KR101177033B1 - Cell separation chip using silicon nanowire - Google Patents
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Abstract
본 발명은 실리콘 나노선을 이용한 세포 분리칩에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 기판; 상기 기판 상에 성장된 실리콘 나노선(silicon nanowire); 상기 실리콘 나노선 표면에 고정화된 스트렙타비딘(streptavidin)을 포함하는 세포 분리칩에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 세포독성이 적으며, 생체적합성(biocompatability)이 뛰어난 실리콘 나노선(silicon nanowire)을 이용하여 특정 세포의 선택적 분리가 가능한 세포 분리칩을 제조할 수 있으며, 상기 세포 분리칩은 자성을 이용하지 않으며, 별도의 키트와 장치가 필요하지 않으며, 적은 수의 세포도 분리 가능할 뿐만 아니라, 고수율의 세포 분리능을 얻을 수 있다. 본 발명의 실시예에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 세포 분리칩을 이용하여 마우스의 비장세포로부터 면역세포(CD4+ T cell)를 성공적으로 분리하였다. 이와 같이 세포 분리방법에 있어서 그 방법이 간단하며 재사용할 수 있으므로 기존의 세포 분리 방법을 대체할 수 있는 기술이 될 것이다.The present invention relates to a cell separation chip using silicon nanowires, and more specifically, a substrate; Silicon nanowires grown on the substrate; It relates to a cell separation chip comprising streptavidin immobilized on the surface of the silicon nanowires.
According to the present invention, a cell separation chip capable of selective separation of specific cells using silicon nanowires having low cytotoxicity and excellent biocompatability can be manufactured, and the cell separation chip is magnetic. It does not use, does not require a separate kit and device, as well as a small number of cells can be separated, a high yield of cell separation can be obtained. As described in the embodiment of the present invention, the cell separation chip of the present invention was successfully isolated from immune cells (CD4 + T cells) from splenocytes of mice. In this way, the cell separation method is simple and can be reused, so it will be a technology that can replace the existing cell separation method.
Description
본 발명은 실리콘 나노선을 이용한 세포 분리칩에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 기판; 상기 기판 상에 성장된 실리콘 나노선(silicon nanowire); 상기 실리콘 나노선 표면에 고정화된 스트렙타비딘(streptavidin)을 포함하는 세포 분리칩에 관한 것이다.
The present invention relates to a cell separation chip using silicon nanowires, and more specifically, a substrate; Silicon nanowires grown on the substrate; It relates to a cell separation chip comprising streptavidin immobilized on the surface of the silicon nanowires.
나노물질은 작은 크기로 인해 혈관이나 림프를 따라 흘러 다니기 용이하며, 표면에 특정 물질을 붙이거나 그 크기를 조절함으로서 나노물질을 특정부위에 축적 및 전달이 가능하다. 최근 이러한 특성을 이용하여 질병 진단에 유용한 분자영상조영제로 이용하거나, 치료용 약물을 전달하는 약물수송체 등의 나노의학분야로 이용가능하다. 이러한 나노물질의 장점은 기존의 상대적으로 큰 크기의 벌크(bulk)물질에 비해 뛰어난 독자적인 특성을 갖는다. 특히, 난치성 질병 중에서 암의 조기진단 및 치료를 위해 최근의 연구들이 많은 응용가능성을 보여주고 있으며, 이를 위해 양자점(quantum dot)을 활용한 분자영상을 위한 조영제 개발, 암의 조기진단을 위한 바이오센서 개발, 그리고 조기 진단된 종양에 대한 약물전달 연구 등이 이루어지고 있다. 특히 near IR 양자점을 이용하여 MRI의 조영제로 사용함과 동시에 특정 지역의 암세포만을 선별적으로 죽이는 새로운 표적지향형 치료방법은 최근 나노물질의 에너지를 흡수하여 열을 내는 성질을 이용한 항암치료가 가능하다는 것을 보여주는 대표적인 예이다 [Hirsch et al., PNAS, Vol. 100, 13549 (2003)].Because of their small size, nanomaterials can easily flow along blood vessels or lymph, and they can accumulate and deliver nanomaterials to specific sites by attaching or controlling the size of specific materials on their surfaces. Recently, these characteristics can be used as a molecular imaging contrast agent useful for diagnosing diseases, or in nanomedicine fields such as drug transporters that deliver therapeutic drugs. The advantage of such nanomaterials is that they have superior properties over existing bulk materials of relatively large size. In particular, the recent researches for early diagnosis and treatment of cancer among refractory diseases have shown many applicability. For this purpose, the development of contrast agent for molecular imaging using quantum dots, biosensor for early diagnosis of cancer Development and drug delivery studies for early-diagnosed tumors are underway. In particular, the new target-oriented treatment method that uses near IR quantum dots as a contrast medium for MRI and selectively kills only cancer cells in a specific area shows that the anticancer treatment using the heat absorbing energy of nanomaterials is possible. Representative examples [Hirsch et al., PNAS, Vol. 100, 13549 (2003).
세포연구 및 세포치료분야에서 세포분리는 각각의 면역세포의 분석 및 진단, 치료에 응용이 가능한 매우 중요하고 필수적인 공정이다. 현재 Miltenyi Biotec사의 microbead는 마이크로 크기의 자성 입자를 이용한 특정세포분리기법이 상용화된 상태이지만, 자기장(magnetic field) 등의 별도의 키트가 필요하다는 번거로움이 있다. 그럼에도 불구하고 자성입자를 이용한 다양한 연구가 진행되고 있다. 최근에는 자성나노선(Magnetic nanowire)을 이용한 연구가 진행되고 있으며 이러한 자성나노선은 기하학적으로 이방성을 가지고 있으며, 자성 나노입자와 비교하였을 때, 높은 aspect ratio를 나타내기 때문에 높은 자성 특성을 보인다. 이러한 특성을 갖는 자성 나노선을 이용하여 세포 분리 진행에 응용한 연구결과가 발표된 바 있다 [Anne Hultgren et al., Biotechnol. Prog. Vol. 21, 509 (2005); Prina-Mello et al., Journal of Nanobiotechnology, Vol. 4, 9 (2006); Choi et al., Biomed Microdevices, Vol. 9, 143 (2007)].In the field of cell research and cell therapy, cell separation is a very important and essential process that can be applied to the analysis, diagnosis and treatment of each immune cell. At present, Miltenyi Biotec's microbead has been commercialized in a specific cell separation technique using micro-sized magnetic particles, but it is troublesome to require a separate kit such as a magnetic field. Nevertheless, various studies using magnetic particles are being conducted. Recently, studies using magnetic nanowires have been conducted, and these magnetic nanowires are geometrically anisotropic and show high magnetic properties because they exhibit a high aspect ratio when compared with magnetic nanoparticles. Application of magnetic nanowires having these characteristics to cell separation has been published [Anne Hultgren et al., Biotechnol. Prog. Vol. 21, 509 (2005); Prina-Mello et al., Journal of Nanobiotechnology, Vol. 4, 9 (2006); Choi et al., Biomed Microdevices, Vol. 9, 143 (2007).
현재까지 자성을 이용하지 않은 나노선을 이용한 선택적 세포분리, 나노선과 생물체와의 상호작용, 나노선에 대한 독성 연구 등에 대한 연구는 거의 발표된 바 없다. 지금까지 보고된 나노선 기반의 세포분리에 대한 연구는 모두 금속성질을 가진 니켈(Ni) 나노선을 이용한 포유류의 세포분리에 대한 결과를 나타내었으나, Ni 금속은 세포독성(cytotoxicity)을 가지고 있으며, 발암 물질(Nickel carcinogenesis)로 작용한다는 연구결과들이 함께 보고되었다. 이러한 문제점을 극복하고자 나노바이오분야에 적합한 세포독성이 적고 생체적합성이 높은 나노선에 대한 연구가 진행되고 있다. 대표적인 예로 실리콘나노선(Si Nanowire)은 살아있는 세포의 증식, 유전인자 증식 등 세포 기능을 방해하지 않는 적합한 물질로 주목 받고 있다 [Bauer et al., Langmuir, Vol. 19, 7043 (2003); Birenbaum et al., Langmuir, Vol. 19, 9580 (2003); Salem et al., Nat. Mater. Vol. 2, 668 (2003)].To date, there have been few studies on selective cell separation using non-magnetic nanowires, interactions between nanowires and organisms, and studies on toxicity of nanowires. All studies on cell separation based on nanowires reported so far have shown the results of mammalian cell separation using nickel (Ni) nanowires with metallic properties, but Ni metal has cytotoxicity. Research has also been reported to act as a carcinogen. In order to overcome this problem, studies on nanowires with low cytotoxicity and high biocompatibility suitable for nanobiotechnology are being conducted. As a representative example, silicon nanowires are attracting attention as suitable materials that do not interfere with cell function such as proliferation of living cells and proliferation of genetic factors [Bauer et al., Langmuir, Vol. 19, 7043 (2003); Birenbaum et al., Langmuir, Vol. 19, 9580 (2003); Salem et al., Nat. Mater. Vol. 2, 668 (2003).
