병원성 대장균에 의한 폐사는 없었다. 본 발명의 백신 접종군 및 기존 상업용 백신 접종군에서 태어난 1주령의 자돈 모두에서 도전감염 후 설사가 관찰되지 않았다. 하지만 대조군의 자돈 9두 중 3두에서 설사가 관찰되었다. 그리고 3주령 자돈에서의 방어 여부 비교시험에서는 본 발명의 백신 접종 자돈 모두에서는 설사가 관찰되지 않았다. 반면 기존 상업용 백신접종 자돈 11두 중 4두에서, 대조군의 경우에는 8두 중 4두에서 설사가 관찰되었으며 도전감염에 사용된 균도 각각 분리되었다. 따라서 개발백신이 기존 백신의 경우보다 면역반응 유도 및 방어에 있어 현저한 효과가 있음이 확인되었다. (표 11)Comparison of defense after challenge infection in 1-week-old pigs showed no mortality caused by Escherichia coli in all experimental groups. Diarrhea after challenge was not observed in both 1-week-old piglets born from the vaccinated group and the existing commercial vaccinated group. However, diarrhea was observed in 3 of 9 piglets in the control group. Diarrhea was not observed in all of the vaccinated pigs of the present invention in a comparison test for protection at 3 weeks old pigs. On the other hand, diarrhea was observed in 4 out of 11 commercial vaccination piglets and in 4 out of 8 pigs in the control group, and the bacteria used for challenge were also isolated. Therefore, it was confirmed that the developmental vaccine had a significant effect on the induction and defense of the immune response than the existing vaccine. (Table 11)

개발백신과 기존 상업용 백신 접종군에서 도전감염 후 병원성 대장균에 대한 방어 효과Protective effect against pathogenic E. coli after challenge in developmental vaccine and conventional commercial vaccine group 그룹group 접종 두수Inoculation head 예방접종Vaccination 도전감염Challenge 모돈Sows 접종
두수inoculation
Head 자돈Piglets 분만
8주전delivery
8 weeks ago 분만
6주전delivery
6 weeks ago 분만
5주전delivery
5 weeks ago 분만
2주전delivery
2 weeks ago 1주령1 week old 3주령3 weeks old 설사diarrhea 설사 분변에서의
균 분리Diarrhea in the feces
Fungal separation II 33 경구접종 생균백신Oral vaccination live vaccine -- 경구접종 생균백신Oral vaccination live vaccine -- 1212 F4, F5, F6, F18, F41이 각각 1×108 cfu가 되도록 혼합하여 경구접종Oral inoculation with F4, F5, F6, F18, F41 mixed to 1 × 10 8 cfu -- 00 　 JJ 33 -- 2ml
근육접종2ml
Inoculation -- 2ml
근육접종2ml
Inoculation 88 00 　 KK 33 20%
수크로즈20%
Sucrose -- 20%
수크로즈20%
Sucrose -- 99 33 병원성
대장균Pathogenic
Escherichia coli LL 33 경구접종 생균백신Oral vaccination live vaccine -- 경구접종 생균백신Oral vaccination live vaccine -- 99 -- F4, F5, F6, F18, F41이 각각 1×109 cfu가 되도록 혼합하여 경구접종Oral inoculation with F4, F5, F6, F18, F41 mixed to 1 × 10 9 cfu 00 　 MM 33 -- 2ml
근육접종2ml
Inoculation -- 2ml
근육접종2ml
Inoculation 1111 44 병원성
대장균Pathogenic
Escherichia coli NN 33 20%
수크로즈20%
Sucrose -- 20%
수크로즈20%
Sucrose -- 88 44 병원성
대장균Pathogenic
Escherichia coli

