KR101144326B1 - Phospholipase C???deficiency mice as an animal model for testing absence seizures - Google Patents
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Abstract
본 발명의 PLCβ4 유전자 결손 마우스는 압상스 간질의 특징인 SWD가 관찰되며, 압상스 간질의 치료제를 투여하였을 때에 SWD가 감소되므로, 상기 PLCβ4 유전자 결손 마우스를 압상스 간질 치료제 효과 검증 동물모델로서 유용하게 사용할 수 있다.In the PLCβ4 gene-deficient mouse of the present invention, SWD, which is characteristic of Apex epilepsy, is observed, and SWD decreases when a therapeutic agent for Apex epilepsy is administered, and thus, the PLCβ4 gene-deficient mouse is useful as an animal model for verifying the effect of Apex epilepsy treatment. Can be used.
Description
본 발명은 PLCβ4(Phospholipase C β４) 유전자 결손 마우스 및 이를 압상스 간질(absence seizure) 치료제 효과 검증 동물모델로 이용한 압상스 간질의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a PLCβ4 (Phospholipase C β4) gene-deficient mouse and a composition for the prevention and treatment of Apoptosis epilepsy using the same as an animal model for verifying the effect of Absence seizure treatment.
간질이란 의식 상실과 함께 처음에는 강직성, 이어서 간대성(間代性)의 경련을 나타내는 발작성 질환으로 그 원인에는 내측두 경화증, 뇌종양, 외상, 뇌졸중, 선천적 장애, 뇌 감염이 있으며, 거의 유전되지 않는다고 알려져 있다. Epilepsy is a paroxysmal disorder that initially manifests with stiffness and then with spasms of constipation, which is caused by medial sclerosis, brain tumors, trauma, strokes, congenital disorders, and brain infections. Known.
간질의 종류는 크게 전신 발작(generalized seizure), 부분 발작(partial seizure)이 있다. 전신 발작은 대뇌 전체에서 동시에 발작이 시작되며, 임상적으로는 신체 좌우 모두에서 일시에 시작되고, 의식 소실을 동반하여 뇌파 검사 시 양쪽 대뇌에서 전반적으로 간질파가 나타난다. 전신 발작의 종류에는 강직 간대 발작, 소 발작, 근간대성 발작, 실조성 발작 등이 있다. 강직 간대 발작은 대발작이라고도 불리우며, 가장 흔한 형태로서 전조 증상이 없는 상태에서 갑자기 의식 소실이 되며, 전신의 근육에 경련이 온다. 발작의 현상은 몸이 굳는 강직기, 몸을 떠는 간대기를 거친 후, 발작을 마치게 된다. 소발작은 주로 5~7세의 유아기에 자주 발생되며 사춘기가 되면 없어진다고 알려져 있다. 보통 수 초 동안의 의식 소실과, 눈이 깜박거림, 가벼운 근육 경련이 동반된다. 근간대성 발작은 의식 변화는 별로 없이 마치 깜짝 놀라 듯 전신의 근육이 순간적으로 수축하는 현상을 보인다. 실조성 발작은 경축과 정반대로 깜짝 놀라며 힘이 빠지는 듯한 발작을 말한다. Epilepsy is divided into generalized seizure and partial seizure. A generalized seizure begins at the same time throughout the cerebrum, clinically at the same time on both the left and right sides of the body, and with episodic loss. Types of generalized seizures include tonic seizures, bovine seizures, myoclonic seizures, and ataxia. Rigid liver seizures are also called large seizures and are the most common form of sudden loss of consciousness in the absence of prognostic symptoms and convulsions in the muscles of the whole body. The symptoms of the seizure are after the body's rigidity and stiffness, the body finishes the seizure. Minor seizures often occur in infants aged 5-7 years, and are known to disappear in puberty. Usually a few seconds of loss of consciousness, blinking eyes, and mild muscle spasms. Myoclonic seizures show a sudden contraction of the muscles of the whole body, as if to startle with little change in consciousness. A stereotyped seizure is a seizure that seems to be startling and weak, in contrast to celebration.
부분 발작은 발작을 시작하면서 전조증상을 특징으로 한다. 부분 발작은 의식의 혼탁 여부에 따라 복합 부분 발작과 단순 부분 발작으로 구별하나, 초기에 부분 발작의 증상이 간질파가 양쪽 뇌로 펴지면서 전신 발작으로 이행되는 경우도 발생한다고 알려져 있다. 전체 간질의 2/3를 차지하는 복합 부분 발작은 사람마다 양상이 매우 다르며, 경미한 경우에는 소발작과 심한 경우에는 대발작과 비슷한 형태를 보이기 때문에, 가장 진단하기 어렵다. 환청, 환취, 환시 등의 전조 증상으로 통해 발작된 후, 손, 발, 입 등에 자신도 모르는 반복적인 행동(자동증, automatism)을 보이거나, 몸을 한쪽으로 돌리거나, 소리를 지르거나 한쪽 팔, 다리에만 힘을 주는 듯한 행동을 보이나, 환자는 이러한 증상을 인식하지 못한다고 알려져 있다. 단순 부분 발작의 경우, 특정한 기능을 담당하는 뇌의 한 부분에서 국소적으로 일어나며, 일반적인 형태로 뇌의 운동 피질이나 감각 피질에서 발생된다고 알려져 있다. Partial seizures are characterized by prognostic symptoms at the onset of a seizure. Partial seizures are classified into complex partial seizures and simple partial seizures, depending on the consciousness of the consciousness. However, it is known that the symptoms of partial seizures are sometimes shifted to generalized seizures as the epileptic waves spread to both brains. Complex partial seizures, which account for two-thirds of all epilepsy, are very different from person to person, and are the most difficult to diagnose because they are similar to minor attacks in mild cases and major ones in severe cases. After having seizures due to hallucinations, hallucinations, and hallucinations, he or she may exhibit repetitive behavior (automatism), turn his body to one side, shout or scream It is known that the legs seem to give strength only, but patients are not aware of these symptoms. In the case of simple partial seizures, it occurs locally in one part of the brain responsible for a specific function, and is known to occur in the motor or sensory cortex of the brain in a general form.
압상스 간질(absence seizure)은 발작을 동반하지 않는 간질의 한 종류로, 의식을 잠시 잃는 현상과 함께 특정적인 뇌파인 SWD(spike and wave discharge)를 특징으로 보이며, 시상피질(thalamocortical, TC) 신경 세포에서는 저전압 의존성 다발성 발화가 동반되는 것으로 알려져 있다. 6세 정도의 유아기에 발생하는 형태 또는 12세 정도의 청소년기에 발생되는 형태로 구분할 수 있으며, 여성에게 발생되는 경우가 높다고 알려져 있으며, 과호흡과 섬광자극에 의해서 발작이 일어난다고 보고되었다. 어린 아이들에게 발생되는 간질의 10% 유병률을 갖는 간질의 형태이나, 그 기전에 관해서는 아직 자세히 밝혀져 있지 않아 치료법이 확립되지 않은 상태이다. Absence seizure is a type of epilepsy that does not involve seizures, and is characterized by a specific brain wave, SWD (spike and wave discharge) with a brief loss of consciousness, and a thalamic cortex (TC) nerve Cells are known to be accompanied by low voltage dependent multiple ignition. It can be classified into the form occurring in infancy of about 6 years old or in the form of adolescence of about 12 years old. It is known to occur in women, and seizures are reported by hyperventilation and scintillation stimulation. The epilepsy type with a 10% prevalence of epilepsy in young children, but its mechanisms have not yet been elucidated, and no treatment has been established.
압상스 간질의 치료는 발작을 동반한 의식 상실기간 동안 발생할 수 있는 부상을 방지하거나, 빈번히 발생하는 간질 때문에 발생할 수 있는 일상의 생활 또는 기억의 문제를 해결하기 위하여, 간질의 발생을 감소시키는 데에 목표를 두고 있으며, 간질보다 심각한 부작용이 발생되지 않도록 하는데에 중점을 두고 있다. Absinus epilepsy treatment can be used to reduce the incidence of epilepsy in order to prevent injuries that may occur during a loss of consciousness with seizures, or to solve everyday life or memory problems that may occur due to frequent epilepsy. It aims to ensure that no serious side effects occur than epilepsy.
현재 간질 치료제에는 경구용으로 페니토인(Phenytoin), 카바마제핀(Carbamazepine), 발프로익에시드(Valproic acid), 페노바비탈(Phenobarbital), 에토숙시마이드(Ethosuximide), 클로나제팜(Clonazepam), 클로바잠(clobazam), 프리미돈(Primidone) 등을 사용하였다. 최근에는 비가바트린(vigabatrin), 조니사마이드(Zonisamide), 라모트리진(Lamotrigine), 토피라메이트(topiramate), 옥스카바제핀(Oxcarbazepine) 및 가바펜틴(Gabapentine) 등의 신약을 사용한 간질의 치료가 활발히 이루어지고 있다. 그러나 간질 환자의 약물치료의 결과를 살펴보면, 한 가지의 약물로 조절되는 경우가 전체의 60~70% 정도이며, 나머지 20~25% 정도는 여러 가지 약을 병용 투여해야 되며, 나머지 10% 남짓의 환자의 경우는 어떤 약을 써도 간질이 적절히 조절되지 않는 문제를 가지고 있다. Current treatments for epilepsy include oral phenytoin, carbamazepine, valproic acid, phenobarbital, ethosuximide, clonazepam, clovazam clobazam), primidone and the like. Recently, treatment of epilepsy using new drugs such as vigabatrin, Zonisamide, Lamotrigine, Topiramate, Oxcarbazepine and Gabapentine has been actively performed. have. However, if you look at the results of the drug treatment of epilepsy patients, 60% to 70% of the cases are controlled by one drug, and the other 20% to 25% should be co-administered, and the remaining 10% Patients have the problem that epilepsy is not properly controlled by any medication.
