KR101176830B1

KR101176830B1 - 신규한 파아지 디스플레이 방법

Info

Publication number: KR101176830B1
Application number: KR1020050097665A
Authority: KR
Inventors: 차상훈
Original assignee: 주식회사 아이지세라피
Priority date: 2005-10-17
Filing date: 2005-10-17
Publication date: 2012-08-27
Also published as: KR20070041966A

Abstract

본 발명은 파아지 디스플레이 기술에 관한 것이다. 상세하게는 본 발명은 항체-pIII 융합 단백질을 최적의 상태로 유전자 재조합 파아지 표면 상에 디스플레이할 수 있는 보다 안정적이고 실용적인 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 유전자 재조합 파아지의 표면에 실제적인 항체-pIII 융합 단백질의 단가 (oligovalent) 발현을 안정적으로 이룰 수 있다.

파아지 디스플레이, 항체, 융합 단백질, 헬퍼 파아지

Description

신규한 파아지 디스플레이 방법 {Novel method for phage display}

도 1은 M13K07, Ex12 및 Ex-파아지의 pIII의 N-말단의 아미노산 서열을 비교하여 도시한 것이다.

도 2는 M13K07 또는 Ex12 헬퍼 파아지로 감염시킨 4 종류의 대장균 균주의 세포내 pIII 발현에 대한 분석 결과를 도시한 것이다.

도 3은 Ex12 헬퍼 파아지로 감염시킨 4 종류의 대장균 균주에서 pIII 및 Fd-ΔpIII 융합의 세포내 발현에 대한 분석 결과를 도시한 것이다.

도 4는 파아지 구조 (phage rescue)에 의해 pCMTG-SP112를 보유한 대장균 세포로부터 수득된 파아지 입자 상에 디스플레이된 wt pIII, Fd-ΔpIII 융합 단백질 및 카파 L 사슬 단편을 보여주는 웨스턴 블롯 결과를 도시한 것이다.

도 5는 샌드위치 ELISA에 의해 pCMTG 클론으로부터 수득된 재조합 파아지 후손 상에 디스플레이된 항-사람 카파 L 사슬을 정량화한 결과를 도시한 것이다.

도 6은 항-M13 폴리클로날 항체를 사용한 ELISA에 의한 상이한 파아지 구조 (phage rescue)에 의해 수득된 pCMTG-SP112 클론과 파아지 후손의 항원-결합 반응도를 비교한 결과를 도시한 것이다.

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기술분야

본 발명은 파아지 디스플레이 기술에 관한 것이다. 상세하게는 본 발명은 항체-pIII 융합 단백질을 최적의 상태로 유전자 재조합 파아지 표면 상에 디스플레이할 수 있는 보다 안정적이고 실용적인 방법에 관한 것이다.

종래기술

생물학 관련 연구에서 파아지 디스플레이 기술의 가장 성공적인 활용 예는 항체 라이브러리로부터 다양한 유전자 재조합 항체 절편 (scFv 또는 Fab 형태)을 선별하는 것이라 할 수 있으며 (상기 문헌: 19 및 28), 이 기술을 이용할 경우 파아지 디스플레이 항체 라이브러리로부터 항원과의 친화도 선별 과정을 거쳐 생체내 (in vivo) 진단 및 치료제로 단시일 내에 활용될 수 있는 수 많은 인간 항체들을 획득할 수 있다 (상기 문헌: 10). 그러나 원하는 항원 결합 특이성을 지닌 항체의 안정적인 분리를 위해 필수적이라 할 수 있는 고품질의 항체 라이브러리 제작 및 친화도 선별 과정에 있어서의 효율 개선은 현실적으로 그리 쉽게 이루어지지 않는다 (상기 문헌: 1).

일반적으로 항체 디스플레이 라이브러리는 파아지미드 벡터에 이미 마련된 gIII의 5' 단말 부위에 나이브 (naive), 면역화되거나 (immunized) 반-합성 유래에서 얻어진 항체 유전자를 클로닝 한 후 대장균에 도입함으로서 제작된다 (상기 문헌: 8, 9 및 12). 항체 유전자가 삽입되어 있는 파아지미드 클론들은 대장균 내에서 항체-pIII 융합 단백질을 발현하며, 유전자 재조합 파아지의 형성에 필요한 자연형 (wt) pIII 등과 같은 모든 구조 단백질들은 M13K07 혹은 VCSM13과 같은 헬퍼 파아지에 의해 제공되며, 파아지 구조 (phage rescue)라고 불리는 과정을 통해 대장균 내에서 유전자 재조합 파아지가 생성되게 된다 (상기 문헌: 28). 이러한 과정을 통해 생성된 유전자 재조합 파아지는 표면에 wt pIII와 항체-pIII 융합 단백질을 동시에 디스플레이하며, 파아지미드 DNA가 유전자 재조합 파아지 안에 우선적 으로 패키징되면서 결과적으로 유전형-표현형 연관 (genotype-phenotype linkage)을 형성하게 되는 것이다 (상기 문헌: 1). 이러한 파아지 패키징 (phage packaging) 과정은 이론적으로 유전자 재조합 파아지의 표면에 항체 절편의 단가 (oligovalent) 디스플레이를 가능케 하며, 따라서 이러한 과정의 결과로 얻어지는 파아지 디스플레이 기술의 강력한 선별 능력은 수 많은 타겟 분자-비특이적인 백그라운드 클론들 중에서 오직 타겟 분자-특이적인 기능성 있는 항체 클론만을 패닝에 의해 분리해 낼 수 있게 해 준다 (상기 문헌: 6, 11, 19 및 28).

그러나 여러 기술적인 어려움들이 항체 생산에 있어서 이 기술의 안정적인 활용 및 실용적인 사용을 저해하여 왔다 (상기 문헌: 7). 예를 들어 파아지-디스플레이 항체 라이브러리의 품질에 영향을 미치는 매우 중요한 척도들 중 하나는 기능성 있는 항체 절편을 디스플레이하는 유전자 재조합 파아지의 숫자인데, 이것은 다음과 같은 2가지의 요인, 즉 '1) 파아지-디스플레이 항체 라이브러리를 구성하는 클론들 중 수용성 항체 절편을 코딩하는 항체 유전자가 삽입된 클론의 존재 여부 및 2) 과량의 wt pIII 존재 상태에서 항체-pIII 융합 단백질이 파아지 조립 (phage assembly) 과정을 통해 유전자 재조합 파아지에 삽입되는 효율'에 의해 영향을 받는다. 또한 항체-pIII 융합 단백질의 분해 혹은 응집 그리고 파아지 조립에 참여하는 항체-pIII 융합 단백질의 낮은 효율 등을 야기하는 항체 유전자 자체에 기인한 클론 변이 (clonal variations)는 상황을 더욱 악화시키며, 따라서 대부분의 경우 유전자 재조합 파아지 표면에 융합 단백질이 제대로 디스플레이 되지 못한다. 부가적으로 항체-pIII 융합 단백질이 수용성이며 또한 세포 내에서 적절한 장소로 수송 이 되었더라도 이들 중 약 80% 정도가 대장균의 페리플라즘 공간 (periplasmic space)에서 단백질 가수 분해 작용을 겪게 된다 (상기 문헌: 20). 결과적으로 파아지미드에 근간을 둔 디스플레이 시스템의 경우 유전자 재조합 파아지의 표면에 존재하는 대부분의 pIII는 wt pIII이며 많은 경우 항체 라이브러리의 타켓-특이적 친화도 선별 과정을 무의미하게 만든다.

