KR101157461B1 - Highly-Expressed Glutathione from Saccharomyces cerevisiae 54-8 wild type and use thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 글루타치온 고발현용 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 54-8 야생형, 이의 배양 방법, 이를 이용한 글루타치온 생산 방법 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 글루타치온을 고농도로 발현하는 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형, 이를 배양하는 방법, 이를 이용한 글루타치온 생산 방법 및 이를 이용한 가축사료 첨가용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a wild type, Saccharomyces cerevisiae ( Saccharomyces cerevisiae ) 54-8 wild type, a culture method thereof, glutathione production method using the same and its use, and more particularly Saccharomyces expressing a high concentration of glutathione cerevisiae 54-8 wild type, a method for culturing the same, a method for producing glutathione using the same and a composition for adding livestock feed using the same.

Description

글루타치온 고발현 사카로마이세스 세레비지애 54-8 야생형 및 이의 용도 {Highly-Expressed Glutathione from Saccharomyces cerevisiae 54-8 wild type and use thereof}Highly-Expressed Glutathione from Saccharomyces cerevisiae 54-8 wild type and use according to Glutathione high expression Saccharomyces cerevisiae 54-8

본 발명은 글루타치온 고발현 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형, 이를 이용한 글루타치온 대량 생산방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 자세하게는 막걸리로부터 분리한, 글루타치온(glutathione)을 고발현하는 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형, 상기 균주를 배지에서 배양하여 글루타치온을 대량 생산하는 방법, 상기 균주의 배양물 또는 그로부터 분리한 글루타치온을 함유하는 가축 사료 첨가용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a glutathione high expression Saccharomyces cerevisiae 54-8 wild type, a method for mass production of glutathione using the same, and a use thereof, more specifically, a Saccharomyces cerevisiae 54-8 wild type isolated from makgeolli, high expression glutathione, The present invention relates to a method for mass production of glutathione by culturing a strain in a medium, and a composition for adding livestock feed containing glutathione isolated from the culture of the strain or separated therefrom.

효모는 균류 중 단세포 형태로 fission이나 budding의 방법으로 무성생식 할 수 있는 종류를 지칭하는 일반적인 용어로서 분류학적으로 효모를 명확하게 구분할 수는 없다. 효모는 자낭균류와 담자균류에서 발견되며, 크게 5개의 분류군으로 나누어 볼 수 있다. 자낭균류에 포함된 효모는 Schizosaccharomyces pompe를 포함한 Archaeascomycetes, Saccharomyces cerevisiae를 포함한 Hemiascomycetes로 크게 나누어 볼 수 있으며, 담자균류의 경우 Urediniomycetes, Ustilagomycetes 그리고 Hymenomycetes로 나누어 질 수 있다.Yeast is a generic term that refers to the type of fungi that can be asexually reproduced by fission or budding in a single cell form of fungi. Yeast is found in asymptomatic fungus and basidiomycetes, which can be divided into five taxa. Yeast included in asymptomatic fungi can be divided into Archaeascomycetes including Schizosaccharomyces pompe , Hemiascomycetes including Saccharomyces cerevisiae , and basidiomycetes can be divided into Urediniomycetes, Ustilagomycetes and Hymenomycetes .

글루타치온 (L-γ-glutamyl-L-cysteinylglycine, GSH)은 세포내 존재하는 생리활성물질로서 글루타메이트(glutamate), 시스테인(cystein), 글라이신(glycine) 의 세가지 아미노산으로 구성된 트리펩타이드로 동물, 식물 및 미생물의 세포내에서 0.1~10mM의 농도로 존재하며, 세포의 총 비단백질성 활성분의 90% 이상을 차지하고 있다. 그것의 다양한 기능은 농업 분야뿐 아니라 효소학, 수송, 약물학, 치료, 독물학, 내분비학 및 미생물학을 포함하는 많은 의학 분야에서 중요하다.Glutathione (L-γ-glutamyl-L-cysteinylglycine, GSH) is a physiologically active substance present in cells. It is present in cells at a concentration of 0.1-10 mM, and accounts for more than 90% of the total nonproteinaceous activity of the cells. Its various functions are important not only in agriculture but in many medical fields, including enzymatics, transport, pharmacology, treatment, toxicology, endocrinology and microbiology.

생체 내에서 글루타치온(glutathione)은 백혈구 생성을 통한 면역 활성 증가를 야기함으로써 중요한 항바이러스제의 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, GST (glutathione S-transferase)의 기질로 작용하여 생체에 해로운 비생체물질(xenobiotics)과 같은 독성물질과 콘쥬게이션되어 해독 작용에 중요한 역할을 한다. 이러한 작용들 중 세포내에서 중요한 항산화 기능을 하는 성분으로서 환원형 글루타치온(reduced glutathione)이 널리 알려져 있다.In vivo, glutathione (glutathione) is known to play an important antiviral agent by causing an increase in immune activity through the production of leukocytes. Conjugation with toxic substances such as plays an important role in detoxification. Among these actions, reduced glutathione is widely known as an important antioxidant component in cells.

글루타치온은 세포 방어에서 뿐만 아니라 다양한 대사 과정에서 결정적인 역할을 한다. 그것은 단백질과 다른 분자들과의 이황화물 결합의 환원, DNA의 옥시리보뉴클레오타이드 전구물질의 합성, 대사작용의 다양한 단계에서 형성되는 많은 활성 산소 매개체 (예를 들면, 과산화물) 및 자유 라디칼(free radical)의 해로운 효과로부터 세포 보호를 수행한다(Meister 'Selective Modification Of Glutathione Metabolism', Science, volume 220, No.4596,472-477 (1983)).Glutathione plays a crucial role in various metabolic processes as well as in cell defense. It is the reduction of disulfide bonds between proteins and other molecules, the synthesis of oxyribonucleotide precursors in DNA, many free radicals (e.g. peroxides) and free radicals formed at various stages of metabolism. Cell protection from the deleterious effects of (Meister 'Selective Modification Of Glutathione Metabolism', Science, volume 220, No. 4596,472-477 (1983)).

글루타치온은 1888년 Baker's yeast의 효모 추출물에서 처음 발견된 이래로 동물, 식물을 포함하는 거의 모든 생물에서 발견되지만, 세포내에서 그 함량이 매우 낮고 최종 산물이 고가여서 산업적으로 적용하는 데에는 많은 문제점을 내포하고 있다. 약 70년 전에 글루타치온이 화학적으로 합성되었지만 D-및 L-형의 광학이성질체의 혼합물로 합성되어 실제적으로 생물학적으로 활성이 있는 L-글루타치온만을 얻을 수 없어 이들 광학이성질체를 분리해야 하는 추가 공정이 필요하여 이 역시 비용에 비하여 생산량이 적어 산업적으로 경제성이 문제되고 있다.Since glutathione was first discovered in the yeast extract of Baker's yeast in 1888, it has been found in almost all organisms, including animals and plants, but its content is very low in cells and the end product is expensive, which presents many problems in industrial applications. have. Glutathione was chemically synthesized about 70 years ago, but it was synthesized with a mixture of D- and L-type optical isomers to obtain only the biologically active L-glutathione, requiring an additional process to separate these optical isomers. This, too, produces less than the cost, causing economic problems.