더욱이 사용되는 이러한 약물은 부작용을 가지고 있으며, 클로나제팜의 경우, 짧은 시간에 효과가 나타나지만, 약에 대한 내성이 쉽게 생기고, 부작용이 빈번히 발생되는 것으로 알려져 있어서 권장되지 않고 있다. 이외에도 간손상을 일으킬 수 있다고 알려져있다. 비록 이러한 약물들이 압상스 간질에 효과가 있으나, 상기의 부작용을 유발할 수 있으며, 간질의 원인에 따른 처방이 다르기 때문에 반드시 의사의 정확한 간질 진단을 받은 후 치료제를 복용하는 것이 바람직하다.
Moreover, such drugs used have side effects, and in the case of clonazepam, it is effective in a short time, but is not recommended because it is known that drug resistance easily occurs and side effects occur frequently. In addition, it is known to cause liver damage. Although these drugs are effective for Apex epilepsy, they may cause the above side effects, and since the prescription according to the cause of epilepsy is different, it is preferable to take a therapeutic agent after accurately diagnosing the epilepsy.
이에 본 발명자들은 압상스 간질의 치료제를 개발하고자, 포스포리파제β4(Phospholipase C beta4, PLCβ4) 유전자 결손 마우스를 제작하여, PLCβ4 유전자 결손 마우스에서 압상스 간질의 특징인 SWD를 관찰됨을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
Therefore, the present inventors made a phospholipase β4 (PLCβ4) gene-deficient mouse to develop a therapeutic agent for Apax epilepsy, and confirmed that SWD, which is a characteristic of Apex epilepsy, was observed in PLCβ4 gene-deficient mice. The invention was completed.
본 발명의 목적은 PLCβ4 유전자 결손 마우스를 압상스 간질(absence seizure) 치료제 효과 검증 동물모델로의 용도를 제공하는 것이다.
It is an object of the present invention to provide the use of a PLCβ4 gene deficient mouse as an animal model to verify the effectiveness of Absence seizure therapeutics.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 압상스 간질 치료제 효과 검증 모델로서 PLCβ4 유전자 결손 동물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a PLCβ4 gene-deficient animal as a model for verifying the effectiveness of Apax epilepsy therapeutics.
아울러, 본 발명은 PLCβ4 유전자 결손 동물을 이용한 압상스 간질 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
In addition, the present invention provides a method for screening and preventing Apex epilepsy using a PLCβ4 gene deficient animal.
본 발명의 PLCβ4 유전자 결손 마우스는 압상스 간질의 특징인 SWD가 관찰되며, 압상스 간질의 치료제를 투여하였을 때에 SWD(spike-and-wave discharge) 뇌파가 감소되므로, PLCβ4 유전자 결손 마우스를 압상스 간질 치료제 효과 검증 동물모델로서 유용하게 사용할 수 있다.
In the present invention, the PLCβ4 gene-deficient mouse was observed to have SWD, which is a hallmark of Apex epilepsy, and the spiked-and-wave discharge (SWD) brain waves were reduced when the therapeutic agent for Apex epilepsy was administered. Therapeutic effect verification It can be usefully used as an animal model.
도 1은 PLCβ4 유전자 결손 마우스에서 보이는 자발성 압상스 간질을 나타낸 그림이다:
도 1의 A는 PLCβ4 유전자 결손 마우스에 에토숙시미드(Ethosuximide)를 투여 전후의 뇌전도(electroencephalogram, EEG)를 전두엽(frontal cortex)과 시상 전달핵의 복기저군(ventrobasal complex)에서 관찰한 그림이다;
Cx: 전두엽;
VB: 복기저군;
도 1는 B는 PLCβ4 유전자 결손 마우스에서 관찰된 SWD 횟수를 나타낸 그래프이다;
도 1의 C는 자발성 SWD의 파워 스페트럼(Power spectrum) 결과를 나타낸 그래프이다;
Averaged Power: 각 동물의 주파수 파워 스펙트럼의 평균;
SEM: 평균의 표준오차;
도 1의 D는 에토숙시미드를 투여 전후의 SWD를 관찰한 그래프이다;
before: 약물 투여전;
veh: 염화 나트륨(NaCl)을 투여한 대조군; 및
ETX: 에토숙시미드를 투여한 군.
도 2는 PLCβ4 유전자 결손 마우스의 시상전달 신경세포에서 증가한 다발성 경화를 나타낸 그림이다:
도 2의 A는 정상 마우스의 시상 전달 신경세포에 탈분극 전류를 흘려 단일 발화를 유도한 뒤 다발성 발화가 관찰되지 않은 결과를 나타낸 그림이다;
도 2의 B는 PLCβ4 유전자 결손 마우스의 시상 전달 신경세포에 탈분극 전류를 흘려 단일 발화를 유도한 뒤 신경세포가 다발성 발화 모드로 전환되는 것이 관찰되는 그림이다
도 2의 C는 정상 마우스의 시상 전달 신경세포에 세포막을 -65mV로 과분극시킬 정도의 전펄스(prepulse)를 주입하였을 때, 다발성 발화가 관찰되지 않은 결과를 나타낸 그림이다;
도 2의 D는 PLCβ4 유전자 결손 마우스의 시상 전달 신경세포에 세포막을 -65mV로 과분극 시킬 정도의 전펄스를 주입하였을 때, 관찰되는 다발성 발화를 나타낸 그림이다; 및
도 2의 E는 -73 ~ -63mV의 펄스(pulse)를 주입하였을 때에 PLCβ4 유전자 결손 마우스와 정상 마우스에서 관찰된 다발성 발화의 스파이크(spike)의 수를 나타낸 그림이다.
도 3은 PLCβ4 유전자 결손 마우스의 압상스 간질 약물 투입 후, 감소된 SWD를 나타낸 그림이다:
도 3의 A는 PLCβ4 유전자 결손 마우스와 정상 마우스에 감마부티로락톤(γ-butyrolactone) 투여 전후의 EEG를 전두엽과 시상전달핵의 복기저군에서 관찰한 그림이다;
Cx: 전두엽;
VB: 복기저군;
GBL: 감마부티로락톤(γ-butyrolactone);
도 3의 B는 감마부티로락톤을 주입 후 PLCβ4 유전자 결손 마우스와 정상 마우스에서 관찰되는 SWD를 나타낸 그림이다;
도 3의 C는 RS(+/-)-baclofen을 주입 후 PLCβ4 유전자 결손 마우스와 정상 마우스에서 관찰되는 SWD를 나타낸 그림이다;
도 3의 D는 감마부티로락톤을 주입 후 PLCβ4 유전자 결손 마우스와 정상 마우스에서 관찰되는 파워 스펙트럼을 나타낸 그림이다; 및
도 3의 E는 RS(+/-)-baclofen을 주입 후 PLCβ4 유전자 결손 마우스와 정상 마우스에서 관찰되는 파워 스펙트럼을 나타낸 그림이다.
도 4는 LV-shPLCβ4 벡터를 시상에 마이크로인젝션(microinjection) 후 관찰되는 시상 국소적 PLCβ4 단백질의 발현 감소를 나타낸 그림이다:
도 4의 A는 정상 마우스의 시상과 전두엽 부분에서 PLCβ4 단백질의 발현을 나타낸 그림이다;
도 4의 B는 PLCβ4 유전자 결손 마우스의 시상과 전두엽 부분에서 PLCβ4 단백질의 발현을 나타낸 그림이다;
도 4의 C는 pKLO 벡터를 시상에 마이크로인젝션한 후 PLCβ4 유전자 결손 마우스의 시상과 전두엽 부분에서 PLCβ4 단백질의 발현을 나타낸 그림이다;
pKLO-control: 비특이적인 대조군 벡터;
도 4의 D는 LV-shPLCβ4 벡터를 시상에 마이크로인젝션한 후 정상 마우스의 시상과 전두엽 부분에서 PLCβ4 단백질의 발현을 나타낸 그림이다; 및
shPLCβ4: PLCβ4의 short hairpin RNA를 포함하는 렌티 바이러스 벡터.
도 5는 시상 전달핵 제한적으로 PLCβ4 유전자 결손된 마우스에서 관찰된 압상스 간질을 나타낸 그림이다:
도 5의 A는 pKLO 벡터와 LV-shPLCβ4 벡터를 각각 시상에 제한적으로 마이크로 인젝션한 후 EEG를 기록한 그림이다;
Frontal Cx: 전두엽;
Pariel Cx: 두정엽 ;
도 5의 B는 LV-shPLCβ4 벡터를 마이크로인젝션한 후 SWD의 수를 나타낸 그래프이다;
도 5의 C는 pKLO 벡터와 LV-shPLCβ4 벡터를 각각 시상에 제한적으로 마이크로 인젝션한 후, RS(+/-)-baclofen를 투여하여 발생되는 SWD의 지속 시간을 비교한 그래프이다; 및
control: pKLO 벡터를 마이크로인젝션한 군.
도 6은 PLCβ4 유전자 결손 마우스에 시상 전달해 제한적으로 PKC 작용 활성제와 칼슘 채널 억제제를 마이크로인젝션하였을 때 감소되는 SWD를 나타낸 그림이다:
도 6의 A는 PLCβ4 유전자 결손 마우스에 PDD를 주입전, 후의 EEG를 나타낸 그림이다;
PDD: 포르볼 12,13-디데카노에이트(phorbol 12,13-didecanoate);
도 6의 B는 PDD, 미베프라딜(mibefradil), 니페디핀(nifedipine)의 투여전, 후의 SWD가 발생한 수를 비교한 그래프이다;
before: 약물투여 전;
Mibe: 미베프라딜(mibefradil); 및
Nif: 니페디핀(nifedipine).1 is a diagram showing spontaneous Apix epilepsy seen in PLCβ4 gene deficient mice:
FIG. 1A shows the electroencephalogram (EEG) before and after administration of etosuximide to PLCβ4 gene deficient mice in the frontal cortex and ventrobasal complex of the thalamus transfer nucleus; FIG.