유전자 재조합 파아지 표면에 디스플레이 되는 항체-pIII 양을 향상시키기 위하여 M13dg3, Hyperphage, Ex-phage or Pharberge와 같은 여러 종류의 돌연변이 헬퍼 파아지의 제작과 활용이 시도되어 왔다 (상기 문헌: 2, 20, 25 및 27). 비록 약간의 차이는 있지만 이러한 돌연변이 헬퍼 파아지 들은 파아지 구조 (phage rescue) 과정 중 숙주 세포 내에서 자연형 pIII 결핍 현상을 유도한다는 공통점을 지니고 있으며, 다시 말해 오직 항체-pIII 절편 만을 파아지 조립에 사용되도록 함으로서 결과적으로 파아지 후손 (phage progenies)의 항체-pIII 디스플레이 양을 급격히 증가시킬 수 있게 하는 것이다. 특히 상기의 돌연변이 헬퍼 파아지 중 Ex-phage와 Pharberge는 M13K07 헬퍼 파아지의 돌연변이 종으로서 인위적으로 위치-특이적 돌연변이유발 (site-directed mutagenesis) 과정을 통해 gIII 유전자에 Ex-phage의 경우는 두개의 앰버 (amber) 코돈, 그리고 Pharberge의 경우는 한 개의 앰버 코돈을 지니고 있으며, 고역가 돌연변이 헬퍼 파아지의 생산은 XL-1 Blue와 같은 앰버 억제형 대장균을 이용해 수행하고 유전자 재조합 파아지를 생산하고자 할 때는 항체-pIII 융합 단백질을 코딩하는 파아지미드 벡터가 삽입되어 있는 JS5 혹은 TOP10F' 같은 비억제성 (non-suppressing (non-supE)) 대장균을 사용하여 수행 하는 특징을 지니고 있다. 유전자 재조합 파아지의 생산 시 Ex-phage를 파아지미드 벡터가 내재된 비억제성 (non-supE) JS5 대장균과 조합하여 사용할 경우 비억제성 (non-supE) JS5 대장균 내에서 Ex-phage에 의한 자연형 pIII의 발현이 gIII에 존재하는 앰버 코돈에 의해 이루어지지 않으므로, 결과적으로 M13K07 헬퍼 파아지를 사용할 경우와 비교하여 유전자 재조합 파아지의 표면에 디스플레이 되는 항체-pIII 융합 단백질의 양이 약 20배 이상 향상되었으며 또한 이와 상응하여 친화도 선별 효율 역시 100배 정도 증가함을 보였다 (상기 문헌: 2). 그럼에도 불구하고 다른 돌연변이 헬퍼 파아지에서도 마찬가지겠지만 파아지 구조 (phage rescue)시 Ex-phage의 사용은 파아지 후손의 매우 낮은 역가, 그리고 wt pIII 부재로 인해 유전자 재조합 파아지가 새로운 대장균 숙주에 감염이 잘 되지 않아 연속적인 친화도 선별 과정의 수행에 어려움을 겪는 등 여러 중요한 단점을 지니고 있다 (상기 문헌: 20 및 27).

새로운 기술 혁신의 개발이 아직도 현재 파아지 발현 기술의 이슈이므로 본 특허에서는 항체-pIII 융합 단백질을 최적의 상태로 유전자 재조합 파아지 표면 상에 디스플레이 할 수 있는 좀 더 안정적이며 실용적인 방법에 Ex-phage에서 유래된 Ex12 헬퍼 파아지를 활용할 수 있는 가를 조사하였으며, 유전자 재조합 파아지의 생산을 위해 gIII에 두개의 앰버 코돈을 지니고 있는 Ex12 헬퍼 파아지를 항체-pIII를 코딩하는 파아지미드 벡터가 삽입되어 있는 앰버 억제형 (supE) 대장균와 조합하여 사용하므로서 대장균의 유전형에 의해 매개되는 자연형 pIII의 완전한 발현 저해가 아닌 비효율적인 read-through 기작을 통한 자연형 pIII의 생산 양을 인 위적으로 저하시킴으로서 결과적으로 유전자 재조합 파아지의 표면에 실제적인 항체-pIII 융합 단백질의 단가 (oligovalent) 발현을 안정적으로 이룰 수 있음을 최초로 증명하였다.

본 발명의 목적은 파아지미드가 삽입되어 있는 억제형 유전형을 지닌 대장균 균주와 조합하여 파아지미드 벡터를 패키징하기 위한, 파아지 게놈에 존재하는 gIII 내에 1개 이상의 조건부 번역 억제 코돈을 지니고 있는 돌연변이 헬퍼 파아지를 제공하는 것이다.

파아지미드 벡터 시스템을 사용한 파아지-발현 항체 라이브러리는 유전자 재조합 파아지의 표면에 발현되는 항체-pIII 융합 단백질의 발현 레벨이 극히 낮다는 단점을 지니고 있다. 이러한 단점을 극복하기 위하여 M13K07 헬퍼 파아지의 gIII 부위에 두 개의 앰버 코돈을 삽입된 돌연변이 헬퍼 파아지 (이하 Ex12 헬퍼 파아지라 명함)를 제작한 후 이 파아지를 이용하여 숙주세포 내에서 생산되는 pIII 단백질의 양을 인위적으로 조절함으로서 유전자 재조합 파아지의 표면에 발현되는 항체-pIII 융합 단백질의 발현 레벨을 향상시킬 수 있는지 조사하였다. Ex12 헬퍼 파아지는 앰버 억제성 (supE) 숙주 세포인 XL-1 Blue와 TG1 대장균 균주 내에서 자연형인 M13K07 헬퍼 파아지에 비하여 1% 이하의 pIII 단백질을 생산하였고, 앰버 비억제성 (non-supE) 균주인 TOP10F'와 JS5에서는 전혀 pIII 단백질을 발현하지 않았다. 이러한 pIII의 발현 저하로 인하여 pCMTG-SP112 파아지미드 벡터를 지니고 있 는 supE XL-1 Blue 세포를 Ex12 헬퍼 파아지로 초감염(super-infection) 하였을 경우 세포내의 Fd-ΔpIII:wt pIII 비율이 2:1이였으며 유전자 재조합 파아지의 표면에서는 1:2가 되었다. 그 결과 자연형인 M13K07 헬퍼 파아지를 사용할 때와 비교하여 유전자 재조합 파아지의 표면의 Fab-ΔpIII 융합 단백질 발현 양이 약 50배 증가하였으며, 항원 특이적 결합력 또한 100배 이상 증가하였다. 따라서 Ex12 헬퍼 파아지와 같이 gIII 부위에 앰버 코돈이 삽입된 돌연변이 헬퍼 파아지와 항체 절편이나 그 외의 폴리펩티드를 코딩하는 외래 유전자가 삽입된 파아지미드 벡터를 지닌 supE 숙주 세포를 조합한 유전자 재조합 파아지의 생산 방법은 최소한 1개 이상의 항체 절편 혹은 그 외의 외래 폴리펩티드를 파아지 표면에 발현시킬 수 있는 최적의 파아지 발현 시스템이라 하겠으며 파아지미드 벡터에 기초한 파아지 발현 기술을 손쉬운 방법으로 좀 더 실용적이며 안정적으로 성장시킬 수 있는 새로운 기술적 진보라 하겠다.