그러나 최근 효모나 재조합 미생물을 이용한 생물공학적 기법에 의해 글루타치온을 대량으로 생산하는 방법이 활발하게 이루어지고 있다. 효모를 이용한 글루타치온의 생산에는 전구체들(글루타메이트(glutamate), 시스테인(cystein), 글라이신(glycine))과 에탄올 및 젖산 등을 배지에 첨가하는 방법, 글루타치온 생산균주를 고정화시켜 생산하는 방법, 유전공학 기술을 활용하여 재조합된 미생물에서 글루타치온 생합성 효소를 이용하여 글루타치온을 생산하는 공정이 개발되었다. 이들 방법 중에서 미생물인 효모를 이용하여 합성 전구물질인 글루타메이트, 시스테인 및 글라이신과 탄소원으로서 포도당 및 당밀 등을 배지에 첨가하여 글루타치온을 생산하는 방법이 현재 많이 활용되고 있다.Recently, however, a large amount of glutathione is actively produced by biotechnological techniques using yeast or recombinant microorganisms. Production of glutathione using yeast includes the addition of precursors (glutamate, cysteine, glycine) and ethanol and lactic acid to the medium, method of immobilizing glutathione producing strains, and genetic engineering technology. A process for producing glutathione using glutathione biosynthetic enzymes in recombinant microorganisms has been developed. Among these methods, a method for producing glutathione by adding glutamate, cysteine and glycine, which are synthetic precursors, and glucose and molasses as a carbon source to a medium using yeast, which is a microorganism, is now widely used.

그러나 산업적으로 경제성을 가지기 위하여서는 쉽고 단순한 공정을 통하여 고효율의 글루타치온을 생산하는 것이 필수적이다. 또한 농축산, 식품, 의약 분야 에서 주로 사용될 글루타치온의 안전성 확보를 위하여 자연발생적이며 이미 식품분야에 응용되고 있는 미생물을 이용한 생산 방법에 대한 개발이 요구된다.However, in order to have industrial economics, it is essential to produce high efficiency glutathione through an easy and simple process. In addition, in order to secure the safety of glutathione, which is mainly used in the fields of livestock, food, and medicine, development of a production method using microorganisms that are naturally occurring and already applied in the food field is required.

본 발명자는 글루타치온을 고발현하는 효모를 한국인의 대표적인 발효식품인 생막걸리 제조를 위하여 제공되는 효모 균주에서 찾고자 연구를 거듭하던 중 경북군위 부계면 팔공산 주조장에서 주조된 팔공산 생막걸리에서 글루타치온을 고발현하는 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형이 포함되어 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.The inventors of the present invention have repeatedly studied to find yeast strains for expressing glutathione in yeast strains for the production of saengmakgeul, a representative fermented food of Koreans, and Saccharomyces expressing glutathione in Palgongsan saengmakgeul cast at Palgongsan foundry in Bugye-myeon, Gyeongbuk. cerevisiae 54-8 confirmed that the wild type is included and completed the present invention.

따라서 본 발명의 목적은 글루타치온을 고발현하는 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형 및 이의 배양물을 제공하는 것이다.It is therefore an object of the present invention to provide a Saccharomyces cerevisiae 54-8 wild type and its culture which express high glutathione.

또한 본 발명의 목적은 상기 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형을 배양하는 배양 방법을 제공하는 것이다.It is also an object of the present invention to provide a culture method for culturing the Saccharomyces cerevisiae 54-8 wild type.

또한 본 발명의 목적은 상기 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형을 이용하여 글루타치온을 생산하는 생산 방법을 제공하는 것이다.It is also an object of the present invention to provide a production method for producing glutathione using the Saccharomyces cerevisiae 54-8 wild type.

또한 본 발명의 목적은 상기 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형의 배양물 또는 이로부터 분리한 균주 자체 또는 이들로부터 분리한 글루타치온을 포함하는 가축사료 첨가용 조성물을 제공하는 것이다.It is also an object of the present invention to provide a composition for adding livestock feed comprising glutathione isolated from the Saccharomyces cerevisiae 54-8 wild type culture or the strain itself or separated therefrom.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 글루타치온을 고발현하는 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형 및 이의 배양물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a Saccharomyces cerevisiae 54-8 wild-type and culture thereof having high expression of glutathione.

또한 본 발명은 상기 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형을 배양하는 배양 방법을 제공한다.The present invention also provides a culture method for culturing the Saccharomyces cerevisiae 54-8 wild type.

또한 본 발명은 상기 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형을 이용하여 글루타치온을 생산하는 생산 방법을 제공한다.The present invention also provides a production method for producing glutathione using the Saccharomyces cerevisiae 54-8 wild type.

또한 본 발명은 상기 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형 또는 이의 배양물을 함유하는 가축사료 첨가용 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a composition for adding livestock feed containing the Saccharomyces cerevisiae 54-8 wild type or its culture.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명의 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형은 글루타치온을 고발현하는 특징이 있으며 그 배양물은 글루타치온을 고발현하는 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형에 의하여 생성된 것을 특징으로 한다. Saccharomyces cerevisiae 54-8 wild type of the present invention is characterized by high expression of glutathione, and its culture is characterized by being produced by Saccharomyces cerevisiae 54-8 wild type expressing glutathione.

일반적으로 사카로마이세스 세레비지애 또는 그 배양물은 통상적인 배양조건에서 균체 g 당 10~40mg의 글루타치온을 함유하나 본 발명의 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형 또는 그 배양물은 균체 g당 최대 52mg의 글루타치온을 함유하여 그 생산 효율이 월등한 것으로 나타났다.Generally, Saccharomyces cerevisiae or its cultures contain 10-40 mg of glutathione per g of cells under normal culture conditions, but the Saccharomyces cerevisiae 54-8 wild type of the present invention or its culture contains up to 52 mg of cells per g. It contains glutathione and its production efficiency has been shown to be superior.

상기 배양물은 액체배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액(원심분리한 상등액) 등을 포함한다. 조성물 내 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형, 또는 글루타치온의 함량은 조성물의 용도 및 제형에 따라 달라질 수 있다.The culture includes a culture solution itself cultured in a liquid medium, a filtrate (centrifuged supernatant) from which the strain is removed by filtration or centrifugation of the culture solution. The content of Saccharomyces cerevisiae 54-8 wild type, or glutathione in the composition may vary depending on the use and formulation of the composition.

또한 본 발명의 배양 방법은 통상의 배양 방법에 있어 상기 본 발명의 글루타치온을 고발현하는 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형을 이용하는 것을 그 특징으로 한다.In addition, the culturing method of the present invention is characterized by using the wild type Saccharomyces cerevisiae 54-8 expressing the glutathione of the present invention in a conventional culturing method.

본 발명에 따른 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형은 통상적인 미생물의 배양에 이용되는 배양방법에 의해 대량으로 배양할 수 있다. 배양배지는 탄소원, 질소원으로 구성된 배지를 사용 할 수 있으며 미네랄 및 비타민을 첨가하여도 된다. Saccharomyces cerevisiae 54-8 wild type according to the present invention can be cultured in large quantities by a culture method used for culturing conventional microorganisms. The culture medium may use a medium consisting of a carbon source and a nitrogen source, and minerals and vitamins may be added.

