KR101144563B1 - Mouse animal model for the study of arthritis and method for producing the same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 관절염 마우스 동물모델 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 본 발명은 마우스에게 고열량의 사료를 섭취시켜 비만을 유도하는 단계; 및 상기 비만 마우스에 2형 콜라겐을 투여하여 관절염을 유발시키는 단계를 포함하는 관절염 마우스 동물모델의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 관절염 마우스 동물모델에 관한 것이다. 본 발명에 따른 관절염 마우스 동물모델의 제조방법은 기존의 관절염 연구용 마우스보다 관절염의 증상을 더 심각하게 유발시킬 수 있는 효과가 있어 보다 정확한 관절염 연구를 위한 마우스 동물모델을 제공할 수 있는 효과가 있으며, 또한 관절염 연구를 위해 사용되고 있는 유전자변형 마우스들의 배경이 c57BL/6 마우스라는 점을 감안할 때, c57BL/6 마우스를 이용하여 제조한 본 발명의 관절염 마우스 동물모델은 관절염 치료약제의 스크리닝을 위한 검증 및 관절염의 연구를 위한 동물모델로 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.The present invention relates to a novel animal model of arthritis mouse and a method for producing the same. More particularly, the present invention relates to a method for producing an animal model of arthritis mouse, And inducing arthritis by administering type 2 collagen to the obesity mouse, and an animal mouse model of arthritis produced by the method. The method for producing an animal model of arthritic mice according to the present invention has the effect of inducing the symptoms of arthritis more seriously than the mouse for conventional arthritis research and provides a mouse animal model for more accurate arthritis research, Considering that the background of transgenic mice used for arthritis research is c57BL / 6 mice, the animal model of arthritis mouse of the present invention, which was prepared using c57BL / 6 mouse, was used for the screening of arthritis therapeutic agents, , Which is useful as an animal model for the study of < RTI ID = 0.0 >

Description

관절염 마우스 동물모델 및 이의 제조방법{Mouse animal model for the study of arthritis and method for producing the same}[0001] The present invention relates to an animal model of arthritis and an animal model of arthritis,

본 발명은 신규한 관절염 연구용 동물모델 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 비만을 유도한 마우스에 약물을 처리하여 관절염을 유발시켜 제작한 관절염 마우스 동물모델 및 이의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a novel animal model for arthritis research and a method for producing the same. More specifically, the present invention relates to an animal model of arthritis mouse produced by treating a mouse with obesity-induced drug to induce arthritis, and a method for producing the same.

자가면역성 류마티스 관절염은 비정상적인 면역 반응에 따른 염증 전달 물질의 증가로 인한 활막의 염증과 신생 혈관 형성, 관절 연골 및 뼈 손상을 특징으로 하는 질환으로, 그 유병률은 현재 약 1% 정도로 알려져 있다. 이는 유전적인 요인, 감염 등 환경적 요인에 의해 면역 체계의 이상을 초래하는 면역 매개성 질환으로 발병원인이 아직 밝혀지지 않은 질환이다. Autoimmune rheumatoid arthritis is a disease characterized by synovial inflammation and neovascularization, arthritic cartilage and bone damage due to an increase in inflammatory mediators due to abnormal immune responses. Its prevalence is now known to be about 1%. It is an immune - mediated disease that causes an immune system abnormality due to environmental factors such as genetic factors and infection.

이러한 자가면역성 류마티스 관절염의 병인을 밝히기 위해 많은 연구자들이 일련의 관절파괴 과정에 관여하는 세포에 대한 실험을 수행하고 있다. 그러나 관절은 단순히 뼈와 뼈 사이의 빈 공간이 아니고 활막, 연골, 뼈, 혈액 등의 여러 부분이 유기적으로 연결되어 구성되며, 사이토카인과 같은 여러 가지 면역 반응을 유도할 수 있는 분자들과 세포들 간의 상호작용을 통해 서로 미묘하게 영향을 미치는 하나의 복잡한 장기와 같은 구조물이기 때문에, 관절염의 치료를 위해서는 고려해야 할 변수가 많고 따라서 그 치료가 어렵다. 이렇듯 자가면역성 류마티스 관절염 내의 병인 염증반응은 복합 병리 질환이므로 다각적인 측면에서의 치료적 접근이 절실히 요구된다. To elucidate the pathogenesis of such autoimmune rheumatoid arthritis, many researchers are conducting experiments on cells involved in a series of joint destruction processes. However, joints are not merely empty spaces between bones and bones but are composed of organically connected parts such as synovial membrane, cartilage, bone, and blood, and molecules and cells capable of inducing various immune responses such as cytokines Because of the complexity of organ complexes that subtly affect each other through interactions, there are many variables to consider for treatment of arthritis and are therefore difficult to treat. The inflammatory reaction, a disease in autoimmune rheumatoid arthritis, is a complex pathologic disease, so a therapeutic approach in multiple aspects is urgently required.

또한 관절의 장애뿐만 아니라 골다공증, 전신 장기침범 (폐, 피부, 눈)을 동반하여 환자에게 엄청난 삶의 질 저하를 가져오고 정상적인 생활을 불가능하게 하여 사회적으로 환자를 고립시키는 역할을 하기도 한다. 부적절한 면역작용의 산물인 이 질환은 장기간 진단과 치료가 어려운 난치병이어서 심각한 사회적, 경제적 문제를 일으키는 요인이 되고 있다. 이러한 상황에서 복잡한 병리 현상에 기반하여 근본적인 병인을 조절할 수 있는 연구가 수행되어야 할 것이다. In addition to joint disorders, osteoporosis, systemic organ involvement (lungs, skin, eyes), accompanied by a tremendous loss of quality of life, making normal life impossible and socially responsible for the isolation of patients. This disease, which is a product of inappropriate immune function, is an incurable disease that is difficult to diagnose and treat for a long time, which causes serious social and economic problems. In this situation, studies should be conducted to control the underlying pathogenesis based on complex pathology.

한편, 류마티스 관절염의 치료제 개발을 위한 동물모델로서 지금까지 대부분의 연구기관에서는 마우스 모델을 일반적으로 사용하여 왔다. 이러한 류마티스 관절염의 실험모델은 2형 콜라겐을 마우스에 접종하여 관절염을 유도시킴으로써 관절염 연구에 사용되고 있는데, 이 모델은 임상적으로나 조직학적으로 사람의 류마티스 관절염과 매우 유사한 것으로 알려져 있다(Stuart et al,1982). 따라서 2형 콜라겐으로 유도된 관절염 모델은 만성 관절염의 병인과 기전을 이해하고, 여러 가지 새로운 치료 약물개발을 위해 마우스에 직접 처리하여 반응을 관찰하고 치료효과를 연구하는데 널리 사용되고 있다. On the other hand, as an animal model for developing a therapeutic agent for rheumatoid arthritis, mouse models have been generally used in most research institutions to date. This experimental model of rheumatoid arthritis is known to be clinically and histologically similar to human rheumatoid arthritis (Stuart et al, 1982), which is used in arthritis studies by inducing arthritis by inoculating mice with type 2 collagen ). Therefore, the arthritis model induced by type 2 collagen is widely used to understand the pathogenesis and mechanism of chronic arthritis and to study the effects of treatment with mice directly on the development of various new therapeutic drugs.