Cx: frontal lobe;
VB: Respiratory Base Group;
1 is a graph showing the number of SWD observed in PLCβ4 gene deficient mice;
1C is a graph showing the power spectrum of the spontaneous SWD;
Averaged Power: average of the frequency power spectrum of each animal;
SEM: standard error of the mean;
1D is a graph illustrating SWD before and after administration of etosuccimid;
before: prior to drug administration;
veh: control group administered sodium chloride (NaCl); And
ETX: group administered with ethosuccimid.
FIG. 2 shows increased multiple sclerosis in thalamic neurons of PLCβ4 gene deficient mice:
FIG. 2A is a diagram showing the result that no multiple ignition was observed after inducing a single ignition by depolarizing current flowing to the sagittal transfer neurons of a normal mouse;
FIG. 2B is a diagram showing that neurons are switched to multiple ignition mode after inducing a single ignition by inducing depolarization currents in thalamic transmission neurons of PLCβ4 gene deficient mice.
FIG. 2C is a diagram showing the result that multiple ignition was not observed when prepulse enough to overpolarize the cell membrane to -65mV in thalamus neuronal cells of normal mice;
FIG. 2D is a diagram showing the multiple ignition observed when injecting a pulse of hyper-polarization of the cell membrane to -65mV into the sagittal neurons of the PLCβ4 gene-deficient mouse; And
FIG. 2E shows the number of spikes of multiple ignition observed in PLCβ4 gene deficient mice and normal mice when injected with pulses of −73 to −63 mV.
Figure 3 shows reduced SWD after injection of Apax epilepsy drug in mice lacking PLCβ4 gene:
FIG. 3A shows EEG before and after gamma-butyrolactone administration in PLCβ4 gene deficient mice and normal mice in the ventral basal group of frontal lobe and thalamus transfer nucleus; FIG.
Cx: frontal lobe;
VB: Respiratory Base Group;
GBL: gamma-butyrolactone;
3B is a diagram showing SWD observed in PLCβ4 gene deficient mice and normal mice after gammabutyrolactone injection;
3C is a diagram showing SWD observed in PLCβ4 gene deficient mice and normal mice after RS (+/-)-baclofen injection;
3D is a graph showing the power spectrum observed in PLCβ4 gene deficient mice and normal mice after gamma butyrolactone injection; And
3E shows the power spectrum observed in PLCβ4 gene deficient mice and normal mice after RS (+/−)-baclofen injection.
FIG. 4 shows a decrease in the expression of sagittal local PLCβ4 protein observed after microinjection of the LV-shPLCβ4 vector into the thalamus:
4A is a diagram showing the expression of PLCβ4 protein in the thalamus and frontal lobe of normal mice;
4B is a diagram showing the expression of PLCβ4 protein in the thalamus and frontal lobe of a PLCβ4 gene deficient mouse;
Figure 4C shows the expression of PLCβ4 protein in the thalamus and frontal lobe of PLCβ4 gene deficient mice after microinjecting the pKLO vector into the thalamus;
pKLO-control: nonspecific control vector;
4D shows the expression of PLCβ4 protein in the thalamus and frontal lobe of normal mice after microinjecting the LV-shPLCβ4 vector into the thalamus; And
shPLCβ4: A lentiviral vector comprising short hairpin RNA of PLCβ4.
FIG. 5 is a diagram showing Abnormal epilepsy observed in mice with thalamic nucleus restricted PLCβ4 gene deletion:
FIG. 5A shows EEG recording after limited micro-injection of pKLO vector and LV-shPLCβ4 vector into thalamus;
Frontal Cx: frontal lobe;
Pariel Cx: parietal leaf;
5B is a graph showing the number of SWDs after microinjecting the LV-shPLCβ4 vector;
5C is a graph comparing the duration of SWD generated by RS (+/-)-baclofen administration after limited microinjection of the pKLO vector and LV-shPLCβ4 vector into the thalamus; And
control: A microinjection of a pKLO vector.
FIG. 6 shows SWDs reduced upon thalamic delivery of mice to PLCβ4 gene deficient mice with limited microinjection of PKC agonists and calcium channel inhibitors:
FIG. 6A is a diagram showing EEG before and after PDD injection into PLCβ4 deficient mice; FIG.
PDD: phorbol 12,13-didecanoate;
FIG. 6B is a graph comparing SWDs generated before and after administration of PDD, mibefradil, and nifedipine; FIG.
before: before drug administration;
Mibe: mibefradil; And
Nif: nifedipine.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 압상스 간질 치료제 효과 검증 모델로서 PLCβ4 유전자 결손 동물을 제공한다.The present invention provides a PLCβ4 gene deficient animal as a model for verifying effect of Apex epilepsy therapeutics.
상기 PLCβ4 유전자 결손 마우스는 동형접합체(homozygote)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.The PLCβ4 gene deficient mouse is preferably a homozygous (homozygote), but is not limited thereto.
상기 PLCβ4 유전자 결손은 PLCβ4 유전자 전체의 결손인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.The PLCβ4 gene deletion is preferably a deletion of the entire PLCβ4 gene, but is not limited thereto.
상기 PLCβ4 유전자 결손은 뇌의 시상(thalamus) 국소적인 PLCβ4 유전자 결손인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.The PLCβ4 gene deletion is preferably a thalamus local PLCβ4 gene deletion in the brain, but is not limited thereto.
상기 PLCβ4 유전자 결손 마우스는 참고문헌(Cheong E, et al., Journal of Neuroscience, 2008)에 기재된 방법과 같이, 유전자 조작으로 PLCβ4 유전자를 녹아웃시켜 제작하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.The PLCβ4 gene deficient mouse is described in Cheong E, et al., Journal As in the method described in ( Science of Neuroscience , 2008), it is preferable to knock out the PLCβ4 gene by genetic engineering, but not limited thereto.
본 발명의 한가지 실시예에서는 PLCβ4 유전자 결손 마우스의 뇌전도(electroencephalogram, EEG)를 측정한 결과, 자발성 압상스 간질에서 특징적으로 관찰되는 SWD를 관찰할 수 있었으며, 이러한 뇌파는 압상스 간질 치료제인 에토숙시미드(ethosuximide, ETX)를 투여하였을 때에 감소함을 확인할 수 있었다(도 1 참조).In one embodiment of the present invention, the electroencephalogram (EGE) of the PLCβ4 gene-deficient mouse was measured. As a result, SWDs characteristic of spontaneous Apax epilepsy were observed. (ethosuximide, ETX) was confirmed to decrease when administered (see Figure 1).
또한, 본 발명의 한가지 실시예에서는 PLCβ4 유전자 결손 마우스의 시상 피질 신경세포에서 늘어난 다발성 발화 경향성을 관찰할 수 있었으며, 휴지 막전압근처에서도 정상 마우스에서 관찰되지 않은 다발성 발화가 PLCβ4 유전자 결손 마우스에서 발생함을 관찰할 수 있었다(도 2 참조).In addition, one embodiment of the present invention was able to observe the increased tendency of multiple ignition in the sagittal cortical neurons of PLCβ4 gene deficient mice, and that multiple ignitions not observed in normal mice near resting membrane voltage occur in PLCβ4 gene deficient mice. Observation was possible (see FIG. 2).
또한, 본 발명의 한가지 실시예에서는 압상스 간질 유도 약물인 감마부티로락톤(γ-butyrolactone,GBL)또는 RS(+/-)-baclofen을 투여하였을 때, SWD가 더욱 오랜 시간동안 관찰되고, 파워 스펙트럼(power spectrum) 분석 결과 PLCβ4 유전자 결손 마우스에서 SWD가 발생하는 주파수와 동일한 범위에서 파워가 일찍 증가하기 시작하여 오랫동안 유지됨을 관찰할 수 있었다(도 3 참조).In addition, in one embodiment of the present invention, SWD is observed for a longer time when administration of gamma-butyrolactone (GBL) or RS (+/-)-baclofen, which is an Apax epilepsy-inducing drug, As a result of power spectrum analysis, it was observed that power began to increase early in the PLCβ4 gene-deficient mouse and was maintained for a long time (see FIG. 3).
또한, 본 발명의 한가지 실시예에서는 LV-shPLCβ4(PLCβ4의 short hairpin RNA를 포함하는 렌티바이러스(Lentivirus)) 벡터를 정상 마우스의 시상 전달핵에 국소적으로 주입하여, PLCβ4 유전자 결손 마우스를 만든 후, PLCβ4 단백질의 발현이 시상에서 감소함을 확인하였다(도 4 참조).In addition, in one embodiment of the present invention, the LV-shPLCβ4 (Lentivirus including short hairpin RNA of PLCβ4) vector is injected locally into the thalamus transfer nucleus of a normal mouse to make a PLCβ4 gene-deficient mouse. It was confirmed that the expression of PLCβ4 protein decreased in the thalamus (see FIG. 4).
또한, 본 발명의 한가지 실시예에서는 시상 전달핵에 국소적으로 PLCβ4 유전자를 결손시킨 마우스에서 압상스 간질의 SWD가 관찰됨을 확인하였다(도 5 참조).In addition, in one embodiment of the present invention, it was confirmed that SWD of Apax epilepsy was observed in mice deficient in the PLCβ4 gene locally in the sagittal delivery nucleus (see FIG. 5).
