KR101155306B1 - 유기용매 전처리에 의한 바이오매스에 대한 효소가수분해 개선방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유기용매 전처리에 의한 바이오매스 특히 리그닌 물성 변화를 유도시켜 효소가수분해 소화율을 개선하기 위한 것이다. 본 발명은 목질계 바이오매스를 대상으로 유기용매 전처리 단계 및 효소가수분해 단계를 포함하여 구성되는, 유기용매 전처리에 의한 바이오매스에 대한 효소가수분해 개선방법에 관한 것이며, 본 발명에 의하면, 바이오매스 특히 목질계 바이오매스의 리그닌의 구조적, 형태학적 변화를 통하여 유효기공의 증가가 달성되어 효소가수분해를 개선시킬 수 있고, 이에 따라 가수분해 생성물의 수율을 높일 수 있다.

유기용매 전처리, 효소가수분해, 리그닌 방울, 유효기공

Description

유기용매 전처리에 의한 바이오매스에 대한 효소가수분해 개선방법{Method for improving enzyme hydrolysis on the biomass by orgainc solvent pretreatment}

본 발명은 유기용매 전처리에 의한 바이오매스에 대한 효소가수분해 개선방법에 관한 것이고, 특히 바이오매스의 물성 변화를 유발시켜 효소가수분해 효율을 높이기 위한 방법에 관한 것이다.

여러 환경적, 경제적인 문제로 인해 기존 화석연료에서 얻어지던 연료를 대체할 수 있는 재생가능한 바이오매스로부터 생산되는 대체 연료에 대한 관심이 증가하고 있다 (Mosier et al., 2005). 대체 연료는 에탄올, 메탄올, 바이오디젤 등의 형태로 연구되어 왔으며, 이 중에서도 바이오매스로 얻어지는 에탄올 (바이오에탄올)에 대한 많은 연구 및 관심이 집중되고 있다 (Sun and Cheng, 2002). 또한 바이오에탄올은 개솔린을 대체할 수 있는 친환경 연료일 뿐만 아니라 최근 환경오염 문제로 사용이 제한되고 있는 연료 첨가제, MTBE를 대체할 수 있어 가치 및 관심이 더욱 높아지고 있다 (Browner, 2000). 현재의 바이오에탄올 생산 1위국인 미국에서는 주로 전분질계 바이오매스인 옥수수를 생산 원료로 사용하고 있다. 하지만 전분질계 바이오에탄올이 갖고 있는 다양한 문제들-식량자원과의 경쟁 (Gray et al., 2006), 낮은 환경 개선 효과 (Fulton et al., 2004), 낮은 기술 개발 향상 가능성 (Ingram and Doran, 1995)-등으로 인해 목질계 바이오매스를 원료로 하는 목질계 바이오에탄올로 연구방향이 전환되고 있다. 그러나, 목질계 바이오에탄올의 경우 원료인 목질계 바이오매스의 구조적인 특징, 즉 원료로 사용가능한 셀룰로오스가 헤미셀룰로오스와 리그닌으로 둘러싸여 있어 미생물의 접근이 제한되는 특성으로 인해 이를 개선하기 위한 전처리 공정이 반드시 필요하다. 그리고 이를 위해 효과적인 전처리 공정 개발을 위한 다양한 연구가 진행되고 있다. 하지만 기존의 전처리 연구들은 corn stover와 같이 상대적으로 리그닌 함량이 낮은 바이오매스에 여러 공정을 적용함으로써 얻어지는 당화 수율의 향상에 초점을 맞춰왔다. 그러나 각기 물성이 다른 다양한 바이오매스에 적합한 맞춤형 전처리 공정의 개발을 위해서는 전처리 반응 기작의 이해가 중요하며, 이를 위해 당화 효소의 접근성에 영향하는 주요 전처리 인자들의 제어가 필수적이다. 주요 전처리 인자로는 리그닌, 헤미셀룰로오스, 결정화도 등이 알려져 왔으며, 특히 많은 연구자들이 리그닌을 주요 당화 효소 영향 인자로 가정하고 리그닌 제거를 통한 당화 수율 향상에 관한 많은 연구가 진행되었다.