또한, 류마티스 관절염의 자가면역 모델로 2형 콜라겐으로 관절염을 유도한 마우스를 이용하여 많은 연구들이 수행되고 있는데, 주로 사용되는 마우스 종으로는 DBA/1(H-2q)가 있다. DBA/1(H-2q)는 관절염을 유도할 수 있는 마우스 종으로서, 몇몇 사이토카인 유전자 변형 마우스를 제외하고는 유일하게 관절염을 유발시킬 수 있는 종으로 알려져 있다. In addition, many studies have been carried out using mice that induced arthritis with type 2 collagen as an autoimmune model of rheumatoid arthritis. DBA / 1 (H-2 q ) is the most commonly used mouse species. DBA / 1 (H-2 q ) is a mouse species capable of inducing arthritis and is known to be the only species capable of inducing arthritis, except for some cytokine transgenic mice.

그러나 류마티스 관절염과 관련 있는 주요 사이토카인 유전자 변형 마우스들의 대부분은 그 백그라운드(background)를 c57BL6 종으로 하고 있어서, DBA/1(H-2q)는 류마티스를 연구하는데 있어서 한계가 있다. 따라서 관절염 연구를 위해서는 상기 c57BL6 마우스에 류마티스 관절염을 성공적으로 유발시킬 필요가 있으나, 종래의 연구에 따르면 c57BL6 마우스에 2형 콜라겐으로 관절염을 유도시 관절염 평가 지수는 3점을 넘지 못했고 발병율(incidence)도 평균적으로 50% 정도에 그쳐 그 성공률이 미미하다. 따라서 관절염을 연구하기 위한 새로운 동물 모델이 필요한 실정이다.
However, most of the major cytokine transgenic mice involved in rheumatoid arthritis have a c57BL6 background in their backgrounds, so DBA / 1 (H-2 q ) has limitations in studying rheumatism. Therefore, it is necessary to successfully induce rheumatoid arthritis in c57BL6 mice for the study of arthritis. However, according to the conventional studies, arthritis evaluation index of c57BL6 mice induced arthritis with type 2 collagen did not exceed 3 points and incidence The average success rate is only 50%. Therefore, a new animal model is needed to study arthritis.

이에 본 발명자들은 c57BL/6 마우스를 기반으로 한 관절염 연구용 마우스 모델을 개발하던 중 마우스에 비만을 유도한 후, 관절염을 유발할 경우 관절염 평가 지수와 발병율(incidence)이 증가된 관절염 마우스 동물모델을 제작할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the inventors of the present invention developed an arthritic mouse animal model in which arthritis evaluation index and incidence were increased when inducing obesity in a mouse while developing a mouse model for arthritis research based on c57BL / 6 mouse And the present invention was completed.

따라서 본 발명의 목적은 관절염 평가 지수와 발병율(incidence)이 증가된 관절염 마우스 동물모델을 제공하는 것이다.It is therefore an object of the present invention to provide an arthritis mouse animal model with an increased arthritis rating index and incidence.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 관절염 마우스 동물모델의 제조방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for producing the arthritis mouse animal model.

상기한 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은,In order to achieve the above object,

마우스에게 고열량의 사료를 섭취시켜 비만을 유도하는 단계; 및 Inducing obesity in a mouse by feeding a high calorie feed; And

상기 비만 마우스에 2형 콜라겐을 투여하여 관절염을 유발시키는 단계를 포함하는 관절염 마우스 동물모델의 제조방법을 제공한다.And administering type 2 collagen to the obesity mouse to induce arthritis.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 2형 콜라겐을 투여하는 단계는 2형 콜라겐을 1차 접종한 후 마우스를 일정기간 사육한 다음, 다시 2차 접종하는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the step of administering the type 2 collagen may include a first inoculation of type 2 collagen, a periodical breeding of the mouse, and a second inoculation.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 1차 접종은 2형 콜라겐과 CFA(complete freud's adjuvant)를 동량으로 혼합한 혼합용액을 투여하는 것이고, 상기 2차 접종은 2형 콜라겐과 IFA(incomplete freud's adjuvant)를 동량으로 혼합한 혼합용액을 투여하는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the first inoculation is administration of a mixed solution of an equal amount of type 2 collagen and complete freud's adjuvant (CFA), and the second inoculation is a combination of type II collagen and IFA (incomplete freud's adjuvant ) In the same amount.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 1차 접종 또는 2차 접종은 상기 혼합용액을 마우스의 둔부 또는 꼬리 쪽 복강에 피내(intradermal)로 투여하는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the primary inoculation or the secondary inoculation may be administration of the mixed solution intradermally to the buttocks or caudal abdominal cavity of a mouse.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 1차 접종은 고열량의 사료를 섭취한 마우스의 몸무게가 일반사료를 섭취한 마우스 몸무게의 1.5~2배가 되는 시기에 이루어지는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the primary vaccination may be performed at a time when the weight of a mouse consuming a high-calorie feed is 1.5 to 2 times the weight of a mouse that consumes a general feed.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 2차 접종은 상기 1차 접종 후 10일 내지 15일 후에 이루어지는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the secondary vaccination may be performed 10 to 15 days after the primary vaccination.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 마우스는 c57BL/6 마우스일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the mouse may be a c57BL / 6 mouse.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 방법에 따라 제조된 관절염 마우스 동물모델을 제공한다.The present invention also provides an animal model of arthritis mouse produced according to the method of the present invention.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 관절염 마우스 동물모델은, (a) 혈청 중 IgG2a의 농도 증가; (b) 관절에 면역세포들의 침식 발생; (c) 판누스(pannus) 형성; (d) 연골파괴 및 뼈 침식 발생; 및 (e) Th17 세포의 유도 증가로 이루어진 특성 중에서 선택되는 하나 이상의 특성을 갖는 것일 수 있다. In one embodiment of the invention, the arthritic mouse animal model comprises (a) an increase in the concentration of IgG2a in serum; (b) occurrence of erosion of immune cells in the joints; (c) formation of pannus; (d) cartilage destruction and bone erosion; And (e) an increase in the induction of Th17 cells.