아울러, 본 발명의 한가지 실시예에서는 PLCβ4 유전자 결손 마우스의 시상 전달핵에 제한적으로 PKC 작용 활성제(Protein kinase C,PKC agonist)인 포르볼 12,13-디데카노에이트(phorbol 12,13-didecanoate, PDD)와 T-type 칼슘 채널 억제제를 시상에 마이크로인젝션(microinjection) 하였을 때, SWD가 현저히 감소함을 관찰할 수 있었다(도 6 참조).In addition, in one embodiment of the present invention, phorbol 12,13-didecanoate (PDD), which is a protein kinase C (PKC agonist), is limited to the thalamus nucleus of PLCβ4 gene deficient mice. ) And the T-type calcium channel inhibitor microinjection (microinjection) in the thalamus, it can be observed that the SWD is significantly reduced (see Figure 6).
따라서, 본 발명의 PLCβ4 유전자 결손 마우스는 압상스 간질의 특징인 SWD 뇌파가 관찰되며, 압상스 간질의 치료제를 투여하였을 때에 SWD가 감소하므로, 압상스 간질 치료제 효과 검증 동물모델로서 유용하게 사용할 수 있다.
Therefore, in the PLCβ4 gene-deficient mouse of the present invention, SWD brain waves, which are characteristic of Apex epilepsy, are observed, and SWD decreases when the Apex epilepsy treatment is administered. .
아울러, 본 발명은 PLCβ4 유전자 결손 동물을 이용한 압상스 간질 예방 및 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for screening and preventing Apex epilepsy using a PLCβ4 gene deficient animal.
구체적으로 상기 방법은 다음과 같이 수행되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다: Specifically, the method is preferably performed as follows, but is not limited thereto.
1) 포스포리파제β4(Phospholipase C beta4, PLCβ4) 유전자 결손 동물에 피검 물질을 투여하는 단계;1) administering a test substance to a phospholipase β4 (PLβ4) gene deficient animal;
2) 상기 피검 물질을 투여한 동물에서, 압상스 간질 관련 증상 또는 지표를 를 측정하는 단계; 및2) measuring symptoms or indicators related to Apax epilepsy in the animal administered the test substance; And
3) 상기 피검 물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 상기 압상스 간질 관련 증상 또는 지표를 감소시키는 피검 물질을 선별하는 단계.3) selecting a test substance that reduces the symptoms or indicators related to Apex epilepsy compared to a control group not administered the test substance.
상기 동물은 실험 동물로 이용 가능한 랫트, 마우스, 햄스터, 토끼, 기니아피그, 마우스, 개, 돼지, 소 및 영장류로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 마우스가 더욱 바람직하며, 이에 한정되지 않는다. The animal is preferably any one selected from the group consisting of rats, mice, hamsters, rabbits, guinea pigs, mice, dogs, pigs, cattle and primates that can be used as experimental animals, but more preferably, mice are not limited thereto. Do not.
상기 압상스 간질 관련 증상은 의식상실과 발작, 무긴장성 증상, 기절 및 극서파(spike-and wave)를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. The symptoms related to Apex epilepsy may include, but are not limited to, loss of consciousness and seizures, tension-induced symptoms, fainting, and spike-and waves.
상기 압상스 간질 관련 지표는 SWD(Spike-and-wave discharge)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. The piezoelectric epilepsy-related indicator is preferably a spike-and-wave discharge (SWD), but is not limited thereto.
상기 SWD 측정은 뇌전도 측정해 수행되는 것을 특징으로 하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
Preferably, the SWD measurement is performed by measuring an electroencephalogram, but is not limited thereto.
본 발명의 한가지 실시예에서는 PLCβ4 유전자 결손 마우스의 뇌전도(electroencephalogram, EEG)에서 자발성 압상스 간질에서 특징적으로 관찰되는 SWD가 관찰되며, 이러한 뇌파는 에토숙시미드(ethosuximide, ETX)를 투여하였을 때에 감소하였다(도 1 참조).In one embodiment of the present invention, SWD, which is characteristically observed in spontaneous Apax epilepsy, is observed in electroencephalogram (EEG) of PLCβ4 gene deficient mice, and this brain wave was reduced when administration of ethosuximide (ETX). (See Figure 1).
또한, 본 발명의 한가지 실시예에서는 PLCβ4 유전자 결손 마우스의 시상 전달 신경세포에서 늘어난 다발성 발화 경향성을 관찰할 수 있었으며, 다발성 발화가 PLCβ4 유전자 결손 마우스에서 발생하였다(도 2 참조).In addition, one embodiment of the present invention was able to observe the increased tendency of multiple ignition in sagittal delivery neurons of PLCβ4 gene deficient mice, and multiple ignition occurred in PLCβ4 gene deficient mice (see FIG. 2).
또한, 본 발명의 한가지 실시예에서는 압상스 간질 유도 약물을 투여하였을 때, SWD가 더욱 오랜 시간 동안 관찰되고, PLCβ4 유전자 결손 마우스에서 SWD가 발생하는 주파수와 동일한 범위에서 파워가 일찍 증가하기 시작하여 오랫동안 유지됨을 관찰할 수 있었다(도 3 참조).In addition, in one embodiment of the present invention, SWD was observed for a longer time when administration of Apax epilepsy-inducing drug, and power began to increase early in the same range as the frequency at which SWD occurs in PLCβ4 gene-deficient mice. Retention could be observed (see FIG. 3).
또한, 본 발명의 한가지 실시예에서는 LV-shPLCβ4 벡터를 정상 마우스의 시상 전달핵에 국소적으로 주입하여, PLCβ4 유전자 결손 마우스를 만든 후, PLCβ4 단백질의 발현이 시상에서 감소됨을 확인하였다(도 4 참조).In addition, in one embodiment of the present invention, after injection of the LV-shPLCβ4 vector into the thalamus nucleus of normal mice to make PLCβ4 gene deficient mice, it was confirmed that the expression of PLCβ4 protein was decreased in the thalamus (see FIG. 4). ).
또한, 본 발명의 한가지 실시예에서는 시상 전달핵에 국소적으로 PLCβ4 유전자를 결손시킨 마우스에서 압상스 간질의 SWD가 관찰됨을 확인하였다(도 5 참조).In addition, in one embodiment of the present invention, it was confirmed that SWD of Apax epilepsy was observed in mice deficient in the PLCβ4 gene locally in the sagittal delivery nucleus (see FIG. 5).
아울러, 본 발명의 한가지 실시예에서는 PLCβ4 유전자 결손 마우스의 시상 전달핵에 제한적으로 PKC 작용 활성제인 포르볼 12,13-디데카노에이트와 T-type 칼슘 채널 억제제를 시상에 마이크로인젝션하였을 때, SWD가 현저히 감소함을 관찰할 수 있었다(도 6 참조).In addition, in one embodiment of the present invention, when the microtransjection of PKC agonist phorbol 12,13-didecanoate and T-type calcium channel inhibitor to the thalamus nucleus of PLCβ4 gene deficient mice was microinjected into the thalamus, A significant decrease could be observed (see FIG. 6).
따라서, 본 발명의 PLCβ4 유전자 결손 마우스는 압상스 간질의 특징인 SWD가 관찰되며, 압상스 간질의 치료제를 투여하였을 때에 SWD가 감소되므로, 압상스 간질 예방 및 치료제 스크리닝 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.
Therefore, in the PLCβ4 gene-deficient mouse of the present invention, SWD, which is a characteristic of Apex epilepsy, is observed, and SWD is reduced when a therapeutic agent for Apex epilepsy is administered, and thus, it may be usefully used as a method for preventing and treating Apex epilepsy.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예 및 실험예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail by Examples and Experimental Examples. However, the following Examples and Experimental Examples are merely illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited by the following Examples and Experimental Examples.
<실시예 1> 포스포리파제β4(Phospholipaseβ4) 유전자 결손 마우스의 제조Example 1 Preparation of Phospholipase β4 Gene Deficient Mice
<1-1> PLCβ4 유전자 결손 벡터의 제조<1-1> Preparation of PLCβ4 Gene Deletion Vector
마우스 게놈으로부터 PLCβ4 유전자를 분리하기 위하여, PLCβ4 유전자의 cDNA(서열번호 1)의 시작 코돈으로 부터 226 - 369부분에 해당하는 부위를 RT-PCR로 분리해 내고 이를 탐침(probe)으로 사용하여 129/svJae 마우스 게놈 DNA 라이브러리(LamdaFixII, Stratagene Inc., USA)에 혼성화 반응을 수행하였다. 이로부터, PLCβ4 유전자를 가진 게놈 클론 파지를 선별한 후 제한 효소 지도, 서던 블럿 분석 및 염기서열 결정 등에 의하여 상기 파지 클론이 PLCβ4 유전자인 것을 확인하였다. To isolate the PLCβ4 gene from the mouse genome, 226 to 369 sites from the start codon of the cDNA (SEQ ID NO: 1) of the PLCβ4 gene were isolated by RT-PCR and used as a probe. Hybridization reactions were performed on svJae mouse genomic DNA library (LamdaFixII, Stratagene Inc., USA). From this, genome clone phage having PLCβ4 gene was selected, and it was confirmed that the phage clone was PLCβ4 gene by restriction enzyme map, Southern blot analysis and sequencing.
PLCβ4 유전자가 결실된 벡터를 제조하기 위하여, 상기 PLCβ4 유전자 클론에서 PLCβ4 단백질의 X 도메인의 일부분을 제거하여 PSK-플라스미드 벡터(Stratagene Inc., USA)에 클로닝하였다. 상기 PLCβ4 유전자의 일부가 결실된 것을 포함하는 적중벡터의 3' 상동절편 말단에는 유전자의 적중 효율을 높이기 위하여 티미딘 키나제(thymidine kinase) 유전자 카셋트 및 음성선별 마커(negative selection marker)를 삽입하였다.
To prepare a vector lacking the PLCβ4 gene, a portion of the X domain of the PLCβ4 protein was removed from the PLCβ4 gene clone and cloned into a PSK-plasmid vector (Stratagene Inc., USA). A thymidine kinase gene cassette and a negative selection marker were inserted at the 3 'homologous end of the hit vector including a part of the PLCβ4 gene deleted.