파아지 디스플레이 기술이 처음 묘사되었던 이 후 거의 20년이 지났으며 원하는 항원 결합 특이성을 지닌 수 많은 항체의 성공적인 선별에 관한 많은 논문들은 유전자 재조합 항체의 생산에 있어서 이 기술의 중요성을 여지 없이 기술하고 있다. 그러나 파아지 디스플레이 기술은 파아지 디스플레이 나이브 (naive) 혹은 반-합성 항체 라이브러리 내에 원하는 항원 결합 특이성을 지닌 항체가 존재할 확률이 매우 미약한 이유로 인하여 좀 더 실용적인 사용을 위하여 항원에 위해 유도되는 친화도 선별 과정을 더욱 안정화시키는 방향으로 더 개선할 필요성이 있다 (상기 문헌: 6 및 13). 이는 파아지 발현 항체 라이브러리로부터 파아지 구조 (phage rescue)에 의해 생산된 파아지 후손 중 아주 미미한 정도의 유전자 재조합 파아지만이 표면에 기능성 있는 항체-pIII 융합 단백질을 디스플레이 하기 때문이다 (상기 문헌: 20). 실제로 실험 조건에 따라 유전자 재조합 파아지미드 비리온 (virion) 표면상에 존재하는 scFv-pIII 융합 단백질:wt pIII의 비율이 1:10 ~ 1:1000 정도임이 보고 되었으며 (상기 문헌: 1), pCANTAB-5E 파아지미드 벡터를 이용한 발명자의 연구에서도 이 비율이 약 1:50 ~ 1:100 정도임이 밝혀 졌다. 따라서 파아지의 표면에 5개의 pIII가 존재한다고 가정한다면 M13K07 헬퍼 파아지를 이용한 일반적인 파아지 구조 (phage rescue) 과정을 통해 파아지 디스플레이 항체 라이브러리로부터 획득된 파아지의 경우 scFv 절편을 디스플레이 하지 못하는 "대머리 (bald)" 파아지가 항체 절편을 발현하는 파아지보다 약 10 ~ 200 배 많다는 것을 의미한다. 이것은 결국 너무 과다한 백그라운드 파아지의 존재로 말미암아 친화도 선별과정을 어렵게 만들며 따라서 항원 특이적인 파아지 클론의 선별이 제대로 이루어지지 않게 만든다. 이와 유사하게 본 연구의 결과에서도 pCMTG-SP112가 삽입된 대장균 균주로부터 M13K07 헬퍼 파아지를 이용하여 획득된 유전자 재조합 파아지의 경우 Fd-ΔpIII:wt pIII의 비율 역시 1:100 정도 였다.

유전자 재조합 파아지의 표면에 항체의 디스플레이 양을 증가시키는 전략 중 하나는 숙주 세포 내에서의 wt pIII 발현을 막기 위하여 gIII 결핍 헬퍼 파아지를 파아지 구조 (phage rescue) 과정에 활용하는 것이며 (상기 문헌: 2, 20, 25 및 27), 이미 본 발명자는 Ex-phage와 non-supE JS5 균주의 조합을 통해 정상적인 gIII를 지닌 M13K07 헬퍼 파아지를 사용할 때와 비교하여 유전자 재조합 파아지의 표면에 디스플레이 되는 scFv-pIII 양을 약 20배 이상 증가 시킨바 있다 (상기 문헌: 2). 이와 유사하게 Soltes 등 (상기 문헌: 27)도 gIII의 3' 단말 지역에 하나의 앰버 코돈이 삽입된 돌연변이 M13K07인 Phaberge를 항-파상풍 독소 (anti-tetanus toxoid) Fab 유전자가 삽입된 pMAB77 파아지미드를 지닌 non-supE TOP10F' 균주와 함께 사용하여 유전자 재조합 파아지의 표면에 발현되는 Fab-pIII의 양을 5 ~ 20배 증가시킬 수 있었다 (상기 문헌: 27). 그러나 유전자 재조합 파아지의 생산에 있어서 Ex-phage와 non-supE E. coli strain과의 조합은 파아지 역가를 100배 정도 감소시키며 또한 연차적인 항원-특이적 친화도 선별 과정에 필수적인 유전자 재조합 파아지의 새로운 숙주 대장균에 대한 감염성이 자연형 pIII의 부재로 인하여 지극히 저하되는 등 여러 단점이 나타났다 (상기 문헌: 3). 따라서 돌연변이 헬퍼 파아지에 의한 완전한 pIII의 발현 저해보다는 pIII 발현 양의 적절한 감소가 이러한 단점들을 어느 정도 보완할 수 있지 않을까 추정하였다.