지금까지 예시적인 실시 태양을 참조하여 본 발명을 기술하여 왔지만, 본 발명의 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고서도 다양한 변화를 실시할 수 있으며 그의 요소들을 등가물로 대체할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 본질적인 범주를 벗어나지 않고서도 많은 변형을 실시하여 특정 상황 및 재료를 본 발명의 교시내용에 채용할 수 있다. 따라서, 본 발명이 본 발명을 실시하는데 계획된 최상의 양식으로서 개시된 특정 실시 태양으로 국한되는 것이 아니며, 본 발명이 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 태양을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.While the present invention has been described with reference to exemplary embodiments, it will be understood by those skilled in the art that various changes may be made and equivalents may be substituted for elements thereof without departing from the scope of the invention. You will know. In addition, many modifications may be made to adapt a particular situation and material to the teachings of the invention without departing from the essential scope thereof. Accordingly, it is intended that the invention not be limited to the particular embodiment disclosed as the best mode contemplated for carrying out this invention, but that the invention be construed as including all embodiments falling within the scope of the appended claims.

도 1은 본 발명의 개관도이다. 1 is an overview of the present invention.

도 2는 각 부착인자 항원 준비 및 각 부착인자를 발현?분비하는 약독화 살모넬라 티피무리움 제작 과정을 도시한 것이다. Figure 2 shows the attenuated Salmonella typhimurium production process to express and secrete each adhesion factor antigen preparation and each adhesion factor.

도 3은 웨스턴 블롯을 이용하여 약독화 살모넬라 티피무리움 배양액 내에서 발현?분비된 각 부착인자를 확인한 것이다. 레인　1은 대조군의 상층액 에서의 분비 항원을, 레인 2는 각 부착인자 발현?분비 백신균주의 상층액에서의 분비 항원을 나타낸다. FIG. 3 shows each attachment factor expressed and secreted in attenuated Salmonella typhimurium culture using Western blot. Lane # 1 represents the secreted antigen in the supernatant of the control group, lane 2 represents the secreted antigen in the supernatant of each adhesion factor expression-secreting vaccine strain.

도 4a 내지 4c는 접종 경로별 혈청에서의 대장균 부착인자에 대한 항체 역가를 나타낸 것이다. 4A to 4C show antibody titers against E. coli adhesion factors in serum by inoculation route.

도 5a 및 5b는 접종 경로별 초유에서의 대장균 부착인자에 대한 항체 역가를 나타낸 것이다. 5A and 5B show antibody titers against E. coli adhesion factors in colostrum by inoculation route.

도 6은 접종 경로별 살모넬라 티피무리움의 LPS에 대한 항체 역가를 나타낸 것이다. Figure 6 shows the antibody titers against LPS of Salmonella typhimurium by inoculation route.

도 7은 자돈에서의 백신접종 후 대장균 각 부착인자에 대한 혈청 IgG 항체 역가를 나타낸 것이다. Figure 7 shows serum IgG antibody titers for each E. coli adhesion factor after vaccination in piglets.

도 8은 자돈에서 백신접종 후 살모넬라 티피무리움의 LPS에 대한 항체 역가를 나타낸 것이다. Figure 8 shows antibody titers against LPS of Salmonella typhimurium after vaccination in piglets.

도 9a 내지 9d는 본 발명의 백신과 기존 상업용 백신 접종 후 모돈 및 자돈에서의 대장균의 각 부착인자에 대한 항체 역가를 나타낸 것이다. 9A-9D show antibody titers for each adherent of E. coli in sows and piglets following vaccination with the vaccine of the present invention.

도 10은 본 발명의 백신과 기존 상업용 백신 접종 후 모돈 및 자돈에서의 살모넬라 티피무리움의 LPS 대한 항체 역가를 나타낸 것이다. Figure 10 shows antibody titers of LPS of Salmonella typhimurium in sows and piglets after the vaccine of the present invention and conventional commercial vaccination.