<1-2> 세포 배양<1-2> cell culture
상기 실시예 <1-1>에서 제조한 적중벡터를 형질도입시키기 위한 세포주로 J1 배아간세포(embroinic liver cells)를 사용하였다. J1 배아간세포(미국 매사추세츠공과대학(MIT)의 R. Jeanisch로부터 분양받음)를 DMEM 배지(Gibco Co., USA)에 15% 소 태아 혈청(fetal bovine serum, Hyclone Co., USA), 1×페니실린-스트렙토마이신(phenicillin-streptomycin), 1×비-필수 아미노산(Gibco Co., USA), 0.1 mM 2-머캅토에탄올(mercaptoethanol)이 첨가된 ES 배지에 접종한 후 37℃에서 2 내지 3 일 동안 배양하였다. 상기 배양으로부터 얻은 배세포군에 0.25% 트립신이 포함된 1 mM EDTA 용액을 처리하여 단일세포들로 분리하였다.
J1 embroinic liver cells were used as a cell line for transducing the hit vector prepared in Example <1-1>. J1 embryonic stem cells (received from R. Jeanisch, Massachusetts Institute of Technology, USA) were placed in DMEM medium (Gibco Co., USA) in 15% fetal bovine serum, Hyclone Co., USA, 1 × penicillin -Inoculated into ES medium with phenicillin-streptomycin, 1x non-essential amino acid (Gibco Co., USA), 0.1 mM 2-mercaptoethanol and then at 37 ° C. for 2-3 days Incubated. The germ cell group obtained from the culture was treated with 1 mM EDTA solution containing 0.25% trypsin to isolate single cells.
<1-3> 세포로의 PLCβ4 유전자 결손 벡터 도입<1-3> Introduction of PLCβ4 Gene Deletion Vectors into Cells
상기 실시예 <1-2>에서 단일세포로 분리된 배아간세포에 실시예 <1-1>에서 제조한 적중벡터를 트랜스펙션(transfection)하기 위하여 일렉트로포레이션 (electroporation)을 수행하였다. 구체적으로, 2×107 세포/㎖의 농도로 희석된 배아간세포에 상기 실시예 <1-1>에서 제조된 적중벡터 DNA 25 ㎍를 첨가하여 혼합한 후, 270 V/500 μF 조건으로 전기충격을 가하였다. 상기 배아간세포를 0.3 mg/㎖ G418 및 2 μM의 간사이클로버가 포함된 ES 배지에서 5 내지 7일 동안 배양하여 동형재조합(homologous recombination) 방법에 의해 배아간세포 내 PLCβ4 유전자가 적중벡터에 의해 정확하게 적중된 배아간세포 클론을 서던 블럿으로 선별?유지하였다.
Electroporation was performed to transfect the hit vector prepared in Example <1-1> to embryonic stem cells separated into single cells in Example <1-2>. Specifically, 25 μg of the hit vector DNA prepared in Example <1-1> was added to the embryonic hepatocytes diluted to a concentration of 2 × 10 7 cells / ml and mixed, followed by electric shock at 270 V / 500 μF. Was added. The embryonic hepatocytes were cultured in ES medium containing 0.3 mg / ml G418 and 2 μM hepatocyclovir for 5 to 7 days, and the PLCβ4 gene in embryonic hepatocytes was correctly hit by a hit vector by homologous recombination. Embryonic stem cell clones were screened and maintained by Southern blot.
<1-4> PLCβ4+/- 마우스의 제조<1-4> Preparation of PLCβ4 +/- Mouse
PLCβ4 +/-의 유전자형을 갖는 키메라 마우스를 제조하기 위하여, 수정된 포배아 세포에 상기 실시예 <1-3>에서 선별된 배아간세포 클론을 미세주입하였다. To prepare chimeric mice with genotype PLCβ4 +/−, fertilized embryonic cells were microinjected with the embryonic hepatocyte clones selected in Example 1-1 above.
구체적으로, C57BL/6J 마우스(Jackson Laboratory, USA) 암컷과 수컷을 교배시킨 후, 3.5일(3.5 p.c.)된 암컷을 경부탈구법으로 희생시켰다. 희생된 암컷으로부터 자궁을 적출하여 자궁 말단부를 가위로 절제한 후, 1 ㎖ 주사기를 이용하여 20 mM HEPES, 10% 소 태아 혈청, 0.1 mM 2-머캅토에탄올 및 DMEM을 포함하는 주사 용액 1 ㎖을 관류시켰다. 해부 현미경하에서 미세 유리관을 사용하여 상기 자궁조직으로부터 포배아를 분리하였으며, 분리한 포배아를 35 mm 페트리디쉬 위에 미리 떨어뜨려 놓은 주사 용액 방울에 옮긴 후 하기의 도입과정에 사용하였다. Specifically, females and males of C57BL / 6J mice (Jackson Laboratory, USA) were crossed, and 3.5 days (3.5 p.c.) of females were sacrificed by cervical dislocation. After removal of the uterus from the sacrificed females and excision of the terminal part of the uterus with scissors, 1 ml injection solution containing 20 mM HEPES, 10% fetal bovine serum, 0.1 mM 2-mercaptoethanol and DMEM was added using a 1 ml syringe. Perfusion. The blastocyst was separated from the uterine tissue under a dissecting microscope using a micro glass tube, and the separated blastocyst was transferred to a drop of injection solution previously dropped on a 35 mm Petri dish and used for the following introduction process.
상기와 같이 분리한 포배아에 상기 실시예 <1-3>에서 선별된 배아간세포 클론을 도입하기 위하여, 미세주입기(Zeiss Inc., USA)를 이용하여 홀딩(holding) 피펫으로 포배아의 내부세포괴(inner cell mass) 방향을 음압으로 잡은 상태에서 10 내지 15 개의 배아간세포 클론을 흡입한 주사 피펫을 포배아의 포배강내로 삽입한 후 양압을 주어 배아간세포 클론을 포배아의 포배강내로 주입하였다. 상기 클론이 주입된 포배아를 정관수술한 수컷과 교배시킨 후, 2.5 p.c.된 가임신 대리모 마우스의 자궁에 이식하여 배아간세포 클론(J1) 및 C57BL/6J 마우스의 포배아로부터 형성된 이형세포 교잡종의 일종인 키메라 마우스의 발생을 유도하였다. 이때, 자궁이식은 애버틴(avertine, 체중당 1 ㎎/㎏)으로 마취된 대리모의 복부를 1 ㎝ 정도 절제하고; 자궁 상부를 핀셋으로 집어 2 cm 정도 체외로 잡아당기고; 주사 바늘로 자궁에 구멍을 내어 이 구멍을 통하여 상기의 포배아를 미세유리관으로 주입하고; 내부 복강막을 봉합사로 두 바늘 꿰멘 다음 겉가죽을 내과용 클립으로 봉입하는 방법을 사용하였다. 상기와 같이 배아간세포가 주입된 포배아를 대리모 마우스의 자궁으로 이식하여 약 19 일 동안 배양함으로써 배아간세포 유래의 세포와 포배아 유래의 세포가 융합되어 게놈 내 PLCβ4 +/-의 유전자형을 가지는 키메라 마우스를 확보하였다.
In order to introduce the embryonic stem cell clones selected in Example <1-3> to the isolated embryos as described above, internal cell masses of the embryos were held by a holding pipette using a microinjector (Zeiss Inc., USA). An injection pipette with 10-15 embryonic stem cell clones inhaled with negative pressure in the direction of (inner cell mass) was inserted into the blastocyst of the blastocyst and injected into the blastocyst of the blastocyst under positive pressure. The clone-implanted blastocysts were mated with a vas deferens male, and then transplanted into the uterus of 2.5 pcs of fertility surrogate mice to form heterologous cell hybrids formed from embryonic stem cell clones (J1) and blastocysts of C57BL / 6J mice. Induction of in chimeric mice was induced. At this time, uterine transplantation is excised the abdomen of the surrogate mother anesthetized with avertine (1 mg / kg per body weight) by about 1 cm; Pick the upper uterus with tweezers and pull it out of the body about 2 cm; Puncturing the uterus with a needle to inject the blastocyst into the microglass tube through the hole; The inner peritoneal membrane was sewn with two stitches, and the outer skin was sealed with a medical clip. As described above, blastocysts injected with embryonic stem cells were transplanted into the uterus of surrogate mice and cultured for about 19 days, thereby culturing cells derived from embryonic stem cells and cells derived from blastocysts and having a genotype of PLCβ4 +/- in the genome. Secured.