예컨대, 글루타치온의 대량 생산을 위하여 본 발명의 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형을 0.3 내지 0.5% 암모늄 설페이트, 0.3 내지 0.5% 디포타슘 포스페이트, 0.3 내지 0.5% 모노포타슘 포스페이트, 1.5 내지 2% TSB(Tryptic Soy Broth), 2.0 내지 2.5% 폴리펩톤, 1.0 내지 1.5% 수크로오스, 1.0 내지 1.5% 글루코오스, 0.02 내지 0.025% 미오-이노시톨, 0.2 내지 0.25mM ZnSO4 및 0.15 내지 0.2% L-시스테인을 함유한 배지에서 배양할 수 있다.For example, for mass production of glutathione, the Saccharomyces cerevisiae 54-8 wild type of the present invention was prepared with 0.3-0.5% ammonium sulfate, 0.3-0.5% dipotassium phosphate, 0.3-0.5% monopotassium phosphate, 1.5-2% TSB (Tryptic Soy Broth) ), 2.0 to 2.5% polypeptone, 1.0 to 1.5% sucrose, 1.0 to 1.5% glucose, 0.02 to 0.025% myo-inositol, 0.2 to 0.25 mM ZnSO 4 and 0.15 to 0.2% L-cysteine Can be.

보다 바람직하게는 0.5% 암모늄 설페이트, 0.5% 디포타슘 포스페이트, 0.5% 모노포타슘 포스페이트, 2.0% TSB(Tryptic Soy Broth), 2.5% 폴리펩톤, 1.5% 수크로오스, 1.0% 글루코오스, 0.025% 미오-이노시톨, 0.25mM ZnSO4 및 0.2% L-시스테인을 함유한 배지에서 배양할 수 있다.More preferably 0.5% ammonium sulfate, 0.5% dipotassium phosphate, 0.5% monopotassium phosphate, 2.0% Tryptic Soy Broth (TSB), 2.5% polypeptone, 1.5% sucrose, 1.0% glucose, 0.025% myo-inositol, 0.25 It can be cultured in medium containing mM ZnSO 4 and 0.2% L-cysteine.

배양액 중의 배양배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 또는 여과 과정을 거칠 수 있으며, 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동(frozen)하거나 또는 냉동건조(lyophilized)하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.Centrifugation or filtration may be performed to remove the culture medium in the culture and recover only the concentrated cells, and this step may be performed by those skilled in the art as needed. The concentrated cells may be frozen or lyophilized according to a conventional method so as not to lose their activity.

또한 본 발명의 글루타치온 생산 방법은 상기 본 발명의 글루타치온을 고발현하는 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형에 의해 생성된 배양물을 이용하는 것을 그 특징으로 한다.In addition, the glutathione production method of the present invention is characterized by using a culture produced by the wild type Saccharomyces cerevisiae 54-8 expressing the glutathione of the present invention.

한편, 글루타치온은 세포내 비단백질이므로 배양물 또는 균주로부터 글루타치온을 분리하기 전에 균주를 용균시키는 것이 바람직하다. 균주의 용균은 이에 한정되는 것은 아니지만, 용균용 완충용액, 소니케이터, 열 처리 등에 의해 달성 가능하다.On the other hand, since glutathione is an intracellular non-protein, it is preferable to lyse the strain before separating the glutathione from the culture or strain. The lysis of the strain is not limited to this, but can be achieved by lysis buffer solution, sonicator, heat treatment and the like.

Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형균주의 배양물 또는 이의 균주로부터 글루타치온을 분리하는 방법은 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만, 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함한 전통적인 방법에 의하여 분리할 수 있다. 더 나아가, 크로마토그래피(예, 이온교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제), 전기영동, SDS-PAGE를 포함하여 일반에 공지된 다양한 방법을 통해서 분리 가능하다. Saccharomyces cerevisiae 54-8 A method for separating glutathione from a culture of wild strains or strains thereof is, for example, but not limited to, by conventional methods including centrifugation, filtration, extraction, spray drying, evaporation or precipitation. Can be. Furthermore, it can be separated by a variety of methods known in the art, including chromatography (eg, ion exchange, affinity, hydrophobicity and size exclusion), electrophoresis, SDS-PAGE.

또한 본 발명의 가축사료 첨가용 조성물은 상기 본 발명의 글루타치온을 고발현하는 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형에 의해 생성된 배양물 또는 이로부터 분리된 균주 자체 또는 이들로부터 분리된 글루타치온을 포함하는 것을 그 특징으로 한다.In addition, the composition for adding livestock feed of the present invention comprises a culture produced by the Saccharomyces cerevisiae 54-8 wild type expressing the glutathione of the present invention or a strain isolated therefrom or a glutathione isolated from them It is done.

또한, 본 발명에 따른 사료첨가용 조성물은 이를 첨가하여 발효사료, 배합사료, 펠렛형태 및 사일레지(silage) 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 발효사료는 본 발명의 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형과 여러 가지 미생물 균 또는 효소들을 첨가함으로써 유기물을 발효시켜 제조할 수 있으며, 상기 배합사료는 여러 종류의 일반사료와 본 발명의 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형을 혼합하여 제조될 수 있다. 펠렛 형태의 사료는 상기 발효사료 또는 배합사료를 펠렛기로 제형화하여 제조될 수 있다.In addition, the feed composition according to the present invention can be prepared in the form of fermented feed, compound feed, pellet form and silage (silage) by adding it. The fermented feed may be prepared by fermenting an organic material by adding Saccharomyces cerevisiae 54-8 wild type of the present invention and various microorganisms or enzymes, and the blended feed may include various kinds of general feeds and Saccharomyces cerevisiae 54-8 of the present invention. It can be prepared by mixing wild type. Pellet feed may be prepared by formulating the fermented feed or blended feed into a pellet machine.

한편, 본 발명의 사료 첨가용 조성물을 사료에 배합하여 첨가하는 방법으로는 기계적 혼합, 흡착, 흡장 등의 방법이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.On the other hand, there is a method of mixing and adding the feed composition of the present invention to feed, such as mechanical mixing, adsorption, occlusion, but is not limited thereto.

사료에는 일반 볏짚, 야초, 앤시리지, 건초, 산야초 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고 가축의 사육에 사용되는 사료이면 무방하다.The feed may include general rice straw, weeds, ansiridge, hay, wild grasses, etc., but is not limited thereto, and may be used for raising livestock.

따라서, 본 발명의 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형은 종래 균주에 비하여 고효율의 글루타치온을 생산할 수 있을 뿐만 아니라 이에 의한 배양물은 적은 비용으로 가축의 생장을 매우 증진시켜 가축농가의 경제성 및 생산성을 월등히 증 대시킬 수 있어 산업적으로 활용 가치가 매우 크다.Therefore, the Saccharomyces cerevisiae 54-8 wild type of the present invention not only can produce high-efficiency glutathione compared to the conventional strain, but the culture thereby greatly enhances the growth of livestock at a low cost, thereby greatly increasing the economics and productivity of the livestock farm. It can be used, so it is very useful industrially.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are merely to illustrate the present invention, the content of the present invention is not limited only to the following examples.