본 발명은 유기용매 전처리에 의한 바이오매스 특히 리그닌 물성 변화를 유도시켜 효소가수분해 소화율을 개선하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 목질계 바이오매스를 대상으로 유기용매 전처리 단계 및 효소가수분해 단계를 포함하여 구성되는, 유기용매 전처리에 의한 바이오매스에 대한 효소가수분해 개선방법을 제안하는 것이다. 한정적이지는 않지만, 본 발명은 유기용매로는 1% (w/w) 황산이 촉매로 적용된 50% (v/v) 에탄올을 사용하여, 120 내지 140℃를 반응온도로 처리되는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 유기용매 전처리 단계는 약 10분간 전처리 되는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 목질계 바이오매스는 리그닌인 것을 특징으로 하며, 특히 리그닌은 백합나무 리그닌인 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명은 목질계 바이오매스를 대상으로 유기용매 전처리 단계 및 효소가수분해 단계를 포함하여 구성되는, 리그닌의 구조적 변화를 통한 목질 바이오매스 유효 기공 증가 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 의하면, 바이오매스 특히 목질계 바이오매스의 리그닌의 구조적, 형태학적 변화를 통하여 유효기공의 증가가 달성되어 효소가수분해를 개선시킬 수 있으며, 이에 따라 가수분해 생성물의 수율을 높일 수 있다.

1. 공시 재료

경기도 남양주시 산림청 산림인력개발원으로부터 20년생 백합나무 (Liriodendron tulipifera)를 제공받아 이를 실험용 분쇄기를 이용, 40 mesh 이하의 목분으로 제조하여 공시 재료로 사용하였다. 공시재료의 함수율은 10% 이하로 유지되었으며, 초기 백합나무의 화학조성은 글루칸 41.1%, 자일란 21.2%, 아라비난 2.5%, 만난 0.2%, 갈락탄 0.9%, 산불용성 리그닌 21.4%, 산가용성 리그닌 2.1%, 회분 0.3%, 추출물 4.2%로 확인되었다.

2. 유기용매 전처리 공정

유기용매 전처리를 위하여 스테인리스 스틸 (SUS 316)로 제작된 500ml 반응기를 이용하였다. 내부의 압력 유지를 위해 바이톤 링 시스템이 적용되었으며 온도 센서가 삽입되어 실제 반응온도를 측정하였다.

유기용매로는 1% (w/w) 황산이 촉매로 적용된 50% (v/v) 에탄올을 사용하였다. 공시 재료 20 g과 용매 200 ml를 반응기에 투입하고 120, 130, 140℃를 반응온도로 하여 40분간 예열한 후 10분간 전처리를 실시하였다. 각각의 목표 온도에 대한 H-factor는 2.4, 6.7, 11.9 (Gullichsen and Fogelholm, 1999)였으며, 전처리 후 반응기를 30분간 아이스챔버에 담가 전처리된 바이오매스를 상온까지 냉각시켰다. 전처리된 바이오매스는 증류수를 이용하여 여과액의 색변화가 없을 때까지 세척을 실시하고, glass filter (2G; Iwaki, Japan)를 이용하여 고체상 분획과 액체상 분획으로 분리하였고, 고체상 분획을 이용한 분해율 측정, 효소가수분해 및 다양한 물성 분석을 실시하였다.

3. 효소 가수분해 공정

전처리된 바이오매스의 효소가수분해를 위해 상용 효소인 Celluclast 1.5L (Novo Co.)와 β-glucosidase 강화 효소인 Novozym 188 (Novo Co.)을 사용하였다. Celluclast 1.5L와 Novozym 188의 효소활성도는 각각 74 IU/ml, 250 CBU/ml이었고, 250ml 삼각플라스크에 각 조건에서 전처리된 시료와 효소를 pH 5.0으로 조절된 50 mM의 sodium acetate 완충액 100 ml에 넣고 50℃, 150rpm으로 조절된 진탕배양기를 이용하여 효소가수분해를 실시하였다.