Claims (27)

돼지의 병원성 대장균의 부착인자 F4(K88ab) 및 asd유전자를 포함하는 살모넬라균 변이주; Salmonella mutant strains including the attachment factor F4 ( K88ab ) and asd genes of Escherichia coli of swine; 돼지의 병원성 대장균의 부착인자 F4(K88ac) 및 asd유전자를 포함하는 살모넬라균 변이주; Salmonella mutant strains including the attachment factor F4 ( K88ac ) and asd genes of Escherichia coli in swine; 돼지의 병원성 대장균의 부착인자 F5(K99) 및 asd유전자를 포함하는 살모넬라균 변이주; Salmonella mutant strains comprising the attachment factor F5 ( K99 ) and asd gene of pathogenic E. coli in swine; 돼지의 병원성 대장균의 부착인자 F6(FasA) 및 asd유전자를 포함하는 살모넬라균 변이주; Salmonella mutant strains comprising the attachment factor F6 ( FasA ) and asd genes of Escherichia coli in swine; 돼지의 병원성 대장균의 부착인자 F18(FedA) 및 asd유전자를 포함하는 살모넬라균 변이주; Salmonella mutant strains comprising the attachment factor F18 ( FedA ) and asd gene of pathogenic E. coli in swine; 돼지의 병원성 대장균의 부착인자 F18(FedF) 및 asd유전자를 포함하는 살모넬라균 변이주; Salmonella mutant strains comprising the attachment factor F18 ( FedF ) and asd gene of pathogenic E. coli in swine; 돼지의 병원성 대장균의 부착인자 F41 및 asd유전자를 포함하는 살모넬라균 변이주; Salmonella mutant strains comprising the attachment factors F41 and asd genes of Escherichia coli of swine; 돼지의 병원성 대장균의 부착인자 Intimin 및 asd유전자를 포함하는 살모넬라균 변이주; 및 Salmonella mutant strains including the Intimin and asd genes, the adhesion factors of Escherichia coli in swine; And LTB(heat-labile enterotoxin B subunit) 및 asd 유전자를 포함하는 살모넬라균 변이주를 포함하고, 상기 9개의 살모넬라균 변이주는 lon 및 cpxR 유전자가 결실된 혼합 살모넬라균 변이주.A mixed Salmonella strain comprising Salmonella strains comprising a heat-labile enterotoxin B subunit (LTB) and an asd gene, wherein the nine Salmonella strains have lon and cpxR genes deleted. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제1항의 혼합 살모넬라균 변이주를 포함하는, 돼지의 병원성 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료용 백신 조성물.A vaccine composition for preventing and treating Escherichia coli and Salmonella spp., Comprising the mixed Salmonella strain of claim 1. 삭제delete 삭제delete 제6항에 있어서, The method of claim 6, 돼지의 병원성 대장균증은 소화기 질환, 부종병 (edema disease), 호흡기 질환 또는 비뇨생식기계 질환을 포함함을 특징으로 하는 백신 조성물.Vaccine composition characterized in that the pathogenic E. coliosis in pigs includes digestive disease, edema disease, respiratory disease or urogenital disease. 제9항에 있어서, 10. The method of claim 9, 소화기 질환은 신생자돈 설사병, 조발성 설사병, 3주령 설사병, 백리, 포유자돈 설사병, 또는 이유자돈 설사병을 포함함을 특징으로 하는 백신 조성물.Gastrointestinal diseases include neonatal pig diarrhea, precocious diarrhea, three-week-old diarrheal disease, white liquor, mammalian diarrhea, or weaning diarrhea. 제6항에 있어서, The method of claim 6, 병원성 대장균은 장독성 대장균 (entrotoxigenic Escherichia coli.; ETEC) 또는 장병원성 대장균 (enteropathogenic Escherichia coli;; EPEC)임을 특징으로 하는 백신 조성물.E. coli is E. coli, Chapter toxicity (entrotoxigenic Escherichia coli;. ETEC) or intestinal pathogenic E. coli (EPEC enteropathogenic Escherichia coli ;;) a vaccine composition as claimed. 