앰버 억제자 supE (su2)의 활성이 UAG의 3' 지역에 존재하는 첫 번째 염기에 의존하거나 세포의 생리적 상태에 따라 약 20배 이상 변화한다는 사실이 이미 알려진 바 있으며 (상기 문헌: 17 및 18), 알려진 부위에 42개의 각기 다른 앰버 코돈을 가지고 있는 돌연변이 lacI 유전자를 사용한 연구에서 4가지 앰버 억제자의 억제 활성도가 UAG의 3' 지역에 존재하는 첫 번째 염기가 A 혹은 G일 경우 약 25%임이 밝혀 졌다 (상기 문헌: 14). Ex12 헬퍼 파아지의 경우 돌연변이 gIII에 있는 2개의 amber 코돈이 모두 A가 뒤따라 있으므로 이론적으로 이 돌연변이 파아지는 supE 세포에서 M13K07의 wt gIII에 의한 wt pIII의 발현과 비교할 때 약 6%의 wt pIII를 생산하리라 예측된다. 그러나 본 연구의 웨스턴 블롯 (Western blot) 분석에 의하면 Ex12 헬퍼 파아지는 XL-1 Blue 세포 내에서 M13K07에 비하여 약 1% 정도만의 pIII를 발현하였으며 이러한 pIII 발현 양의 감소는 유전자 재조합 파아지의 파아지 역가와 Fab-ΔpIII 융합 단백질의 디스플레이 양에 많은 영향을 미쳤다. 예측했던 것과는 달리 Ex12/XL-1 Blue와 Ex12/TOP10F' 조합에 의해 생산된 유전자 재조합 파아지의 역가에는 별다른 차이가 없었으며 Ex12/TOP10F' 조합에 의해 생산된 유전자 재조합 파아지에서도 아주 약하나마 wt pIII가 검출되는 것으로 보아 실험 과정에서 약간의 M13K07 오염이 발생했다는 것을 알 수 있었다. 실제로 고역가의 Ex12 헬퍼 파아지 스톡 (stock)에서 극미량의 M13K07 오염 (약 1 M13K07/3 x 10⁶ Ex12 phages)이 발견되었으며 이러한 M13K07 파아지가 유전자 재조합 파아지의 증폭 과정 동안 non-supE TOP10F' 세포에서 증폭 되었고 PFU:CFU 비율의 증가 및 파아지 역가의 과대 평가를 야기하였다. 그러나 이러한 정도의 파아지 오염은 파아지 디스플레이 기술을 사용하는 거의 모든 연구실에 매우 흔히 나타나는 현상이며 도 3에서 보는 바와 같이 Ex12 헬퍼 파아지에 감염된 non-supE TOP10F' 세포 내에는 전혀 wt pIII가 웨스턴 블롯 상 검출되지 않았다는 결과로 미루어 보아 본 연구에서 도출된 결론에 영향을 미칠 만한 수준은 전혀 아니라는 것을 알 수 있다.

이미 증명되었듯이 Ex12 헬퍼 파아지를 supE 숙주 세포와의 조합하여 사용할 경우의 장점은 Fab-ΔpIII:wt pIII의 비율을 아주 간편하게 1:2 정도로 이룰 수 있다는 것이며 이는 하나의 파아지 입자에 3 ~ 5개의 pIII가 존재한다는 가정하에 상 기의 조합으로 생산된 모든 유전자 재조합 파아지의 표면에 적어도 1개의 Fab-ΔpIII 융합 단백질을 발현한다는 것이다. 또한 wt pIII를 지니고 있어 새로운 숙주 세포에 효율적인 감염이 가능하다는 것이다. 또한 이 조합은 Ex12 헬퍼 파아지를 non-supE 숙주 세포와의 조합하여 사용할 때 생산되는 유전자 재조합 파아지에 여러 개의 Fab-ΔpIII 융합 단백질이 발현됨으로서 파생되는 다가 (polyvalent) 디스플레이를 지양하고 결과적으로 항원 특이적 친화도 선별과정에서 불필요한 avidity 효과를 없앨 수 있다는 장점도 동시에 지니고 있으며, 예상 밖으로 도 5에서 보는 바와 같이 Fab-ΔpIII 융합 단백질이 보다 안정한 상태로 파아지 표면에 디스플레이 된다는 등 여러 장점을 지니고 있다. 또한 기존의 M13K07 등과 같은 자연형 헬퍼 파아지를 사용할 경우보다 유전자 재조합 파아지의 표면에 존재하는 Fab-ΔpIII 융합 단백질의 발현율이 결과적으로 50배 이상, 그리고 항원 결합력이 100배 이상 증가함과 동시에 파아지 구조 (phage rescue)에 의해 생산된 유전자 재조합 파아지 후손 중 Fab-ΔpIII 융합 단백질을 발현하지 않는 '대머리' 파아지의 빈도를 현저히 감소시킬 수 있어 현재 개발되어 있는 파아지 디스플레이 기술 중 항원 특이적인 친화도 선별 과정의 효율이 최적의 상태로 개선될 수 있음을 쉽게 판별할 수 있다.

항체 유전자가 삽입된 파아지미드를 지닌 클론의 수, 수용성 항체 절편을 발현하는 클론의 수 그리고 기능성 있는 항체 절편을 디스플레이하는 파아지를 생산하는 클론의 수 등 여러 요소들이 파아지 디스플레이 항체 라이브러리의 품질을 결정한다고 이미 밝혀져 왔다 (상기 문헌: 1). 그리고 이러한 인자들을 개선할 수 있 는 기술적 혁신이 면역 접종 과정의 필요성 없이 하나 (single pot)의 파아지 디스플레이 항체 라이브러리로부터 모든 종류의 항원과 각각 특이적으로 결합하는 항체들을 일상적이며 안정적으로 분리할 수 있는 이상적인 파아지 디스플레이 기술에 이를 수 있도록 만들 것이다 (상기 문헌: 11 및 22). 본 연구는 Ex12 헬퍼 파아지를 XL-1 Blue와 같은 supE E. coli strain과 함께 파아지 구조 (phage rescue)에 사용함으로서 유전자 재조합 파아지의 표면에 최적의 상태로 Fab 절편을 디스플레이 할 수 있다는 것을 증명하였다. 이 기술적 접근 방법이 Fab 절편뿐만 아니라 scFv 절편 혹은 더 나아가 모든 외래 폴리펩티드의 파아지 디스플레이에 모두 적용될 수 있으며, 파아지디스플레이 기술의 실용적 사용에 가장 걸림돌이 되었던 기술적 문제를 해결할 수 있는 돌파구를 제공하는 원천 기술인 것이다.

실시예

실시예 1: 대장균 균주

비억제형 (non-supE) 대장균 균주인 TOP10F' (F'[lacI ^q Tn10(Tet^R)] mcrA D(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80 lacZΔM15 lacX74 deoR recA1 araD139 D(ara -leu)7697 galU galK rpsL endA1 nupG) 및 JS5 (F [proAB ⁺ lacI ^q lacZDM15 Tn10(Tet^R)]/araD139 Δ(ara-leu)7696 galE15 galK16 D(lac)_χ74 (Str^r) hsdR2 (r_k ^-m_k ⁺) mcrA mcrB1) (Biorad, USA), 그리고 amber 억제형 (supE) 대장균 균주인 XL-1 Blue (recA1 endA1 gyrA96 thi -1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F' proAB lacI ^q ZΔM15 Tn10 (Tet^R)]) (Stratagene, USA) 및 TG1 ( supE thi -1 Δ(lac - proAB) Δ(mcrB-hsdSM)5 (rK- mK- [F' traD36 proAB lacI ^q lacZΔM15]) (Amersham Pharmacia Biotech, Sweden)을 파아지미드를 위한 숙주세포 및 M13K07 (Amersham Pharmacia, Sweden) 혹은 Ex12 helper phage (IG Therapy Co., South Korea)를 이용한 유전자 재조합 파아지의 생산을 위해 사용하였다.