실험예

1. 효소가수분해 소화율

단당류 수율 측정을 위해 효소가수분해 시작 후 6, 12, 24, 48, 72 시간에 당분석 샘플을 채취하였고, 동일한 과정을 미처리 바이오매스 (control)에 대하여도 실시하였다. 단당류 수율은 전처리된 바이오매스의 글루코오스와 자일로스 함량 대비 효소가수분해 후 생성된 글루코오스와 자일로스의 함량을 백분율로 계산하였다. 글루코오스와 자일로스 함량은 BioRad (Hercules, CA) Aminex HPX-87H 컬럼 (300 ㅧ 7.8 mm, 5μm)이 장착된 HPLC (HP1100, Hewlett Packard, USA)를 이용하여 40˚C에서 이동상으로 5 mM 황산을 0.5 ml/min의 속도로 이동시켜 측정하였고, 샘플의 주입량은 10 μl였다. 또한 검출기로는 refractive index detector (HP 1100, Hewlett Packard, USA)가 정량 계산을 위해 사용되었다. 효소가수분해 소화율은 효소가수분해 시작후 72시간이 지난 후 남겨진 잔사의 무게를 이용하여 계산하였다.

2. 화학조성

전처리된 바이오매스의 산불용성 리그닌, 산가용성 리그닌, 구성당 분석은 NREL Chemical Analysis and Testing Standard Procedures을 이용하여 측정하였다 (NREL, 2005).

3.현미경 분석

전처리된 바이오매스의 형태학적 변화를 살펴보기 전계방출 주사전자 현미경 (field-emission scanning electron microscopy, SUPRA 55VP, Carl Zeiss, Germany) 을 이용한 현미경 분석이 실시되었다. 현미경 분석을 위해 전처리된 시료는 동결건조 되어졌으며, 동결건조된 시료는 카본 테이프를 이용하여 알루미늄 스텁에 고정시켜졌다. 시료의 전자 간섭을 감소시키기 위해 백금코팅이 실시되어졌고, 현미경 분석은 3 kV의 전압에서 실시되었다 (Donohoe et al., 2008).

4. 유효기공 분포 및 BET 비표면적

전처리된 바이오매스의 유효기공 분포와 BET (Brunauer Emmett Teller) 비표면적은 기공분석기 (ASAP 2010, Micromeritics, USA)를 이용하여 실시되었다 (Lee et al., 2003). 기공 분포는 BJH (Barrett-Joyner-Halenda) 방법에 의한 탈착 등온선을 이용하여 계산되었으며, 총 기공 분포는 p/p_o=0.975에서 계산되었다.

5. 효소 흡착

효소가수분해 초기 효소 흡착률 계산은 쿠마르 등이 제시한 방법을 이용해 측정되었다(Kumar and Wyman, 2008). 효소 흡착을 위해 50 mM acetate buffer와 1% 바이오매스, 45 IU/g 바이오매스의 상용효소 (Celluclast 1.5L, Novozymes, Denmark)를 50ml 테스트 튜브에 넣고 4˚C에서 8시간 반응시켰다. 반응이 평형상태에 이르면 테스트 튜브를 원심분리하여 buffer를 제거하고, 질소 분석을 위해 105˚C에서 고온 건조하였다. 효소 흡착량 계산은 기질에 흡착된 단백질 함량을 측정함으로써 계산되었고, 단백질 함량은 원소분석기 (Flash EA 1112, Thermo Electron Corporation, USA)를 이용한 질소 함량 측정을 통해 이루어졌다. 효소 흡착률 계산은 다음과 같다.

효소 흡착률 (Wt %) = (N_enzyme / W_biomass)*100

* N_enzyme = 효소 흡착에 의한 질소 흡착량 (g)

* W_biomass = 바이오매스 전건 중량 (g)

본 발명에 의한 평가는 다음과 같이 수행되었다.

1. 화학 조성 및 효소가수분해 소화율 비교 평가

백합나무의 전처리는 120˚C, 130˚C, 140˚C에서 각각 수행되었고, 각각의 전처리 후에 얻어진 고체상 분획에 대한 화학 조성의 변화를 조사하였다. 주요 구성당인 글루칸과 자일란의 함량과 리그닌 함량이 각각 조사되었다 (표 1).