본 발명에 따른 관절염 마우스 동물모델의 제조방법은 기존의 관절염 연구용 마우스보다 관절염의 증상을 더 심각하게 유발시킬 수 있는 효과가 있어 보다 정확한 관절염 연구를 위한 마우스 동물모델을 제공할 수 있는 효과가 있으며, 또한 관절염 연구를 위해 사용되고 있는 유전자변형 마우스들의 배경이 c57BL/6 마우스라는 점을 감안할 때, c57BL/6 마우스를 이용하여 제조한 본 발명의 관절염 마우스 동물모델은 관절염 치료약제의 스크리닝을 위한 검증 및 관절염의 연구를 위한 동물모델로 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.
The method for producing an animal model of arthritic mice according to the present invention has the effect of inducing the symptoms of arthritis more seriously than the mouse for conventional arthritis research and provides a mouse animal model for more accurate arthritis research, Considering that the background of transgenic mice used for arthritis research is c57BL / 6 mice, the animal model of arthritis mouse of the present invention, which was prepared using c57BL / 6 mouse, was used for the screening of arthritis therapeutic agents, , Which is useful as an animal model for the study of < RTI ID = 0.0 >

도 1은 고지방식이를 섭취하게 하여 비만을 유도한 후, 2형 콜라겐을 투여하여 류마티스 관절염을 유도한 본 발명에 따른 관절염 마우스 동물모델 및 비만을 유도하지 않은 통상적으로 사용되는 전임상 동물모델인 c57BL/6 마우스를 대상으로 관절염의 발생을 평가한 결과를 나타낸 것으로서, 도 1a는 관절염의 발생범위를 백분율로 나타낸 결과이고, 도 1b는 관절염의 평가지수를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 고지방식이 관절염 유도 마우스군과 정상식이 관절염 유도 마우스군을 대상으로 혈청내 CII 특이적인 IgG와 CII 특이적인 IgG2a의 변화를 ELISA 방법을 이용하여 관찰한 것으로서, 도 2a는 CII에 특이적인 총 IgG의 양을 비교한 그래프이고, 도 2b는 CII에 특이적인 IgG2a의 양을 비교한 그래프이다.
도 3은 고지방식이 관절염 유도 마우스군과 정상식이 관절염 유도 마우스군의 관절조직을 적출하여 관절의 파괴정도를 관찰한 결과를 나타낸 것으로서, 위의 사진은 각 관절조직을 H&E 염색, 사프라닌 O 염색 및 톨루딘 블루 염색을 수행한 결과를 나타낸 것이고, 아래의 그래프는 연골 표면의 침식정도를 점수화하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 고지방식이 관절염 유도 마우스군과 정상식이 관절염 유도 마우스군의 비장세포에서 림프구의 증식반응을 관찰한 결과를 나타낸 것으로서, 4a는 이다. 아무것도 자극하지 않은 세포에서의 측정치가 비만식이 관절염군의 측정치의 약 두 배 정도 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한 T림프구 세포 자극조건에서도 역시 비만식이 관절염 조건에서 림프구의 증식반응이 확연하게 차이가 나는 것을 관찰하였다.
도 5는 고지방식이 관절염 유도 마우스군과 정상식이 관절염 유도 마우스군의 비장세포에서 Th17 세포를 유세포 분석기를 이용하여 Th17의 세포수를 측정한 결과를 나타낸 것이다. FIG. 1 is a graph showing an animal model of arthritis according to the present invention in which obesity is induced by ingesting a high fat diet, followed by administration of type 2 collagen to induce rheumatoid arthritis, and c57BL, which is a commonly used pre- / 6 mice. FIG. 1A shows the incidence rate of arthritis as a percentage, and FIG. 1B shows the evaluation index of arthritis as a graph.
FIG. 2 is a graph showing changes in CII-specific IgG and CII-specific IgG2a in the serum of a high fat diet-induced arthritis-induced mouse group and a normal diet-induced arthritis-induced mouse group prepared according to an embodiment of the present invention by ELISA FIG. 2A is a graph comparing the amount of total IgG specific to CII, and FIG. 2B is a graph comparing the amount of IgG2a specific to CII.
FIG. 3 shows the result of observing the degree of joint destruction by extracting the joint tissues of the arthritis-inducing mouse group and the normal-type arthritis-inducing mouse group in the high fat diet method, wherein each of the joint tissues was stained with H & E staining, Staining and toludin blue staining. The graph below shows the degree of erosion of the cartilage surface as a scaled graph.
FIG. 4 shows the result of observing lymphocyte proliferation in spleen cells of the arthritis-inducing mouse group and the normal-type arthritis-inducing mouse group in the high fat diet, and 4a is the result. It was confirmed that the measured value in the non-stimulated cells was about twice that of the obesity diabetic arthritis group. We also observed that the proliferative response of lymphocytes was significantly different in the T lymphocyte cell stimulation conditions in obesity - induced arthritis conditions.
FIG. 5 shows the results of measuring the number of Th17 cells in the spleen cells of the arthritis-inducing mouse group and the normal-type arthritis-inducing mouse group, using the flow cytometry analyzer.

본 발명은 관절염을 연구하기 위한 동물 모델을 연구하던 중, 마우스에 비만을 유도한 후 관절염을 유발시킬 경우 종래 사용하던 관절염 동물모델에 비해 관절염 평가지수와 발병율(incidence)이 증가된 마우스 모델을 제작할 수 있다는 사실을 최초로 확인하였다. The present invention relates to an animal model for studying arthritis, which, when inducing obesity and inducing arthritis in a mouse, produces a mouse model in which an arthritis evaluation index and incidence are increased compared to an animal model of arthritis conventionally used It was the first time that I could confirm that I could.

따라서 본 발명은 신규한 관절염 마우스 동물모델 및 이의 제조방법을 제공함에 그 특징이 있으며, 본 발명에서 제공하는 상기 관절염 마우스 동물모델의 제조방법은, 마우스에게 고열량의 사료를 섭취시켜 비만을 유도하는 단계; 및 상기 비만 마우스에 2형 콜라겐을 투여하여 관절염을 유발시키는 단계를 포함할 수 있다. Accordingly, the present invention provides a novel animal model of arthritis mouse and a method for producing the same, and the method is characterized in that the animal model of arthritis mouse provided by the present invention comprises a step of inducing obesity by feeding a high- ; And inducing arthritis by administering type 2 collagen to the obesity mouse.

본 발명에서 상기 관절염 마우스 동물모델을 제조하기 위해 사용한 고열량의 사료는 일반적으로 에너지 함량이 높은 사료를 의미하는 것으로, 에너지 함량의 절대적인 기준은 없으나 비교적 단기간 내에 정상적인 식이를 한 마우스보다 체중을 유의적으로 증가시킬 수 있는 사료이어야 한다. 상기 고열량 사료의 종류에는 제한이 없으며 일반적으로 마우스에 투여할 수 있는 어떠한 종류의 사료도 본 발명의 고열량 사료로 사용될 수 있다.In the present invention, the high calorie feed used to produce the animal models of arthritic mice generally means a feed having a high energy content. Although there is no absolute standard for the energy content, the weight of the animal is significantly It should be a feed that can increase. There is no limitation on the kind of the high-calorie feed, and any kind of feed that can be generally administered to a mouse can be used as the high-calorie feed of the present invention.

본 발명의 일실시예에서는, 4주령의 마우스를 대상으로 60kcal의 고열량 사료를 섭취하게 하여 동일 주령의 일반식이를 섭취시킨 마우스에 비해 체중이 1.5배 더 증가되도록 하였다. In one embodiment of the present invention, a high calorie feed of 60 kcal was administered to a 4-week-old mouse, and the body weight was 1.5-fold higher than that of a mouse fed the same-weighted general diet.