<실시예 1>&Lt; Example 1 >

본 발명의 균주 스크리닝Strain Screening of the Invention

<1-1> 시료의 준비<1-1> Preparation of Sample

하기 표 1에 나열된 전국 각지로부터 시료를 채취하였다. 채취한 샘플을 멸균수에 희석하여 yeast용 평판 배지 플래이트에 접종한 후, 유리막대로 도말 하였다. 이후, 플래이트를 37℃ 항온배양기에서 하룻밤동안 배양한 후 각 플레이트에서 활성화된 콜로니 중 10개를 선택하여 10ml의 yeast용 액체 배지에 각각 접종하여 32℃, 200rpm에서 진탕배양하고, 배양한 후 24시간, 48시간, 72시간에서 각각 시료를 채취하여 다음의 방법으로 글루타치온 활성도 측정을 수행하였다. Samples were taken from all over the country listed in Table 1 below. The collected sample was diluted in sterile water and inoculated on a yeast flat medium plate, and then plated with a glass rod. Subsequently, the plate was incubated overnight at 37 ° C. incubator, and then 10 plates of activated colonies were selected from each plate and inoculated in 10 ml of yeast liquid medium, followed by shaking culture at 32 ° C. and 200 rpm, followed by incubation for 24 hours. Samples were taken at, 48 h and 72 h, respectively, and glutathione activity was measured by the following method.

<1-2> 글루타치온 활성도 측정<1-2> glutathione activity measurement

배양액 1.8ml를 원심분리하여 cell를 포집하고 동결건조를 실시하였다. 이를 0.8% SDS 0.6ml에 완전히 현탁한 후 직경 4mm의 글래스 비드 10개를 넣고 진탕 배양기(32℃, 250rpm)에서 2시간 동안 파쇄하였다. 이어서, 원심분리 후 96-well plate에 상층액 10㎕와 50mM의 소듐 포스페이트 완충용액(pH 7.5) 100㎕ 및 10mM의 DTNB(5,5-dithio-bis 2-nitrobenzoic acid) 10㎕를 반응시킨 후, 마이크로플레이트 리더를 이용하여 412nm에서의 흡광도를 측정하여 글루타치온의 농도를 측정하였다.The cells were collected by centrifugation of 1.8 ml of the culture and lyophilized. This was completely suspended in 0.6 ml of 0.8% SDS, and then 10 glass beads having a diameter of 4 mm were added and crushed in a shaking incubator (32 ° C., 250 rpm) for 2 hours. Subsequently, after centrifugation, 10 µl of the supernatant, 100 µl of 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5), and 10 µm of 10 mM DTNB (5,5-dithio-bis 2-nitrobenzoic acid) were reacted with a 96-well plate. The concentration of glutathione was measured by measuring the absorbance at 412 nm using a microplate reader.

<1-3> 글루타치온 고발현 <1-3> glutathione high expression Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae 54-8 야생형 선별 54-8 Wild Type Screening

총 65개의 시료를 상기의 방법으로 배양하여 글루타치온의 농도를 측정하여 비교하였다. 그 결과 54번으로 표기된 경북 군위 부계면 막걸리로부터 유래된 사카로마이세스 세레비지애에서 글루타치온의 발현이 가장 많은 것을 확인하였다.A total of 65 samples were cultured by the method described above to compare and measure the concentration of glutathione. As a result, it was confirmed that the expression of glutathione was the highest in Saccharomyces cerevisiae derived from Makgeolli, Bugye-myeon, Gyeongbuk.