전처리 온도가 증가함에 따라 리그닌 및 자일란의 분해가 진행되었고, 따라서 이들의 함량 감소가 확인되었다. 리그닌과 자일란의 분해는 바이오에탄올 생산의 주원료인 글루칸 함량을 상대적으로 증가시켰다.

리그닌 함량의 경우 촉매로 사용된 산으로 인해 산가용성 리그닌의 함량은 감소하였지만 산불용성 리그닌 함량이 유지되고, 자일란 함량이 큰 폭으로 감소함으로써 전체 리그닌 함량은 20% 이상으로 유지되었다. 이러한 리그닌 함량의 결과는 산촉매를 사용한 유기용매 전처리가 리그닌 함량을 크게 감소시킨다고 보고한 종래의 유기용매 전처리 연구 결과와는 상이한 결과였다 (Pan et al., 2006).

본 발명에서 실시된 전처리에 의한 탈리그닌 효과는 크지 않았지만 효소가수분해에 의한 소화율은 미처리재와 비교하였을때 큰 폭으로 증가하였다 (도 1). 이러한 결과는 앞서 발표된 연구들의 결과, 즉 효소가수분해에 가장 큰 영향을 주는 전처리 인자는 리그닌 함량이라는 보고와는 매우 상이한 결과였다 (Converse, 1993; Gould, 1984; Yoshida, 2008). 즉, 본 발명은 리그닌 함량만으로 리그닌과 효소 가수분해와의 상관 관계를 설명하는 것은 불충분하다는 것을 제시하며, 리그닌 함량을 유지시키면서도 효소 가수분해 소화율을 개선할 수 있음을 제안하고 있다. 특히 효소가수분해에 의한 소화율은 전처리 온도가 120˚C에서 130˚C로 증가할 때 가장 큰 폭으로 향상되었고, 상기 온도 범위에서 리그닌 관련 물성 변화가 시작된다고 판단된다.

2. 효소가수분해에 의해 생성된 발효가능한 단당류 수율 평가

효소가수분해를 통해 전처리된 바이오매스로부터 발효가능한 단당류를 획득하고 그 수율을 측정하였다 (도 2). 모든 조건에서 미처리 바이오매스보다 높은 단당류 수율을 얻을 수 있었다.

최대 단당류 수율은 140˚C로 전처리된 바이오매스를 72시간동안 효소가수분해 하였을때 얻었으며, 바이오매스 구성당 대비 90.4%로 확인되었다. 또한 발효가능한 단당류의 대부분이 48시간 안에 생성되었고, 유기용매 전처리된 바이오매스의 효소가수분해를 위해서는 48시간의 가수분해 시간이면 충분하다고 평가되었다. 120˚C와 130˚C 사이의 온도범위에서 확인된 급격한 단당류 수율의 증가는 백합나무의 유기용매 전처리를 위한 임계온도가 이 범위내에 있다는 것을 제시해주었다.

3. 전계방출 주사전자 현미경에 의한 현미경 분석

앞서 확인된 120˚C와 130˚C 사이에서의 효소가수분해 소화율과 단당류 수율의 급격한 증가는 리그닌 물성 변화에 기인한 것으로 판단되었다. 리그닌 물성 변화는 리그닌의 이동 및 재배치를 유발함으로써 유효기공 분포와 같은 다른 물성에 영향을 줄 수 있다고 보고되었고, 특히, 리그닌 재배치는 바이오매스의 형태학적 변화를 통해 효소가수분해에 영향을 준다고 보고되었다 (Donohoe et al., 2008). 따라서 백합나무의 유기용매 전처리를 통해 발생하는 리그닌 배치의 변화를 확인하기 위해 전계방출 주사전자 현미경을 이용하여 현미경적 분석을 실시하였다 (도 3).