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 세포독성이 적은 실리콘 나노선(silicon nanowire)을 이용하여 세포 분리칩을 제조하는 경우, 자성을 이용하지 않으며, 별도의 키트와 장치가 필요하지 않으며, 적은 수의 세포도 분리 가능하므로 고수율의 세포 분리능을 얻을 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
Therefore, the present inventors have made diligent research efforts to overcome the problems of the prior art, when manufacturing a cell separation chip using silicon nanowires with low cytotoxicity, do not use magnetism, a separate kit No device is required, and since a small number of cells can be separated, it has been confirmed that a high yield of cell separation ability can be obtained, thus completing the present invention.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 세포독성이 적으며, 생체적합성(biocompatability)이 뛰어난 실리콘 나노선(silicon nanowire)을 이용한 세포 분리칩을 제공하는데 있다.Accordingly, a main object of the present invention is to provide a cell separation chip using silicon nanowires having low cytotoxicity and excellent biocompatability.
본 발명의 다른 목적은 상기 세포 분리칩을 이용한 특정 세포의 분리방법을 제공하는데 있다.
Another object of the present invention is to provide a method for separating specific cells using the cell separation chip.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 기판; 상기 기판 상에 성장된 실리콘 나노선(silicon nanowire); 상기 실리콘 나노선 표면에 고정화된 스트렙타비딘(streptavidin)을 포함하는 세포 분리칩을 제공한다.According to one aspect of the invention, the invention is a substrate; Silicon nanowires grown on the substrate; Provided is a cell separation chip comprising streptavidin immobilized on the surface of the silicon nanowires.
본 발명의 세포 분리칩에서, 상기 기판은 실리콘 나노선을 성장시키기 위한 것으로써 상기 실리콘 나노선을 성장시킬 수 있는 어떠한 기판도 사용가능하나, 구체적으로 유리 웨이퍼 또는 실리콘 웨이퍼를 사용할 수 있으며, 본 발명의 실시예에서는 실리콘 웨이퍼를 사용하였다.In the cell separation chip of the present invention, the substrate may be any substrate capable of growing the silicon nanowires to grow the silicon nanowires, but specifically, a glass wafer or a silicon wafer may be used. In the Examples, silicon wafers were used.
본 발명의 세포 분리칩에 있어서, 상기 실리콘 나노선은 top-down [Peng et al., Angew. Chem. Int. Ed. Vol. 44, 2737 (2005)] 또는 bottom-up [Wagner et al., Appl. Phys. Lett. Vol. 4, 89, (1964)] 방법으로 성장시킬 수 있으며, 본 발명에서는 바람직하게 많은 양의 단결정구조의 나노선을 성장하기 적합한 bottom-up 방법으로 실리콘 나노선을 성장시켰다. 상기 bottom-up 방법으로 실리콘 나노선이 성장된 기판을 이용함으로써 세포와 결합할 수 있는 영역을 증가시켰다.In the cell separation chip of the present invention, the silicon nanowire is top-down [Peng et al., Angew. Chem. Int. Ed. Vol. 44, 2737 (2005) or bottom-up [Wagner et al., Appl. Phys. Lett. Vol. 4, 89, (1964)], and the silicon nanowires are grown in the present invention by a bottom-up method suitable for growing a large amount of single crystal nanowires. By using the substrate on which the silicon nanowires were grown by the bottom-up method, an area capable of binding to cells was increased.
상기 실리콘 나노선은 SiH4를 실리콘 전구체로 금(Au)을 촉매로 사용하여 핫월 화학기상증착장비(hot-wall Chemical Vapour Deposition; HW-CVD)에서 VLS(vapor-liquid-solid) 방법을 이용하여 성장시키는 것을 특징으로 한다. 반응로에 촉매물질인 금(Au)을 도포한 뒤 SiH4 가스를 공급하여 고온으로 올리면 금(Au) 촉매 표면에 SiH4 가스가 달라붙게 되고, 공융점(eutectic point) 이상에서 Au-Si 혼합용액 방울(liquid droplet)이 형성된 후 과포화(supersaturated)되는 SiH4 가스에 의해 고체-액체 계면에서 대칭성이 파괴(symmetry breaking)되어 1 차원으로 나노선이 형성된다. 이때 성장하는 나노선의 직경은 촉매 결정의 크기를 조절함으로써 제어할 수 있고, 나노선의 길이는 반응시간으로 제어할 수 있다.The silicon nanowires were formed using a vapor-liquid-solid (VLS) method in a hot-wall Chemical Vapor Deposition (HW-CVD) using SiH 4 as a silicon precursor and gold (Au) as a catalyst. It is characterized by growing. After coating gold (Au) as a catalyst on the reactor and supplying SiH 4 gas and raising it to high temperature, SiH 4 gas adheres to the surface of gold (Au) catalyst and Au-Si is mixed above eutectic point. After the liquid droplets are formed, the supersaturated SiH 4 gas causes symmetry breaking at the solid-liquid interface to form nanowires in one dimension. At this time, the diameter of the growing nanowires can be controlled by adjusting the size of the catalyst crystal, the length of the nanowires can be controlled by the reaction time.
본 발명의 실시예에서 확인한 바와 같이, 상기의 방법으로 실리콘 웨이퍼 기판에 성장시킨 실리콘 나노선이 단결정이며, 150 ~ 300 nm의 직경과 3 ~ 10 μm의 길이를 갖는 것을 확인하였다.As confirmed in the embodiment of the present invention, it was confirmed that the silicon nanowires grown on the silicon wafer substrate by the above method were single crystals and had a diameter of 150 to 300 nm and a length of 3 to 10 μm.
본 발명의 세포 분리칩에 있어서, 상기 스트렙타비딘(streptavidin)은 실리콘 나노선에 O2 플라즈마를 처리하고, APTES(Aminopropyltriethoxylsilane)을 콘쥬게이션(chemical conjugation)하고, GA(Glutaraldehyde)를 콘쥬게이션하고, 스트렙타비딘(streptavidin)을 콘쥬게이션함으로써 고정화되는 것을 특징으로 한다.In the cell separation chip of the present invention, the streptavidin (Streptavidin) is treated with O 2 plasma to the silicon nanowires, chemical conjugation (Aminopropyltriethoxylsilane) (APTES), conjugated Glutaraldehyde (GA), It is characterized by being immobilized by conjugating streptavidin.
상기 스트렙타비딘은 바이오틴(biotin)과 매우 강한 결합을 하는 것으로 알려져 있으며 [Gonzalez et al., Journal of Biological Chemistry, Vol. 272(17), 11288 (1997)], 이와 같이 바이오틴과 스트렙타비딘의 결합을 이용하여 실리콘 나노선 표면에 세포를 부착시켜 특정 세포의 분리를 유도하였다. 따라서 본 발명의 세포 분리칩은 비자기장(non-magnetic field) 내에서 특정 세포를 분리하므로 영구자석과 같은 별도의 키트가 필요하지 않으며, 형광활성세포분류기(fluorescence activated cell sorter; FACS)와 같은 고가의 장비를 필요로 하지 않는 장점을 갖는다.The streptavidin is known to have a very strong binding to biotin (Gonzalez et al., Journal of Biological Chemistry, Vol. 272 (17), 11288 (1997)], using the combination of biotin and streptavidin to attach the cells to the surface of the silicon nanowires to induce separation of specific cells. Therefore, since the cell separation chip of the present invention separates specific cells in a non-magnetic field, a separate kit such as a permanent magnet is not required, and a high cost such as a fluorescence activated cell sorter (FACS) Has the advantage of not needing equipment.