본 발명에서 상기 비만이 유도된 마우스를 대상으로 관절염을 유도하는 방법은 통상적으로 관절염 동물모델을 제조하기 위해 사용하는 방법이라면 모두 사용할 수 있으며, 또한, 종래 방법을 변형하여 관절염을 유발할 수 있는 어떠한 방법도 사용될 수 있다. 바람직하게는 2형 콜라겐을 투여하는 방법을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 2형 콜라겐을 CFA(complete freud's adjuvant) 또는 IFA(incomplete freud's adjuvant)와 혼합한 혼합용액을 투여하는 방법을 사용할 수 있다.In the present invention, the method of inducing arthritis in the above-mentioned obesity-induced mouse can be used as long as it is a method generally used for producing an arthritic animal model. In addition, any method that can induce arthritis by modifying the conventional method Can also be used. Preferably, a method of administering type 2 collagen can be used. More preferably, a method of administering a mixed solution in which type II collagen is mixed with CFA (complete freud's adjuvant) or IFA (incomplete freud's adjuvant) can be used.

상기 2형 콜라겐을 투여하는 단계는 1차 및 2차로 반복 투여할 수 있는데, 보다 구체적으로는 2형 콜라겐을 동량의 CFA(complete freud's adjuvant)와 혼합한 혼합용액을 비만 마우스에 1차 접종한 다음, 마우스를 일정기간 사육시키고, 이후, 2형 콜라겐을 동량의 IFA(incomplete freud's adjuvant)와 혼합한 혼합용액을 2차 접종하여 비만 마우스에 관절염을 유발시킬 수 있다.The step of administering the type 2 collagen can be repeatedly administered in primary and secondary doses. More specifically, a mixed solution obtained by mixing type 2 collagen with the same amount of complete freud's adjuvant (CFA) is firstly inoculated into obese mice , Mice may be fed for a certain period of time, and then arthritis may be induced in obese mice by secondly inoculating a mixed solution of type 2 collagen and an incomplete freud's adjuvant (IFA).

또한, 관절염 유발 약물을 동물모델에 투여할 경우, 상기 약물의 투여방법으로는 이에 제한되지는 않으나, 경구투여법, 피내 주사법, 피하 주사법, 근육내 주사법, 복강내 주사법, 정맥내 주사법 등 실험조건에 따라 약물을 효율적으로 전달할 수 있는 적절한 방법을 선택하여 사용할 수 있다.In addition, when the arthritis-inducing drug is administered to an animal model, the method of administering the drug may include, but is not limited to, oral administration, intradermal injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, intravenous injection The drug can be selected and used appropriately in order to efficiently deliver the drug.

본 발명의 일실시예에서는, 상기 1차 접종 또는 2차 접종을 마우스의 둔부 또는 꼬리쪽 복강에 피내 주사법으로 투여하였다. In one embodiment of the present invention, the primary inoculation or secondary inoculation was administered intracutaneously to the buttocks or caudal abdominal cavity of mice.

본 발명에서 상기 1차 접종은 고열량 식이섭취한 마우스의 체중이 일반사료를 섭취한 대조군 마우스 체중에 비해 1.5~2배가 되는 시기에 접종할 수 있으며, 바람직하게는 1.5배가 되는 시기에 접종할 수 있다. 상기 2차 접종은 1차 접종 후 10일 내지 15일 후에 접종할 수 있으며, 바람직하게는 1차 접종 후 14일 후에 접종할 수 있다. In the present invention, the primary vaccination can be inoculated at a time when the body weight of a mouse consumed with a high calorie diet is 1.5 to 2 times as much as that of a control mouse body fed with a general feed, preferably 1.5 times . The second inoculation can be inoculated 10 to 15 days after the first inoculation, preferably 14 days after the first inoculation.

또한, 본 발명에 따른 관절염 마우스 동물모델의 제조를 위해 사용할 수 있는 실험용 마우스의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 계통별 분류상 폐쇄군(Closed Colony)에 속하는 ICR 또는 DDY; 근교계(Inbred)에 속하는 BALB/cA, C57BL/6N, C3H/HeN, DBA/2N 또는 CBA/N; 교잡군(hybrid)에 속하는 BDF1(C57BL/6 x DBA/2), CDF1(CBA/N x DBA/2) 또는 B6C3F1(C57BL/6 x C3H/HeN); 돌연변이계(Mutant)에 속하는 BALB/c-nu 또는 C,B-17SCID 등 실험용 마우스로 사용되고 있는 것이라면 모두 이용할 수 있다. 바람직하게는 c57BL/6 마우스를 사용할 수 있다. 상기 c57BL/6 마우스는 종종 "C57 블랙(black) 6" 또는 단순히 "블랙(black) 6"로도 불리는 근교계 실험용 마우스이다. 이 종은 사람의 질병 모델을 위한 유전자 변형 마우스의 "유전적 기반(genetic background)"으로 가장 널리 사용되고 있으며, 이들은 congenic 균주들의 이용가능성, 손쉬운 교배, 강건성(robustness), 및 유전자 변형 모델들과의 관계 등에서 장점을 갖는다. 특히 C57BL/6로부터의 면역 반응은 BALB/c와 같은 다른 근교계 종들과 차별화 될 수 있는데, 예를 들어, C57BL/6 마우스에서 동일한 병원균에 대한 면역학적 반응이 BALBb/c 마우스에서는 상반되는 결과를 보일 수 있다. In addition, the types of experimental mice that can be used for the preparation of an animal model of arthritic mice according to the present invention include, but are not limited to, ICR or DDY belonging to Closed Colony according to the systematic classification; BALB / cA, C57BL / 6N, C3H / HeN, DBA / 2N or CBA / N belonging to the Inbred; BDF1 (C57BL / 6 x DBA / 2), CDF1 (CBA / N x DBA / 2) or B6C3F1 (C57BL / 6 x C3H / HeN) belonging to the hybrid; BALB / c-nu belonging to the mutant (Mutant) or C, B-17SCID, and the like can be used. Preferably, c57BL / 6 mice can be used. The c57BL / 6 mouse is a near-field mouse often referred to as "C57 black 6" or simply "black 6 ". These species are most widely used as "genetic backgrounds" of genetically modified mice for human disease models, and they are used in a number of ways, including the availability of congenic strains, easy mating, robustness, Relationship and so on. In particular, the immune response from C57BL / 6 can be differentiated from other subpopulations such as BALB / c. For example, immunologic responses to the same pathogen in C57BL / 6 mice are contradictory in BALBb / c mice Can be seen.

따라서 본 발명은 상기와 같은 방법에 따라 관절염 마우스 동물모델을 제조하는 방법을 제공할 수 있으며, 또한, 상기 방법에 의해 제조된 관절염 마우스 동물모델을 제공할 수 있다.Accordingly, the present invention can provide a method of producing an animal model of arthritis mouse according to the above-described method, and also provide an animal model of arthritis mouse produced by the above method.

본 발명의 방법에 따라 제조된 관절염 마우스 동물모델은 통상적으로 사용되는 관절염 마우스 동물모델에 비해 관절염 지수와 관절염 발생비율이 증가되는 특징이 있다.The arthritis mouse animal model prepared according to the method of the present invention is characterized in that arthritis index and arthritis occurrence ratio are increased as compared with a commonly used arthritis mouse animal model.