미처리재의 표면은 매근하고 단단한 형태를 나타내었고 (a), 이러한 표면 구조는 효소의 접근 및 흡착을 저해함으로써 효소 가수분해율을 떨어뜨릴 것으로 사료되었 다. 하지만 120˚C로 전처리된 바이오매스에서는 표면의 거칠기가 증가하였고 (b), 이는 가수분해 초기 효소의 흡착률을 향상시킬 것으로 평가되었다.

전계방출 주사전자 현미경 분석 결과 120˚C로 전처리된 바이오매스 표면에서 물방울 형태의 구조가 관찰되었다. 물방울 구조는 전처리를 통해 리그닌-탄수화물 복합체부터 분리되어 표면으로 이동 및 재배치된다고 보고된 리그닌 방울과 비슷한 형태를 나타내었다 (Donohoe et al., 2008; Micic et al., 2001). 이러한 방울 형태의 구조는 전처리 온도가 상승된 130˚C 및 140˚C로 전처리된 바이오매스에서 더 쉽게 관찰되었다 (c, d). 따라서 관찰된 방울 형태의 구조는 리그닌 방울이라고 판단되었으며, 이에 대한 검증은 하기에서 별도로 실시되었다.

리그닌 방울들은 리그닌의 소수성으로 인해 응집하여 표면에 부착되어 있는 형태로 관찰되었다. 즉, 전처리 과정을 통해 분리 및 이동된 리그닌의 상당량이 제거될 수 있지만 제거되지 않은 많은 양의 리그닌이 분리 및 이동하여 표면에 부착된 형태로 존재하게 된다. 표면에 부착된 리그닌 방울들은 리그닌 함량에 영향을 주게되고, 따라서 앞서 확인된 것처럼 전처리된 바이오매스의 리그닌 함량이 20% 이상으로 유지되게 된다. 이와함께 120˚C로 전처리된 바이오매스 표면에서는 리그닌 방울과는 다른 형태의 반구 형태의 돌출도 관찰되었고, 이들은 분리된 리그닌이 표면으로 이동 중인 형태로 사료되었다. 즉 본 연구에서 실시된 유기용매 전처리에 의해 백합나무의 리그닌은 120˚C 이하의 온도에서 리그닌-탄수화물 복합체로부터 분리 및 이동되기 시작하지만 이동이 완료되지는 않는다고 판단되었다.

130˚C로 전처리된 바이오매스에서는 전처리 온도가 증가함에 따라 리그닌의 분리 및 이동이 활발해져, 리그닌 방울의 양이 증가하고, 응집 그룹의 크기가 커짐을 확인하였다 (c). 하지만 여전히 바이오매스 표면에 부착된 형태로 존재하게 되고, 따라서 리그닌 함량은 큰 변화없이 유지되게 된다. 바이오매스 표면의 반구형태의 돌출은 더이상 관찰되지 않는데, 이는 분리된 리그닌의 대부분이 표면으로 이동을 완료하였기 때문이다. 분리 및 이동하여 표면으로 재배치된 리그닌으로 인해 바이오매스의 유효기공은 증가할 것으로 사료되며, 따라서 효소가수분해율 역시 향상되게 된다. 140˚C로 증가된 전처리 온도는 추가적인 리그닌 분리 및 이동을 발생시킴으로써, 응집된 리그닌 방울의 밀도를 증가시켰다 (d). 따라서, 유효기공은 더욱 증가할 것으로 사료되며, 이로 인해 효소가수분해 효율 역시 더욱 증가하게 된다.

4. 전처리된 바이오매스의 유효기공 분포 분석

전처리된 바이오매스의 유효기공 분포를 증가시킬 수 있는 리그닌의 분리, 이동 및 재배치가 현미경 분석을 통해 관찰되어졌다. 이러한 구조적, 형태학적 변화는 최종적으로는 효소가수분해를 향상시킬 수 있다고 보고되었다 (Grous et al., 1986). 이러한 가설을 증명하기 위해, 실제 전처리된 바이오매스의 유효기공 분포가 분석되었다. 또한 유효기공 분포와 효소가수분해 소화율과의 상관관계 역시 조사되었고 (도 4) 리그닌의 구조적인 변화로 인한 유효기공의 증가는 백합나무의 유기용매 전처리 공정에 있어서 중요한 전처리 인자라고 판단되었다.

