KR101147228B1

KR101147228B1 - 소 수정란의 체외 생산 방법

Info

Publication number: KR101147228B1
Application number: KR1020100023912A
Authority: KR
Inventors: 김소섭; 이용욱; 박용수; 최규명
Original assignee: 주식회사 젠닥스; 광개토한우농업법인 주식회사
Priority date: 2010-03-17
Filing date: 2010-03-17
Publication date: 2012-05-17
Also published as: KR20110104801A

Abstract

본 발명은 공란우로부터 난소 조직 및 난자를 채취하여 개체별로 보관하고, 상기 난자를 개체별로 체외 성숙, 체외 수정 및 체외 배양하고, 상기 체외 수정된 수정란과 상기 공란우의 DNA를 검사하여 공란우와 수정란의 동일성을 확인하여 생식세포의 동일성이 유지되는 수정란의 배양방법에 있어서, 상기 체외 수정된 수정란의 DNA를 검사하는 것은 수정일로부터 0 내지 10일의 생식세포를 채취하여 이루어지는 수정란의 체외 생산 방법을 제공한다.

Description

소 수정란의 체외 생산 방법{In vitro production method for bovine embryos}

본 발명은 수정란의 체외 생산 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로 본 발명은 소 수정란의 체외 생산 방법에 관한 것이다.

혈통이 고정된 우량형질의 한우 또는 젖소 번식용 암소가 부족한 국내에서는 우수한 육종을 가진 수정란을 대량으로 생산하여 실시간으로 이식하기 위한 체외수정란 이식기술이 매우 중요하다.

체외수정란의 생산시 동일한 배양 드롭/웰 내에는 동일한 부모축(공란우종모우)의 생식세포들로만 구성되게 체외성숙체외수정체외배양하는 기술을 개체배양체계라고 한다. 만일, 개체배양체계가 엄밀하고 정확하게 지켜진다면 체외 배양 중인 동일한 로트의 배양 드롭/웰 내의 난구세포, 난자는 공란축과 DNA 동일성 관계이며, 수정란 상호간에는 DNA 친형매 관계가 성립된다.

배양 드롭 내의 생식세포 개체의 동일성, 친형매, 친자관계 증명을 위한 가장 정확하고 신뢰성 있는 과학적 기법은 DNA 검사법으로 알려져 있다. 이 기법은 특정의 유전자 좌위를 검색함으로써 99.99% 이상 고도의 정확한 동일성 또는 혈통을 확립할 수 있다.

만일 배양 드롭/웰 내에 난자 채취 직후 또는 배발생의 초기에 난구세포가 부착된 소수의 난자가 혼입된다면 이는 개체배양되는 난자로서의 신뢰가 상실된다. DNA 검사법에 의하면 다른 공란우의 생식세포가 2.5% 정도 혼합된 경우라도 탐지될 수 있다. 그러므로 동일한 배양 드롭 내의 배발생 초기의 난구세포, 난자, 수정란의 DNA와 특정 공란우의 DNA 검사를 실시하면 배양 중인 드롭/웰에 다른 공란축의 난자가 혼입되거나 혼동되어 그것이 뒤바뀌는 것 역시 탐지할 수 있다.

체외수정란 이식기법에 의해 태어난 후대축의 정확한 혈통이 확립되고 승계되기 위해서는 도축 공란우, 난자, 수정란의 개체 동일성이 배발생의 매우 초기에 공인되고 검증 가능한 체외수정란 생산기법의 개발이 선행되어야 한다.

이를 위한 전제 조건으로써, 체외배양 중인 생식세포에 대한 DNA 검사는 시기성, 용이성, 안전성, 정량성, 변별력이 있어야 한다. 즉, 배발생의 초기인 0?10일에 공란우와 체외배양중인 생식 세포 간에 동일성이 확립되어야 하고, 체외배양중인 생식세포로부터 DNA 검사를 위한 시료의 채취가 용이하고 간단하여야 하며, 시료의 채취와 처리를 한 후에도 이식에 사용할 난자, 수정란은 직접적인 조직의 손상이 없어야 하고, 이들 생식세포로부터는 동일성 분석과 감별에 필요한 충분한 량의 DNA를 확보할 수 있어야 하며, 체외 배양 드롭/웰 내에 다른 공란우의 생식세포가 극소량 혼입되더라도 이를 쉽게 변별해 내거나 교정할 수 있는 체외수정란의 생산기술이 확립되어야 한다. 나아가 태어난 후대축에 대한 혈통과 이력확립을 위한 전과정 역시 매우 엄밀하고 체계적으로 관리될 수 있는 번식기술과 관리기술이 필요하다.

그러므로 본 발명의 목적은 시기성, 용이성, 안전성, 정량성 및 변별력이 있는 DNA 검사를 통해 생식세포의 동일성이 유지되는 수정란의 체외 배양 방법을 제공하는 것이다.