시료를 채취한 막걸리의 명칭 및 소재지Name and location of the rice wine from which the sample was taken NoNo 이름name 지역area 양조장brewery 글루타치온 함량Glutathione content 1One 안중 김선달Ahn Jung Sun Kim 경기도 안중Anjung, Gyeonggi-do ++ 22 아산 쌀막걸리Asan Rice Makgeolli 아산 영인면Asan Youngin-myeon ++ 33 신선도 쌀막걸리Freshness Rice Makgeolli 아산 신창면Asan Sinchang-myeon ++ 44 예산 스가올 생막걸리Budget Sugaol Raw Rice Wine 예산 신례원Budget new house ++ 55 백제 쌀막걸리Baekje Rice Makgeolli 공주 신풍면Princess scene ++ 66 동동주 (음식점)Dongdongju (Restaurant) 유구 마곡사Yugu Magoksa Temple ++ 77 공주 알밤 인삼주Princess chestnut ginseng 공주 시곡면Princess Sigok-myeon ++ 88 칠갑산 장곡사 동동주 (음식점)Chilgapsan Janggoksa Temple Dongdongju (Restaurant) 청양 장곡면Cheongyang Janggom-myeon ++ 99 양촌 순수 생막걸리Yangchon pure fresh rice wine 논산 양촌면Nonsan Yangchon-myeon ++ 1010 신비로 생막걸리Raw rice wine with mystery 부여 조천면Buyeo Jocheon-myeon 두배주조Double casting ++ 1111 가야골 뻑뻑주Gogol stiff 논산 가야골면Nonsan Gayagol-myeon ++ 1212 원광 생막걸리Ore Saengmakri 익산시Iksan 원광주조Wonkwang Casting ++ 1313 함라 생막걸리Hamlaeng Makgeolli 익산 함라면Iksan Ham Ramen ++ 1414 한내 생막걸리Hannae Fresh Makgeolli 완주 한내면Wanju Hannae-myeon 천둥소리Thunder ++ 1515 부안 생막걸리Buan Saengmakri 부안Buan 부안협동 양조장Buan Cooperative Brewery ++ 1616 줄포 생막걸리Julpo Fresh Makgeolli 부안 동진면Buan Dongjin-myeon ++ 1717 순곡 생막걸리Sungok fresh rice wine 고창 흥덕면Gochang Heungdeok-myeon ++ 1818 선운사 생동동주Seondongsa Saengdongdongju 고창 아산면Gochang Asan-myeon ++ 1919 생한방 막걸리Fresh Oriental Rice Wine 영광대마면 Glory ++ 2020 함평 나비막걸리Hampyeong Butterfly Rice Cake 함평 월야면Hampyeong moon and noodles 해보Try ++ 2121 무안 봉탄 생막걸리Muan Bongtan Fresh Rice Wine 무안 몽탄면Muan Montan-myeon ++ 2222 생쌀막걸리Uncooked rice wine 나주 봉황면Naju Phoenix ++ 2323 청계 생막걸리Cheonggye Makgeolli 무안Muan ++ 2424 살아있는 효모생막걸리Live Yeast Makgeolli 목포 용해동Mokpo Melt Copper 목포탁주Mokpojuju ++ 2525 도갓집 동동주Dogat House Dongdongju 영암 삼호면Yeongam Samho-myeon ++++ 2626 다산촌 생막걸리Dasan Village Saeng Makgeolli 강진 도암면Gangjin Doam-myeon ++ 2727 안양 생막걸리Anyang Fresh Makgeolli 장흥 안양면Jangheung Anyang-myeon ++ 2828 겸백 생막걸리Fresh makgeolli 보성 겸백면Boseong Comeback ++ 2929 향토주 참막걸리Local sake rice wine 보성 조성면Boseong Composition ++ 3030 녹차 생막걸리Green tea rice wine 보성 벌교면Boseong Beolgyo 벌교주조Punishment casting ++ 3131 승주 생막걸리Seungju raw rice wine 순천 승주Suncheon Seungju ++ 3232 지리산 생막걸리Jirisan Fresh Rice Wine 구례 복동리Gurye Bokdong-ri 산동생수Shandong Bottled Water ++ 3333 순곡 생막걸리Sungok fresh rice wine 곡성 오지리Gokseong Ojiri ++ 3434 곡성 생막걸리Gokseong Makgeolli 곡성곡성읍 Gokseonggok-eup ++ 3535 지리산 생막걸리Jirisan Fresh Rice Wine 남원Namwon 서남합동 주조장Southwest Joint Brewery ++ 3636 남원 춘향골 생막걸리Namwon Chunhyanggol Fresh Makgeolli 남원 산곡동Namwon Mountain Valley ++ 3737 남원 산동 막걸리Namwon Shandong Rice Wine 남원 산동면 태릉리Taewon-ri, Namdong-myeon, Namwon-si ++ 3838 번암 막걸리Burnam Rice Wine 장수 번암면Longevity ++ 3939 장수 향토 참막걸리Longevity Local Rice Wine 장수 장수읍Jangsu Jangsu-eup ++ 4040 무주 민속주Muju Folk Wine 무주 무주군 읍내리Muju Muju-gun Eupnae-ri 무주 민속탁주장Muju Folk Table Claim ++ 4141 금산 인삼 막걸리 (길거리)Geumsan Ginseng Makgeolli (street) 금산 금산읍Geumsan Geumsan-eup ++ 4242 금산 생막걸리Geumsan Fresh Makgeolli 금산 제원면Geumsan Jewon-myeon ++ 4343 이원 막걸리Binary rice wine 옥천 이원면 강천리Okcheon Iwon-myeon Gangcheon-ri ++ 4444 영동 생막걸리Yeongdong Saengmakgeolli 영동 심천면 심천리Shenzhen-li ++ 4545 영동 황간 막걸리 (개인)Yeongdong royal rice wine (individual) 영동 황간면Yeongdong Hwanggan-myeon ++ 4646 영동 황간 매곡생막걸리Yeongdong Hwanggok Maegoksaenggeolli 영동 매곡면 노천리Yeongdong Maegok-myeon Nocheon-ri ++ 4747 김천 숯 막걸리Gimcheon Charcoal Rice Wine 김천Gimcheon 김천 탁주 협동 제조Gimcheon Takju Cooperative Manufacturing ++ 4848 남면 옥산 생막걸리Namsan Oksan Makgeolli 김천 남면Namcheon Gimcheon 옥산탁주Oksan Takju ++ 4949 왜관 생막걸리Waegwan live makgeolli 칠곡 왜관읍Chilgok Waegwaneup 왜관탁주Waegwan Takju ++ 5050 대구 불로 막걸리Cod fired rice wine 대구 불로동Daegu Bullo-dong 대구탁주Daegu Takju ++ 5151 대구 막걸리Daegu rice wine 달성군 천어동Dalseong-gun Cheon-dong ++ 5252 효령 막걸리Hyoyeong Makgeolli 군위 효령면 중구리Jungguri, Hyoyeong-myeon ++ 5353 군위 동동주 (음식점)Yue Dong Dong-ju (Restaurant) 군위 부계면 남산1리
(삼존석불)Namsan 1-ri, Bugye-myeon, Gunwi-gun
(Samzon Stone Buddha) 군위 부계면 남산1리
(삼존석불)Namsan 1-ri, Bugye-myeon, Gunwi-gun
(Samzon Stone Buddha) ++ 5454 팔공산 생막걸리Palgongsan Fresh Makgeolli 군위 부계면Suburbs 팔공산 주조장Palgongsan Foundry ++++++ 5555 춘산 쌀막걸리Chunsan Rice Makgeolli 의성 춘산면 옥정리Okjeong-ri, Chunsan-myeon, Uiseong ++ 5656 빙계 생막걸리Ice Iced Makgeolli 의성 가음면 장리Uiseong Gai-myeon ++ 5757 단촌 생막걸리Danchon Fresh Makgeolli 의성 단촌면 세천리Secheon-ri, Danchon-myeon, Uiseong ++ 5858 안동 쌀막걸리Andong Rice Makgeolli 안동 황석동Andong Hwangseok-dong 안동탁주 제1 공장Andong Takju Plant 1 ++ 5959 풍산 생막걸리Poongsan Fresh Makgeolli 안동 풍산읍 상리Sang-ri, Pungsan-eup, Andong 풍산탁주Poongsan Takju ++ 6060 하회민속주Hahoe Folk Wine 안동 풍천읍 갈전리Andong Pungcheon-eup Galjeon-ri 풍천양조장Poongcheon Brewery ++ 6161 예천 생막걸리Yecheon fresh rice wine 예천Yecheon ++ 6262 용궁 생막걸리Yonggung Saeng Makgeolli 예천 용궁면Yecheon Yonggung-myeon 용궁주조장Yonggung Brewery ++ 6363 얼음골 생막걸리Ice bone raw rice wine 상주 내서면 송암리Sangju Naeseon-myeon Songam-ri 능암양조장Neungam Brewery ++ 6464 조껍데기술Shell technology 상주 화북면 입석리Sangju Hwabuk-myeon Seokseok-ri 막걸리나라Rice wine ++ 6565 마성 생막걸리Demon Makgeolli 문경 마성면 신현리Sinhyeon-ri, Maseong-myeon, Mungyeong ++

<1-4> 선발 균주의 동정<1-4> Identification of Selected Strains

균주의 동정은 한국생명공학연구원 생물자원센터에 의뢰하여, 26S rRNA유전자의 D1/D2 영역 염기서열과 ITS 영역을 분석하였다. 그 결과. 상기 균주의 26S rRNA gene의 D1/D2 영역에서 조사된 572개의 염기서열을 분석한 결과 Saccharomyces cerevisiae 표준균주인 NRRL Y-12632NT(SCU44806)의 염기서열과 100% 동일함을 확인할 수 있었다. 그리고 상기 균주의 ITS 영역에서 조사된 731개의 염기서열을 분석한 결과 Saccharomyces cerevisiae 표준균주인 NBRC 10217T(D89886)와 99% 유사도를 확인할 수 있었다(결과 미도시). 그러므로 상기균주는 Saccharomyces cerevisiae 균주로 동정되었다.Identification of the strains was commissioned by the Korea Institute of Bioscience and Biotechnology, and analyzed the D1 / D2 region sequence and ITS region of 26S rRNA gene. As a result. Analysis of 572 nucleotide sequences examined in the D1 / D2 region of the 26S rRNA gene of the strain confirmed that the nucleotide sequence of NRRL Y-12632 NT (SCU44806), a Saccharomyces cerevisiae standard strain, was 100% identical. As a result of analyzing the 731 nucleotide sequences irradiated in the ITS region of the strain, 99% similarity with the Saccharomyces cerevisiae standard strain NBRC 10217 T (D89886) was confirmed (result not shown). Therefore, the strain was identified as Saccharomyces cerevisiae strain.

본 발명자들은 상기 균주를 "Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형"으로 명명하였고, 이를 한국농업 미생물자원센터(Korean Agricultural culture collection)에 2009년 02월 11일자로 기탁하였다(기탁번호: KACC 93069P). The inventors named the strain " Saccharomyces cerevisiae 54-8 wild type", which was deposited on February 11, 2009 to the Korean Agricultural Culture Center (Accession No .: KACC 93069P).

<실시예 2><Example 2>

본 발명의 글루타치온 고발현용 High glutathione expression of the present invention Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae 54-8 야생형 균주의 배양 배지. Culture medium of 54-8 wild type strain.