앞서 종래기술에도 기술된 바와 같이, 현재 관절염 마우스 모델로 사용하고 있는 유일한 마우스 종으로 DBA/1(H-2a)가 사용되고 있다. 그러나 DBA/1(H-2a) 마우스는 관절염과 관련이 있는 주요 사이토카인 유전자변형 마우스들이 c57BL6가 사용되고 있기 때문에 보다 정확한 관절염의 메카니즘을 연구하는데는 한계가 있다. 또한, c57BL6 마우스에 관절염을 유도한 경우, 관절염 평가지수가 대부분 3점을 넘지 못하고 있어 관절염 연구를 위한 동물모델로 사용하기에는 충분하지 못한 문제점이 있다. As previously described in the prior art, DBA / 1 (H-2 a ) is used as the only mouse species currently used as an arthritis mouse model. However, DBA / 1 (H-2 a ) mice have limitations in studying the mechanism of osteoarthritis more precisely because c57BL6 is used in major cytokine transgenic mice that are associated with arthritis. In addition, when arthritis is induced in c57BL6 mice, the arthritis evaluation index does not exceed 3 points, which is insufficient for use as an animal model for arthritis research.

한편, 본 발명에서는 이러한 한계를 극복하기 위해 c57BL6 마우스를 대상으로 비만을 유도한 후, 2형 콜라겐 투여를 통해 관절염을 유발시킨 결과, 관절염 평가지수가 높고 발병지수 또한 우수하여 관절염 연구를 위한 동물모델로 사용하기에 충분하다는 사실을 알 수 있었다(도 1 참조).In order to overcome this limitation, in the present invention, osteoarthritis was induced by induction of obesity with c57BL6 mouse and then type 2 collagen. As a result, arthritis evaluation index was high and the onset index was also excellent. (See Figure 1).

이러한 결과는 또 다른 실험을 통해서도 확인되었는데, 즉, 본 발명의 일실시예에 따르면, 비만 유도후 관절염을 유발시킨 본 발명의 관절염 마우스 동물모델과 일반식이 섭취 후 관절염을 유발시킨 대조군 관절염 마우스 동물모델을 대상으로 혈청 중의 IgG2a의 양을 측정하였는데, 그 결과, 본 발명의 관절염 마우스의 경우, 혈청 중 IgG2a의 양이 대조군에 비해 현저하게 증가된 것으로 나타났다(도 2 참조).According to one embodiment of the present invention, an animal model of arthritic mice of the present invention, which induces arthritis after induction of obesity, and a control animal arthritis mouse animal model that induces arthritis after general dietary intake As a result, the amount of IgG2a in the serum of the arthritic mouse of the present invention was significantly increased as compared with that of the control group (see FIG. 2).

상기 본 발명의 일실시예에서 측정한 IgG2a는 Th1 면역반응의 지표로 알려져 있는데, 일반적으로 Th1 세포는 주로 IL-2, IFN-g, TNF-a를 분비하여 세포 면역반응을 일으켜 다른 세포 내로 침입하는 병원균에 대한 면역반응을 담당한다. 그러나 부적절한 Th1 면역반응은 다발성 경화증, 류마티스 관절염 또는 당뇨병과 같은 자가면역질환을 일으키는 것으로 알려져 있다.IgG2a, which is measured in one embodiment of the present invention, is known as an index of Th1 immune response. In general, Th1 cells secrete mainly IL-2, IFN-g and TNF-a to induce cell immune response, Responsible for immune responses to pathogens. However, an inappropriate Th1 immune response is known to cause autoimmune diseases such as multiple sclerosis, rheumatoid arthritis or diabetes.

따라서 본 발명에서 제작한 마우스 동물모델의 경우, 혈청 중의 IgG2a 양이 대조군에 비해 증가된 결과를 통해 Th1 면역반응에 의한 관절염이 잘 유발되었음을 알 수 있다.Therefore, in the mouse animal model prepared in the present invention, the amount of IgG2a in the serum was increased as compared with that of the control group, indicating that the arthritis caused by the Th1 immune response was well induced.

또한, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 본 발명에서 제작한 마우스 동물모델로부터 관절 절편을 수득한 후, 조직학적 검사를 수행한 결과, 대조군 마우스에 비해 관절 부분에 많은 면역 세포들이 침식되어 있는 것으로 나타났으며, 판누스가 형성되어 있고, 연골파괴 및 뼈 침식도 발생된 것으로 나타났다(도 3 참조).In addition, according to another embodiment of the present invention, after obtaining the joint slice from the mouse animal model prepared in the present invention, histological examination was performed, and it was found that many immune cells were eroded in the joint region (Fig. 3). It was found that pannus was formed, and cartilage destruction and bone erosion occurred (see Fig. 3).

뿐만 아니라 림프구 반응성을 분석하기 위해 본 발명에 따른 관절염 마우스 동물모델로부터 비장세포를 분리한 후, CD3 및 CII로 세포를 자극시킨 후, 티미딘을 이용하여 세포 반응성을 조사한 결과, 대조군에 비해 본 발명의 고지방식이 관절염 마우스의 경우 MLR 및 CPM값이 모두 높은 것으로 나타났다(도 4 참조).In addition, in order to analyze the lymphocyte reactivity, spleen cells were isolated from an animal model of arthritic mice according to the present invention, and cells were stimulated with CD3 and CII, and the cell reactivity was examined using thymidine. As a result, Of high-fat diet showed high MLR and CPM values in arthritic mice (see FIG. 4).

나아가 본 발명의 방법으로 제조한 관절염 마우스 동물모델은 Th17 세포가 증가된 특징이 있다.Furthermore, the arthritis mouse animal model prepared by the method of the present invention is characterized by an increased Th17 cell.

일반적으로 류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis)은 관절내 대식세포 및 T 세포 등 염증세포의 침윤 및 활막의 이상증식(hyperplasia)을 특징으로 하며, 분비되는 염증성 사이토카인들이 관절 파괴에 중요한 인자로 작용한다고 알려져 있고, 이러한 염증성 사이토카인으로는 인터루킨 1β(interleukin(IL)-1β)와 TNF-α가 주목을 받아왔으며, 최근에는 T 헬퍼 17(Th17)에서 분비되는 IL-17이 자가면역질환에서 중요한 역할을 한다는 보고가 계속되면서, IL- 17 또는 IL-23와 같은 사이토카인이 자가면역 관절염에서 새로운 치료 표적 사이토카인으로 주목을 받게 되었다. 특히 류마티스 관절염에서 IL-17은 Th17 림프구에서 생성되어 활막세포, 단핵구, 대식세포 및 연골세포 등에 작용함으로써 다양한 사이토카인을 유리시켜 관절의 염증 및 파괴에 주요한 역할을 한다.In general, rheumatoid arthritis is characterized by infiltration of inflammatory cells such as macrophages and T cells in the joints and hyperplasia of the synovial membrane, and that the secreted inflammatory cytokines act as an important factor in joint destruction IL-17, which is secreted by T helper 17 (Th17), plays an important role in autoimmune diseases. In addition, IL-17 plays an important role in autoimmune diseases such as inflammatory cytokines such as interleukin (IL) -1β and TNF- As the report continued, cytokines such as IL-17 or IL-23 became a new therapeutic target cytokine in autoimmune arthritis. In rheumatoid arthritis, IL-17 is produced in Th17 lymphocytes and acts on synovial cells, monocytes, macrophages and chondrocytes to play a major role in inflammation and destruction of joints by releasing various cytokines.