난포로부터 채취된 난자는 난구세포로 둘러싸여 있는데 이들 난구세포의 DNA는 공란우, 난자, 수정란의 그것과 동일성 관계이다. 특정 공란우의 난소로부터 난자를 채취하여 동일한 로트의 동일한 배양 드롭/웰 내에서 정확하게 개체 배양 체계가 유지된다면 공란우, 난구세포, 난자 및 수정란의 DNA는 동일성 관계가 성립된다. 본 발명의 발명자들은 이러한 점에 착안하여 본 발명을 완성하였다.

그러므로 상기와 같은 본 발명의 목적은

공란우로부터 난소 조직 및 난자를 채취하여 개체별로 보관하고,

상기 난자를 개체별로 체외 성숙, 체외 수정 및 체외 배양하고,

상기 체외 수정된 수정란과 상기 공란우의 DNA를 검사함으로써 공란우와 수정란의 동일성을 확인하여 생식세포의 동일성이 유지되는 수정란의 배양방법에 있어서,

상기 체외 수정된 수정란의 DNA를 검사하는 것은 수정일로부터 0 내지 10일의 생식세포를 채취하여 이루어지는 수정란의 체외 생산 방법에 의해 달성된다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 상세한 설명 및 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이다.

본 발명에 의해 시기성, 용이성, 안전성, 정량성 및 변별력이 있는 DNA 검사를 통해 생식세포의 동일성이 유지되는 수정란의 체외 배양 방법이 제공된다.

도 1은 본 발명의 실시예 4에 따른 48번 난소조직과 난구세포의 DNA 프로파일링 결과를 보여준다.
도 2는 본 발명의 실시예 4에 따른 49번 난소조직과 난구세포의 DNA 프로파일링 결과를 보여준다.
도 3은 본 발명의 실시예 5에 따른 FAM-표지된 5개의 마커(TGLA227, BM2113, TGLA53, ETH10, SPS115)에서의 다른 개체간의 혼합비율에 따른 프로파일링 결과를 보여준다.
도 4는 본 발명의 실시예 5에 따른 VIC-표지된 3개 마커(TGLA126, TGLA122, INRA23)에서의 다른 개체간의 혼합비율에 따른 프로파일링 결과를 보여준다.
도 5는 본 발명의 실시예 5에 따른 NED-표지된 3개 마커(ETH3, ETH225, BM1824)에서의 다른 개체간의 혼합비율에 따른 프로파일링 결과를 보여준다.

본 발명은

상기 체외 수정된 수정란과 상기 공란우의 DNA를 검사하여 공란우와 수정란의 동일성을 확인하여 생식세포의 동일성이 유지되는 수정란의 배양방법에 있어서,

상기 체외 수정된 수정란의 DNA를 검사하는 것은 수정일로부터 0 내지 10일의 생식세포를 채취하여 이루어지는 수정란의 체외 생산 방법을 제공한다.

DNA 검사를 위해 실제로 이식에 제공할 체외 배양 중인 난자나 수정란으로부터 직접적으로 조직을 채취하는 침습적인 방법은 채취기법의 정밀성이 요구되며, 충분한 양의 DNA 확보가 어렵고, 이식 후 임신율이 낮고, 유산율도 높다고 알려져 있다. 그러나 본 발명의 방법에서와 같이 체외배양 0?10일의 배발생 초기 단계에서 생식세포를 채취하면 검사에 필요한 검체물을 용이하게 채취할 수 있다.

특히, 상기 검체로서 수정란 이식에 직접 사용할 수정란이 아닌 수정 전후의 난구세포, 미수정난자, 배발생이 비정상적으로 발생한 수정란 및 형태학적으로 비정상적인 수정란과 같은 잔여 세포 및 잔여 수정란의 DNA를 추출하여 검사를 하면, 검사에 필요한 검체물을 용이하게 채취할 수 있고, 이식에 제공되어야 하는 수정란을 직접적으로 침습하거나 그 수량도 감소시키지 아니하며, 증폭에 필요한 충분한 양의 DNA 확보가 가능하다. 그리하여 다른 개체의 생식세포가 혼입되거나 혼동된 것도 확실히 구별해 낼 수 있으므로, 수정란을 이식하기 전인 체외 배양 과정에서 이미 동일성 또는 친자관계를 확립할 수 있다. 그러나 상기 외에 배발생이 정상적으로 발생한 수정란 및 형태학적으로 정상적인 수정란도 역시 본 발명의 방법에서 사용할 수 있다.

특히, 각각의 난자 또는 수정란을 둘러싸고 있는 난구 세포는 체외성숙수정단계에서 필수적으로 제거되는 생식세포로서, 난자나 수정란에 비해 수십 배의 세포로 구성되어 있으므로 충분한 양의 DNA 추출이 가능하며 다른 개체의 소수의 난구세포가 혼입되더라도 DNA 유형의 차이가 분명히 구분된다.