<2-1> 본 발명의 포스페이트 종류 및 농도에 의한 글루타치온의 생산효율<2-1> Production Efficiency of Glutathione by Phosphate Type and Concentration of the Present Invention

2% TSB(Tryptic Soy Broth), 2.5% 폴리펩톤, 1.5% 수크로오스, 1.0% 글루코오스, 0.5% 암모늄 설페이트로 이루어지고, 여기에 디포타슘 포스페이트와 모노포타슘 포스페이트(1번 배지), 디포타슘 포스페이트와 모노나트륨 포스페이트(2번 배지), 모노포타슘 포스페이트와 디나트륨 포스페이트(3번 배지), 디포타슘 포스페이트와 디나트륨 포스페이트(4번 배지) 또는 모노포타슘 포스페이트와 모노나트륨 포스페이트(5번 배지)를 첨가한 배지를 각각 제조하였다. 상기 각각의 배지에 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형 균주를 접종하여 배양하였다. 이때, 배양시간은 72시간, 온도 32℃ 및 진탕배양 회전수는 200rpm 으로 조절하고 지정된 시간별로 배양액의 일부를 회수하여 실시예 1-2에 기재된 방식에 따라 글루타치온 농도를 확인하였다.It consists of 2% Tryptic Soy Broth (TSB), 2.5% polypeptone, 1.5% sucrose, 1.0% glucose, 0.5% ammonium sulfate, which contains dipotassium phosphate and monopotassium phosphate (No. 1 medium), dipotassium phosphate and mono Medium containing sodium phosphate (medium 2), monopotassium phosphate and disodium phosphate (medium 3), dipotassium phosphate and disodium phosphate (medium 4) or monopotassium phosphate and monosodium phosphate (medium 5) Were prepared respectively. Each medium was inoculated with Saccharomyces cerevisiae 54-8 wild type strain and cultured. At this time, the culture time was adjusted to 72 hours, the temperature 32 ℃ and the shaking culture rotation speed to 200rpm and recovered a portion of the culture medium by the designated time to determine the glutathione concentration according to the method described in Example 1-2.

포스페이트 이온의 종류에 따른 글루타치온 생산량 측정 결과Measurement Results of Glutathione Production According to Kinds of Phosphate Ions 배지번호Badge number 포스페이트 이온의 종류(농도:0.5%)Kind of phosphate ion (concentration: 0.5%) 24시간 GSH%24 hours GSH% 48시간 GSH%48 hours GSH% 72시간 GSH%72 hours GSH% 1One Kpi di, Kpi monoKpi di, Kpi mono 1.61.6 3.63.6 4.44.4 22 Kpi di, Napi monoKpi di, Napi mono 1.21.2 2.82.8 3.23.2 33 Kpi mono, Napi diKpi mono, Napi di 0.80.8 0.80.8 0.80.8 44 Kpi di, Napi diKpi di, Napi di 1.21.2 2.42.4 2.82.8 55 Kpi mono, Napi monoKpi mono, Napi mono 1.21.2 2.82.8 3.23.2

* GSH% 는 측정된 글루타치온 농도를 말한다.* GSH% refers to the measured glutathione concentration.

상기 표 2에서 보는 바와 같이 1번 배지, 즉 디포타슘 포스페이트와 모노포타슘 포스페이트를 이용한 경우에 배양 효율이 높은 것을 확인하였다.As shown in Table 2, it was confirmed that the culture efficiency is high when using No. 1 medium, that is, dipotassium phosphate and monopotassium phosphate.

<2-2> 본 발명의 염(ZnSO<2-2> Salt of the present invention (ZnSO 44 ) 선택에 따른 글루타치온의 생산 효율Production Efficiency of Glutathione According to Selection

TSB 2%, 폴리펩톤 2%, 수크로오스 1.5%, 글루코오스 1.0%, 0.5% 암모늄 설페이트로, 0.5% 디포타슘 포스페이트와 모노포타슘 포스페이트 이루어지고, 여기에 표 3에 기재된 염을 각각 첨가한 배지를 제조하였고 상기 각각의 배지에 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형 균주를 접종하여 온도 32℃에서 200rpm으로 진탕하여 배양하였다. 이때, 지정된 시간별로 배양액의 일부를 회수하여 실시예 1-2에 기재된 방식에 따라 글루타치온 농도를 확인하였다.A medium consisting of 2% TSB, 2% polypeptone, 1.5% sucrose, 1.0% glucose, 0.5% ammonium sulfate, 0.5% dipotassium phosphate and monopotassium phosphate, to which the salts listed in Table 3 were added, was prepared. Saccharomyces cerevisiae 54-8 wild-type strains were inoculated into the respective mediums, and cultured by shaking at 200 rpm at a temperature of 32 ° C. At this time, a portion of the culture solution was collected at a designated time to check the glutathione concentration according to the method described in Example 1-2.

각종 금속이온의 첨가에 따른 글루타치온 생산량 측정 결과Results of measuring glutathione production according to the addition of various metal ions 종류Kinds 24시간 GSH%24 hours GSH% 48시간 GSH%48 hours GSH% A600(10:1)A 600 (10: 1) nonenone 1.61.6 2.02.0 1.0061.006 0.5mM CaCl2 0.5 mM CaCl 2 1.61.6 1.61.6 1.0401.040 0.5mM MgCl2 0.5 mM MgCl 2 2.02.0 3.23.2 0.8000.800 0.5mM MgSO4 0.5 mM MgSO 4 2.82.8 2.42.4 0.8330.833 0.5mM FeCl2 0.5 mM FeCl 2 2.02.0 1.61.6 0.9450.945 0.5mM FeCl3 0.5 mM FeCl 3 2.42.4 1.61.6 0.9310.931 0.5mM ZnCl3 0.5 mM ZnCl 3 2.42.4 2.42.4 0.7100.710 0.5mM ZnSO0.5mM ZnSO 44 2.42.4 3.63.6 0.6820.682 0.5mM MnCl2 0.5 mM MnCl 2 2.82.8 2.02.0 1.0931.093 0.5mM MnSO4 0.5 mM MnSO 4 2.02.0 2.42.4 0.5910.591

그 결과, 상기 표 3에서 보는 바와 같이, ZnSO4를 이용한 경우에 글루타치온 생산량이 가장 높은 것을 확인하였다.As a result, as shown in Table 3, it was confirmed that glutathione production is the highest when using ZnSO 4 .

<2-3> 본 발명의 미오-이노시톨, ZnSO<2-3> myo-inositol, ZnSO of the present invention 44 , 시스테인 첨가에 따른 글루타치온 생산 효율Production Efficiency of Glutathione with Cysteine Addition

2% TSB, 2.5% 폴리펩톤, 수크로오스 1.5%, 글루코오스 1.0%, 0.5% 암모늄 설페이트로, 0.5% 디포타슘 포스페이트와 모노포타슘 포스페이트 등으로 이루어진 배지(A), A 배지에 0.025% 미오-이노시톨, 0.25mM ZnSO4 를 추가한 배지(B), B배지에 0.2% 시스테인을 추가한 배지(C)를 제조하여 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형을 접종하여 32℃에서 진탕하면서 배양하여 지정된 시간별로 배양액의 일부를 회수하여 실시예 1-2에 기재된 방식에 따라 글루타치온 농도를 확인하였다.Medium (A) consisting of 2% TSB, 2.5% polypeptone, 1.5% sucrose, 1.0% glucose, 0.5% ammonium sulfate, 0.5% dipotassium phosphate and monopotassium phosphate, 0.025% myo-inositol in A medium, 0.25 A medium (B) added with mM ZnSO 4 and a medium (C) with 0.2% cysteine added to medium B were prepared, inoculated with Saccharomyces cerevisiae 54-8 wild type, incubated with shaking at 32 ° C., and part of the culture solution was designated at a specified time. The glutathione concentration was recovered and confirmed in the manner described in Example 1-2.