제6항에 있어서, The method of claim 6, 살모넬라균은 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 타이피(Salmonella typhi), 살모넬라 파라타이피(Salmonella paratyphi), 살모넬라 센다이(Salmonella sendai), 살모넬라 갈리나리움(Salmonella gallinarium) 및 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나임을 특징으로 하는 백신 조성물.Salmonella Salmonella typhimurium (Salmonella typhimurium), Salmonella Thai Phi (Salmonella typhi), Salmonella para Thai Phi (Salmonella paratyphi), Salmonella Sendai (Salmonella sendai), Salmonella Galina Leeum (Salmonella gallinarium) and Salmonella Entebbe utility disk (Salmonella enteritidis ) vaccine composition, characterized in that any one selected from the group consisting of. 제6항에 있어서, The method of claim 6, 형질전환시킨 살모넬라균 변이주는 생균 또는 사균임을 특징으로 하는 백신 조성물. Vaccine composition characterized in that the transformed Salmonella mutant strain is live or dead. 제13항에 있어서, 14. The method of claim 13, 사균은 가열 또는 포르말린으로 불활화시킨 사균임을 특징으로 하는 백신 조성물. The bacterium is a vaccine composition characterized in that the bacterium inactivated by heating or formalin. 제6항에 있어서, The method of claim 6, 경구, 경피, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내 또는 비강 경로로 투여됨을 특징으로 하는 백신 조성물. Vaccine composition, characterized in that administered by oral, transdermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous or nasal route. 제6항의 백신 조성물을 포함하는, 돼지의 면역증강 또는 성장촉진을 위한 사료 첨가제.Comprising the vaccine composition of claim 6, feed additives for the promotion or growth of pigs. (i) 돼지의 병원성 대장균의 부착인자 F4(K88ab), F4(K88ac), F5(K99), F6(FasA), F18(FedA), F18(FedF), F41, Intimin 및 LTB(heat-labile enterotoxin B subunit) 유전자를 각각 증폭시키는 단계;(i) Homologous Escherichia coli adhesion factors F4 (K88ab), F4 (K88ac), F5 (K99), F6 (FasA), F18 (FedA), F18 (FedF), F41, Intimin and LTB (heat-labile enterotoxin) Amplifying each B subunit) gene; (ii) 상기 유전자를 asd 유전자를 가진 플라스미드에 각각 클로닝하여 9개의 클로닝된 플라스미드를 수득하는 단계;(ii) cloning said gene into a plasmid with an asd gene, respectively, to obtain nine cloned plasmids; (iii) 살모넬라 균주의 염색체 DNA에서 lon, cpxR 및 asd 유전자를 결실시켜 약독화 살모넬라 균주를 제조하는 단계; (iii) deleting the lon, cpxR and asd genes from the chromosomal DNA of the Salmonella strain to prepare the attenuated Salmonella strain; (iv) 단계 (ii)의 클로닝된 각각의 플라스미드로 단계 (iii)의 약독화 살모넬라 균주를 각각 형질전환시켜 9개의 형질전환된 살모넬라균 변이주를 수득하는 단계; 및(iv) transforming each of the attenuated Salmonella strains of step (iii) with each cloned plasmid of step (ii) to obtain nine transformed Salmonella strains; And (v) 각각 형질전환된 살모넬라균 변이주를 선별하는 단계를 포함하는 살모넬라균 변이주를 제조하는 방법.(v) A method for producing Salmonella mutants comprising the step of selecting each transformed Salmonella mutants. 삭제delete 제17항에 있어서, 18. The method of claim 17, 돼지의 병원성 대장균은 장독성 대장균 (entrotoxigenic Escherichia coli.; ETEC) 또는 장병원성 대장균 (enteropathogenic Escherichia coli;; EPEC)임을 특징으로 하는 살모넬라균 변이주를 제조하는 방법. A method for producing Salmonella mutants, characterized in that the pathogenic E. coli of the pig is enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) or enteropathogenic Escherichia coli (EPEC). 