따라서 염증성 사이토카인인 IL- 17을 생산하는 Th17 세포가 증가된 본 발명에 따른 관절염 마우스 동물모델은 궁극적으로 관절염이 잘 유발되었고(도 5 참조), 종래 방법으로 제조되어 사용된 관절염 마우스 모델에서 관절염의 증상이 미비한 점을 보완하여 관절염 연구에 더욱 유용하게 사용할 수 있다는 사실을 알 수 있었다. Therefore, the animal model of arthritis mice according to the present invention in which Th17 cells producing IL-17, which is an inflammatory cytokine, is ultimately well induced (see Fig. 5) and arthritis mice model And it can be used for arthritis research more effectively.

그러므로 본 발명의 방법에 따라 제조된 관절염 마우스는 (a) 혈청 중 IgG2a의 농도 증가; (b) 관절에 면역세포들의 침식 발생; (c) 판누스(pannus) 형성; (d) 연골파괴 및 뼈 침식 발생; 및 (e) Th17 세포의 유도 증가로 이루어진 특성 중에서 선택되는 하나 이상의 특성을 갖는 것으로 나타났다.Therefore, arthritic mice prepared according to the method of the present invention are useful for (a) increasing the concentration of IgG2a in serum; (b) occurrence of erosion of immune cells in the joints; (c) formation of pannus; (d) cartilage destruction and bone erosion; And (e) increased induction of Th17 cells.

이에 본 발명자들은 먼저 고열량식이로 비만을 유도한 후, 2형 콜라겐과 같은 관절염 유도 방법을 적용하여 제조한 본 발명의 관절염 마우스 동물모델은 종래 관절염 마우스 모델에 비해 관절염 증상이 더욱 악화된 모델로서 관절염의 전임상적 동물모델로 사용하기에 적합한 특징이 있을 뿐만 아니라 종래 류마티스 관절염 질환과 직접적인 관련이 있는 각종 사이토카인의 유전자 변형 마우스들이 c57BL/6 마우스라는 점을 고려할 때, c57BL/6 마우스를 사용하여 제조한 본 발명의 관절염 마우스 동물모델은 그 유용가치가 더욱 크다고 할 수 있다.
Accordingly, the inventors of the present invention prepared an arthritis mouse animal model of the present invention, which was manufactured by inducing obesity using a high calorie diet and then applying an arthritis inducing method such as type 2 collagen, as compared with the conventional arthritis mouse model, In addition to being suitable for use as a preclinical animal model of rheumatoid arthritis, considering that the transgenic mice of various cytokines directly related to rheumatoid arthritis disease are c57BL / 6 mice, One useful animal model of arthritic mouse of the present invention is more useful.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, these examples are intended to further illustrate the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

<< 실시예Example 1> 1>

관절염 연구를 위한 마우스 모델의 제조Manufacture of mouse models for arthritis research

관절염 연구를 위한 마우스 모델을 제조하기 위해 먼저 4주령의 c57BL/6 마우스를 사육한 다음, 한 달 정도 지난 시점에서, 60Kcal 고열량 사료를 섭취하게 하여 몸무게가 약 30g이 되도록 하였고, 이때 대조군으로는 고열량 사료 대신 일반 사료를 먹인 마우스(대조군)로서 몸무게가 약 20g으로 양자 간에 평균 10g 정도의 차이가 있도록 하였다. 이후, 류마티스 관절염을 유발시키기 위해 고열량 사료로 비만을 유도한 c57BL6 마우스에 제2형 콜라겐과 CFA(complete freud's adjuvant)의 혼합용액을 접종하였는데, 제2형 콜라겐의 농도는 4mg/ml이 되도록 0.05N 아세트산 용액에 녹인 후, 여기에 4mg의 CFA(complete freud's adjuvant)를 첨가하여 균질기를 이용하여 혼합함으로써 관절염 유도를 위한 혼합용액을 제조하였다. 이후, 상기 혼합용액 중 100㎕를 마우스의 둔부 쪽 꼬리 기저부분과 복강의 꼬리 가까운 위치에 각각 피내(intradermal) 접종한 후, 다시 상기 용액을 소독한 3차 증류수에 1:10(용액:증류수)의 비율로 섞어준 다음, 200㎕를 복강에 1차 접종하였다. 상기 1차 접종 후, 14일 후에 다시 4mg의 2형 콜라겐과 IFA(incomplete freud's adjuvant) 혼합용액을 상기 1차 접종 때와 같은 방법으로 제조한 뒤에, 꼬리 기저 쪽의 두 군데에 나누어서 피내(intradermal)로 100㎕씩 2차 접종하였다. 이때 식이 사료는 실험기간 동안 계속 공급해 주었고, 상기 접종을 통해 관절염 마우스 모델을 제조하였다.
Four weeks old c57BL / 6 mice were first raised to prepare a mouse model for arthritis research, and about one month later, a 60Kcal high calorie diet was administered to obtain a body weight of about 30 g. As a control group, As a mouse fed with a general diet (control group) instead of feed, the body weight was about 20 g, and the difference between them was about 10 g on average. Then, in order to induce rheumatoid arthritis, a mixed solution of type 2 collagen and complete freud's adjuvant (CFA) was inoculated into c57BL6 mice inducing obesity with a high calorie feed. The concentration of type 2 collagen was 0.05N Acetic acid solution, mixed with 4 mg CFA (complete freud's adjuvant) and homogenized to prepare a mixed solution for induction of arthritis. Then, 100 쨉 l of the mixed solution was inoculated intradermally to the base of the tail of the mouse and the vicinity of the tail of the abdominal cavity, and then the solution was sterilized and sterilized at a ratio of 1:10 (solution: distilled water) , And then 200 쨉 l was inoculated into peritoneal cavity for the first time. After 14 days from the first inoculation, again 4 mg of type II collagen and IFA (incomplete freud's adjuvant) mixed solution was prepared in the same manner as in the first inoculation, and then divided into two parts of the tail base, Were inoculated at a dose of 100 쨉 l each. At this time, dietary feeds were continuously supplied during the experiment period, and an arthritic mouse model was prepared through the inoculation.

<< 실시예Example 2> 2>

비만식이Obesity diet 관절염 마우스 모델의 관절염 지수와 관절염 발생 비율의 확인 Determination of arthritis index and arthritis incidence rate in arthritis mouse model

상기 실시예 1의 방법으로 제조된 관절염 마우스 모델을 대상으로 관절염이 제대로 유발되었는지 확인하기 위해, 관절염 유발군 및 대조군을 각각 6마리씩으로 나눈 뒤, 10주까지 관절염 평가를 수행하였으며, 관절염 평가는 시험관내(in vitro) 시험을 위해 10주가 되는 시기에 각 동물을 치사시켜 혈액, 세포, 관절조직 내에서 관절염의 활성 정도 및 각종 시험관내 실험을 다음과 같이 수행하였다.
In order to confirm whether or not arthritis was properly induced in the arthritis mouse model prepared by the method of Example 1, arthritis evaluation was performed for 10 weeks after dividing the arthritis-induced group and the control group into 6 mice each, For in vitro testing, each animal was sacrificed at the age of 10 weeks, and the degree of activity of arthritis in the blood, cells, and joint tissues and various in vitro experiments were performed as follows.