배지 종류에 따른 글루타치온 농도 Glutathione Concentration According to Media Type 배지 종류 및 시간Badge type and time A600 A 600 DTNB 처리후 A412A412 after DTNB treatment 0 min0 min 2 min2 min AA 26h26h 1.6021.602 0.8940.894 0.9100.910 47h47h 1.5131.513 0.8160.816 0.8480.848 BB 26h26h 1.6831.683 1.0391.039 1.0441.044 47h47h 1.4771.477 0.8930.893 0.8710.871 CC 26h26h 1.3531.353 1.1301.130 0.9970.997 48h48h 1.4121.412 1.3041.304 1.0671.067

그 결과, 상기의 표 4에서 나타난 바와 같이 본 발명의 균주는 0.025% 미오-이노시톨, 0.25mM ZnSO4, 0.2% L-시스테인을 모두 추가한 경우 글루타치온 생산 효율이 가장 높은 것을 확인하였다.As a result, as shown in Table 4 above, the strain of the present invention confirmed that glutathione production efficiency was the highest when all of 0.025% myo-inositol, 0.25 mM ZnSO 4 , and 0.2% L-cysteine were added.

상기 실시예 2-1, 2-2, 2-3을 종합 해 보면 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형을 배양함에 있어서 최적화 배지는 하기 표 4와 같은 조성과 농도로 이루어진 것이라는 결론에 이르렀다.Comparing the Examples 2-1, 2-2, 2-3, it was concluded that the optimizing medium in culturing Saccharomyces cerevisiae 54-8 wild type was composed of the composition and concentration as shown in Table 4 below.

Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형을 배양 하기위한 최적화 배지 조성Optimal Medium Composition for Saccharomyces cerevisiae 54-8 Wild-Type Cultivation 구성 성분Constituent 농도density 암모늄 설페이트Ammonium sulfate 0.5%0.5% 디포타슘 포스페이트Dipotassium Phosphate 0.5%0.5% 모노포타슘 포스페이트Monopotassium phosphate 0.5%0.5% Tryptic Soy BrothTryptic Soy Broth 2.0%2.0% 폴리펩톤Polypeptone 2.5%2.5% 수크로오스Sucrose 1.5%1.5% 글루코오스Glucose 1.0%1.0% 미오-이노시톨Myo-inositol 0.025%0.025% ZnSO4 ZnSO 4 0.25mM0.25mM L-시스테인L-cysteine 0.2%0.2%

<2-4> 최적 조건에서의 <2-4> at optimum conditions Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae 54-8 야생형의 글루타치온 생산효율 비교 Comparison of Glutathione Production Efficiency of Wild-type

상기 표 5의 배양배지 조건에서 배양시간은 72시간, 온도 32℃ 및 진탕배양 회전수는 200rpm 으로 조절하여 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형 균주를 배양하여 글루타치온 생산량을 측정하였다. 그 결과 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형 균주는 건조균체중량 g당 30mg에서 최대 52mg(건조균체량 대비 3.0~5.2%)의 글루타치온을 함유하는 것을 확인하였다. 이는 박진철 등이 J. Korean Soc. Agric. Chem. Biotechnol. 46(4), 348-352 (2003)에서 밝힌 Saccharomyces cerevisiae FF-8 균주의 생산량인 13mg/g(건조균체량 대비 1.3%)이나 대한민국 공개특허공보 10-2004-0014360에서 공개된 Saccharomyces cerevisiae NCYC 2958의 생산량인 27mg/g 내지 39mg/g(건조 상태에서 2.7~3.9%)에 비하여 상당히 높은 수치로 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형 균주의 글루타치온 생산효율이 공지 균주에 비하여 월등한 것을 확인하였다.In the culture medium conditions of Table 5, the culture time was adjusted to 72 hours, temperature 32 ℃ and shaking culture rotation speed to 200rpm to culture the Saccharomyces cerevisiae 54-8 wild-type strain was measured glutathione production. As a result, it was confirmed that Saccharomyces cerevisiae 54-8 wild-type strain contained glutathione from 30 mg up to 52 mg (3.0-5.2% of dry cell weight) per g of dry cell weight. Park Jin-cheol et al. J. Korean Soc. Agric. Chem. Biotechnol. Production of Saccharomyces cerevisiae FF-8 strain, 13 (mg) / g (1.3% of dry cell weight) as disclosed in 46 (4), 348-352 (2003) or Saccharomyces cerevisiae NCYC 2958 published in Korean Patent Publication No. 10-2004-0014360 It was confirmed that the glutathione production efficiency of the Saccharomyces cerevisiae 54-8 wild type strain was significantly higher than that of the known strain, compared to the production amount of 27 mg / g to 39 mg / g (2.7-3.9% in the dry state).

<실시예 3> <Example 3>

가축 사료 첨가제로서의 기능Function as a livestock feed additive

평균 10개월령 수컷 사슴(엘크)를 14두를 선정하여 그 중 7두에는 하기 표 6과 같은 성분 및 비율의 글루타치온을 함유하는 가축사료 첨가물을 매일 체중 kg 당 6mg 씩 일반사료에 섞어 급여하고 7두는 대조군으로 동일한 일반사료만을 급여하여 사육하였다. 이에 따른 체중 증가량 및 녹용생산량을 분석하였다. 체중은 6개월간 사육 개시일을 포함하여 총 4회 측정하였고 녹용생산량은 길이가 30cm 정도 자랐을 때 절각하여 생녹용 상태에서 전자저울로 그 무게를 측정하였다.An average of 10 male 10-year-old male deer (elk) were selected, and 7 of them were fed animal feed additives containing glutathione with the ingredients and ratios as shown in Table 6 below daily by mixing 6 mg / kg body weight with daily feed. As a control, only the same general feed was fed by breeding. The weight gain and antler production were analyzed. The body weight was measured four times, including the start date of breeding for six months, and the antler production amount was cut to 30cm in length, and the weight was measured by electronic scale in the state of live antler.

가축 사료 첨가제의 성분 및 비율Composition and proportions of livestock feed additives 성분ingredient 비율ratio glutathione(99%)glutathione (99%) 0.0420.042 감미제Sweetener 0.0200.020 밀겨Push 0.9380.938 소계sub Total 1.0001,000

실험결과 체중증가량 및 녹용생산량을 하기 표 8 및 9에 나타내었다.The results of the weight gain and antler production are shown in Tables 8 and 9 below.