실시예 2: Ex12 헬퍼 파아지의 제작

Ex-phage에서 유래된 Ex12 헬퍼 파아지는 이미 언급된 바와 같이 (상기 문헌: 2) Mutan^TM-K kit (Takara, Japan)를 사용한 위치-특이적 돌연변이 유발 (site-directed mutagenesis) 방법에 의하여 M13K07 헬퍼 파아지의 성숙 (mature) pIII를 코딩하는 gIII 유전자의 5' 말단에 존재하는 첫 번째 및 두 번째 GAA (Glu) 코돈을 앰버 코돈 (UAG)으로 치환하여 제작하였다.

실시예 3: 파아지 구조 (phage rescue) 방법을 이용한 유전자 재조합 파아지의 증폭

피루베이트 탈수소효소 복합체 (Pyruvate dehydrogenase compelx)-E2 (PDC-E2)를 인지하는 SP112 Fab의 V_H + C_H1 및 V_L + C_L 유전자가 삽입된 pCMTG 파아지미드 벡터 (IG Therapy Co.) (pCMTG-SP112)를 준비하였으며, 이 파아지미드 클론을 TOP10F', JS5, XL-1 Blue 그리고 TG1 세포에 일렉트로포레이션 (electroporation) 방법을 사용하여 도입하였으며 대장균들을 100 ㎍/ml 농도의 암피실린 (ampicillin)이 함유된 2 x YT 배지 (2 x YT/amp)에서 선택하였다. 유전자 재조합 파아지는 이미 언급된 방법(상기 문헌: 2 및 20)을 약간 수정하여 획득하였는데 요약하면 다음과 같다. pCMTG-SP112를 지니고 있는 TOP10F', JS5, XL-1 Blue 그리고 TG1 세포를 100 ㎍/ml의 암피실린과 2% glucose가 함유된 10 ml의 2 x YT 배지 (2 x YT/amp/glu)에 OD₆₀₀가 0.5에 도달할 때까지 37℃에서 배양하였다. 그 후 세포 배양액을 3,300 x g에서 10분 동안 원심분리하여 침전된 세포를 획득하고 이를 2% 글루코오스가 함유된 10 ml의 2 x YT 배지 (2 x YT/glu)에 현탁하였다. 고역가의 M13K07 또는 Ex12 헬퍼 파아지를 MOI (multiplicity of infection) 20이 되도록 세포 현탁액에 첨가한 후 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 세포와 헬퍼 파아지가 혼합된 배양액을 3,300 x g 에서 10분 동안 원심분리 한 후 얻어진 세포 침전물을 100 ml의 100 ㎍/ml의 암피실린과 70 ㎍/ml의 카나마이신 (kanamycin)이 함유된 2 x YT 배지 (2 x YT/amp/kan)에 현탁하였다. 27℃에서 밤새 배양한 후 배양액을 원심분리(3,300 x g, 20 min)하여 유전자 재조합 파아지 입자들을 획득하였고 PEG/NaCl 용액을 사용하여 침전시킨 후 1 ml의 멸균 PBS (phosphate-buffered saline)에 현탁하였다. 증폭된 파아지 입자들의 PFU (plaque forming unit) 및 CFU (colony forming unit)는 기존에 이미 잘 알려진 표준 방법에 의거하여 측정하였다. 또한 파아지 ELISA를 이용한 파아지 역가를 아래의 방법을 사용하여 측정하였다.

실시예 4: 웨스턴 블롯

각기 다른 균주 내에서 헬퍼 파아지에 의해 생산되는 자연형 pIII의 양을 분석하기 위하여 non-supE TOP10F' 및 JS5, 그리고 supE XL-1 Blue 및 TG1 세포를 각각 M13K07 혹은 Ex12 헬퍼 파아지로 감염시킨 후 5 ml의 2 x YT 배지를 사용하여 27℃에서 밤새 배양하였다. 그런 후 잔류 파아지 오염을 제거하기 위하여 세포를 차가운 PBS로 3회 세척하였다. 세포의 농도를 OD₆₀₀ = 0.8로 조절한 후 유사한 숫자의 각 대장균 균주들을 SDS sample buffer에 현탁하였다. 세포 용해물을 시료로 사용하여 12% SDS-PAGE를 수행하였고 분획된 단백질들을 니트로셀룰로오스 멤브레인 (nitrocellulose membrane) (Amersham Pharmacia Biotech)에 전달 하였다 (상기 문헌: 2). Polyacrylamide gel 상의 단백질 밴드들은 쿠마쉬 브릴리언트 블루 염료 (Coomassie Brilliant Blue staining) (Biorad, USA)을 사용하여 발색하였고, 웨스턴 블롯 분석은 다음과 같이 수행하였다. 먼저 멤브레인 (membrane)을 MPBS (3% powdered milk solution in PBS)로 상온에서 1 시간 동안 블로킹하였으며 0.5% Tween 20이 함유된 PBS (PBST)로 충분히 세척하였다. 그 후 상온에서 1 시간 동안 마우스 항-pIII 모노클로날 항체 (mAb) (Mobitec, Germany)로 블롯을 처리하였으며, 이차 항체로는 AP (alkaline phosphatase)와 컨쥬케이션된 염소 항-마우스 IgG 항체 (Sigma Co, USA.)를 사용하였고 발색 기질로는 NBT (nitro blue tetrazolium chloride)/BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate) 기질 (Sigma Co.)을 멤브레인에 사용하였다. 블롯에 나타난 밴드는 밀도측정기 (densitometer) (Biorad)를 사용하여 분석하였다. 세포 내에서 발현되는 Fd-pIII 및 wt pIII와 유전자 재조합 파아지에 발현되는 Fd-pIII 및 wt pIII의 양을 비교하기 위하여 파아지 구조 (phage rescue) 후의 세포와 파아지 입자들을 수거하였고, 비슷한 농도의 세포와 파아지 입자 (약 10⁹)을 SDS 샘플 완충액에 현탁하였다. 웨스턴 블롯은 상기에서 언급한 바와 같이 수행하였으나 SP112 Fd-ΔpIII 융합 단백질 혹은 SP112 L 사슬 절편을 감지하기 위하여 마우스 항-myc tag mAb (IG Therapy Co.) 혹은 AP에 컨쥬게이션된 항-사람 카파 L 사슬 폴리클로날 항체 (Sigma Co.)를 각기 사용하였다.

실시예 5: 파아지 ELISA

파아지 역가를 측정하거나 유전자 재조합 파아지의 표면에 발현되는 카파 L 사슬을 검출하기 위해 Maxi-sorp 플레이트 (Nunc, Denmark)에 1:3,000으로 희석된 마우스 항-M13 모노클로날 항체 (Mobitec, Germany)로 각각 웰 당 50㎕씩 첨가하여 코팅하였다. Maxi-sorp plate를 3% MPBS로 블로킹 한 후 여러 희석비의 유전자 재조합 파아지 입자들을 각각의 웰에 첨가한 후 27℃에서 2시간 동안 반응 시켰다. 플레이트를 200 ㎕의 PBST를 사용하여 10 회 세척한 후 1:3,000으로 희석된 항-M13 폴리클로날 항체-HRPO 컨쥬케이션 (Sigma Co.) 혹은 염소 항-사람 카파 L 사슬- HRPO 컨쥬게이션 (Sigma Co.) 50 ㎕를 각각의 well에 첨가한 후 27℃에서 1시간 동안 반응 시켰다. 플레이트를 200 ㎕의 PBST를 사용하여 4 회 세척한 후 3.3', 5.5' -테트라메틸 벤지딘 (TMB) 기질 (Sigma Co.)을 첨가하여 발색하였다. 450 nm 흡광도는 ELISA 판독기 (Biorad)를 사용하여 측정하였다. 유전자 재조합 파아지의 항원 결합 반응은 상기와 같은 ELISA 방법으로 측정하였으며 단지 10 ㎍/ml의 rPDC-E2, 말토오스 결합 단백질 (MBP) 또는 BSA (bovine serum albumin)을 플레이트의 코팅에 사용하였다.