<2-1> <2-1> 질환 모델의 관절염 유효성 평가Evaluation of arthritis efficacy in disease models

관절염의 평가(Mean arthritic index)는 잘 알려져 있는 프로토콜(Current protocols in immunology. vol.2. p15.5-11. John Wiley & Sons, New Yo가 NY, 1996)에 기준하여 마우스 당 아래의 척도에 따라 매긴 접수를 합하여 3으로 나눈 평균치를 얻고 다시 각 마우스에서 3명의 관찰자가 얻은 수치를 합산하여 나눈 평균치를 사용하였다. 평가기준은 다음과 같다.
The mean arthritic index is based on the well-known protocol (Current Protocols in Immunology. Vol.2, p15.5-11, John Wiley & Sons, New Yo, NY, 1996) The mean values obtained by dividing the sum of the received values by 3 and dividing the values obtained by the three observers in each mouse were used again. The evaluation criteria are as follows.

<평가기준><Evaluation Criteria>

0점 :　부종이나 종창이 없다.0 point: No edema or swelling.

1점 : 발 또는 발목관절에 국한된 경한 부종과 발적1 point: mild swelling and redness limited to the foot or ankle joint

2점 : 발목관절에서 족근골 (Metatarsal bone)에 걸친 경한 부종과 발적2 points: Mild swelling and redness from ankle joint to metatarsal bone

3점 : 발목관절에서 족근골에 걸친 중등도의 부종과 발적3 points: Moderate edema and redness from ankle joint to foot

4점 : 발목에서 다리 전체에 걸쳐 부종과 발적이 있는 경우
4 points: with edema and redness across the entire ankle

<2-2> <2-2> 발병율Incidence rate (( incidenceincidence ) 관찰) observe

마우스 다리가 붓게 되면 25%로 측정하여 네 다리의 합을 100%로 계산하여 평균치를 얻고 다시 각 마우스에서 3명의 관찰자가 얻은 수치를 합산하여 나눈 평균치를 사용하였다.
When the mouse leg was swollen, the average value was obtained by calculating 25% of the sum of the four legs and 100% of the sum of the three legs of each mouse.

상기와 같은 관절염 유효성 및 발병율 관찰 결과, 고지방식을 먹인 관절염 유도 모델이 정상식이를 한 관절염 유도 모델에 비해 관절염 지수가 높게 유지되는 것으로 나타났으며, 관절염 발병율(incidence) 또한 고지방식이 관절염 모델에서 지속적으로 증가되는 것으로 나타났다(도 1 참조).
As a result of observing the efficacy and incidence of arthritis as above, arthritis induction model fed with high fat diet showed a higher arthritis index than that induced by normal diet, and incidence of arthritis was also higher in arthritis model (See FIG. 1).

<< 실시예Example 3> 3>

비만식이Obesity diet 관절염 마우스 모델의 혈청학적 검사  Serological examination of arthritis mouse model

혈청학적인 실험으로 CII에 특이적인 IgG와 IgG2a 항체의 아형을 측정하기 위해 효소결합 면역측정법(ELISA)을 수행하였는데, 통상적으로 마우스의 경우 IgG2a는 염증반응을 촉진하고 매개하는 인자로 작용한다고 알려져 있으며, 관절염이 유도될 경우, 전체적인 IgG는 증가되고 또한 IgG2a가 특이적으로 증가되는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명에서 제작한 관절염 마우스 모델을 대상으로 IgG와 IgG2a의 양을 측정하였다. 이를 위해, 각 시험군의 혈청을 1:5000으로 희석한 후 통상적인 방법인 ELISA을 이용하여 CII 특이적인 혈청 내 IgG와 IgG2a의 양을 측정하였다.
Serologically, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) were performed to determine the subtypes of IgG and IgG2a antibodies specific to CII. IgG2a is known to act as a mediator of inflammatory responses, When arthritis is induced, it is known that total IgG is increased and IgG2a is specifically increased. Therefore, the amount of IgG and IgG2a was measured in the arthritic mouse model produced in the present invention. For this purpose, the serum of each test group was diluted to 1: 5000 and the amount of IgG and IgG2a in CII-specific serum was measured using a conventional ELISA.

그 결과, 고지방식이를 섭취하게 한 후 관절염을 유도한 마우스의 경우 정상식이 마우스 보다 전체적으로 IgG가 감소되는 경향으로 나타났으며 반면 Th1 타입인 CII 특이적인 IgG2a의 생성은 더 증가된 것으로 나타났다(도 2 참조).As a result, mice fed with high-fat diet and fed with arthritis showed a tendency that the IgG was decreased as a whole compared with that of the mouse, whereas the production of CII-specific IgG2a of Th1 type was further increased 2).

따라서 상기 결과를 통해 본 발명에서 제작된 관절염 마우스 모델의 경우 IgG2a의 생성이 증가되어 염증반응이 유발되었음을 알 수 있었다.
Therefore, it can be seen from the above results that the production of IgG2a in the arthritic mouse model produced by the present invention was increased and inflammation reaction was induced.

<< 실시예Example 4> 4>

조직학적 검사Histological examination

고지방식이 마우스와 정상식이 마우스에 관절염(Collagen Induced Arthritis)을 유발시킨 후, 관절염 지수가 그대로 유지되는 10주 경에 시험동물을 치사시킨 후, 마우스의 뒷발을 10% 포르말린(Formalin)으로 고정시키고 뼈에서 석회질을 제거한 후 파라핀으로 블록을 만들었다. 관절 절편(7um)을 준비하고 헤마톡실린(Hematoxylin)과 에오신(Eosin)으로 관절 절편을 염색하였다. 또한 연골파괴 정도를 확인하기 위하여 톨루이딘 블루(Toluidin blue)와 사프라닌 O (Safranin O) 염색으로 조직학적 검사를 실시하였다.
After high-fat diet induces collagen-induced arthritis in mice and normal mice, the test animals were sacrificed at about 10 weeks in which the arthritic index remained intact, and the hind paws of the mice were fixed with 10% formalin After removing the calcite from the bones, blocks were made with paraffin. Joint sections (7 μm) were prepared and stained with hematoxylin and eosin. Histological examinations were also performed by staining with toluidine blue and safranin O to confirm the extent of cartilage destruction.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 고지방식이를 섭취하게 한 후 관절염을 유발한 마우스의 경우, 정상식이의 마우스 모델에서보다 많은 면역 세포들이 관절에 침식(Infiltration)되어 있었으며 판누스(Pannus)의 형성, 연골파괴 및 뼈 침식 등이 관찰되었다.
As a result, as shown in FIG. 3, in the case of the mice that induced arthritis after ingesting the high-fat diet, more immune cells were infiltrated into the joints than in the mouse model of the normal diet, , Cartilage destruction and bone erosion were observed.