한편, DNA에는 일정한 염기서열이 연쇄적으로 반복되어 나타나는 마이크로새틀라이트(Microsatellites)라고 부르는 유전자들이 있으며, STR(Short Tandem Repeats)이라고 불리기도 한다. STR 부위들은 각 개체들 마다 반복되는 염기서열의 수가 다양하게 나타나기 때문에, 즉 대립유전자의 수가 많기 때문에 혈액, 조직, 머리카락 등의 유전정보를 비교하여 보면 같은 개체의 것인지 다른 개체의 것인지 알 수가 있다.

유전자는 어미, 아비로부터 반씩을 받아서 한 쌍을 이루게 된다. 그러므로 한 STR의 DNA 프로필은 한 쌍의 대립유전자로 이루어지며, 이 대립 유전자는 각각 어미, 아비로부터 하나씩 받은 것이다. 결과적으로 한 개체의 STR 프로필을 확인함으로써 어미, 아비와의 공유여부 등을 확인하고, 개체들을 식별할 수 있는 가장 확실한 방법이 될 수 있다.

본 발명에서 난소를 채취하는 특정한 공란우는, 쇠고기이력관리제의 개체식별번호를 확인대조하고 (사)한국종축개량협회 전산망을 활용하여 도축우의 혈통이력, 능력평가, 생산이력, 질병이력에 관한 정보를 조회한 후 난소채취 대상우를 먼저 선정하고, 축산물품질평가원(구, 축산물등급판정소)로부터 상기 도축우들의 육질판정등급 정보를 획득하여 체외수정란의 계획교배의 지표로 활용하고, 또한 질병전파를 차단하기 위한 지표로써 부루셀라 검사증명서 및 생체, 해체, 도체검사 및 기타 혈청학적 병성검사의 결과를 종합하여 활용할 수 있으며, 난소 및 난자 조직은 도축 시에 채취할 수 있다.

또한 상기 난자를 채취, 처리한 공란우가 쇠고기이력관리제의 도체와 동일한 개체인지를 확인하기 위하여, 공란우의 혈액, 조직 또는 난소조직의 DNA 지문을 쇠고기이력관리제의 DNA 지문과 비교할 수 있다.

개체별로 난소 및 조직시료를 채취할 때는 선정된 대상우의 도체번호와 일치화할 수 있는 식별번호를 불수용성 재료를 이용하여 개체별 채취용 용기에 표기하고, 도축 작업 시 박피 후의 2분 도체 번호와 개복 후 방출되는 내장 및 난소의 일치여부를 확인하고, 난소 채취와 동시에 시료용 혈액 또는 조직을 채취한다. 이들이 다른 한우 암소의 난소 또는 조직시료(조직, 혈액)와 섞이지 않도록 구획이 분리된 독립된 포장용기에 암소 개체별로 각각 구분되게 암소의 난소 또는 조직시료를 담으며, 암소 개체별 식별번호(바코드번호, 도체번호 등)를 기록하고, 난소의 손상을 최소화할 수 있는 휴대 용기에 담아 실험실로 수송하도록 한다. 이때 공란우 개체별로 채취된 난소를 구분 표시된 용기에 넣은 후, 20~30℃의 온도를 유지하여 2~4시간 내에 이송하는 것이 바람직하다.

바람직하게는 채취된 난소로부터 난자를 획득하고 처리하기 위하여, 개체별 난소를 위생적으로 처리한 후 1회용 주사기를 사용하여 직경 2 내지 6mm의 가시 난포로부터 난자를 채취하여 다른 공란우의 난자와 섞이지 않도록 하는 기술에 따라 처리한 후, 사전에 전처리된 배양접시의 배양액 드롭 또는 웰 단위별로 동일한 개체의 난자들만 주입하여 배양한다.

준비한 배양용기에 다른 개체의 난자들과 혼합되거나 혼동되지 않도록 개체별 도축된 공란우의 난자를 분주하는 과정에서, 배양 접시 및 배양액 드롭별 전처리 및 식별표시를 함에 있어 배양액 드롭 또는 웰 별로 공란우 번호를 구분할 수 있는 로트를 표시하고, 난자 배양용 디쉬/웰에는 난소의 채취장소, 일시를 구분할 수 있고 공란우와 일치화되는 로트를 표시하는 것이 바람직하다.

도축된 공란우로부터 채취한 난자는 개체별로 구분하여 배양액에서 18 내지 24시간 체외 성숙시키며, 도축우 등급 판정 성적과 도축된 공란우의 혈통을 참조하여 계획 교배용 검정 종모우를 선정하여 체외 수정을 시킨다.

상기 배양액으로는 종래 난자 및 수정란의 배양액으로 알려진 임의의 배지를 사용할 수 있는데 예를 들어 TCM199 또는 무혈청 배양액을 사용할 수 있다.