상기 콘쥬게이션은 APTES는 실리콘 표면의 O2 플라즈마 처리에 의한 OH-의 H+ 3개와 APTES의 Si3 +가 치환되어 화학적 결합을 하며, 이후, 결합된 APTES에 공유결합시킨 GA(Glutaraldehyde)는 APTES의 아민그룹과 반응하여 결합된다.
The conjugation is APTES is O 2 plasma treatment OH according to the silicon surface of the Si 3 + for
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 세포의 분리방법을 제공한다.According to another aspect of the invention, the invention provides a method for separating cells comprising the following steps.
a) 제 1항에 따른 실리콘 나노선 표면에 고정화된 스트렙타비딘(streptavidin)을 갖는 세포 분리칩을 준비하는 단계;a) preparing a cell separation chip having streptavidin immobilized on a surface of a silicon nanowire according to
b) 바이오틴(biotin)이 결합된 항체(antibody)를 이용하여 특정세포를 결합시키는 단계; 및b) binding specific cells using an antibody to which biotin is bound; And
c) 상기 바이오틴과 스트렙타비딘의 결합을 이용하여 실리콘 나노선 표면에 특정세포를 부착시키는 단계.c) attaching specific cells to the surface of the silicon nanowires by using the combination of biotin and streptavidin.
본 발명의 세포 분리방법에 있어서, 상기 항체는 바이오틴이 결합된 어떠한 항체도 가능하나, 바람직하게는 CD3, CD4, CD19 및 CD8로 이루어진 군에서 선택된 항체이고, 상기 특정세포는 면역세포인 것을 특징으로 한다. 따라서 바이오틴-항체(biotin-Ab)의 종류를 변화시킴에 따라 세포 분리칩으로부터 다양한 세포의 분리가 가능하다.In the cell separation method of the present invention, the antibody may be any antibody to which biotin is bound, preferably an antibody selected from the group consisting of CD3, CD4, CD19, and CD8, and the specific cell is an immune cell. do. Therefore, it is possible to separate various cells from the cell separation chip by changing the type of biotin-Ab.
본 발명의 실시예에서는 상기 면역세포를 얻기 위해 마우스에서 비장(spleen)을 추출하였다. 비장(spleen)은 면역세포를 생성하는 장기 중에 하나로써, 다양한 종류의 면역세포(B 림프구, T 림프구, 자연 살상세포(NK cell) 등)가 존재한다. 본 발명에서는 구체적으로 상기 마우스의 비장세포로부터 CD4+ T cell을 성공적으로 분리하였으며, 도 4에 보이는 바와 같이 기판에 성장시킨 실리콘 나노선 사이에 면역세포가 부착되어 고정되어 있는 것을 확인하였다.In the embodiment of the present invention, the spleen was extracted from the mouse to obtain the immune cells. The spleen is one of the organs that produce immune cells, and there are various types of immune cells (B lymphocytes, T lymphocytes, natural killer cells, etc.). In the present invention, specifically, CD4 + T cells were successfully isolated from the spleen cells of the mouse, and as shown in FIG. 4, it was confirmed that immune cells were attached and fixed between the silicon nanowires grown on the substrate.
본 발명의 세포 분리방법에 있어서, 상기 바이오틴과 스트렙타비딘의 결합을 가역적으로 분리함으로써 세포 분리칩을 재사용하는 것을 특징으로 한다. 예컨대, 비-이온성 수용액(nonionic aqueous solution)에 넣고 70 ℃ 이상에서 배양시킴으로써 바이오틴과 스트렙타비딘의 결합을 끊음으로써 분리할 수 있다 [Holmberg et al., Electrophoresis, Vol. 26, 501 (2005)].
In the cell separation method of the present invention, the cell separation chip is reused by reversibly separating the binding of the biotin and streptavidin. For example, it can be isolated by breaking the binding of biotin and streptavidin by incubating at 70 ° C. or above in a nonionic aqueous solution [Holmberg et al., Electrophoresis, Vol. 26, 501 (2005)].
도 1a는 기판 상에 성장된 실리콘 나노선의 SEM 이미지이다.
도 1b는 기판 상에 성장된 실리콘 나노선의 TEM 이미지(A) 및 EDS 분석 결과(B)를 나타낸 것이다.
도 1c는 온도에 따라 성장된 실리콘 나노선의 직경(A) 및 길이(B)를 분석한 결과를 나타낸다.
도 2는 실리콘 표면에의 화학결합 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 면역세포의 분리과정 모식도를 나타낸 것이다.
도 4는 스트렙타비딘이 코팅된 실리콘 나노선에 결합된 면역세포의 SEM 이미지이다.
도 5는 유세포 분석기를 이용하여 세포의 개체수를 측정한 결과를 나타낸 것이며, (A)는 wool column을 이용하여 B 세포를 제거시킨 후 면역세포의 개체수 측정 결과이며, (B)는 스트렙타비딘이 결합된 실리콘 나노선을 이용하여 세포분리를 진행한 후 면역세포의 개체수를 측정한 결과이다.
도 6은 세포분리에 사용한 기판의 종류에 따른 면역세포의 분리율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 실리콘 나노선이 성장된 기판에서 O2 플라즈마 처리 유무에 따른 면역세포의 분리율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 실리콘 나노선이 성장된 기판에서 O2 플라즈마의 처리 시간에 따른 면역세포의 분리율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 O2 플라즈마를 처리하지 않고 실리콘 나노선을 성장시킨 기판에서 세포분리를 여러번 반복하였을 때의 면역세포 분리율을 측정한 결과를 나타낸 것이다.1A is an SEM image of silicon nanowires grown on a substrate.
FIG. 1B shows a TEM image (A) and an EDS analysis result (B) of silicon nanowires grown on a substrate.
Figure 1c shows the results of analyzing the diameter (A) and the length (B) of the silicon nanowires grown with temperature.
2 shows a schematic diagram of chemical bonding to the silicon surface.
Figure 3 shows a schematic diagram of the separation process of immune cells.
4 is an SEM image of immune cells bound to streptavidin-coated silicon nanowires.
Figure 5 shows the results of measuring the population of cells using a flow cytometer, (A) is a result of measuring the population of immune cells after removing B cells using a wool column, (B) is streptavidin Cell separation was performed using the bonded silicon nanowires, and then the number of immune cells was measured.
Figure 6 shows the results of measuring the separation rate of immune cells according to the type of substrate used for cell separation.
Figure 7 shows the results of measuring the separation rate of immune cells according to the presence or absence of O 2 plasma treatment on the silicon nanowire growth substrate.
Figure 8 shows the results of measuring the separation rate of immune cells according to the treatment time of O 2 plasma in the silicon nanowires growth substrate.
Figure 9 shows the results of measuring the immune cell separation rate when the cell separation is repeated several times on the substrate on which the silicon nanowires were grown without O 2 plasma treatment.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.
실시예Example 1. 실리콘 1.silicone 나노선(silicon nanowire)의Of nanowires 성장 growth
1-1. 성장용 시료 준비1-1. Sample Preparation for Growth
실리콘 나노선 성장을 위하여 (111) 방향의 실리콘 웨이퍼를 사용하였으며, 시료의 표면에 형성된 산화막을 제거하기 위해 BOE(buffered oxide etchant)와 탄이온수(deionized water; DW)를 각각 5 분씩 반응하여 세척하였다. 또한 아세톤(acetone)과 이소프로판올(isopropanol; IPA)의 혼합용액 및 DW를 각각 5 분씩 반응하여 표면의 유기물질을 제거하였으며, 실리콘 나노선이 성장될 때 촉매제 역할을 하는 금(Au)을 전자빔 증착기를 이용하여 2 nm 증착시켰다. Au가 증착된 실리콘 웨이퍼는 Sawing machine(Aron) 장비를 이용하여 0.7×0.7 cm2의 크기로 잘랐으며, 시료를 자르는 도중 발생되는 실리콘 파편의 손쉬운 제거를 위해, photoresist(PR, AZ 5214 E)를 실리콘 웨이퍼에 도포한 후 진행하였다. 이후 표면의 PR 제거를 위해 아세톤과 IPA 혼합용액, DW를 이용하였다.