<1-5> PLCβ4 녹-아웃 마우스의 제조<1-5> Preparation of PLCβ4 Knock-out Mouse
키메라 마우스를 각각 C57BL/6J 및 129sv 마우스와 20 차례 이상 교배하면서 유지하였고, 이로부터 생성된 C57BL/6J-PLCβ4+/- 및 129sv-PLCβ4+/- 마우스를 교배하여 F1 단계에서 PLCβ4+/+ 및 PLCβ4-/- 마우스를 제조하였으며, 이들을 하기의 행동실험에 사용하였다. 유전자 형 확인은 중합효소연쇄반응(PCR) 방법을 사용하였다. 프라이머는 K1(5'-CTCCACACTCTGCAACCTAC-3'; 서열번호 2), K9(5'-AGTTACTTCTGGATTTTCAGCC-3'; 서열번호 3) 및 PGK22(5'-CTGACTAGGGGAGGAGTAGAAG-3'; 서열번호 4)를 이용하여 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초로 40회 반응시켰다. 상기 프라이머 K1 및 K9은 정상 마우스의 유전자 형을 확인하기 위한 프라이머 쌍으로, 프라이머 K1 및 PFK22는 돌연변이 마우스의 유전자 형을 확인하기 위한 프라이머 쌍으로 사용하였다. 이렇게 하여 수득한 PCR 산물은 1.5% EtBr/아가로스 겔에서 각각의 밴드를 확인하였다.(PLCβ4+/+: 190 bp, PLCβ4+/-: 250/190 bp 및 PLCβ4-/-: 250 bp)
The chimeric mice were maintained at least 20 crossings with C57BL / 6J and 129sv mice, respectively, and the resulting C57BL / 6J-PLCβ4 + // and 129sv-PLCβ4 +/- mice were crossed to PLCβ4 + / + and PLCβ4- / at the F1 stage. Mice were prepared and used in the following behavioral experiments. Genotyping was performed using polymerase chain reaction (PCR). Primers were prepared using K1 (5'-CTCCACACTCTGCAACCTAC-3 '; SEQ ID NO: 2), K9 (5'-AGTTACTTCTGGATTTTCAGCC-3'; SEQ ID NO: 3) and PGK22 (5'-CTGACTAGGGGAGGAGTAGAAG-3 '; SEQ ID NO: 4). The reaction was carried out 40 times in 30 seconds at 30 캜, 30 seconds at 58 캜, and 30 seconds at 72 캜. The primer K1 and K9 was used as a primer pair for identifying genotypes of normal mice, and primers K1 and PFK22 were used as primer pairs for identifying genotypes of mutant mice. The PCR product thus obtained identified each band in 1.5% EtBr / agarose gel. (PLCβ4 + / +: 190 bp, PLCβ4 +/-: 250/190 bp and PLCβ4-/-: 250 bp)
<< 실시예Example 2> 마우스의 사육 및 구성 2> Breeding and composition of mouse
상기 마우스들은 12 시간 밝은 조명, 12 시간 어두운 조명 일주기하에서 물과 사료가 자유롭게 주어지며 온도 22℃, 습도 55%가 유지 되는 SPF(specific pathogen free) 환경에서 사육되었다. 실험에 사용된 마우스는 모두 수컷이며 6마리 ~ 18마리가 사용되었으며, T-test와 repeated two-way ANOVA를 사용하여 통계 테스트를 실시하였다.
The mice were bred in a SPF (specific pathogen free) environment in which water and feed were freely maintained at a temperature of 22 ° C. and a humidity of 55% under a 12-hour bright and 12-hour dim light cycle. The mice used in the experiment were all males and 6-18 animals were used. Statistical tests were performed using T-test and repeated two-way ANOVA.
<실험예 1> PLCβ4 유전자 결손 마우스의 자발성 압상스 간질 현상Experimental Example 1 Spontaneous Apoptosis Epilepsy in Mice Lacking PLCβ4 Gene
<1-1> EEG 측정을 통한 SWD 분석<1-1> SWD analysis through EEG measurement
시상의 PLCβ4가 압상스 간질에서 나타나는 특정 뇌파 SWD(Spike-and-wave discharges)의 생성에 영향을 끼치는지 확인하기 위하여, PLCβ4 유전자 결손 마우스와 대조군인 정상 마우스(PLCβ4 +/+)를 이용하여 뇌전도(electroencephalogram, EEG)를 측정하였다. 경막외 전극봉(epidural electrode)은 전두엽(frontal lobe) 혹은 두정엽(parietal lobe)에 설치하며, 기준 전극봉(grounding electrode)은 후두부(occipital region)에 설치하였다. 시상국부 전압 측정을 위해서는 텅스텐 전극을 설치하였다. 뇌전도는 자유롭게 움직이며 행동하는 마우스에서 500 Hz 샘플링 속도로 측정되었다. 뇌전도 측정에서 SWD는 최소한 베이스라인 전압의 두 배 이상의 크기인 것으로 0.5초이상 지속되는 것만을 분석하였다. 전극의 위치는 사후 조직 확인법(posthoc hitological analysis)으로 검증하였다. To determine whether PLCβ4 in the thalamus affects the production of specific spike-and-wave discharges (SWDs) in Apex epilepsy, we used electroencephalogram using PLCβ4 deficient mice and control mice (PLCβ4 + / +). (electroencephalogram, EEG) was measured. Epidural electrodes were installed in the frontal lobe or parietal lobe, and grounding electrodes were installed in the occipital region. A tungsten electrode was installed for sagittal local voltage measurement. EEG was measured at a 500 Hz sampling rate in freely behaving mice. In electroencephalogram measurements, the SWD was at least twice the baseline voltage and only lasted 0.5 seconds or more. The location of the electrodes was verified by posthoc hitological analysis.
EEG를 측정시 관찰되는 SWD를 분석한 결과, SWD가 나타날 때에, 행동멈춤(behavioral arrest), 의식을 잠깐 잃는 현상을 동반하는 자발적인 압상스 간질이 관찰되었다. PLCβ4 유전자 결손 마우스에서 SWD 패턴은 변화가 급격하였으며, 스파이크와 비슷한 느린 형태의 뇌파가 관찰되었고, 평균적으로 PLCβ4 유전자 결손 마우스에서 관찰된 SWD는 시간당 87.9 ± 8.8의 횟수를 보였으며, SWD가 지속된 평균시간은 1.3 ± 0.1 초였다(도 1의 B).
Analysis of the SWD observed during the EEG measurement revealed spontaneous Apex epilepsy accompanied by behavioral arrest and brief loss of consciousness when the SWD appeared. The SWD pattern in the PLCβ4 gene-deficient mouse changed rapidly, and a spike-like slow-shaped EEG was observed. On average, the SWD in PLCβ4-deficient mouse showed 87.9 ± 8.8 times per hour, and the average duration of SWD persisted. The time was 1.3 ± 0.1 seconds (B in FIG. 1).
<1-2> 최고 주파수(<1-2> highest frequency ( peakpeak frequencyfrequency ) 측정) Measure
SWD의 주파수 구성요소에 대한 정보를 얻기 위해 푸리에 해석(Fourier analysis) 방법을 이용하여, 자발성 압상스 간질의 파워 스펙트럼(power spectrum)을 측정한 결과, SWD의 최고 추파주는 4 ~ 10 헤르츠(Hz) 범위에서 7.8 Hz를 나타내었다(도 1의 C). 15.6 Hz와 23.5 Hz에 나타난 피크(peak)는 SWD의 조화요소(harmonic component)를 가지고 있는 특성 때문에 관찰되는 피크이다.
Using the Fourier analysis method to obtain information about the frequency components of the SWD, the power spectrum of the spontaneous piezoelectric epilepsy was measured, and the highest frequency of the SWD was 4 to 10 hertz (Hz). 7.8 Hz is shown in the range (C of FIG. 1). The peaks appearing at 15.6 Hz and 23.5 Hz are the peaks observed due to the nature of the harmonic components of the SWD.
<1-3> ETX에 의한 SWD 감소 효과<1-3> SWD Reduction Effect by ETX
PLCβ4 유전자 결손 마우스와 대조군인 정상 마우스를 이용하여, 압상스 간질약으로 사용되는 에토숙시미드(ethosuximide, ETX) (sigma)를 200㎎/㎏으로 복강내 주사(intraperitoneal injection)로 투여하였다. 약물 투여에 대한 대조군으로 0.9% 염화 나트륨(NaCl)을 복강내 주사하여 실험하였다. 마우스의 뇌전도를 1시간동안 측정한 뒤, 약물을 마우스에 복강내 주사법으로 상기 양을 1회 투여하고 30분간 기다린 후, 다시 1시간 동안 뇌전도를 측정하였다.Using mice lacking PLCβ4 gene and normal mice as controls, ethosuximide (ETX) (sigma), used as an Apex epilepsy, was administered by intraperitoneal injection at 200 mg / kg. Experiments were performed by intraperitoneal injection of 0.9% sodium chloride (NaCl) as a control for drug administration. After the electroencephalogram of the mouse was measured for 1 hour, the drug was administered to the mouse by intraperitoneal injection once, waited for 30 minutes, and then again for 1 hour.
그 결과, PLCβ4 유전자 결손 마우스에서 관찰된 SWD가 에토숙시미드를 복강내 투여한 군에서염화 나트륨을 투여한 군에 비해서 유의하게 감소하는 결과를 확인할 수 있었다(도 1의 D).
As a result, it was confirmed that SWD observed in the PLCβ4 gene-deficient mouse was significantly reduced in the group in which the etosuccimid was administered intraperitoneally compared to the group in which the sodium chloride was administered (FIG. 1D).
<실험예 2> PLCβ4 유전자 결손 마우스 시상피질 신경세포에서 증가된 다발성 발화Experimental Example 2 Increased Multiple Ignition in Mouse Sagittal Cortical Neurons with PLCβ4 Gene Deletion
PLCβ4의 시상 피질 신경세포의 다발성 발화가 SWD 발생에 영향을 끼치는지 알아보기 위하여, 뇌의 복기저군(ventrobasal complex, VB) 부위에서 다발성 발화의 경향을 관찰하였다. PLCβ4 유전자 결손 마우스와 대조군인 정상 마우스에서 분리한 4주령 뇌의 절편을 만들어 하기에 기재된 논문에서 사용된 방법을 이용하여 패치 클램프(patch clamp) 실험을 수행하였다(Cheong E, et al ., Journal of Neuroscience, 2008). 뇌의 절편에서 신호는 Multiclamp 700-A amplifier(Axon Instruments)을 이용하여 증폭되었으며, pCLAMP 9.2 and Mini-Analysis software(Synaptosoft)를 이용하여 분석하였다.In order to determine whether multiple ignition of PLCβ4 sagittal cortical neurons affected SWD development, we observed the tendency of multiple ignition at ventrobasal complex (VB) site of the brain. Sections of 4 week old brains isolated from PLCβ4 gene deficient mice and control mice were made and patch clamp experiments were performed using the method used in the paper described below (Cheong E, et. al ., Journal of Neuroscience , 2008). Signals from brain sections were amplified using a Multiclamp 700-A amplifier (Axon Instruments) and analyzed using pCLAMP 9.2 and Mini-Analysis software (Synaptosoft).