<< 실시예Example 5> 5>

고지방식이 관절염 모델에서의 림프구 반응성 검사Lymphocyte reactivity test in high fat diet arthritis model

고지방식이 관절염 모델과 정상식이 관절염 모델의 10주 시점에서 실험동물을 치사시킨 후, 비장을 적출하여 비장세포를 분리하여 아무것도 자극하지 않은 그대로의 세포와 CD3 0.5ug/ml, 1ug/ml, 2ug/ml과 CII 40ug/ml로 5일동안 자극을 해주고 측정하기 18시간 전에 티미딘(Thymidine)을 처리해서 세포의 증식 반응성을 조사하였다.
The animals were sacrificed at 10 weeks of high fat diet arthritis model and normal diet arthritis model, and the spleen was excised and spleen cells were isolated and seeded with untreated cells and 0.5 μg / ml, 1 μg / ml, 2 μg / ml and CII 40ug / ml for 5 days, and 18 hours before the measurement, thymidine was treated to examine the proliferative activity of the cells.

그 결과, 고지방식이 관절염 모델이 정상식이 관절염 모델에 비해 높은 MLR의 CPM 값을 나타내었다.
As a result, the high fat diet arthritic model showed a higher MLR CPM value than the arthritic model of the normal diet.

<< 실시예Example 6> 6>

고지방식이 관절염 모델에서의 High-fat diet in arthritic models Th17Th17 세포의 증가 확인 Confirmation of cell growth

고지방식이 관절염 모델에서 Th17 세포를 관찰하기 위해 고지방식이 마우스와 정상식이 마우스에 관절염(Collagen Induced Arthritis)을 유발하여 관절염 지수의 지수가 그대로 유지되는 10주 시점에 시험동물을 치사시킨 후, 비장세포에서 Th17 세포를 유세포 분석기(Fluorescence activated cell sorter, FACS)를 이용하여 IL-17을 발현하는 세포의 유도 정도를 관찰하였다.
In order to observe Th17 cells in the high fat diet-induced arthritic model, the test animals were sacrificed at 10 weeks in which the high fat diet induced the collagen induced arthritis in the mouse and the normal diet, Th17 cells were induced to induce IL-17-expressing cells using a fluorescence activated cell sorter (FACS).

그 결과, 고지방식이 관절염 유도 모델의 경우 골파괴 기전과 관련이 있는 Th17 세포가 정상식이 마우스 모델에 비해 현저하게 증가된 것으로 나타났다(도 5 참조).
As a result, in the case of the high fat diet-induced arthritis induction model, the expression of Th17 cells correlated with the bone destruction mechanism was markedly increased compared to the mouse model (see FIG. 5).

따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 고지방식이로 비만을 유도한 후, 제2형 콜라겐을 투여한 마우스의 경우, 관절염이 용이하게 발생함을 확인함으로써 본 발명의 경우 관절염 연구를 위한 마우스 모델을 용이하게 제작할 수 있음을 알 수 있었다.
Accordingly, the inventors of the present invention confirmed that arthritis easily occurs in a mouse administered with type 2 collagen after induction of obesity by a high-fat diet, and thus the mouse model for arthritis research can be easily It can be seen that

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.The present invention has been described with reference to the preferred embodiments. It will be understood by those skilled in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. Therefore, the disclosed embodiments should be considered in an illustrative rather than a restrictive sense. The scope of the present invention is defined by the appended claims rather than by the foregoing description, and all differences within the scope of equivalents thereof should be construed as being included in the present invention.

Claims (9)

마우스에게 고열량의 사료를 섭취시켜 비만을 유도하는 단계; 및
상기 비만 마우스에 2형 콜라겐을 투여하여 관절염을 유발시키는 단계를 포함하는 관절염 마우스 동물모델의 제조방법.Inducing obesity in a mouse by feeding a high calorie feed; And
And inducing arthritis by administering type 2 collagen to said obesity mouse. 제1항에 있어서,
상기 2형 콜라겐을 투여하는 단계는 2형 콜라겐을 1차 접종한 후 마우스를 일정기간 사육한 다음, 다시 2차 접종하는 것을 특징으로 하는 관절염 마우스 동물모델의 제조방법.The method according to claim 1,
Wherein the step of administering the type 2 collagen comprises the step of first inoculating the type 2 collagen, then raising the mouse for a certain period of time, and then inoculating it again. 제2항에 있어서,
상기 1차 접종은 2형 콜라겐과 CFA(complete freud's adjuvant)를 동량으로 혼합한 혼합용액을 투여하는 것이고, 상기 2차 접종은 2형 콜라겐과 IFA(incomplete freud's adjuvant)를 동량으로 혼합한 혼합용액을 투여하는 것을 특징으로 하는 관절염 마우스 동물모델의 제조방법.3. The method of claim 2,
The first inoculation is to administer a mixed solution of an equal amount of type 2 collagen and complete freud's adjuvant (CFA). In the second inoculation, a mixed solution of two types of collagen and IFA (incomplete freud's adjuvant) Wherein said method comprises administering to said animal an animal model of arthritis. 제3항에 있어서,
상기 1차 접종 또는 2차 접종은 상기 혼합용액을 마우스의 둔부 또는 꼬리 쪽 복강에 피내(intradermal)로 투여하는 것을 특징으로 하는 관절염 마우스 동물모델의 제조방법.The method of claim 3,
Wherein said first inoculation or second inoculation is performed by intradermally administering said mixed solution to the buttocks or tail side abdominal cavity of a mouse. 제2항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 1차 접종은 고열량의 사료를 섭취한 마우스의 몸무게가 일반사료를 섭취한 마우스 몸무게의 1.5~2배가 되는 시기에 이루어지는 것을 특징으로 하는 관절염 마우스 동물모델의 제조방법.5. The method according to any one of claims 2 to 4,
Wherein the primary inoculation is performed at a time when the weight of the mouse consuming the high calorie feed is 1.5 to 2 times the weight of the mouse that consumes the general diet. 제2항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서,
상기 2차 접종은 상기 1차 접종 후 10일 내지 15일 후에 이루어지는 것을 특징으로 하는 관절염 마우스 동물모델의 제조방법.5. The method according to any one of claims 2 to 4,
Wherein the second inoculation is performed 10 to 15 days after the first inoculation. 제1항에 있어서,
상기 마우스는 c57BL/6 마우스인 것을 특징으로 하는 관절염 마우스 동물모델의 제조방법.The method according to claim 1,
Wherein said mouse is a c57BL / 6 mouse. 제1항의 방법에 의해 제조된 관절염 마우스 동물모델.An animal model of arthritis mice produced by the method of claim 1. 제8항에 있어서,
상기 관절염 마우스 동물모델은, (a) 혈청 중 IgG2a의 농도 증가; (b) 관절에 면역세포들의 침식 발생; (c) 판누스(pannus) 형성; (d) 연골파괴 및 뼈 침식 발생; 및 (e) Th17 세포의 유도 증가로 이루어진 특성 중에서 선택되는 하나 이상의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 관절염 마우스 동물모델.


9. The method of claim 8,
The arthritic mouse animal model can be used to (a) increase the concentration of IgG2a in serum; (b) occurrence of erosion of immune cells in the joints; (c) formation of pannus; (d) cartilage destruction and bone erosion; And (e) an increase in the induction of Th17 cells.


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