A silicon wafer in the (111) direction was used to grow the silicon nanowires, and washed with reacted BOE (buffered oxide etchant) and deionized water (DW) for 5 minutes to remove the oxide film formed on the surface of the sample. . In addition, the organic material on the surface was removed by reacting acetone and isopropanol (IPA) mixed solution and DW for 5 minutes each, and the gold (Au), which acts as a catalyst when silicon nanowires are grown, is an electron beam evaporator. 2 nm was deposited. Au-deposited silicon wafers were cut to a size of 0.7 × 0.7 cm 2 using a Sawing machine (Aron) equipment, and photoresist (PR, AZ 5214 E) was used for easy removal of silicon debris generated during sample cutting. After application to a silicon wafer, it proceeded. Then, acetone and IPA mixed solution, DW was used to remove the PR of the surface.
1-2. 실리콘 나노선의 성장1-2. Growth of Silicon Nanowires
상기 준비된 기판에의 나노선 성장은 핫월 방식의 화학기상증착장비(hot-wall Chemical Vapour Deposition; HW-CVD)를 이용한 VLS 방법을 이용하였으며, 실리콘 나노선 성장 시간 동안 일정한 온도 유지가 가능하도록 하였으며, 석영관 양쪽에 냉각수 라인을 설치하여 고온에서도 무리가 없도록 설계하였다. 내부에는 2 개의 석영관을 사용하여 안쪽 석영관에 일정한 반응 가스 흐름(gas rate)을 가질 수 있도록 구축하였다. 이러한 이중 석영관의 사용은 외부 석영관의 물리, 화학적 오염을 방지하는 역할을 한다.Nanowire growth on the prepared substrate using a VLS method using a hot-wall chemical vapor deposition (HW-CVD) method, it was possible to maintain a constant temperature during the silicon nanowire growth time, Cooling water lines were installed on both sides of the quartz tube so that they were designed to be free from high temperatures. Inside, two quartz tubes were used to build a constant reactant gas rate in the inner quartz tube. The use of such a double quartz tube serves to prevent physical and chemical contamination of the external quartz tube.
먼저, 상기에서 준비한 시료(실시예 1-1에서 제조된 실리콘 나노선을 성장시킬 실리콘 웨이퍼)를 안쪽 석영관에 로딩 하였다. 이때 캐리어 가스(carrier gas)로부터 일정한 거리를 유지하기 위해 시료를 안쪽 석영관의 끝 쪽부터 각각 19, 21, 23, 25, 27, 29 cm의 거리에 6 개의 시료를 위치시켰다. 안쪽 석영관을 HW-CVD 가운데에 위치시킨 후, 반응기 내부의 잔류 불순물을 없애주고, SiH4 가스관 내에 잔존할 수 있는 가스들을 제거하기 위해 가스관의 밸브를 열고 반응기의 진공도를 로터리 펌프를 이용하여 진공상태를 만들어 주었다. 반응 압력이 5×10-2 torr 이하가 되면 SiH4 가스관의 밸브를 닫고, 30 분 동안 진공상태를 유지시켜 주었다. 이때 진공상태를 계속 유지하며 반응기의 온도를 30 분 동안 상온에서 500 ~ 600 ℃까지 상승시켰으며, 반응 온도에 다다르면 3 sccm의 캐리어 가스인 SiH4 가스를 반응기 내로 흘려주었다. 이때 반응기의 압력은 5 torr로 고정시켜 주었다. 4 시간 동안 같은 상태를 유지시켜 실리콘 나노선을 성장시켰으며, 반응이 끝난 후 SiH4 가스의 주입을 막고 상온까지 반응기를 천천히 식혀주었다.
First, the sample prepared above (a silicon wafer to grow the silicon nanowires prepared in Example 1-1) was loaded into an inner quartz tube. At this time, in order to maintain a constant distance from the carrier gas (carrier gas) 6 samples were placed at a distance of 19, 21, 23, 25, 27, 29 cm from the end of the inner quartz tube, respectively. After placing the inner quartz tube in the middle of the HW-CVD, remove the residual impurities in the reactor, open the valve of the gas pipe to remove the gas remaining in the SiH 4 gas pipe and vacuum the reactor vacuum using a rotary pump. Made a state. When the reaction pressure was 5 × 10 −2 torr or less, the valve of the SiH 4 gas tube was closed and vacuum was maintained for 30 minutes. At this time, while maintaining the vacuum state, the temperature of the reactor was raised to 500 ~ 600 ℃ for 30 minutes at room temperature, when reaching the reaction temperature of 3 sccm carrier gas SiH 4 gas flowed into the reactor. At this time, the pressure of the reactor was fixed at 5 torr. The silicon nanowires were grown by maintaining the same state for 4 hours, and after the reaction was completed, the SiH 4 gas was prevented from being injected and the reactor was slowly cooled to room temperature.
1-3. 실리콘 나노선 물질의 특성 분석1-3. Characterization of Silicon Nanowire Materials
시료에 성장된 실리콘 나노선 물질의 특성을 분석하기 위해 전계방출주사현미경(FE-SEM, Hitachi S-4300)을 이용하여 성장된 실리콘 나노선의 지름과 길이, 표면 상태를 관찰하였다. 또한 나노선을 구성하는 물질을 알아보기 위해 EDS(Energy Dispersive Spectroscopy)를 이용하였으며, 실리콘 나노선의 결정학적 구조와 합성 방향의 분석을 위해 고분해능 투과전자현미경(HR-TEM, JEOL JEM-2010), 제한시야전자회절(selected area electron diffraction; SAED) 패턴을 통해 분석하였다. 상기 분석 결과는 도 1a, 도 1b 및 도 1c에 나타내었다.In order to analyze the characteristics of the silicon nanowire material grown on the sample, the diameter, length, and surface state of the grown silicon nanowire were observed using a field emission scanning microscope (FE-SEM, Hitachi S-4300). In addition, EDS (Energy Dispersive Spectroscopy) was used to investigate the material that constitutes the nanowire, and high-resolution transmission electron microscope (HR-TEM, JEOL JEM-2010), restriction for analysis of crystallographic structure and synthesis direction of silicon nanowire Analysis was performed using a selected area electron diffraction (SAED) pattern. The analysis results are shown in FIGS. 1A, 1B and 1C.
먼저 도 1a에 나타낸 SEM 이미지에서 확인할 수 있듯이 실리콘 나노선이 150 ~ 300 nm의 직경과 3 ~ 10 μm의 길이를 갖는 것을 확인할 수 있으며(A), 2 μm의 간격으로 수직으로 성장된 것을 확인할 수 있다(B). 또한 도 1b의 HR-TEM 이미지에서 보이는 바와 같이, (111) 방향의 단결정 나노선이 성장되었음을 확인할 수 있으며, 표면에 자연 산화막(native oxide)이 형성되어 있는 것을 확인할 수 있다. 그리고 EDS 결과를 통해, 성장된 나노선이 실리콘을 주성분으로 하는 것을 확인할 수 있다.First, as shown in the SEM image shown in FIG. 1A, it can be seen that the silicon nanowire has a diameter of 150 to 300 nm and a length of 3 to 10 μm (A), and it can be seen that it is vertically grown at an interval of 2 μm. (B). In addition, as shown in the HR-TEM image of FIG. 1B, it can be seen that the single crystal nanowires in the (111) direction have been grown, and a native oxide film is formed on the surface. And through the EDS results, it can be confirmed that the grown nanowires are mainly composed of silicon.