400 피코 암페어(pA) 크기의 탈분극 전류를 흘려 일반 발화(tonic firing)을 유도하면, PLCβ4 유전자 결손 마우스의 시상 전달 신경세포에서는 21개 중 15개의 세포에서 일반발화가 끝난 후, 쉽게 다발성 발화 모드로 전환되는 것을 관찰하였다. 이는 정상 마우스의 시상전달 신경세포에서는 17개의 세포 전부에서 한 번도 관찰되지 않은 현상이다(도 2의 A 및 B). Induction of tonic firing by depolarizing current of 400 picoamperes (pA) in the hypothalamus of PLCβ4 gene-deficient mice results in the ease of multiple ignition mode after normal ignition in 15 of 21 cells. The conversion was observed. This is a phenomenon that has not been observed in all 17 cells in thalamic neurons of normal mice (A and B of Fig. 2).
PLCβ4 유전자 결손 마우스와 정상 마우스의 휴지 막전압은 각각 -60.24±5.63 mV, -58.74±6.71 mV 이며, 저항(input resistance)은 각각 167.03±31.45㏁, 158.91±29.61㏁으로 차이가 관찰되지 않았다. 그러나, 다양한 과분극 전류를 이용하여 다발성 발화의 경향성을 살펴본 결과, -67 ~ -64 mV 사이의 과분극 자극을 주었을 때, 다발성 발화의 차이가 큰 것으로 관찰되었다. PLCβ4 유전자 결손 마우스의 시상 피질 신경세포에서는 다발성 발화가 발생하는 것이 관찰되었으나, 정상 마우스의 시상 피질 신경세포에서는 전혀 관찰되지 않았다. 즉, 휴지막 전압 근처에서 대조군인 정상 마우스에서 생기지 않는 다발성 발화가 PLCβ4 유전자 결손 마우스에서는 쉽게 생성됨을 확인할 수 있었다(도 2의 C, D 및 E).
Resting membrane voltages of mice lacking PLCβ4 gene and normal mice were -60.24 ± 5.63 mV and -58.74 ± 6.71 mV, respectively, and the input resistance was 167.03 ± 31.45㏁ and 158.91 ± 29.61㏁, respectively. However, as a result of examining the tendency of multiple ignition using various hyperpolarization currents, it was observed that the difference in multiple ignition was large when the hyperpolarization stimulus was between -67 and -64 mV. Multiple ignition was observed in thalamic cortical neurons of PLCβ4 gene deficient mice, but not in sagittal cortical neurons of normal mice. In other words, multiple ignition that does not occur in the control mice near the resting membrane voltage was easily generated in the PLCβ4 gene deficient mouse (C, D and E of Figure 2).
<실험예 3> PLCβ4 유전자 결손 마우스의 압상스 간질 약물 감수성 증가 관찰Experimental Example 3 Observation of Apex Epilepsy Drug Susceptibility in Mice Deficient for PLCβ4 Gene
PLCβ4 유전자 결손 마우스와 대조군인 정상 마우스에 압상스 간질을 유도한다고 알려진 GABABR 수용체(type B gamma-aminobutyric acid receptor)의 작용 활성제(agonist)인 감마부티로락톤(γ-butyrolactone, GBL)과 GABAB수용체에 특이적으로 작용하는 RS(+/-)-baclofen을 복강내 주사하였다. 감마부티로락톤은 40 ㎎/㎏ 혹은 70 ㎎/㎏으로 복강내 주사하였으며, RS(+/-)-baclofen은 20 ㎎/㎏으로 복강내 주사하였다. Gamma-butyrolactone (GBL) and GABA, which are agonists of the GABA B R receptor (type B gamma-aminobutyric acid receptor), known to induce Apex epilepsy in mice lacking the PLCβ4 gene and control mice Intraperitoneal injection of RS (+/-)-baclofen that specifically acts on B receptors. Gamma butyrolactone was injected intraperitoneally at 40 mg / kg or 70 mg / kg and RS (+/-)-baclofen was injected intraperitoneally at 20 mg / kg.
약물 투여 전후의 마우스 뇌전도를 측정한 결과, 도 3의 B, 및 C에서 나타난 바와 같이, 짧은 시간 동안 관찰할 수 있었던 자발성 SWD가 약물을 복강내 투여한 후(투여시점을 0 분으로 잡았다), 2 ~ 5 Hz에서 발작성 SWD는 대조군인 정상 마우스와 비교하여 PLCβ4 유전자 결손 마우스와 대조군에서 유의한 차이를 보이며 더욱 오랜 시간 동안 지속됨을 관찰할 수 있었다(도 3의 B, 도 3의 C).As a result of measuring the mouse electroencephalogram before and after drug administration, as shown in B and C of FIG. 3, after spontaneous administration of the drug by the spontaneous SWD which was observed for a short time (the administration time point was 0 minutes), The seizure SWD at 2 to 5 Hz showed a significant difference in the PLCβ4 gene-deficient mouse and the control group compared to the normal mouse control group and it was observed that it lasted for a longer time (Fig. 3B, C in Fig. 3).
또한, 파워 스펙트럼(power spectrum) 분석 결과 평균적인 파워 스펙트럼의 값이 2 ~ 5 Hz 주파수 범위에서 강한 파워 농도를 보였으며, 이 영역의 파워가 일찍 증가되기 시작하여 오랫동안 유지됨을 알수 있었다(도 3의 D, 및 E). 따라서, PLCβ4 유전자 결손 마우스는 GABAB수용체의 작용 활성제를 처리하였을 때, 압상스 간질이 더욱 잘 발현됨을 확인할 수 있었다.
In addition, the power spectrum analysis shows that the average power spectrum has a strong power concentration in the frequency range of 2 to 5 Hz, and the power in this region starts to increase early and is maintained for a long time (see FIG. 3). D, and E). Therefore, it was confirmed that the PLCβ4 gene deficient mouse was better expressed in Apax epilepsy when treated with an agonist of GABA B receptor.
<실험예 4> LV-shPLCβ4에 의한 PLCβ4 발현의 억제 측정Experimental Example 4 Measurement of Inhibition of PLCβ4 Expression by LV-shPLCβ4
<4-1> LV-shPLCβ4의 벡터의 제작 <4-1> Construction of vector of LV-shPLCβ4
LV-shPLCβ4 벡터(PLCβ4의 shRNA(short hairpin RNA)를 포함하는 렌티바이러스(Lentivirus))는 하기에 기재된 논문에 사용된 방법으로 제작한 후, 테스트하였다(Shin J, et al., Journal of Neuroscience In press, 2009). 이에 대한 대조군은 pLKO 벡터(PLCβ4에 비특이적인 shRNA를 발현시키는 벡터)을 사용하엿다.
The LV-shPLCβ4 vector (Lentivirus comprising short hairpin RNA (shRNA) of PLCβ4) was constructed and tested by the method used in the paper described below (Shin J, et al., Journal of Neuroscience In press , 2009). As a control group, a pLKO vector (a vector expressing nonspecific shRNA to PLCβ4) was used.
<4-2> <4-2> LVLV -- shPLCshPLC β4 투여방법β4 administration method
농축된 LV-shPLCβ4 벡터와 pLKO 벡터를 시상 전달핵 부위 (anteroposterior, -1.82 mm; lateral, ±1.5 mm; ventral -3.5 mm)에 주입하였다. 마우스를 애버틴 (2,2,2- tribromoethanol)으로 마취한 후, 30 게이지의 해밀튼 주사기를 이용하여 뇌의 양쪽 반구 목표 부위에 각각 2 ㎕씩 0.1 ㎕/분의 속도로 주입하였다. 바이러스 벡터를 주입한 뒤 4주 후에 뇌전도를 측정하였다.
Concentrated LV-shPLCβ4 and pLKO vectors were injected into the sagittal nucleus site (anteroposterior, -1.82 mm; lateral, ± 1.5 mm; ventral -3.5 mm). Mice were anesthetized with Avertin (2,2,2-tribromoethanol), and then injected into each hemisphere target site of the brain at a rate of 0.1 μl / min using a 30 gauge Hamilton syringe. EEG was measured 4 weeks after injection of the viral vector.
<4-3> 면역 염색학적 분석 <4-3> Immunostaining Analysis
면역 염색학적 분석을 하기 위하여, 뇌 조직은 냉동 시킨후, 마이크로톰(microtome)에서 30 ㎛의 두께로 관상면 절편(coronal section)을 만들고, 하기에 기재된 논문에 사용된 방법을 사용하였다(Kang SJ, et al, Molecules and cells, 2008). 뇌 절편은 1차 항체인 PLCβ4(Chemicon)과 2차 항체인 Cy-3가 컨쥬게이트된 2차 항체(Amersham)을 이용하여 염색한다. 염색한 조직은 공초점 현미경(confocal microscopy)을 이용하여 고화질의 이미지를 만들었다.For immunostaining analysis, brain tissue was frozen, and then coronal sections were made to a thickness of 30 μm in a microtome, using the method used in the paper described below (Kang SJ, et al, Molecules and cells , 2008). Brain sections are stained using a secondary antibody (Amersham) conjugated with the primary antibody PLCβ4 (Chemicon) and the secondary antibody Cy-3. The stained tissue was made of high quality images using confocal microscopy.
그 결과, 대조군인 정상 마우스에서는 PLCβ4 단백질이 시상 전달핵(relay nuclei)에서 발현이 관찰되나(도 4의 A1), 대뇌 피질(cortex)에서는 발현이 매우 낮은 것을 확인할 수 있었다(도 4의 A2). As a result, PLCβ4 protein was observed in the relay nuclei in normal mice as a control (A1 in FIG. 4), but it was confirmed that the expression was very low in the cortex (A2 in FIG. 4). .