결 과

헬퍼 파아지와 or pCMTG - SP112 에 의해 각기 다른 대장균 균주 내에서 생산되는 wt pIII 및 Fd -Δ pIII 융합 단백질의 분석

Ex-phage에서 유래한 Ex12 헬퍼 파아지는 이미 다른 인용문 (상기 문헌: 2)에서 언급된 바와 같이 성숙 (mature) pIII의 N-말단에 존재하는 글루탐산 (glutamic acid)을 코딩하는 M13K07 게놈 내의 gIII 유전자 배열 중 첫 번째 및 두 번째 GAA 코돈을 위치-특이적 돌연변이 유발 (site-directed mutagenesis) 방법에 의해 UAG 앰버 코돈으로 치환하여 도 1과 같이 제작되었으며, Ex-phage와 비교 시 어떠한 기능적 차이도 보이지 않는다 (자료 제시 안함). 도 1에서 시그널 펩티드의 아미노산 서열을 밑줄로 표시하였고 애스터리스크 (*)는 성숙 pIII의 N-말단의 앰버 (amber) 코돈의 위치를 가르킨다.

M13K07 혹은 Ex12 헬퍼 파아지에 의해 non-supE TOP10F' 혹은 JS5, 또는 supE XL-1 Blue 혹은 TG1 세포 내에서 발현되는 wt pIII의 양을 12% SDS-PAGE와 웨스턴 블롯 방법으로 조사하였으며 도 2에 그 결과를 제시 하였다. M13K07 혹은 Ex12 헬퍼 파아지에 감염된 세포들은 이 연구에서 사용된 파아지 구조 (phage rescue) 과정과 조건을 일치시키기 위하여 대장균의 최적 성장 온도보다 낮은 27℃에서 배양되었다. 도 2에서 좌측은 각각의 SDS-PAGE에 첨가된 총 대장균 단백질의 상대적인 양을 쿠마쉬 블루 (Coomassie Blue) 염색을 통해 보여주고 있다. 비록 SDS-PAGE 분석상에는 확연히 보이지 않지만 항-pIII mAb를 이용한 웨스턴 블롯 분석에서는 M13K07 헬퍼 파아지에 의해 모든 4가지의 대장균 균주 (TOP10F', JS5, XL1-Blue 및 TG1)의 세포 내에 많은 양의 wt pIII (이론적으로 44.6 kDa의 분자량을 보여야 하나 실제로는 많은 타 연구자들에 의해 보고된 것과 같이 약 60 kDa의 분자량을 나타냄)가 발현 됨을 알 수 있다 (도 2에서 우측). 한편 Ex12 헬퍼 파아지의 경우 두 개의 UAG non-sense 코돈으로 말미암아 non-supE TOP10F' 및 JS5 세포에서는 전혀 wt pIII가 검출되지 않았으며 다만 supE XL-1 Blue 및 TG1 세포에서 아주 작은 양 (M13K07와 비교 시 약 1%)의 wt pIII가 검출되었고 이는 Ex12 헬퍼 파아지의 gIII에 존재하는 앰버 코돈이 supE 숙주 E. coli 내에서 글루타메이트로 번역되는 효율이 매우 낮다는 것을 의미하였다.

Non-supE TOP10F' 및 supE XL-1 Blue E. coli 균주 내에서 헬퍼 파아지에 의해 발현되는 wt pIII와 pCMTG-SP112에 의해 발현되는 Fd-ΔpIII 융합 단백질의 양을 비교하기 위하여 pCMTG-SP112가 도입된 균주에 M13K07 혹은 Ex12 헬퍼 파아지를 감염 시켰다. 그 후 세포를 IPTG가 첨가되지 않은 배지를 사용하여 밤새 27℃에서 배양하였고 이렇게 획득된 세포들을 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 도 3에서 보는 바와 같이 wt pIII (~ 60 kDa)와 Fd-ΔpIII (~ 50 kDa)를 모두 인지하는 항-pIII mAb를 사용한 블롯 결과에 의하면 M13K07에 감염된 supE XL-1 Blue 및 non-supE TOP10F' 세포의 경우 wt pIII가 매우 다량으로 생산되며 wt pIII와 비교하여 각각 약 10% 및 2%의 Fd-ΔpIII만이 supE XL-1 Blue 및 non-supE TOP10F' 세포 내에서 pCMTG-SP112에 의해 생산됨을 확인할 수 있었고 따라서 Fd-ΔpIII 융합 단백질:wt pIII의 비율이 1:10 혹은 1:50임을 알 수 있었다. Ex12 헬퍼 파아지에 감염된 supE XL-1 Blue 세포의 경우 도 2의 우측에서와 같이 wt pIII의 발현 양이 현저히 감소되었으나 pCMTG-SP112에 의해 발현되는 Fd-ΔpIII 융합 단백질의 발현 양은 오히려 M13K07 헬퍼 파아지에 감염되었을 때 보다 약 2배 정도 증가하였다. 이러한 결과는 Ex12 헬퍼 파아지에 감염된 supE 유전형의 대장균 균주 내에서는 돌연변이 파아지의 gIII에 존재하는 앰버 코돈에 의해 wt pIII의 발현 양이 억제되고 또한 wt pIII의 생산에 쓰여질 필요가 없는 여분의 세포질 내 물질 대사 기능이 파아지미드 벡터에 의해 발현되는 Fd-ΔpIII 융합 단백질의 생산을 어느 정도 향상시킴으로서 Fd-ΔpIII:wt pIII 비율을 2:1 정도로 크게 증진시킴을 의미한다. 도 2의 우측과 마찬가지로 Ex12 헬퍼 파아지에 감염된 non-supE TOP10F' 세포의 용출액에서는 wt pIII가 검출되지 않았다. 한편 또 다른 일차 항체로서 pCMTG 벡터의 Fd와 ΔpIII (wt pIII의 214-406 잔기) 부위 사이에 존재하는 Myc 태그 (tag) 펩티드 (10 아미노산 길이)를 인지 할 수 있는 항-Myc tag mAb와 SP112의 L 사슬 이소타입인 사람 카파 L 사슬을 인지할 수 있는 항-사람 카파 L 사슬 폴리클로날 Ab를 활용하였는데 항-Myc tag mAb 혹은 항-사람 카파 L 사슬 폴리클로날 Ab를 이용한 Fd-ΔpIII 융합 단백질 및 카파 L 사슬 절편 (~ 28 kDa 길이) 검출 결과 pCMTG 파아지미드 벡터가 지니고 있는 lac 프로모터에 의해 IPTG 부재 하에서도 항체 절편이 leaky하게 발현되고 있음을 알 수 있었다. 그러나 흥미롭게도 M13K07 감염은 supE XL-1 Blue cells 및 non-supE TOP10F' 세포 모두에 있어서 파아지미드에 의해 발현되는 Fd-Δ pIII 융합 단백질과 카파 L 사슬 절편의 생산 양을 감소시켰으며 이는 세포 내의 생합성 기작이 우선적으로 파아지 성분의 생산에 활용된다는 것을 의미하는 듯 하다.