도 1c는 온도에 따라 성장된 실리콘 나노선의 직경 및 길이를 분석한 결과를 나타낸다. 도 1c에서 확인할 수 있듯이 온도가 증가될수록 성장되는 실리콘 나노선의 직경이 증가하는 것을 확인할 수 있다. 이는 Ostwald ripening 효과에 의한 것으로, 온도가 증가할수록 크기가 큰 입자가 작은 입자보다 표면 에너지가 작기 때문에 작은 입자가 큰 입자가 되려는 자발적인 현상이 나타나기 때문이다 [Lifschitz et al., Phys. Chem. Solids, Vol. 19, 35 (1981)]. 이러한 결과는 성장되는 온도와 시간의 조절에 의하여 실리콘 나노선의 직경 및 길이를 조절함으로써 서로 다른 직경에서의 나노선 특성 분석 연구가 가능하다는 것을 보여준다.
Figure 1c shows the results of analyzing the diameter and length of the silicon nanowires grown with temperature. As can be seen in Figure 1c it can be seen that as the temperature increases the diameter of the grown silicon nanowires increases. This is due to the Ostwald ripening effect, because spontaneous phenomena of small particles become larger particles because the larger particles have smaller surface energy than the smaller ones [Lifschitz et al., Phys. Chem. Solids, Vol. 19, 35 (1981). These results show that nanowire characterization studies at different diameters are possible by controlling the diameter and length of silicon nanowires by controlling the growth temperature and time.
실시예Example 2. 세포 2. Cell 분리칩Separation chip 제작 making
면역세포를 분리시키기 위해, 상기 실시예 1에서 성장시킨 실리콘 나노선 표면에 바이오틴(biotin)과 매우 강한 결합력을 가지는 스트렙타비딘(streptavidin, 5.3 kD tetrameric protein)의 화학결합을 유도하였다. 이를 위해 먼저, 실리콘 나노선에 O2 플라즈마 처리를 이용하여 APTES(Aminopropyltriethoxylsilane)의 화학적 결합을 수행하였다. 상기 APTES는 실리콘 표면의 OH-의 H+ 3개와 APTES의 Si3 +가 치환되어 화학적 결합을 한다. 이후, 결합된 APTES에 GA(Glutaraldehyde)를 공유결합 시킨다. 상기 GA는 APTES의 아민그룹과 반응하여 결합된다. 마지막으로 스트렙타비딘을 GA에 결합시킴으로써 세포 분리칩의 제작을 완성하였다. 상기 화학결합의 모식도는 도 2에 나타낸 것과 같다.In order to separate immune cells, chemical bonding of streptavidin (5.3 kD tetrameric protein) having very strong binding power with biotin was induced on the silicon nanowire surface grown in Example 1 above. To this end, first, chemical bonding of APTES (Aminopropyltriethoxylsilane) was performed using O 2 plasma treatment on silicon nanowires. The APTES is
상기 과정을 보다 자세히 설명하면 다음과 같다. 실리콘 나노선이 성장된 기판에 O2 플라즈마를 처리하여 표면에 -OH 이온을 결합시킨다. 상기 O2 플라즈마는 파워 50 W, 압력 40 Pa, 산소 100 ml/min을 유지하여 5 분간 처리하였다. 상기 O2 플라즈마를 처리한 기판을 에탄올에 1 % APTES(Sigma-Aldrich, USA)를 섞은 용액에 넣고, 100 rpm의 속도로 30 분간 쉐이커(shaker) 위에서 반응시켰다. 30 분 후, 기판을 꺼내어 순수한 에탄올에 넣어 세척한 후, 120 ℃ 핫-플레이트(hot-plate) 위에서 10 분간 열처리(baking)하였다. 이후, 3차 증류수(ddH2O)에 50 % GA를 섞은 용액에 상기 열처리한 기판을 넣고 100 rpm의 속도로 4 시간 동안 쉐이커 위에서 반응시켰다. 반응이 완료되면 3차 증류수를 이용하여 세척한 후, 500 μg/ml의 스트렙타비딘(Calbiochem, Germany)이 포함된 10 mM Phosphate buffer(pH 8.4) 30 μl를 기판 위에 올려놓고 CO2 배양기(incubator)에서 밤새도록(overnight) 반응시켰다. 이때 상기 10 mM Phosphate buffer(pH 8.4)는 Monosodium phosphate 0.0039 %와 Disodium phosphate 0.2604 %를 혼합하여 제조하였다. 상기 스트렙타비딘의 합성이 완료되면 1 % BSA(bovine serum albumin)가 포함된 완충용액(PBS, pH 7.4) 용액 내에 30 분간 보관한 뒤, 완충용액으로 세척한 후, 4 ℃ 완충용액에 보관하였다.
The process is described in more detail as follows. The substrate on which the silicon nanowires are grown is treated with O 2 plasma to bind -OH ions to the surface. The O 2 plasma was treated for 5 minutes while maintaining a power of 50 W, a pressure of 40 Pa, and 100 ml / min of oxygen. The O 2 plasma treated substrate was placed in a solution of 1% APTES (Sigma-Aldrich, USA) mixed with ethanol, and reacted on a shaker for 30 minutes at a speed of 100 rpm. After 30 minutes, the substrate was taken out, washed in pure ethanol, and then heat-baked for 10 minutes on a 120 ° C. hot-plate. Then, the heat-treated substrate was added to a solution of 50% GA in distilled water (ddH 2 O) and reacted on a shaker for 4 hours at a speed of 100 rpm. After completion of the reaction, the mixture was washed with 3rd distilled water, and 30 μl of 10 mM Phosphate buffer (pH 8.4) containing 500 μg / ml of streptavidin (Calbiochem, Germany) was placed on a substrate and a CO 2 incubator was used. ) Overnight. At this time, the 10 mM Phosphate buffer (pH 8.4) was prepared by mixing 0.0039% Monosodium phosphate and 0.2604% Disodium phosphate. When the synthesis of the streptavidin was completed for 30 minutes in a buffer solution (PBS, pH 7.4) containing 1% BSA (bovine serum albumin), washed with a buffer solution, and then stored in 4 ℃ buffer solution .
실시예Example 3. 면역세포 분리 3. Immune Cell Isolation
비장(spleen)은 면역세포를 생성하는 장기 중에 하나로써, 다양한 종류의 면역세포(B 림프구, T 림프구(CD4+ T, CD8+ T), 자연살상세포(NK cell) 등)가 존재한다. 따라서 본 발명에서 상기와 같은 면역세포를 얻기 위해 마우스의 비장을 이용하였다.
The spleen is one of the organs that produce immune cells, and there are various kinds of immune cells (B lymphocytes, T lymphocytes (CD4 + T, CD8 + T), natural killer cells (NK cells), etc.). Therefore, the spleen of the mouse was used in the present invention to obtain such immune cells.
3-1. 면역세포 추출3-1. Immune Cell Extraction
세포 분리칩에 고정화 시킬 면역세포를 마우스의 비장(spleen)으로부터 분리하였다.Immune cells to be immobilized on the cell separation chip were isolated from the spleen of the mouse.
먼저, B6 마우스를 CO2 가스를 이용하여 희생시킨 후 왼쪽 옆구리 쪽에서 비장을 적출하였다. 적출한 비장 조직을 mRPMI 배양액(2 % FBS(fetal bovine serum) 함유된 RPMI 1640)이 담긴 세포배양접시(culture dish)에 옮겨 놓은 뒤 슬라이드글라스(slide glass)를 이용하여 비장 조직을 단일세포(single cell)로 분리하였다. 단일세포를 얻기 위해 1,500 rpm의 속도로 3 분간 원심분리한 후 상층액은 제거하였다. 이후, 삼투압을 이용한 적혈구(RBC, red blood cell)의 제거를 위해 3차 증류수 0.5 ml을 튜브에 넣고 3 차례 pipetting 해주었다. 다른 세포에 영향을 적게 주기 위해 곧바로 mRPMI 배양액을 상기 튜브에 가득 채운 후 1,500 rpm의 속도로 3 분간 원심분리 하였다.First, B6 mice were sacrificed using CO 2 gas and spleens were extracted from the left flank. The spleen tissues were removed and transferred to a culture dish containing mRPMI culture medium (RPMI 1640 containing 2% FBS (fetal bovine serum)), and then spleen tissues were separated using a slide glass. cells). The supernatant was removed after centrifugation for 3 minutes at 1,500 rpm to obtain a single cell. Thereafter, in order to remove red blood cells (RBC) using osmotic pressure, 0.5 ml of tertiary distilled water was added to a tube and pipetting three times. In order to lessen the impact on other cells, the mRPMI culture was immediately filled with the tube and centrifuged for 3 minutes at a speed of 1,500 rpm.