실험대상 사슴의 출생일 및 체중변화Birth Date and Weight Change of Deer 시 험 구 Test strip 대 조 구Control 명호Name 생년월일date of birth 개시체중Initiation weight 1차체중Primary weight 2차체중Secondary weight 3차체중3rd body weight 명호Name 생년월일date of birth 개시체중Initiation weight 1차체중Primary weight 2차체중Secondary weight 3차체중3rd body weight 04월 19일April 19 06월 05일June 05 07월 18일Jul 18 10월 04일Oct 04 04월 19일April 19 06월 05일June 05 07월 18일Jul 18 10월 04일Oct 04 182182 2006-06-132006-06-13 156.6156.6 178.9178.9 196.5196.5 203.6203.6 163163 2006-05-292006-05-29 149.1149.1 168.4168.4 186.4186.4 203.5203.5 190190 2006-06-302006-06-30 105.8105.8 134.4134.4 155.3155.3 167.2167.2 191191 2006-07-092006-07-09 113.4113.4 136.9136.9 154.8154.8 176.2176.2 166166 2006-06-012006-06-01 145.1145.1 173.5173.5 198.7198.7 225.7225.7 189189 2006-06-302006-06-30 146.3146.3 169.7169.7 186.7186.7 203.3203.3 165165 2006-06-012006-06-01 119.2119.2 139.8139.8 155.1155.1 173.1173.1 192192 2006-07-182006-07-18 115.3115.3 142.6142.6 161.7161.7 174.6174.6 193193 2006-08-152006-08-15 143.0143.0 169.0169.0 189.5189.5 205.1205.1 184184 2006-06-182006-06-18 142.5142.5 162.2162.2 183.5183.5 199.5199.5 186186 2006-06-222006-06-22 131.0131.0 160.5160.5 175.3175.3 188.0188.0 169169 2006-06-042006-06-04 132.0132.0 146.3146.3 164.6164.6 176.8176.8 157157 2006-05-212006-05-21 133.7133.7 159.4159.4 177.4177.4 185.9185.9 171171 2006-06-042006-06-04 135.1135.1 157.5157.5 175.2175.2 180.0180.0 평 균Average 133.49133.49 159.36159.36 178.26178.26 192.66192.66 평 균Average 133.39133.39 154.80154.80 173.27173.27 187.70187.70 편 차Deviation 17.0117.01 16.7416.74 18.0318.03 20.2720.27 편 차Deviation 14.3114.31 12.9812.98 12.9812.98 13.6313.63

글루타치온을 함유하는 가축사료 첨가물 투여구와 비 투여구의 체중 측정 결과Body Weight Measurement Results of Glutathione-Containing Animal Feed Additives 대조구Control 시험구Test 체중(kg)Weight (kg) 일당 증체량(kg)Daily weight gain (kg) 체중(kg)Weight (kg) 일당 증체량(kg)Daily weight gain (kg) 개시시(4/19)At the start (4/19) 133.4±14.3133.4 ± 14.3 133.5±17.0133.5 ± 17.0 1.5 개월(6/05)1.5 months (6/05) 154.8±13.0154.8 ± 13.0 0.460.46 159.4±16.7159.4 ± 16.7 0.550.55 3개월(7/18)3 months (7/18) 173.3±13.0173.3 ± 13.0 0.430.43 178.3±18.0178.3 ± 18.0 0.440.44 5.5개월(10/04)5.5 months (10/04) 187.8±13.6187.8 ± 13.6 0.180.18 192.7±20.3192.7 ± 20.3 0.180.18

글루타치온을 함유하는 가축사료 첨가물 투여구와 비 투여구의 녹용생산량 측정 결과Determination of Deer Antler Production in Animal Feed Additive Containing and Non-Glutathione Containing Glutathione 구 분division 대조구Control 시험구Test 녹용생산량(g)Deer Antler Production (g) 911±256911 ± 256 1066±3571066 ± 357 비율(%)ratio(%) 100100 117117

그 결과, 상기 표 8 및 표 9에서 보는 바와 같이 대조구 및 글루타치온 급여구의 체중 증가량은 두당 각각 39.8, 44.9kg으로, 글루타치온 급여구가 대조구보다 체중증가량이 2.9% 높은 것을 확인하였다. 녹용생산량에 있어서는 대조구와 글루타치온 급여구가 각각 911± 256g 및 1066± 357g으로 글루타치온 급여구가 155g 많았다. 즉, 글루타치온 급여구의 녹용이 비 급여구에 비하여 굵어지고 무거워 약 17%의 녹용생산증가 효과를 나타내는 것을 확인하였다. As a result, as shown in Table 8 and Table 9, the weight gain of the control and glutathione fed diet was 39.8 and 44.9 kg per head, respectively, and it was confirmed that the weight gain of glutathione fed diet was 2.9% higher than that of the control. In antler production, control and glutathione fed diets were 911 ± 256g and 1066 ± 357g, respectively, and glutathione fed diets were 155g. That is, it was confirmed that the antler of the glutathione feeding group was thicker and heavier than the non-paying group, which increased the antler production of about 17%.

글루타치온 급여에 따른 경제성을 분석할 경우 글루타치온 급여구가 두당 약 38,450원 정도의 경제적 이익을 발생시킨다.When analyzing the economics according to glutathione salary, the glutathione salary generates about 38,450 won per head.

이는 글루타치온이 강력한 항산화제로서 기능하기 때문에 글루타치온이 급여된 가축의 경우 산화적 스트레스 저감을 통하여 생산성이 향상됨을 실험적으로 입증한 것이다.This proved experimentally that glutathione enhanced productivity by reducing oxidative stress because glutathione acts as a powerful antioxidant.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형은 종래 균주에 비하여 고효율의 글루타치온을 생산할 수 있을 뿐만 아니라 이에 의한 배양물은 적은 비용으로 가축의 생장을 매우 증진시켜 가축농가의 경제성 및 생산성을 월등히 증대시킬 수 있어 산업적으로 활용 가치가 매우 크다.As described above, the Saccharomyces cerevisiae 54-8 wild type of the present invention not only can produce high-efficiency glutathione compared to the conventional strain, but the culture thereby greatly improves the growth of livestock at low cost, thereby improving the economics and productivity of the livestock farm. As it can be greatly increased, it is very useful industrially.

Claims (4)

글루타치온(glutathione)을 고발현하는 것을 특징으로 하는 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형(기탁번호 KACC 93069P) 또는 이의 균주 배양물. Saccharomyces cerevisiae 54-8 wild type (Accession No. KACC 93069P) or a strain culture thereof, characterized by high expression of glutathione. 삭제delete 제1항에 따른 Saccharomyces cerevisiae 54-8 야생형 배양물로부터 글루타치온을 분리하는 단계를 포함하는 글루타치온 생산방법.Glutathione production method comprising the step of separating the glutathione from Saccharomyces cerevisiae 54-8 wild-type culture according to claim 1. 제1항의 배양물 또는 이로부터 분리한 균주 자체 또는 이들로부터 분리한 글루타치온을 포함하는 가축 사료 첨가용 조성물.The culture of claim 1 or the composition for animal feed comprising a glutathione isolated from them or the strains isolated therefrom.
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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KR102222210B1 (en) * 2019-10-29 2021-03-05 씨제이제일제당 주식회사 Novel strain and a method of producing glutathione using thereof

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Korean J. Biotechnol. Bioeng., Vol.19, No.3, pp.192~199 (2004). *
김춘광 & 이종일, 효모에 의한 글루타치온의 생산과 공정 모니터링, 한국생물공학회지, 제19권, pp.192-199. (2004.12.31.) *
김춘광 & 이종일, 효모에 의한 글루타치온의 생산과 공정 모니터링, 한국생물공학회지, 제19권, pp.192-199. (2004.12.31.)*

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101612421B1 (en) 2013-12-18 2016-04-14 (주)푸른들이엠사료 Novel Yeast Overproducing Glutathione and Method for Glutathione Overproduction by Using it

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