상기 무혈청 배양액에서 체외 배양을 하는 경우, 상기 무혈청 배양액에 마이노이노시톨(myno-inositol) 및 상피성장인자(epidermal growth factor)가 첨가되는 것이 더욱 바람직하다. 상기 마이오이노시톨 및 상피성장인자의 첨가량은 당업자가 적정한 수준에서 결정할 수 있다. 예를 들어 마이오이노시톨 2.0 mM 및 상피성장인자 10 ng/ml를 배지에 첨가할 수 있다. 상기 마이오이노시톨은 비타민의 일종으로서 수정란의 체외 배양시 배반포로의 발육율을 향상시키는 것으로 알려져 있고, 소의 배발달 촉진효과가 있는 것으로 이미 보고되어 있다. 또한, 상기 첨가되는 상피성장인자는 세포의 증식과 분화과정을 세밀하게 조절하여 포유동물의 수정란의 초기 발육 단계에 도움을 주는 것으로 보고되어 있다.

또한, 상기 무혈청 배양액은 mSOF (modified synthetic oviduct fluid)일 수 있다.

상기 수정란은 6 내지 9일간 체외 배양시키는 것이 바람직하다. 이때 각각의 배양액 드롭 또는 웰이 서로 혼동되지 않게 표지를 하여, 다른 개체의 난자 또는 난구세포가 서로 섞이지 않도록 처리하여 수정란을 배양함으로써, 동일성과 혈통이 확립된 소 체외수정란을 생산할 수 있다.

바람직하게는 상기 채취된 난자를 체외 수정 후 체외배양의 0?2일에 난자를 둘러싸고 있는 난구세포, 또는 배양의 10일 간의 기간에서 배양액의 교체시기마다 모든 잔여 생식세포를 배발생의 단계, 또는 일자별로 채취하여 용해 완충액과 프로티나제가 첨가된 튜브에 넣어 배발생 단계, 배발생 일시에 대해 공란우와 동일한 번호를 표기한다.

또한, 배양액 내에 제 2 극체가 확인되지 않는 미수정된 난자, 배발생이 지극히 지연되거나 비정상적으로 발생하는 수정란, 형태학적으로 비정상적인 수정란이 있으면 배발생의 장애를 초래하므로, 제거되어야 하는 모든 생식세포를 동시에 상기와 같은 방법으로 채취, 처리, 보존한 후 DNA를 추출할 수 있다. 상기 활용되는 조직은 동일한 배양액 내의 난자, 수정란과 DNA 동일성, 친형매성이 성립되므로 배양시 버려지는 전 생식세포를 채취, 처리하여 DNA를 추출할 수 있다.

바람직하게는 배양 중인 생식세포를 채취하기 위해 제작된 유리 피펫의 끝은 적당히 가열처리하여 배양 드롭 별로 각각의 피펫을 사용하여야 하며, 투명대에 직접적인 접촉이 최소화되게 주의 깊게 조작하여 난자, 수정란의 투명대에 직접적인 손상이 가해지지 않도록 하면서 난구세포를 분리, 흡입하여야 하며, 이들 분리된 모든 난구세포는 상기와 같은 방법으로 처리, 보존한 후 DNA를 추출한다.

바람직하게는 상기 수정란과 DNA 대조 검사를 하는 공란우의 조직은 상기 채취, 처리되어 보존 중인 공란우의 난소 또는 혈액 및 기타 조직일 수 있다. 또한 쇠고기이력관리제를 위해 보존 중인 도축 공란우의 DNA를 이용하여 동일성 검사를 할 수도 있다.

공란우와 수정란의 DNA 동일성 검사시, 11개 이상의 STR 마커가 일치하는 경우 공란우와 친자관계인 것으로 판정하는 것이 바람직하다.

바람직하게는 상기 동일성 또는 친자성을 대조하기 위하여, 성염색체 X, Y 그리고 개체마다의 다형성이 높은 상염색체 11개의 STR부위(TGLA227, BM2113, TGLA53, ETH10, SPS115, TGLA126, TGLA122, INRA23, ETH3, ETH225, BM1824)를 선정하여 동일한 DNA 프로필에 의한 대립유전자값을 비교하여 일치도 검사를 실시한다.

더욱 바람직하게는 전처리되어 보존 중인 동일한 배양 드롭 내의 난구세포, 잔여 난자, 잔여 수정란으로부터 DNA를 추출하고, 표지된 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 멀티플렉스 PCR 증폭을 실시하고, 자동염기서열 분석장치(ABI 3130xl Genetic Analyzer, Applied Biosystems)를 이용한 절편 분석 방법으로 검사를 수행한다.

또한 체외수정에 사용된 동일한 종모우 정액과의 DNA 지문 대조 검사를 통해 공란우 뿐만 아니라 종모우와의 친자관계도 확인할 수 있다.