적혈구가 제거된 세포를 확인 한 후, 가장 큰 비율을 갖는 B 세포의 제거를 위해 wool column을 이용하였다. 먼저, wool column에 MACS buffer(PBS + 5 % FBS) 7 ml을 기포가 없게 채운 후, CO2 인큐베이터에 40 분간 보관하였다. 40 분 후, wool column의 MACS buffer를 완전히 제거한 뒤 배양액 안의 세포를 wool column에 올려놓고, mRPMI 배양액을 1 ml 넣어 wool column에 B 세포가 달라붙을 수 있도록 CO2 인큐베이터에 40 ~ 50 분간 보관하였다. 이후, wool column에 MACS buffer를 elution하여 B 세포 이외의 다른 세포들을 50 ml 튜브에 담아내었으며, 상기 튜브에 35 ml의 MACS buffer가 채워질 때 까지 계속 흘려주었다. 그 후, 1,500 rpm의 속도로 3 분간 원심분리하여 MACS buffer를 제거한 뒤 세포만 분리해내었다. 상기 분리된 세포를 1 ml MACS buffer에 잘 분산 시킨 후, 혈구계수기(hemacytometer)를 이용하여 세포 수를 측정하였으며, 이후 세포를 4 ℃에 보관하였다.
After identifying the cells from which red blood cells were removed, a wool column was used to remove B cells having the largest ratio. First, 7 ml of MACS buffer (PBS + 5% FBS) was filled in a wool column without bubbles, and then stored in a CO 2 incubator for 40 minutes. After 40 minutes, the MACS buffer of the wool column was completely removed, and the cells in the culture solution were placed on the wool column, and 1 ml of mRPMI culture solution was stored in a CO 2 incubator for 40 minutes to allow the B cells to adhere to the wool column. Then, the MACS buffer was elution on the wool column to contain other cells other than B cells in a 50 ml tube, and the tube continued to flow until 35 ml of MACS buffer was filled. Thereafter, the cells were centrifuged at 1,500 rpm for 3 minutes to remove MACS buffer and only cells were separated. After dispersing the separated cells in 1 ml MACS buffer well, the number of cells was measured using a hemocytometer (hemacytometer), and then the cells were stored at 4 ℃.
3-2. 세포 수의 측정3-2. Measurement of cell number
상기 비장으로부터 분리된 세포의 세포수를 측정하기 위해 혈구계수기(hemacytometer)를 이용하였다.A hemacytometer was used to measure the cell number of cells isolated from the spleen.
먼저 상기에서 분리한 면역세포를 1 ml MACS buffer에 잘 분산 시킨 후, 10 μl를 피펫을 이용하여 분리한 뒤 10 μl 트리판 블루(Trypan Blue) 세포염색약과 1 : 1(v/v) 비율로 섞은 후, 10 μl만 분리하여 혈구계수기에 넣은 후 현미경을 이용하여 3 군데 이상의 사각형 안에 있는 세포수를 계산하였다. 상기 사용한 트리판 블루 염색약은 살아있는 세포와 죽어있는 세포를 분리할 때 사용하며, 죽어있는 세포만 파란색으로 염색시키므로 현미경을 이용하여 세포수를 계산할 때 파란색으로 염색이 되어있는 세포를 제외하였다. 이후 하기식을 이용하여 전체 부피인 1 ml안에 있는 세포의 수를 계산하였다. 하기식에서 2를 곱한 이유는 세포 10 μl와 트리판 블루 10 μl를 사용하여 2 배 희석되었기 때문이며, 혈구계수기의 작은 사각형 하나의 부피는 가로 1 mm, 세로 1 mm, 깊이 0.1 mm이며, 이것의 부피는 0.1 mm3이다. 이것을 10-4 cm3으로 환산할 수 있고, 이는 10-4 ml과 같은 부피가 된다. 이것을 1 ml에 포함된 세포수로 환산해주기 위하여 104을 곱하여 준다. 세포가 너무 많아 세포측정이 어려울 경우에는 10 배, 100 배 희석을 통하여 손쉽게 세포수를 셀 수 있다. 이때 세포수를 계산하는 수식은 하기식에 희석배율을 곱하여 계산한다.First, the immune cells isolated above are well dispersed in 1 ml MACS buffer, and then 10 μl are separated using a pipette, followed by 10 μl Trypan Blue cell dye and 1: 1 (v / v) ratio. After mixing, only 10 μl was separated and put into a hemocytometer, and the number of cells in three or more squares was calculated using a microscope. The used trypan blue dye is used to separate living cells from dead cells, and only dying cells are dyed in blue, so when calculating the number of cells using a microscope, cells that are dyed in blue are excluded. Then, the number of cells in the total volume of 1 ml was calculated using the following formula. The reason for multiplying 2 in the following equation is because the cells were diluted 2 fold using 10 μl of cells and 10 μl of trypan blue, and the volume of one small square of the hemocytometer was 1 mm in width, 1 mm in length, and 0.1 mm in depth. Is 0.1 mm 3 . This can be converted to 10 -4 cm 3 , which is equivalent to 10-4 ml. To convert this to the number of cells contained in 1 ml multiply by 10 4 . If too many cells are difficult to measure, the cell number can be easily counted by diluting 10 times or 100 times. At this time, the formula for calculating the cell number is calculated by multiplying the dilution ratio by the following formula.
<수학식 1>&Quot; (1) "
실시예Example 4. 면역세포 분리율 측정 4. Measurement of Immune Cell Separation Rate
4-1. 세포 4-1. cell 분리칩에서On separation chip 면역세포의 고정화 및 분리 Immobilization and Isolation of Immune Cells
상기 마우스의 비장에서 분리한 세포(splenocyte)를 상기 wool column을 이용해 전처리한 후 얻은 세포(T enriched lymphocyte) 중에서 CD4+ T 세포만을 분리하기 위해, 먼저 본 발명의 세포 분리칩에 스트렙타비딘을 고정화시켰다. 여러 T 림프구 중 세포막 표면에 CD4+ 단백질의 발현이 가장 높으며, 이로 인해 항원항체반응이 일어나기에 용이할 것이다.In order to separate only CD4 + T cells from cells obtained from the splenocytes isolated from the spleen of the mouse using the wool column (T enriched lymphocytes), streptavidin was first immobilized on the cell separation chip of the present invention. . Among the various T lymphocytes, the expression of CD4 + protein is highest on the cell membrane surface, which may facilitate the antigen-antibody reaction.
먼저, 상기 마우스 비장으로부터 분리하여 4 ℃에 보관시킨 T-enriched splenocyte를 1×105 cells로 세포수를 맞춘 뒤, 1.5 ml 마이크로원심관(microcentrifuge tube)에서 MACS buffer 100 μl에 분산 시킨 후, 바이오틴이 결합된 CD4 마우스 항체(biotin-αCD4 mAb) 2 μl를 넣고 4 ℃에서 20 분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 결합하지 못한 항체를 제거하기 위해 MACS buffer 1 ml에서 3,000 rpm의 속도로 3 분간 원심분리한 후 MACS buffer를 제거하고 세척과정을 통해 결합되지 않은 항체를 제거하였다. 상기 분리시킨 세포(biotin-aCD4 mAb가 붙은 CD4+ T cell을 포함한 세포)를 MACS buffer 30 μl에 잘 분산 시킨 후, 상기 실시예 2에서 제작한 세포 분리칩 위에 올려놓고, 4 ℃에서 20 분간 반응시켜 면역세포의 바이오틴과 세포 분리칩의 스트렙타비딘이 결합되도록 하였다. 반응완료 후, 고정화되지 않은 세포를 분리하기 위해 MACS buffer 2 ml을 이용하여 세척하였다. 상기 세척은 100 rpm 속도로 5 분간 쉐이커 위에서 3번 반복 수행하였으며, 이후 1,500 rpm 속도로 3 분간 원심분리하여 고정화되지 않은 세포를 분리하였으며, 이 세포를 유세포분석기(flow cytometer)를 이용하여 표현형(phenotype)을 분석하였다. 즉, 분리 하려한 세포인 CD4+ T cell을 제외한 세포들의 수를 세어 줄어든 CD4+ T cell을 확인하였다. 상기 면역세포 분리과정의 모식도를 도 3에 나타내었다. 또한 본 발명의 실리콘 나노선을 성장시킨 기판 외에 실리콘 웨이퍼, 유리 웨이퍼를 사용하여 상기와 같이 면역세포의 고정 및 분리를 수행하였으며, 각각의 기판에서 면역세포의 분리율을 측정하였다. 상기 실리콘 웨이퍼와 유리 웨이퍼는 상기 실시예 2와 같은 방법으로 스트렙타비딘을 결합시킨 후 사용하였다.