헬퍼 파아지와 대장균 숙주 세포와의 각기 다른 조합에 의해 획득된 유전자재조합 파아지의 역가 및 특성 분석

M13K07 혹은 Ex12 헬퍼 파아지와 pCMTG-SP112가 삽입된 TOP10F' 혹은 XL-1 Blue 대장균을 각기 다른 조합 (M13K07/TOP10F', M13K07/XL-1 Blue, Ex12/TOP10F' or Ex12/XL-1 Blue)으로 사용하여 유전자 재조합 파아지를 획득하였으며, single-stranded pCMTG-SP112을 함유하고 있는 파아지 후손 (phage progenies) (phagemid virions)의 파아지 역가를 측정하기 위하여 CFU를, 그리고 single-stranded viral genome을 함유하고 있는 파아지의 역가를 측정하기 위하여 PFU를 수행하였다 (표 1).

표 1. 파아지 구조 과정의 상이한 조합에 의한 pCMTG-SP112 파아지미드로부터 수득된 재조합 파아지 후손의 역가측정

역가^a	M13K07		Ex12
역가^a	TOP10F'	XL-1 Blue	TOP10F'	XL-1 Blue
CFU	3 x 10^8b	8 x 10⁸	6 x 10⁶	1.8 x 10⁷
PFU	4 x 10⁷	2 x 10⁸	3 x 10⁶	5 x 10⁶
총 파아지 수	3.4 x 10⁸	1 x 10⁹	9 x 10⁶	2.3 x 10⁷

^a파아지 역가는 상기 실시예의 방법에 따라 측정하였으며 데이터는 2회 실험의 평균을 나타낸다.

^b파아지 수 / 배양 상층액 1㎕

M13K07/TOP10F' vs. M13K07/XL-1 Blue 그리고 Ex12/TOP10F' vs. Ex12/XL-1 Blue 조합의 파아지 역가를 비교해 본 결과 사용된 헬퍼 파아지에 상관없이 XL-1 Blue 균주는 TOP10F' 균주에 비해 약 3배 이상의 파아지 후손을 생산하였으며, M13K07 헬퍼 파아지에 비해 Ex12 헬퍼 파아지는 약 40 ~ 50 배 정도 적은 파아지를 생산 하였다 (M13K07/TOP10F' vs. Ex12/TOP10F' and M13K07/XL-1 Blue vs. Ex12/XL-1 Blue). 또한 비록 Ex12 헬퍼 파아지가 도 2의 우측과 도 3에서와 같이 supE E. coli 균주에서 약간의 wt pIII를 생산하였으나 XL-1 Blue 균주가 TOP10F' 균주에 비해 M13K07에서도 역시 약 3배 이상의 파아지 후손들을 더 많이 생산한다는 것을 감안한다면 supE XL-1 blue 균주 (Ex12/XL-1 Blue)에 의해 생산되는 파아지 후손의 역가는 TOP10F' 균주 (Ex12/TOP10F')에 의해 생산되는 파아지 후손의 역가에 비해 증가를 보이지는 않았다. 한편 흥미롭게도 Ex12/TOP10F' 조합에 의해 생산된 파아지 후손들이 wt pIII의 주재에도 불구하고 CFU와 PFU 데이터에서 보여지는 바와 같이 신선한 XL-1 Blue 균주를 감염할 수 있다는 것이다. CFU와 PFU 데이터를 비교해 본 결과 대부분 조합의 경우 single-stranded pCMTG-SP112 파아지미드가 single-stranded phage genome에 비해 약 4 ~ 8배 정도 더 효율적으로 파아지 입자 안에 삽입되어 포장됨을 알 수 있었으며 다만 Ex12/TOP10F' 조합의 경우만은 예외적으로 2배 정도에 그쳤다. 이는 총 파아지 후손의 숫자에는 Ex12/XL-1 Blue와 Ex12/TOP10F' 조합 간에 별 차이가 없었지만 우리가 원하는 유전자 재조합 파아지의 숫자는 Ex12/XL-1 Blue 조합이 약 2 ~ 4배가 더 많음을 알 수 있었다.

파아지 입자 표면에 존재하는 wt pIII, Fd-ΔpIII 및 SP112 L chain 절편의 양을 측정하기 위하여 도 4와 같이 약 10⁹ 파아지를 SDS-PAGE 각각의 lane에 넣은 후 Western blot을 수행하였다. NBT/BCIP 기질을 사용하여 시그널을 가시화시켰다. M13K07/XL-1 Blue과 M13K07/TOP10F' 조합에 의해 생산된 유전자 재조합 파아지의 경우 anti-pIII mAb에 의해 다량의 wt pIII가 검출되었으며, M13K07/XL-1 Blue 조합에 의해 생산된 파아지에서 극히 미약한 양의 Fd-ΔpIII 융합 단백질이 anti-Myc tag mAb에 의해 검출되었으나 M13K07/TOP10F' 조합에서 생산된 파아지에서는 검출되지 않았다. 이는 상기 조합에 의해 생산된 파아지의 표면에 발현되는 pIII는 거의 모두 wt pIII임을 의미한다. 또한 SP112 kappa L chain의 디스플레이 역시 anti-kappa L chain polyclonal Ab에 의해 검출되지 않았다. 반대로 Ex12/XL-1 Blue 조합에 의해 생산된 유전자 재조합 파아지 후손들은 anti-pIII mAb를 이용한 분석에 따르면 Fd-ΔpIII와 wt pIII의 비율이 1:2 정도 이었으며 또한 anti-Myc tag mAb 혹은 anti-human kappa L chain polyclonal Ab에 의해 각각 선명한 Fd-ΔpIII 융합 단백질과 SP112 kappa L chain 절편이 검출되었다. 밀도 분석에 의하면 Ex12/XL-1 Blue 조합에 의해 생산된 유전자 재조합 파아지 후손들은 M13K07/XL-1 Blue 조합에 의해 생산된 유전자 재조합 파아지에 비해 약 50배 이상의 Fd-ΔpIII 융합 단백질을 디스플레이하고 있는 것으로 밝혀 졌으며, Ex12/TOP10F' 조합에 의해 생산된 유전자 재조합 파아지와는 유사한 정도의 Fd-ΔpIII 융합 단백질과 SP112 kappa L chain 절편이 검출되었다. 그러나 anti-pIII mAb를 사용한 블롯의 경우 Ex12/XL-1 Blue 조합에 의해 생산된 유전자 재조합 파아지가 Ex12/TOP10F' 조 합에 의해 생산된 유전자 재조합 파아지에 비해 훨씬 더 강한 Fd-ΔpIII 융합 단백질을 발현하였다. 한편 흥미롭게도 도 3의 결과와 상반되게 미약한 수준의 wt pIII가 Ex12/TOP10F' 조합에 의해 생산된 유전자 재조합 파아지에서 검출되었다.