상기와 같은 DNA 검사결과 시료간 DNA가 불일치하는 경우, 즉 2개의 시료 DNA 지문이 일치하지 않거나 DNA 타입에서 친자관계가 성립되지 않는 경우에는 동일한 배양접시 로트(lot)에서 생산된 수정란과 동일한 배양접시 로트에 제공된 나머지 다른 도축공란우 시료(혈액, 조직 또는 난소)의 DNA 지문을 비교하여 동일한 배양접시 로트인 경우에 한하여 배양 드롭 별 친자관계를 재확립하거나, 기타 다른 배양접시 로트인 경우에는 분석 또는 처리되어 보존중인 DNA 데이터베이스에서 확인한다. 그렇게 확인한 결과 다른 공란우의 수정란임을 확인하면 다시 계통을 확립하여 수정란 이식에 이용하고, 일부만 다른 세포가 혼입되어 오염된 경우에는 수정란을 이식에 활용하지 않고 폐기처분한다.

본 발명의 방법은 DNA 검사를 통해서 체외 배양 중인 배양 드롭 내에 다른 개체의 난구세포, 난자, 수정란이 소량 혼합된 경우에도 그 혼합량을 판별해냄으로서 생식세포의 동일성을 판정할 수 있으며, 다른 개체와 혼동되어 배양 로트 번호가 바뀐 경우에도 보존 또는 전처리된 공란우의 DNA와 비교하여 이를 교정하여 체외 배양할 수 있는 특징적 기술이다.

그러므로 난구세포, 잔여 난자, 잔여 수정란의 DNA를 추출하여 분석에 활용하는 본 발명은 ① 배발생의 매우 초기인 0～10 일의 시기에, ② 난자주위에서 쉽게 채취할 수 있는 난구세포의 DNA 시료와 ③ 체외배양과정 시 버려지는 모든 생식세포의 조직을 활용할 수 있으므로 최종적으로 이식에 제공할 난자, 수정란에 대한 직접적 손상을 초래하지 않는 비침습적 기법이며, ④ 난자나 수정란에 비하여 그 양이 수십 배에 달하여 검사에 필요한 충분한 양의 DNA 확보가 용이하며, ⑤ 배양 드롭/웰 내에 다른 공란우 유래의 소수의 난구세포난자수정란이 혼입된 경우에라도 이를 정확히 변별해 낼 수 있으므로, 동일한 배양 드롭/웰 내의 모든 생식세포에서 DNA 동일성이 정확히 유지되는 소 수정란의 체외배양 방법을 확립할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

특정 도축공란우의 난소 및 조직 채취

도축우 계류대장에서 개체식별번호(공란우번호)를 확인하고 (사)한국종축개량협회 전산망을 활용하여 혈통과 이력을 조회하고, 질병이력, 생체검사 등에 의하여 난소를 채취할 특정 대상우를 선정하였다.

공란우 개체별로 도축 작업시, 박피 후의 2분 도체 번호와 개복 후 방출되는 내장 및 자궁의 일치여부를 확인한 후 난소와 조직을 각각 채취하고, 미리 준비한 도체번호와 동일한 채집용 용기 내에 공란우별로 각각 구분하여 포장한 후 실험실로 송부하였다.

< 실시예 2>

공란우 개체별 난자 채취 및 동일 드롭 내 체외배양

난소와 도축 공란우 조직시료는 개체별로 정리하여 다른 개체와 섞이지 않게 처리하였고, 직경 60mm의 배양용 디쉬, 4-웰 또는 6-웰 디쉬에 구획이 혼돈되지 않도록 상, 하 또는 좌, 우를 표시하여 난자 배양용기의 드롭(drop)/웰(well) 구획별로 도체(난소)번호를 기록하였다.

1두당 1개의 주사기를 사용하여 각 개체의 난소로부터 직경 2～4mm의 가시난포로부터 난자를 흡입, 채취하여 미리 준비된 배양접시 위의 동일한 번호의 배양드롭/웰에 10 내지 30개씩을 넣어 난소번호와 배양 드롭/웰 번호가 일치하도록 하여 배양하였다.

난자 채취 후 각각의 공란우 개체별 난소, 동일한 공란우 조직을 같은 용기에 보존하고, 배양하는 난자의 번호와 동일하게 기록한 후 냉동 또는 건조하여 보존하였다.

체외수정란의 체외성숙, 체외수정 및 체외배양은 38.5℃, 98% 습도, CO₂배양기, N₂, O₂의 혼합가스 배양기를 사용하였고, TCM-199를 기본으로 한 배양체계를 사용하였으나, 무혈청배지를 사용하는 배양체계도 역시 이용하였다.

도축공란우 개체별로 다른 개체와 섞이거나 혼동되지 않도록 배양 드롭/웰 구획을 유지하면서 체외성숙, 체외수정, 6 내지 9일간 체외배양을 실시하며 2일 마다 배양액을 갈아주었으며, 체외배양액의 교환시에도 역시 개체별로 섞이거나 혼동되지 않도록 도체번호와 동일한 배양 드롭/웰 구획이 유지되도록 수정란을 배양하였다.