5. BET 비표면적과 가수분해 초기 효소 흡착률 비교

유효기공의 증가는 바이오매스의 비표면적 및 효소 흡착률을 향상시킬 것으로 가정되므로, 이를 증명하기 위해 130˚C에서 전처리된 바이오매스와 미처리재에 대한 비표면적 및 효소흡착률이 BET 방법과 (Lee et al., 2003) Kumar법으로 측정되어 (Kumar and Wyman, 2008) 비교되었다. 물론 BET 비표면적의 측정은 질소의 흡착 및 탈착이 가능한 모든 비표면적을 측정하기 때문에 실제 효소에 유효한 유효 비표면적과는 차이가 날 수 있다. 하지만 BET 비표면적의 결과 역시 전처리에 의한 유효 비표면적의 증가를 제시해줄 수 있다고 판단되어 본 분석 방법이 사용되었다.

유효기공의 증가로 인한 전처리된 바이오매스의 BET 비표면적의 증가가 확인되었으며, 미처리재와 비교하였을때 약 3배 이상 증가하는 것으로 확인되었다 (표 2).

초기 효소 흡착률 역시 전처리에 의해 크게 증가하였다. 130˚C에서 전처리된 바이오매스의 효소 흡착률은 0.31 wt%로써 미처리재와(0.06 wt %) 비교하였을때 5배 이상 증가하는 모습을 확인할 수 있었다. 즉 전처리에 의해 발생하는 리그닌의 구조적, 형태학적 변화가 바이오매스내의 유효기공 및 비표면적을 증가시키고, 이로 인해 초기 효소흡착량이 증가하는 것으로 사료되었다. 하지만 효소 흡착률의 향상은 다른 인자들에 의해서도 영향을 받을 수 있다 (Meunier-Goddik et al., 1999).

이러한 평가를 통해 백합나무의 산촉매 유기용매 전처리 공정에서 효소가수분해에 영향을 주는 가장 중요한 바이오매스의 물성 변화, 즉 전처리 인자는 유효기공의 변화라고 결론되어졌다.

6. 전처리에 의한 결정화도 변화와 효소가수분해에 미치는 영향 평가

셀룰로오스의 결정 영역은 비결정 영역에 비해 가수분해 효소의 접근이 어렵기 때문에 대부분의 전처리 연구들이 셀룰로오스 결정화도를 중요한 전처리 인자로 보고하였다. 실제 결정화도가 감소함에 따라 소화율이 증가한 다수의 연구 결과가 보고되었고 (Fan et al., 1981; Laureano-Perez et al., 2005), 이러한 연구 결과들로 인해 결정화도는 효소 가수분해를 저해하는 전처리 인자로 간주되어 왔다 (Grohmann et al., 1989). 하지만 이와는 반대로 결정화도와 효소가수분해와의 관계를 하나의 상관관계로 설명하는 것은 어렵다는 연구들 역시 보고되고 있다 (Chang and Holtzapple, 2000; Han and Callihan, 1974; Rivers and Emert, 1988). 이렇게 결정화도와 효소가수분해와의 상관관계에 다양한 가설이 존재하는 것은 바이오매스내의 셀룰로오스 결정화도는 비결정영역에 대한 결정영역의 상대적인 결과로밖에 측정할 수 없기 때문이다. 본 발명에서 전처리된 바이오매스의 상대 결정화도 역시 헤미셀룰로오스와 비결정성 셀룰로오스의 분해로 인해 증가하는 결과를 나타냈다 (표 3). 즉, 산촉매 유기용매 전처리의 비결정영역에 대한 선택적인 분해로 인해 결정화도가 상승하였지만, 결정화도의 증가에도 불구하고 효소가수분해 소화 율은 큰 폭으로 향상되었다. 따라서 목질 바이오매스의 셀룰로오스 상대 결정화도와 효소가수분해와의 상관관계를 규정하는 것은 어렵다고 판단되었다.