도 4에서 사용된 파아지 시료들이 세포 배양 상등액에 존재하는 파아지들을 PEG/NaCl 침전 방법으로 정제하는 동안 배양액 내의 수용성 항체 절편에 의해 오염되었을 수도 있으므로 anti-M13 mAb로 코팅된 microtiter plate를 사용하여 sandwich ELISA를 수행하였으며 유전자 재조합 파아지의 표면에 삽입되어 있는 Fd-ΔpIII 융합 단백질과 이황결합에 의해 연결되어 있는 SP112 kappa L chain 절편의 양을 anti-human kappa polyclonal Ab를 사용하여 측정하였다 (도 5). 도 5에서 TMB 기질을 사용하여 시그널을 가시화시켰다. 데이터는 3회 실험의 평균 ± 표준편차를 나타낸다. ELISA의 결과, 도 4에서의 결과와 마찬가지로 M13K07/XL-1 Blue와 M13K07/TOP10F' 조합에 의해 생산된 유전자 재조합 파아지의 표면 위에는 SP112 L chain 절편이 거의 디스플레이 되지 않고 있음을 확인하였으며 Ex12/XL-1 Blue 및 Ex12/TOP10F' 조합에 의해 생산된 유전자 재조합 파아지에는 많은 양의 SP112 L chain 절편이 디스플레이 되고 있음이 확인되었다. 그러나 도 4의 결과와는 상반되게 Ex12/XL-1 Blue 조합에 의해 생산된 유전자 재조합 파아지가 Ex12/TOP10F' 조합에 의해 생산된 유전자 재조합 파아지에 비해 4 ~ 5배 정도 높은 양의 SP112 L chain 절편을 디스플레이 하고 있음이 확인되었다.

유전자 재조합 파아지 표면 상의 이러한 Fd-ΔpIII 융합 단백질의 디스플레이 증가가 파아지의 항원-결합 기능성과 직접적인 관련이 있는지 알아보기 위해 recombinant PDC-E2, maltose-binding protein (MBP) 그리고 bovine serum albumin (BSA)이 코팅된 microtiter plate를 사용하여 ELISA를 수행하였다 (도 6). 도 6에서 염소 항-M13 폴리클로날 항체-HRPO는 컨쥬케이트되었고, TMB 기질을 사용하여 시그널을 가시화시켰다. 데이터는 3회 실험의 평균 ± 표준편차를 나타낸다. 네가티브 컨트롤 항원으로 사용된 MBP와 BSA에는 전혀 결합 신호가 나타나지 않았으며 (data not shown), Ex12/XL-1 Blue 조합에 의해 생산된 유전자 재조합 파아지가 M13K07/XL-1 Blue 조합에 의해 생산된 유전자 재조합 파아지에 비해 약 100배 이상 증가된 항원 특이적 결합력을 보여 주었으며 Ex12/TOP10F' 조합에 의해 생산된 유전자 재조합 파아지에 비해서는 약 5 ~ 10배 정도 증가된 항원 특이적 결합력을 보여 주었다. 이는 유전자 재조합 파아지의 항체 디스플레이 레벨이 파아지의 항원 결합 반응력과 비례한다는 것을 증명한다.

이와 같이, 본 발명에서는 파아지미드가 삽입되어 있는 억제형 유전형을 지닌 대장균 균주와 조합하여 파아지미드 벡터를 패키징하기 위한, 파아지 게놈에 존재하는 gIII 내에 1개 이상의 조건부 번역 억제 코돈을 지니고 있는 돌연변이 헬퍼 파아지가 제공된다. 본 발명은 최소한 1개 이상의 항체 절편 또는 기타 외래 폴리펩티드를 파아지 표면에 발현시킬 수 있는 최적의 파아지 발현 시스템을 제공하며, 본 발명에 따른 파아지미드에 기초한 파아지 발현 기술은 매우 실용적이고 안정적이다.

Claims

파아지 게놈에 존재하는 gIII 내에 1개 이상의 조건부 번역 억제 코돈을 포함하고, 상기 gIII는 N-말단부터 하기 화학식 1로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 포함하는, 돌연변이 헬퍼 파아지를 파아지미드가 삽입되어 있는 억제형 유전형을 지닌 대장균 균주와 조합하여 파아지미드 벡터를 패키징하는 방법.

상기 화학식 1은 MKKLLFAIPLVVPFYSHSA*TV*SCLAKPHTENSFT이고, *는 조건부 번역 억제 코돈이다.
제 1항에 있어서, 돌연변이 헬퍼 파아지가 fd, M13, f1, If1, Ike, Ff, Sf, Pf1 및 Pf3로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 조건부 번역 억제 코돈이 UAG (amber), UAA (orcher) 및 UGA (Opel)로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 파아지미드가 파아지미드 자체 내에 자연형 (wt) 또는 돌연변이 gIII 유전자의 전부 또는 일부를 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 억제형 유전형을 지닌 대장균 균주가 UAG (amber), UAA (orcher) 또는 UGA (Opel) 코돈과 같은 특정 정지 코돈을 억제하여 20가지 아미노산 중의 하나로 번역할 수 있는 71/18, BB4, BNN102, C600, CSH18, DH1, DH5, DH5α, DP50supF, ED8654, ED8767, HB101, JM101, JM105, JM107, JM109, JM110, K802, KK2186, KW251, LE392, MM294, NM522, NM531, NM538, NM539, Q358, Q359, RR1, TAP90, TG1, TG2, XL-1 Blue, XL-1 Blue MRF', Y1090 및 YK537로 구성된 균주 중 하나임을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 돌연변이 헬퍼 파아지가 M13K07, VCSM13, R408, ExAssit 및 Phi X174로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서, 자연형 (wt) 또는 돌연변이 gIII 유전자의 전부 또는 일부의 5' 말단 영역에 외래 유전자가 삽입됨을 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서, 외래 유전자가 Fab, scFv 및 dsFv로 구성된 군으로부터 선택된 항체 유전자 및 바이러스, 박테리아, 식물 및 동물의 자연형 또는 돌연변이 유전자임을 특징으로 하는 방법
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