체외 배양 중인 난구세포, 난자, 수정란 등의 생식세포는 체외수정 이전과 체외수정 이후의 시기를 선택하여 채취하였고, 체외배양 도중 배발생력이 저하된 경우에 사용하거나 또는 잔여 수정란은 배양 로트 점검에 사용하기 위하여 별도로 보존하였다.

< 실시예 3>

개체 배양 중인 동일 드롭 내의 난구세포 채취 및 처리

동일한 배양접시에서 개체배양중인 특정 공란우의 난구세포, 난자 또는 수정란을 표본추출(선별)하였다.

개체 배양 중인 배양 드롭 로트(lot)내에서 특정 드롭(drop)을 대상으로 난구세포, 난자, 정자, 수정란 샘플을 채취하였다. 특정 배양 드롭 내에서 채취된 난구세포는 세정과 원심분리를 수 회 실시하여 배양액 중의 단백질을 제거하고 용해 완충액으로 처리하였다. 또한 동일한 배양 드롭 내에서 채취된 1개 이상의 난자 또는 수정란에 히알루로니다아제를 첨가하고 수회 피펫팅하여 투명대를 제거하는 전처리를 하였다.

상기 배양 드롭에서 채취하여 전처리된 난구세포, 난자, 수정란은 단백질 용해 완충액이 함유된 스트로우에 넣은 후 DNA를 분석하거나 4℃의 냉장 또는 영하 15℃의 냉동고에 보존하였다.

< 실시예 4>

동일 개체의 난소조직, 난자, 난구세포의 DNA 지문 분석

4.1 난소조직에서의 DNA 추출

약 25?50mg의 난소 조직이 들어 있는 1.5ml 튜브에 용해 완충액(10mM Tris-HCl pH7.5 , 125mM NaCl , 10mM EDTA,0.5% SDS ,5M Urea) 500㎕와 프로티나제 K 20㎕를 첨가하여 충분히 혼합한 후, 60℃에서 조직이 완전히 용해될 때까지 약 6시간 정도 반응시켰다. 반응 후 약 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 새로운 1.5ml 튜브로 옮긴 후, 페놀:클로로포름:이소아밀알코올(25:24:1) 혼합액 500㎕를 혼합하고 섞어주었으며, 13,000rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상등액을 취하여 4℃에서 보관중인 100% 에탄올 500㎕를 혼합하여 -20℃에서 10분간 반응시킨 후, 13,000rpm으로 10분간 원심분리했다. 70% 에탄올 세척완충액 800㎕를 첨가한 후, 다시 12,000rpm에서 10분간 원심분리를 하여 상등액을 버리고, 튜브를 건조시켰다. 건조시킨 튜브는 50 ㎕ 멸균 증류수로 녹여서 최종적으로 DNA를 확보했다.

4.2 난구세포에서의 DNA 추출

난구세포의 DNA 추출은 바이오니아의 Genomic DNA 추출키트(Cat. No. K-3032)를 사용하였다.

난자 20개에 해당하는 난구세포 200㎕(난구세포가 200㎕ 미만일 시 PBS를 첨가하여 200㎕로 맞춰주었다)가 들어 있는 1.5 ml 튜브에 결합 완충액 200㎕와 프로티나제 K 6㎕(25mg/㎕)을 첨가하여 충분히 혼합해 준 후 60℃에서 약 10분 정도 반응시켰다. 칼럼 튜브에 혼합액을 옮겨 담고, 튜브 뚜껑을 닫고 약 8,000rpm에서 1분 동안 원심분리했다. 칼럼에서 통과한 용액을 버리고 세척 완충액 I 500㎕를 첨가하여 튜브 뚜껑을 닫고 약 8,000rpm에서 1분 동안 원심분리하는 과정을 2회 반복했다. 그 다음 칼럼에서 통과한 용액을 버리고 세척완충액 II 500㎕를 첨가하여 튜브 뚜껑을 닫고 약 8,000rpm에서 1분 동안 원심분리하는 과정을 2회 반복했다. 칼럼 튜브에 남은 것을 새로운 1.5 ml 튜브로 옮겨서 용리 완충액 100㎕을 넣고 최종적으로 DNA를 확보했다.

4.3 DNA 지문 분석

표 1과 같이 성염색체 X, Y 그리고 개체마다의 다형성이 높은 상염색체의 11개의 STR부위를 선정하여 검사를 실시하였다. 먼저 표지된 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 PCR 증폭을 실시하고 자동염기서열 분석장치(ABI 3130xl Genetic Analyzer, Applied Biosystems)를 이용한 절편 분석 방법으로 검사를 수행하였다.