7. 리그닌 방울의 검증 및 리그닌 방울이 효소가수분해에 미치는 영향 평가

상기와 같이 바이오매스의 표면에서 관찰된 방울들은 리그닌 방울과 유사한 형태로 인해 리그닌 방울로 간주되었다. 하지만 이에 대한 검증이 실시되어야 하며, 따라서 다음과 같은 다양한 분석이 실시되었다.

먼저 분석을 위하여 표면에 다수의 방울들이 관찰된 130˚C로 전처리된 바이오매스를 이용하여 방울의 수거를 시도하였다. 유기용매 전처리 공정은 설파이트 펄핑공정과 유사하다고 알려져 있고, 실제 펄핑 공정에서 설파이트 펄프의 블리칭을 위해 수산화나트륨을 사용하고 있다 (Sjㆆstrㆆm, 1981). 그러므로 본 연구에서는 1% 수산화나트륨 수용액을 이용한 세척 여과를 통해 방울의 제거를 시도하였다. 방울의 제거 공정은 수산화나트륨 수용액으로 인한 바이오매스내 리그닌의 영향을 최소화하기 위하여 블리칭 과정과는 다르게 상온에서 실시되었다. 세척 공정후에 제거된 방울들의 분리를 위해 세척 용액의 pH를 0.1N 염산을 이용하여 2로 조절하여 침전물을 발생시켰다. 발생된 침전물은 원심분리를 통해 수거되었으며, 이렇게 획득된 방울들의 리그닌 방울로서의 검증을 위해 리그닌 함량 분석, ¹³C NMR 분석, 전계방출 주사전자 현미경을 이용한 현미경 분석이 실시되었다. 또한 방울이 제거된 전처리된 바이오매스의 효소가수분해를 실시함으로써 방울이 효소가수분해에 미치는 영향을 확인하였다.

수거된 방울들의 산불용성 리그닌 및 산가용성 리그닌 함량은 각각 83.18%와 15.16%로 나타났고, 98% 이상의 높은 리그닌 함량은 방울의 대부분이 리그닌으로 구성되었음을 제시해주었다. 또한 ¹³C NMR 스펙트럼 (도 5)에서 확인된 시나필 알코올의 β-o-4 결합 피크 (152, 105 ppm)와 메톡실 피크 (57 ppm)는 전처리된 바이오매스 표면에 위치한 방울들이 리그닌 방울임을 다시 한번 확인해주었다.

리그닌 방울의 검증을 통해 전술한 것처럼 유기용매 전처리 공정은 리그닌-탄수화물 복합체로부터 리그닌의 분리 및 이동을 발생시키고, 이러한 리그닌의 변화는 바이오매스의 형태학적, 구조적 변화를 야기함으로써 유효기공분포를 증가시키고, 효소가수분해를 향상시키는 것으로 판단되었다. 하지만 리그닌은 가수분해효소와의 비가역적 흡착을 통해 효소가수분해를 저해하는 것으로 알려져 있다 (Lee et al., 1995; Yang and Wyman, 2006). 따라서, 전처리된 바이오매스의 표면에 위치한 리그닌 방울 역시 효소가수분해를 저해할 수 있고, 이에 대한 확인과정이 필요할 것으로 판단되었다. 이에 따라 먼저 세척과정을 거친 전처리된 바이오매스의 현미경 분석 및 리그닌 함량 분석을 통해 리그닌 방울의 제거를 확인하였다. 수산화나트륨 수용액 세척 공정은 리그닌 방울의 양 및 응집그룹의 크기를 감소시켰다 (도 6). 이렇게 리그닌 방울들이 제거됨에 따라, 바이오매스 표면에 방울의 제거 흔적이 확인되었다. 또한 리그닌 방울의 제거는 리그닌 함량에도 영향을 미쳐 세척 공정 전 22.5%의 리그닌 함량이 세척 공정 후 16.7%로 큰 폭으로 감소하는 것이 확인되었다. 이상과 같은 현미경적 분석과 리그닌 함량 분석을 통해 전처리된 바이오매스로부터 리그닌 방울의 제거를 확인하였고, 리그닌 방울이 효소가수분해에 미치는 영향을 확인하기 위해 리그닌 방울이 제거된 바이오매스의 효소가수분해를 실시하였다. 리그닌 방울 제거 공정은 표 4에서 보는 것처럼 효소가수분해 소화율을 약 60%에서 77% 이상으로 큰 폭으로 증가시켰고, 따라서 리그닌 방울은 리그닌과 마찬가지로 효소가수분해를 저해시키는 것으로 사료되었다.