제17항에 있어서, 18. The method of claim 17, 살모넬라균은 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 타이피(Salmonella typhi), 살모넬라 파라타이피(Salmonella paratyphi), 살모넬라 센다이(Salmonella sendai), 살모넬라 갈리나리움(Salmonella gallinarium) 및 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나임을 특징으로 하는 살모넬라균 변이주를 제조하는 방법. Salmonella Salmonella typhimurium (Salmonella typhimurium), Salmonella Thai Phi (Salmonella typhi), Salmonella para Thai Phi (Salmonella paratyphi), Salmonella Sendai (Salmonella sendai), Salmonella Galina Leeum (Salmonella gallinarium) and Salmonella Entebbe utility disk (Salmonella enteritidis ) method for producing a Salmonella mutant strain, characterized in that any one selected from the group consisting of. 제1항의 혼합 살모넬라균 변이주를 생균 또는 사균 백신으로 준비하여, 모돈 또는 자돈에 접종하는 것을 특징으로 하는, 돼지의 병원성 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료를 위한 백신화 방법.The method of vaccination for the prevention and treatment of pathogenic Escherichia coli and Salmonella bacterium in pigs, characterized in that the mixed Salmonella mutants of claim 1 are prepared with live or dead bacteria vaccine and inoculated into sows or piglets. 삭제delete 삭제delete 제21항에 있어서, 22. The method of claim 21, 사균은 가열 또는 포르말린으로 불활화시킴을 특징으로 하는 백신화 방법.Vaccinia is heated or inactivated with formalin. 제21항에 있어서, 22. The method of claim 21, 경구, 경피, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내 또는 비강 경로로 백신을 접종함을 특징으로 하는 백신화 방법. Vaccination method characterized by inoculation of the vaccine by oral, transdermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous or nasal route. 제21항에 있어서, 22. The method of claim 21, 1차 및 2차 접종시 생균 백신을 경구로 접종함을 특징으로 하는 백신화 방법. Vaccination method characterized in that orally inoculated live bacteria vaccine at the first and second inoculation. 제21항에 있어서, 22. The method of claim 21, 1차 및 2차 접종시 생균 백신을 경구로 접종하되, 2차 접종시 LTB를 발현 분비하는 살모넬라 변이균주를 제외한 생균 백신을 접종함을 특징으로 하는 백신화 방법. Vaccination method characterized in that orally inoculated with live vaccines at the first and second inoculation, except for Salmonella mutant strains that express LTB during the second inoculation.
KR1020090080020A 2009-08-27 2009-08-27 Attenuated Salmonella mutants transformed with adhesin gene of pathogenic Escherichia coli in pigs and Vaccine composition comprising thereof for protection and treatment against pathogenic Escherichia coli and Salmonella in pigs KR101178415B1 (en)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020090080020A KR101178415B1 (en) 2009-08-27 2009-08-27 Attenuated Salmonella mutants transformed with adhesin gene of pathogenic Escherichia coli in pigs and Vaccine composition comprising thereof for protection and treatment against pathogenic Escherichia coli and Salmonella in pigs
PCT/KR2010/005806 WO2011025310A2 (en) 2009-08-27 2010-08-27 Attenuated salmonella variant strain resulting from the genetic transformation of adhesin from pathogenic pig escherichia coli and a vaccine composition comprising the same for preventing and treating pathogenic colibacillosis and salmonellosis in pigs