소의 다형성 분석용 초위성체(STR) 유전자 좌위

Locus	염색체 번호	염료 표지	크기 범위(bp)*	대립 유전자
TGLA227	18	FAM (청색)	76 ~ 117	11~23
BM2113	2		123 ~ 157	12~27
TGLA53	16		158 ~ 196	20-37
ETH10	5		205 ~ 231	12~22
SPS115	15		240 ~ 275	18~27
TGLA126	20	VIC (녹색)	116 ~ 136	15~22
TGLA122	21		137 ~ 195	21~45
INRA23	3		196 ~ 225	15~26
ETH3	19	NED (황색)	105 ~ 139	19~29
ETH225	9		141 ~ 170	21~30
BM1824	1		176 ~ 205	11~20
BOV_X	X	PET (적색)	117 ~ 121
BOV_Y	Y	PET (적색)	242 ~ 246

* 크기 범위는 ABI 유전자 분석기 3130XL(DS-33-G5 염료 세트, POP7 중합체, 36cm 모세관, 크기 표준물질인 GeneScan^TM-500 LIZ)로 분석하였다. 분석기기 및 중합체 그리고 모세관의 종류에 따라 크기 범위는 달라질 수 있다.

4.4 멀티플렉스 PCR 및 분석

표 1의 마커를 한번에 분석할 수 있도록 설계된 (주)젠닥스 BioTrace^TM 소 동일성확인 키트(Bovine Identification Kit) 1.1을 이용하여 분석을 실시하였다.

주형 DNA 50ng, 프라이머 혼합물 8.25㎕, 0.25mM dNTP 및 Hot start용 Taq DNA 폴리머라제 0.5 유닛((주)젠닥스), 10 × 완충액 1.5㎕를 첨가하였고, 멸균 3차 증류수를 넣어 최종 부피가 15㎕가 되도록 맞추었다.

PCR 조건은 95℃에서 15분간 변성(denaturation)시킨 후 95℃에서 50초, 58℃에서 70초, 72℃에서 70초를 9 주기, 95℃에서 50초, 57℃에서 70초, 72℃에서 70초를 9 주기, 95℃에서 50초, 56℃에서 70초, 72℃에서 70초를 25 주기로 하였다. 그 후 65℃에서 30분 후 8℃에서 종료하였다.

초위성체 유전자좌 분석을 위하여, 3% 아가로스 겔에서 1차 전기영동을 실시한 후, 약 80배 증류수로 희석을 하고 자동염기서열 분석 장치인 Applied Biosystems 3130xl 유전자 분석기(Applied Biosystems, USA)에서 2차 전기영동을 하여 각각의 PCR 최종산물의 증폭 여부 및 농도를 확인하였다.

크기별로 분획시키기 위해, GeneScan^TM-500 LIZ 크기 표준체 및 Hi-Di Formamide(Applied Biosystems, USA) 혼합물을 1:9로 희석하여 전기영동을 실시하였다. 또한 모든 초위성체에 대한 대립형질 사다리(allelic ladder)를 PCR 최종산물의 전기영동과 마찬가지로 GeneScanTM-500 LIZ 크기 표준체 및 Hi-Di Formamide (Applied Biosystems, USA) 혼합물과 1:9로 희석하여 전기영동을 실시하였다.

전기영동이 끝난 후, GeneMapper 4.0(Applied Biosystems, USA)을 이용하여 각 초위성체 유전자좌의 증폭 크기와 표식자의 종류를 확인하고, 대립형질 사다리(allelic ladder)를 통해 표준화된 결과 값을 도출하였다.

4.5 동일 개체의 난소조직 및 난자, 난구세포의 DNA 추출결과

난소조직 50mg 및 난자 10개의 난구세포에서 DNA량을 추출한 결과는 표 2와 같았으며, 난자 20개에 해당하는 난구세포에서의 DNA량은 약 1㎍/100㎕(10ng/㎕) 정도로 유전자 감식을 위한 충분한 양임을 확인하였다.

개체 배양중인 동일 배양액 내 생식세포의 정량 분석 결과

조직시료 종류	난소조직		난자, 수정란		난구세포
조직시료 번호	48	49	3a (48-a)	4a (49-a)	3 (48-b)	4 (49-b)
조직 시료량	50mg	50mg	-	-	20 tc*	10 tc**
DNA 농도 (ng/ul)	15ng/ul	20ng/ul	-	-	10ng/ul	5ng/ul

tc* : 20개의 난자로부터 채취한 난구세포의 총량

tc** : 10개의 난자로부터 채취한 난구세포의 총량

4.6 동일개체의 난소조직, 난자, 난구세포의 DNA 동일성 분석 결과

표 3 및 도 1과 같이 48번 난소 조직과 3번 난구세포가 동일한 DNA 프로필(대립유전자 값)을 나타내고 있음을 확인하였다. 또한 표 4 및 도 2와 같이 49번 난소조직과 난구세포가 동일한 DNA 프로필(대립유전자 값)을 나타내고 있음을 확인하였다.