정리하면, 유기용매 전처리에 의한 백합나무의 탈리그닌율은 높지 않았지만, 효소가수분해 소화율은 급격하게 증가하였다. 이러한 결과는 리그닌 함량만으로 리그닌과 효소가수분해와의 상관관계를 설명하는 것은 불충분하다는 사실을 제시해주었다. 효소가수분해에 의해 생성된 발효가능한 단당류의 최대 수율은 140˚C로 전처리된 바이오매스에서 얻어졌다. 효소가수분해에 의해 얻어진 발효가능한 단당류 수 율과 소화율의 결과를 통해 백합나무의 효소가수분해 효율을 급격하게 향상시키는 유기용매 전처리 임계온도는 120˚C와 130˚C사이에 존재하는 것으로 확인되었다.

전계방출 주사전자 현미경에 의한 현미경 분석 결과, 유기용매 전처리에 의해 리그닌-탄수화물 복합체로부터 분리된 리그닌은 바이오매스 표면으로 이동, 재배치되는 것으로 확인되었다. 표면으로 이동된 물방울 형태의 리그닌 방울은 응집하여 표면에 부착된 형태로 관찰되었으며, 이러한 리그닌의 구조적, 형태학적 물성 변화는 바이오매스의 유효기공 및 비표면적을 증가시킴으로써 효소가수분해 효율을 향상시키는 것으로 판단되었다. 따라서, 리그닌의 구조적, 형태학적 변화에 의한 유효기공의 증가가 유기용매 전처리 공정에서 효소가수분해에 가장 큰 영향을 주는 중요 전처리 인자라고 결론지어졌다.

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도 1은 리그닌 함량과 효소가수분해 소화율을 도시한 것이다.

도 2는 효소가수분해에 의해 생성된 발효가능한 단당류 수율을 보인다.

도 3은 전계방출 주사전자 현미경에 의한 백합나무 미처리재 및 전처리된 바이오매스의 표면 형태 구조 관찰도. a: 미처리 바이오매스; b: 120˚C에서 전처리된 바이오매스; c: 130˚C에서 전처리된 바이오매스; d: 140˚C에서 전처리된 바이오매스.

도 4는 전처리에 의한 바이오매스내 유효기공분포 변화를 보이는 그래프이다.

도 5는 수거된 방울의 ¹³C NMR 스펙트럼이다.

도 6은 수산화나트륨 세척공정에 의한 전처리된 바이오매스로부터 리그닌 방울의 제거된 현미경 사진이다. a: 세척전 전처리된 바이오매스 (130˚C); b: 세척 후 전처리된 바이오매스 (130˚C).

Claims (6)

1. 20 중량% 이상의 리그닌 함량을 포함하는 목질계 바이오매스를 대상으로, 리그닌의 소수성을 이용하여 리그닌-탄수화물 복합체부터 리그닌을 분리하여 이동시키는 유기용매 전처리 단계를 통하여 목질계 바이오매스로부터 소수성 리그닌 방울을 제거하여 목질계 바이오매스에 대한 효소가수분해를 개선하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 유기용매로는 1% (w/w) 황산이 촉매로 적용된 50% (v/v) 에탄올을 사용하여, 120 내지 140℃를 반응온도로 처리되는 것을 특징으로 하는, 목질계 바이오매스에 대한 효소가수분해를 개선하는 방법.
3. 제2항에 있어서, 유기용매 전처리 단계는 10분간 전처리 되는 것을 특징으로 하는, 목질계 바이오매스에 대한 효소가수분해를 개선하는 방법.
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제

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