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020090080020A KR101178415B1 (en) 2009-08-27 2009-08-27 Attenuated Salmonella mutants transformed with adhesin gene of pathogenic Escherichia coli in pigs and Vaccine composition comprising thereof for protection and treatment against pathogenic Escherichia coli and Salmonella in pigs

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20110022428A KR20110022428A (en) 2011-03-07
KR101178415B1 true KR101178415B1 (en) 2012-08-31

Family

ID=43628633

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020090080020A KR101178415B1 (en) 2009-08-27 2009-08-27 Attenuated Salmonella mutants transformed with adhesin gene of pathogenic Escherichia coli in pigs and Vaccine composition comprising thereof for protection and treatment against pathogenic Escherichia coli and Salmonella in pigs

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101178415B1 (en)
WO (1) WO2011025310A2 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101371355B1 (en) 2012-03-29 2014-03-14 전북대학교산학협력단 Oral fowl typhoid vaccine using a live adjuvant system

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101151004B1 (en) * 2009-08-31 2012-06-22 전라북도 Vaccine composition for protection and treatment against pathogenic Escherichia coli and Salmonella in cattle by administration of attenuated Salmonella expressing adhesin gene of pathogenic Escherichia coli and vaccination method thereof
KR101478202B1 (en) * 2012-12-11 2015-01-08 경남과학기술대학교 산학협력단 Ghost Salmonella Vaccine and Method for inducing immune response using the same
CN106170551B (en) * 2013-12-16 2020-01-07 财团法人农业科技研究院 Plasmid, method and kit for producing thermolabile enterotoxin B subunit
KR101705098B1 (en) * 2014-05-29 2017-02-10 전북대학교산학협력단 Vaccine composition for preventing or treating porcine pleuropneumonia comprising attenuated Salmonella mutant
KR101893827B1 (en) * 2016-01-04 2018-08-31 전북대학교 산학협력단 Vaccine composition for preventing or treating porcine proliferative enteritis and salmonellosis simultaneouly comprising attenuated Salmonella mutant as effective component
US10653904B2 (en) 2017-12-02 2020-05-19 M-Fire Holdings, Llc Methods of suppressing wild fires raging across regions of land in the direction of prevailing winds by forming anti-fire (AF) chemical fire-breaking systems using environmentally clean anti-fire (AF) liquid spray applied using GPS-tracking techniques
US11865390B2 (en) 2017-12-03 2024-01-09 Mighty Fire Breaker Llc Environmentally-clean water-based fire inhibiting biochemical compositions, and methods of and apparatus for applying the same to protect property against wildfire
US11865394B2 (en) 2017-12-03 2024-01-09 Mighty Fire Breaker Llc Environmentally-clean biodegradable water-based concentrates for producing fire inhibiting and fire extinguishing liquids for fighting class A and class B fires
US11826592B2 (en) 2018-01-09 2023-11-28 Mighty Fire Breaker Llc Process of forming strategic chemical-type wildfire breaks on ground surfaces to proactively prevent fire ignition and flame spread, and reduce the production of smoke in the presence of a wild fire
US11911643B2 (en) 2021-02-04 2024-02-27 Mighty Fire Breaker Llc Environmentally-clean fire inhibiting and extinguishing compositions and products for sorbing flammable liquids while inhibiting ignition and extinguishing fire
CN113559274B (en) * 2021-08-30 2024-01-26 河南兴华生物技术有限公司 Freeze-drying protective agent for live vaccine of escherichia coli

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KIM, S. W. et al. (2007)Journal of Microbiology and Biotechnology. 17(8), pp.1316-1323.

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101371355B1 (en) 2012-03-29 2014-03-14 전북대학교산학협력단 Oral fowl typhoid vaccine using a live adjuvant system