First, T-enriched splenocytes isolated from the mouse spleen and stored at 4 ° C. were adjusted to 1 × 10 5 cells, and then dispersed in 100 μl of MACS buffer in 1.5 ml microcentrifuge tubes, followed by biotin 2 μl of the bound CD4 mouse antibody (biotin-αCD4 mAb) was added and reacted at 4 ° C. for 20 minutes. After the reaction was completed, centrifugation was carried out for 3 minutes at a rate of 3,000 rpm in 1 ml of MACS buffer to remove the antibody that did not bind, and then the MACS buffer was removed and the unbound antibody was removed by washing. The separated cells (cells containing CD4 + T cells with biotin-aCD4 mAb) were well dispersed in 30 μl of MACS buffer, placed on the cell separation chip prepared in Example 2, and reacted at 4 ° C. for 20 minutes. Biotin of immune cells and streptavidin of cell separation chip were combined. After completion of the reaction, unfixed cells were washed with 2 ml of MACS buffer. The washing was repeated three times on a shaker for 5 minutes at 100 rpm and then centrifuged at 1,500 rpm for 3 minutes to separate the immobilized cells, and the cells were phenotyped using a flow cytometer. ) Was analyzed. That is, the number of cells except for the CD4 + T cells, which are the cells to be separated, was counted to identify the reduced CD4 + T cells. A schematic diagram of the immune cell separation process is shown in FIG. 3. In addition to the substrate on which the silicon nanowires of the present invention were grown, immobilization and separation of immune cells were performed using the silicon wafer and the glass wafer as described above, and the separation rate of the immune cells was measured on each substrate. The silicon wafer and the glass wafer were used after binding streptavidin in the same manner as in Example 2.
본 발명의 실리콘 나노선이 성장된 기판에 면역세포를 고정화 시킨 후 SEM을 측정하였다. 도 4의 SEM 이미지에서 보이는 바와 같이, 스트렙타비딘이 결합된 실리콘 나노선에 바이오틴 항체가 결합된 CD4+ T 세포가 스트렙타비딘과 바이오틴의 강한 결합력에 의해 고정화되어 있는 것을 확인할 수 있다.
SEM was measured after immobilizing immune cells on the substrate on which the silicon nanowires of the present invention were grown. As shown in the SEM image of Figure 4, it can be seen that the CD4 + T cells in which biotin antibody is bound to the streptavidin-bound silicon nanowires are immobilized by the strong binding force of streptavidin and biotin.
4-2. 4-2. 유세포분석을Flow cytometry 위한 세포 염색 Cell staining for
유세포분석기(flow cytometer)를 이용한 표현형분리(phenotypying)는 형광이 발현된 항체가 붙은 세포에 레이저를 이용하여 자극을 주고, 그에 의해 방출된 빛을 감지하는 방법으로 세포의 수를 측정하는 장비이다. 이를 위하여 발현된 항체를 세포에 붙이는 염색과정이 필요하다.Phenotypying using a flow cytometer is a device that measures the number of cells by stimulating cells with fluorescence-expressed antibodies using a laser and sensing the light emitted by them. To this end, a staining process for attaching the expressed antibody to the cell is required.
본 발명에서는 FITC(fluorescein isothiocyanate)(525 nm), PE(phycoerythrin)(575 nm), PerCP(peridinin chlorophyll protein)(675 nm), APC(allophycocyanin)(660 nm)의 4 가지 파장의 형광이 붙은 항체 조합을 이용하여 염색을 진행하였다. 먼저 상기에서 분리한 비장초세포(primary splenocytes)를 FACS buffer(1× PBS 500 ml + FBS 10 ml + 10 % spdium azide 1 ml) 100 μl에 잘 분산 시킨 후, 2.4G2 항체(1 : 100의 비율로 FACS buffer에 희석시킴) 10 μl를 넣고 상온에서 5 분간 반응시켰다. 여기서 2.4G2 항체는 비-특이적인 결합(non-specific binding)을 막아주는 역할을 한다. 반응이 끝난 후, 하기 표 1에 나타낸 것과 같은 항체 조합으로 항체를 10 μl씩 넣고 4 ℃에서 20 분간 반응시켰으며, 결합하지 않은 항체를 제거하기 위하여 1,500 rpm의 속도로 3 분간 원심분리를 2회 반복하여 수행하였다. 이후 고정액(fix buffer, 10× PBS 500 ml + formaldehyde 15 ml) 250 μl에 넣고 측정할 때까지 4 ℃에서 보관하였다.
In the present invention, fluorescein isothiocyanate (FITC) (525 nm), phycoerythrin (PE) (575 nm), peridinin chlorophyll protein (675 nm), PerPC (allophycocyanin) APC (allophycocyanin) (660 nm) with fluorescent light Staining was performed using the combination. First, the splenocytes isolated above are dispersed well in 100 μl of FACS buffer (1 ×
[표 1. 항체 조합]Table 1. Antibody Combinations
4-3. 면역세포 분리율 측정4-3. Immune Cell Isolation Rate Measurement
유세포분석기(flow cytometer)를 이용하여 세포의 개체수를 측정함으로써 면역세포의 분리율(Separation Efficiency)을 측정하였다. 측정결과는 도 5 ~ 9에 나타내었다.Separation efficiency of immune cells was measured by measuring the population of cells using a flow cytometer. The measurement results are shown in FIGS. 5 to 9.
먼저, 도 5에 나타낸 것과 같이, X-축은 CD3 FITC, Y-축은 CD4 PE라고 표시하고 있으며 이는 각각 525 nm의 발산파장을 갖는 형광물질(FITC)이 결합된 CD3 항체를 의미하며, 575 nm의 발산파장을 갖는 형광물질(PE)이 결합된 CD4 항체를 의미한다. 도면에서 하나의 점들은 세포들을 의미하여 일반적으로 가운데 축을 기준으로 세포들이 분포하고 있는데, 가운데 축을 기준으로 왼쪽 아래(lower left; LL)의 세포들은 anti-CD4, anti-CD3 항체가 결합되지 않은 세포들의 분포를 나타내고, 오른쪽 아래(lower right; LR)는 anti-CD3 항체와는 결합하지만 anti-CD4 항체와는 결합하지 않은 세포를 나타낸다. 그리고 왼쪽 위(upper left; UL)은 anti-CD4, anti-CD3 항체 두 가지를 모두 결합한 세포들의 분포를 나타낸다. B cell의 경우 CD19라는 단백질을 발현하는 것으로 알려져 있으며, CD4+ T cell은 CD4, CD8+ T cell은 CD8, NKT와 NK cell은 DX5라는 단백질을 발현하는 것으로 알려져 있다. 그리고 T cell의 경우 공통적으로 CD3이라는 단백질을 발현한다. 그러므로 도 5(A)의 UR(upper right) 세포의 분포는 CD4+ T cell임을 확인할 수 있으며, LR(lower right)의 세포의 분석은 CD4+ T cell을 제외한 T cell의 분포임을 확인할 수 있으며, CD4+ T cell이 34.53 %의 분포를 보이는 것을 확인할 수 있다. 또한 도 5(B)는 O2 플라즈마 처리를 한 실리콘 나노선을 이용하여 세포 분리 실험을 진행한 후 세포의 분포를 측정한 것이며, 여기서 CD4+ T cell의 분포가 2.15 %인 것을 확인할 수 있다. 이는 초기의 CD4+ T cell(세포 분리 수행전 CD4+ T cell의 분포(34.53 %))과 비교하였을 때 약 93 %의 분리율을 나타낸다.First, as shown in FIG. 5, the X-axis denotes CD3 FITC and the Y-axis denotes CD4 PE, which means CD3 antibodies to which fluorescence (FITC) having a diverging wavelength of 525 nm is bound, respectively, of 575 nm. It refers to a CD4 antibody to which a fluorescent substance (PE) having a diverging wavelength is bound. In the figure, one point means cells, and cells are generally distributed along the central axis. Lower left (LL) cells along the center axis are cells in which anti-CD4 and anti-CD3 antibodies are not bound. The lower right (LR) indicates cells that bind anti-CD3 antibodies but not anti-CD4 antibodies. The upper left (UL) shows the distribution of cells that bind both anti-CD4 and anti-CD3 antibodies. B cells are known to express a protein called CD19, CD4 + T cells are known to express a protein called CD4, CD8 + T cells are CD8, NKT and NK cells are DX5. And in the case of T cells commonly express a protein called CD3. Therefore, it can be seen that the distribution of UR (upper right) cells of FIG. 5 (A) is CD4 + T cells, and the analysis of cells of LR (lower right) can be confirmed that the distribution of T cells except CD4 + T cells. It can be seen that the cell shows a distribution of 34.53%. In addition, FIG. 5 (B) shows the distribution of cells after cell separation experiments using silicon nanowires treated with O 2 plasma, where the distribution of CD4 + T cells is 2.15%. This represents an isolation rate of about 93% as compared to the initial CD4 + T cells (distribution of CD4 + T cells (34.53%) before performing cell separation).