48번 난소조직과 난구세포의 DNA 프로파일링에 의한 대립유전자값

마커	TGLA227	BM2113	TGLA53	ETH10	SPS115	TGLA126
난소조직 (48번)	19,22	20,21	23,27	15,20	22,27	17,17
난구세포 (3번)	19,22	20,21	23,27	15,20	22,27	17,17
마커	TGLA122	INRA23	ETH3	ETH225	BM1824
난소조직 (48번)	24,29	21,24	23,23	23,23	13,14
난구세포 (3번)	24,29	21,24	23,23	23,23	13,14

49번 난소조직과 난구세포의 DNA 프로파일링에 의한 대립유전자 값

마커	TGLA227	BM2113	TGLA53	ETH10	SPS115	TGLA126
난소조직 (49번)	14,22	21,21	27,34	20,22	21,25	17,18
난구세포 (4번)	14,22	21,21	27,34	20,22	21,25	17,18
마커	TGLA122	INRA23	ETH3	ETH225	BM1824
난소조직 (49번)	24,29	20,23	22,26	23,24	13,15
난구세포 (4번)	24,29	20,23	22,26	23,24	13,15

< 실시예 5>

이종 개체 난구세포의 혼합비율에 따른 DNA 지문 분석

5.1 난구세포, 난자의 혼합비율

이종 개체 간의 난자, 또는 난구세포가 혼입(DNA 혼입) 되었을 시, DNA 지문분석을 통하여 혼합정도를 구별하기 위하여 표 5와 같이 혼합 비율을 각각 조정하였다.

개체배양중인 난구세포, 난자의 혼합 비율

혼합율	난구세포 혼합율(혼합율, %)		난자혼합율(혼합량, 개)
조직구분	개체배양 3의 난구세포(3B)		개체배양 4의 난구세포(4B)
그룹 1	100% *	0%	20	0
그룹 2	97.5%	2.5%	-	-
그룹 3	95%	5%	19	1
그룹 4	90%	10%	18	2
그룹 5	80%	20%	16	4
그룹 6	50%	50%	10	10

* 난자 10～20개의 난구세포에 해당함.

5.2 DNA 지문 분석

4번 난구세포를 각각 2.5%, 5.0%, 10%, 20%, 50% 비율로 3번 난구세포와 혼합하여 DNA 프로파일링 결과를 확인하였으며, 분석방법은 실시예 4와 동일하다.

5.3 이종 개체의 난구세포의 혼합비율에 따른 DNA 지문 분석 결과

2.5% 및 5.0% 혼합 했을 때의 결과에서 3번 난구세포 대립유전자 값과의 구분은 쉽지 않으나 4번 난구세포의 대립유전자 값이 보이는 것을 확인할 수 있었다(도 3 내지 도 5). 하지만 혼합비율 10%의 결과에서는 4번 난구세포의 대립유전자 값이 분명하게 나타났으며 혼합비율이 커짐에 따라 그 높이가 높아짐을 확인할 수 있었다. 따라서 2.5% 이상 타 개체의 생식세포 혼입시 오염여부를 확인할 수 있으며, 10% 이상 타 개체의 생식세포가 혼입되었을 때에는 혼입된 개체가 어느 종란우의 것인지 구분이 가능했다.

이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

공란우로부터 난소 조직 및 난자를 채취하여 개체별로 보관하고,
상기 난자를 개체별로 체외 성숙, 체외 수정 및 체외 배양하고,
상기 체외 수정된 수정란과 상기 공란우의 DNA를 검사하여 공란우와 수정란의 동일성을 확인함으로써 생식세포의 동일성이 유지되는 수정란의 체외 생산 방법에 있어서,
상기 체외 수정된 수정란의 DNA 검사는 수정일로부터 0 내지 10일의 생식세포를 채취하여 11개의 STR(Short Tandem Repeats) 부위인 TGLA227, BM2113, TGLA53, ETH10, SPS115, TGLA126, TGLA122, INRA23, ETH3, ETH225 및 BM1824와 성염색체를 마커로 하여 동일한 DNA 프로필에 의한 대립유전자 값을 비교하여 일치도 검사를 실시하여 이루어지며,
상기 공란우와 수정란의 동일성 확인은 공란우와 수정란의 DNA 지문검사를 수행하여 11개의 STR 마커가 일치하면 공란우와 수정란이 친자관계인 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는, 수정란의 체외 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 수정일로부터 0 내지 10일의 생식세포는 수정 전후의 난구세포, 미수정난자, 배발생이 비정상적 또는 정상적으로 발생한 수정란 및 형태학적으로 비정상적 또는 정상적인 수정란으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 수정란의 체외 생산 방법.
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 상기 DNA 검사는 멀티플렉스 PCR인 수정란의 체외 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 공란우의 DNA는 공란우의 난소 조직 또는 도체조직으로부터 채취된 DNA인 수정란의 체외 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 공란우의 DNA는 쇠고기이력관리제를 위해 보존된 도축 공란우의 DNA인 수정란의 체외 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 체외 수정된 수정란의 생식세포와 상기 공란우의 DNA를 검사하여 검사결과 2 개체 이상의 생식세포가 혼입되었음이 확인되면 해당 수정란은 폐기처분하는 수정란의 체외 생산 방법.