Also Published As

Publication number Publication date
WO2011025310A9 (en) 2011-07-28
KR20110022428A (en) 2011-03-07
WO2011025310A3 (en) 2011-09-15
WO2011025310A2 (en) 2011-03-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101178415B1 (en) Attenuated Salmonella mutants transformed with adhesin gene of pathogenic Escherichia coli in pigs and Vaccine composition comprising thereof for protection and treatment against pathogenic Escherichia coli and Salmonella in pigs
Hur et al. Enhancement of immune responses by an attenuated Salmonella enterica serovar Typhimurium strain secreting an Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit protein as an adjuvant for a live Salmonella vaccine candidate
Cárdenas et al. Stability, immunogenicity and expression of foreign antigens in bacterial vaccine vectors
Huang et al. Construction and immunogenicity analysis of Lactobacillus plantarum expressing a porcine epidemic diarrhea virus S gene fused to a DC-targeting peptide
JP2011503003A (en) Compositions and methods for enhancing immune responses against Eimeria
US10603371B2 (en) Attenuated Pasteurella multocida vaccines and methods of making and use thereof
Van Diemen et al. Subunit vaccines based on intimin and Efa-1 polypeptides induce humoral immunity in cattle but do not protect against intestinal colonisation by enterohaemorrhagic Escherichia coli O157: H7 or O26: H
Hur et al. Immune responses to new vaccine candidates constructed by a live attenuated Salmonella Typhimurium delivery system expressing Escherichia coli F4, F5, F6, F41 and intimin adhesin antigens in a murine model
Chu et al. Lactobacillus acidophilus expressing recombinant K99 adhesive fimbriae has an inhibitory effect on adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli
KR101151004B1 (en) Vaccine composition for protection and treatment against pathogenic Escherichia coli and Salmonella in cattle by administration of attenuated Salmonella expressing adhesin gene of pathogenic Escherichia coli and vaccination method thereof
Yang et al. Alleviation of enterotoxigenic Escherichia coli challenge by recombinant Lactobacillus plantarum expressing a FaeG-and DC-targeting peptide fusion protein
Hur et al. A vaccine candidate for post-weaning diarrhea in swine constructed with a live attenuated Salmonella delivering Escherichia coli K88ab, K88ac, FedA, and FedF fimbrial antigens and its immune responses in a murine model
Song et al. A lactococcus lactis-vectored oral vaccine induces protective immunity of mice against enterotoxigenic escherichia coli lethal challenge
EP2597151A2 (en) Recombinant microorganisms, methods for preparing vaccine strains, antigens, and vector vaccine compositions of same, uses thereof, and related antibodies, diagnostic kit, and treatment and/or prophylactic methods
Shimizu et al. Incidence and some characteristics of fimbriae FY and 31A of Escherichia coli isolates from calves with diarrhea in Japan
Liu et al. Immune responses elicited in mice with recombinant Lactococcus lactis expressing F4 fimbrial adhesin FaeG by oral immunization
Won et al. A novel Salmonella strain inactivated by a regulated autolysis system and expressing the B subunit of Shiga toxin 2e efficiently elicits immune responses and confers protection against virulent Stx2e-producing Escherichia coli
Torkashvand et al. Mucosal and systemic immune responses elicited by recombinant Lactococcus lactis expressing a fusion protein composed of pertussis toxin and filamentous hemagglutinin from Bordetella pertussis
Ji et al. Construction and immunological evaluation of live vector vaccine based on attenuated Listeria monocytogenes vector against Vibrio parahaemolyticus infection
JP2023517684A (en) Vaccine for protection against Streptococcus suis serotype 9, sequence type 16
KR100465347B1 (en) Preparation method of recombinant ApxIIA toxin protein of Actinobacillus pleuropneumoniae in Yeast and use thereof as feedstuff additive
KR102439333B1 (en) Vaccine composition for preventing or treating pathogenic Escherichia coli in pigs comprising Stx2eA2-(Stx2eB)5 recombinant protein as a vaccine
KR101712012B1 (en) Vaccine composition for preventing or treating porcine pathogenic colibacillosis comprising improved ghost Salmonella mutant as effective component
KR102100503B1 (en) Vaccin compsosition for preventing or treating porcine pathogenic colibacillosis comprising ghost enterotoxigenic Escherichia coli as effective componet
Won et al. Construction of a live attenuated Salmonella strain expressing FanC protein to prevent bovine enterotoxigenic Escherichia coli and evaluation of its immunogenicity in mice

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
N231 Notification of change of applicant
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150729

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160824

Year of fee payment: 5

LAPS Lapse due to unpaid annual fee