도 6은 기판의 종류(실리콘 웨이퍼, 유리 웨이퍼 및 본 발명의 실리콘 나노선이 성장된 기판(SiNW))에 따른 CD4+ T cell의 분리율 측정 결과를 나타낸 것이며, 그래프에서 확인할 수 있듯이 실리콘 웨이퍼와 유리 웨이퍼의 경우 약 89 % 정도의 CD4+ T 림프구의 분리율을 보인다. 각 군간의 통계처리는 Prism 5 통계 프로그램을 이용하여 p-value를 계산하였으며, SiNW와 실리콘 웨이퍼의 경우 0.017, SiNW와 유리 웨이퍼의 경우 0.003의 값을 보인 것으로 보아 각각의 샘플들이 서로 다른 유의성이 없는 결과임을 의미한다. 또한 도 7은 실리콘 나노선에 O2 플라즈마 처리의 유무에 따른 CD4+ T 림프구의 분리율을 나타낸 것이며, 각각 약 65 %, 약 89 %의 분리율을 보인다. p-value는 0.0013 값을 보인다. 도 8은 O2 플라즈마를 처리한 후의 시간별로 CD4+ T cell의 분리율을 나타낸 것이며, O2 플라즈마를 처리한지 1일이 지난 기판에서 약 89 %, 3일이 지난 경우 약 80 %, 7일이 지난 경우 약 71 %의 분리율을 보였다. O2 플라즈마를 처리한지 7일이 경과한 경우 대기중의 수분과의 결합에 의해 O2 플라즈마에 의한 효과가 떨어져 O2 플라즈마를 처리하지 않은 샘플과 유사한 결과를 보인 것으로 확인된다. 도 9는 O2 플라즈마를 처리하지 않고 실리콘 나노선을 성장시킨 기판에서 세포 분리를 여러번 반복하였을 때의 세포 분리율을 나타낸 것이다. 세포분리를 1번한 샘플의 경우 약 65 %, 3번 반복한 샘플의 경우 약 71 %, 5번 반복한 샘플의 경우 약 90 % 정도의 세포 분리율을 보였다. 상기 세포 분리의 반복시행은 상기 실시예 4-1에 나타낸 고정화 및 분리 방법을 반복 진행하였다.FIG. 6 shows the results of measurement of the separation rate of CD4 + T cells according to the type of substrate (silicon wafer, glass wafer, and silicon nanowire-grown substrate (SiNW)), as shown in the graph. About 89% of CD4 + T lymphocytes were isolated. P- values were calculated using the
상기의 결과들로 보아, O2 플라즈마를 처리한 실리콘 나노선의 경우 상용화된 자성나노입자와 유사한 세포 분리율을 보이며, 이는 실리콘 나노선의 높은 비표면적(Surface-volume ratio)으로 인한 세포 결합 영역의 증가 때문인 것으로 분석된다. 즉 실리콘 나노선이 성장된 기판은 매우 높은 표면 거칠기를 가지며, ~수 μm 크기를 갖는 세포가 실리콘 나노선 사이사이에 결합할 수 있는 영역이 많아 높은 분리율을 보이는 것으로 분석된다.
From the above results, the O 2 plasma treated silicon nanowires showed similar cell separation rate as commercially available magnetic nanoparticles due to the increase of cell binding area due to the high surface-volume ratio of silicon nanowires. Is analyzed. In other words, the substrate on which the silicon nanowires are grown has a very high surface roughness, and it is analyzed that a cell having a size of several μm has a large separation area between the silicon nanowires and thus shows a high separation rate.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 세포독성이 적으며, 생체적합성(biocompatability)이 뛰어난 실리콘 나노선(silicon nanowire)을 이용하여 특정 세포의 선택적 분리가 가능한 세포 분리칩을 제조할 수 있으며, 상기 세포 분리칩은 자성을 이용하지 않으며, 별도의 키트와 장치가 필요하지 않으며, 적은 수의 세포도 분리 가능하므로 고수율의 세포 분리능을 얻을 수 있다. As described above, according to the present invention, a cell separation chip capable of selectively separating specific cells using silicon nanowires having low cytotoxicity and excellent biocompatability can be manufactured. The separation chip does not use magnetism, and does not require a separate kit and device, and can separate a small number of cells, thereby obtaining high yield of cell separation ability.
상기 실시예에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 세포 분리칩을 이용하여 마우스의 비장세포로부터 면역세포(CD4+ T cell)를 성공적으로 분리하였다. 이와 같이 세포 분리방법에 있어서 그 방법이 간단하며 재사용할 수 있으므로 기존의 세포 분리 방법을 대체할 수 있는 기술이 될 것이다.
As described in the above examples, immune cells (CD4 + T cells) were successfully isolated from splenocytes of mice using the cell separation chip of the present invention. In this way, the cell separation method is simple and can be reused, so it will be a technology that can replace the existing cell separation method.
Claims (8)
Board; Silicon nanowires grown on the substrate by a bottom-up method; Cell separation chip comprising streptavidin (streptavidin) immobilized on the silicon nanowire surface.
The cell separation chip of claim 1, wherein the substrate is a silicon wafer.
The method of claim 1, wherein the silicon nanowires are grown using a vapor-liquid-solid (VLS) method in a hotwall chemical vapor deposition apparatus (HW-CVD) using SiH 4 as a silicon precursor and gold (Au) as a catalyst. Cell separation chip characterized in that.
The method of claim 1, wherein the streptavidin is treated with O 2 plasma on silicon nanowires, conjugates aminopropyltriethoxylsilane (APTES), conjugates glutaraldehyde (GA), and streptavidin (streptavidin). A cell separation chip characterized in that it is immobilized by conjugation.
a) 제 1항에 따른 실리콘 나노선 표면에 고정화된 스트렙타비딘(streptavidin)을 갖는 세포 분리칩을 준비하는 단계;
b) 바이오틴(biotin)이 결합된 항체(antibody)를 이용하여 특정세포를 결합시키는 단계; 및
c) 상기 바이오틴과 스트렙타비딘의 결합을 이용하여 실리콘 나노선 표면에 특정세포를 부착시키는 단계.
Separation method of cells comprising the following steps:
a) preparing a cell separation chip having streptavidin immobilized on a surface of a silicon nanowire according to claim 1;
b) binding specific cells using an antibody to which biotin is bound; And
c) attaching specific cells to the surface of the silicon nanowires by using the combination of biotin and streptavidin.
The method of claim 6, wherein the antibody is an antibody selected from the group consisting of CD3, CD4, CD19, and CD8, and the specific cell is an immune cell.
The method of claim 6, wherein the cell separation chip is reused by reversibly separating the binding of the biotin and streptavidin.
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