또한, PLCβ4 유전자 결손 마우스에서는 PLCβ4 단백질의 발현이 보이지 않음을 확인할 수 있었다(도 4의 B).
In addition, it was confirmed that the expression of PLCβ4 protein was not observed in the PLCβ4 deficient mouse (FIG. 4B).
<4-4> LV-shPLCβ4의 PLCβ4 발현 억제 <4-4> Inhibition of PLCβ4 Expression by LV-shPLCβ4
실험에 사용하기 위하여, 고농도의 농축된 LV-shPLCβ4 벡터와 대조군으로 pLKO 벡터를 준비하여 약 8주령의 정상 마우스의 시상 피질 전달핵에 주입하였다. For use in experiments, a high concentration of concentrated LV-shPLCβ4 vector and a pLKO vector were prepared as controls and injected into the sagittal cortex nuclei of normal mice of about 8 weeks of age.
LV-shPLCβ4의 PLCβ4 단백질 발현 억제효과를 확인하기 위하여, 실험예 <4-2>에 기재된 방법을 이용하여 면역염색을 수행하였다. In order to confirm the PLCβ4 protein expression inhibitory effect of LV-shPLCβ4, immunostaining was performed using the method described in Experimental Example <4-2>.
그 결과, LV-shPLCβ4 벡터와 pLKO 벡터를 주입 4주후, 비특이적인 pLKO 벡터를 주입한 군의 뇌 조직에서는 PLCβ4의 정상적인 발현이 관찰되었으나, LV-shPLCβ4 벡터를 주입한 군의 뇌 조직에서는 PLCβ4 발현이 시상 피질 전달핵의 많은 부분에서 감소됨을 확인할 수 있었다. 또한 이는 세포의 핵을 염색하는 다피(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI) 염색을 통해서 세포의 수를 관찰한 결과, LV-shPLCβ4와 pLKO 벡터 주입으로 전체적으로 세포 수의 감소가 PLCβ4 발현 감소 원인이 아님을 확인할 수 있었다(도 4의 C,및 D).
As a result, 4 weeks after injection of the LV-shPLCβ4 and pLKO vectors, normal expression of PLCβ4 was observed in the brain tissues of the group injected with the non-specific pLKO vector, whereas PLCβ4 expression was not observed in the brain tissues of the group injected with the LV-shPLCβ4 vector. It was found to be reduced in many of the sagittal cortical nuclei. In addition, it was observed that the number of cells by staining the nucleus of the cells (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI) staining, as a result of reducing the overall number of cells by the injection of LV-shPLCβ4 and pLKO vector expression PLCβ4 It could be confirmed that it is not the cause of the reduction (C, and D of Figure 4).
<실험예 5> LV-shPLCβ4에 의한 압상스 간질의 유도Experimental Example 5 Induction of Apnea Epilepsy by LV-shPLCβ4
정상 마우스에 LV-shPLCβ4와 pLKO 벡터를 주입 후의 RS(+/-)-baclofen을 주입 전 후의 EEG를 측정하였다. <실험예 4>의 결과로 확인된 렌티 바이러스 벡터가 주입된 위치와 PLCβ4의 발현량을 기준으로, 시상의 PLCβ4의 발현이 넓은 영역에서 결손된 마우스를 선택적으로 EEG 측정에 사용하였다. EEG was measured before and after RS (+/-)-baclofen injection after LV-shPLCβ4 and pLKO vectors were injected into normal mice. Based on the location where the lentiviral vector confirmed as a result of <Experimental Example 4> and the amount of expression of PLCβ4 were used, mice deficient in a wide region of expression of PLCβ4 in the thalamus were selectively used for EEG measurement.
그 결과, 실험에 사용한 마우스 12마리 중 7마리에서 자발적인 SWD가 평균적으로 시간당 7.3 ± 2.0회 관찰되었으며, pLKO 벡터를 주입한 9 마리의 마우스에서는 자발적인 SWD와 비슷한 파형이 관찰되지 않았다(도 5의 A, 및 B). 또한, RS(+/-)-baclofen을 주입한 후, LV-shPLCβ4 벡터를 주입한 마우스의 SWD가 발생되는 시간이 pLKO 벡터 주입한 마우스보다 더욱 길어지는 것을 확인할 수 있었다(도 5의 C). 따라서, PLCβ4 유전자 결손 마우스에서 관찰되는 압상스 간질은 시상의 PLCβ4 유전자의 결손이 주요 원인으로 볼 수 있다.
As a result, on average, spontaneous SWD was observed in 7.3 ± 2.0 times per hour in 7 out of 12 mice used in the experiment, and in 9 mice injected with the pLKO vector, a similar waveform to spontaneous SWD was not observed (A of FIG. 5A). , And B). In addition, it was confirmed that after the RS (+/-)-baclofen injection, the SWD generation time of mice injected with the LV-shPLCβ4 vector was longer than that of the mice injected with the pLKO vector (FIG. 5C). Therefore, the Apex epilepsy observed in the PLCβ4 gene deficient mouse may be attributed to the deletion of the PLCβ4 gene in the thalamus.
<실험예 6> PKC 작용 활성제, 칼슘 채널 억제제 투여로 인한 SWD 변화 측정Experimental Example 6 Measurement of SWD Change by Administration of PKC Activator and Calcium Channel Inhibitor
<6-1> <6-1> PKCPKC 작용 활성제 투여로 인한 Due to administration of an active agent SWDSWD 변화 측정 Change measurement
PLCβ4 유전자 결손 마우스의 시상 피질 신경세포에서 T-, L-type 칼슘 채널의 전류가 증가하면, 시상피질 신경세포의 다발성 패턴을 변화시킨다는 관찰이 보고되었다(Cheong, E et al., Journal of Neuroscience, 2008). 시상피질 신경세포의 다발성 패턴을 변화가 PKC 활성 억제로 생긴 결과라고 추정됨에 따라 PLCβ4 유전자 결손 마우스의 시상 피질 신경세포에서 관찰되는 자립성 SWD의 발생이 PKC 신호전달 과정을 통해서 일어나는 것인지 확인하기 위하여, PKC 작용 활성제(agonist)인 포르볼 12,13-디데카노에이트(phorbol 12,13-didecanoate, PDD) 10 pmol을 시상 전달핵에 국소적으로 주입한 후 EEG를 측정하였다. It has been reported that increased currents of T- and L-type calcium channels in the thalamic cortical neurons of PLCβ4 gene-deficient mice alter the multiple patterns of the cortical neurons (Cheong, E et al., Journal of Neuroscience , 2008). In order to determine whether the development of autonomous SWD observed in the thalamic cortical neurons of PLCβ4 gene-deficient mice occurs through the PKC signaling process, it is assumed that the multiple pattern of the sagittal cortical neurons is the result of inhibition of PKC activity. Agonist EEG was measured after topical injection of 10 pmol of phorbol 12,13-didecanoate (PDD) into the thalamus nuclei.
그 결과, 약물 주입 대조군으로 0.9% 염화 나트륨을 주입한 군에서는 SWD의 변화가 관찰되지 않은 반면, PDD를 주입한 군에서는 SWD의 발생이 상당수 감소됨을 확인할 수 있었다(도 6의 A).
As a result, no change in SWD was observed in the group injected with 0.9% sodium chloride as the drug injection control group, whereas the generation of SWD was significantly reduced in the group injected with PDD (FIG. 6A).
<6-2> 칼슘 채널 억제제 투여로 인한 SWD 변화 측정<6-2> SWD Change Measurement by Calcium Channel Inhibitor Administration
PLCβ4 유전자 결손 마우스의 시상 피질 신경세포에서 T-, L-type 칼슘 채널의 전류가 증가하면, 시상피질 신경세포의 다발성 패턴을 변화시킨다는 관찰이 보고되었다(Cheong, E et al., Journal of Neuroscience, 2008). 이에 따라 PLCβ4 유전자 결손 마우스의 시상 피질 신경세포에서 관찰되는 자립성 SWD의 발생이 칼슘 채널 전류의 변화로 인해서 일어나는 것인지 확인하기 위하여, T-type 칼슘 채널 억제제인 미베프라딜(mibefradil) 1 nmol과 L-type 칼슘 채널의 억제제인 니페디핀(nifedipine) 1 nmol을 시상 전달핵에 국소적으로 각각 주입한 후 EEG를 측정하였다. It has been reported that increased currents of T- and L-type calcium channels in the thalamic cortical neurons of PLCβ4 gene-deficient mice alter the multiple patterns of the cortical neurons (Cheong, E et al., Journal of Neuroscience , 2008). Therefore, in order to determine whether the independence of SWD in the thalamic cortical neurons of PLCβ4 gene-deficient mice is caused by the change of calcium channel current, 1 nmol of T-type calcium channel inhibitors mibefradil and L- EEG was measured after local injection of
그 결과, T-type 칼슘 채널 억제제인 미베프라딜을 주입한 군에서는 SWD가 상당수 감소됨을 확인할 수 있었으나, L-type 칼슘 채널 억제제인 니페디핀을 주입한 군에서는 아무런 변화가 관찰되지 않았다(도 6의 B).
As a result, it was confirmed that SWD was significantly reduced in the group injected with mibepradil, a T-type calcium channel inhibitor, but no change was observed in the group injected with nifedipine, an L-type calcium channel inhibitor (Fig. 6). B).
상기에서 보는 바와 같이, 본 발명의 PLCβ4 유전자 결손 마우스는 압상스 간질의 특징인 SWD가 관찰되며, 압상스 간질의 치료제를 투여하였을 때에 SWD가 감소되므로, PLCβ4 유전자 결손 마우스를 압상스 간질 치료제 효과 검증 동물모델로서 유용하게 사용할 수 있다.
As shown above, the PLCβ4 gene-deficient mouse of the present invention is observed SWD characteristic of Apex epilepsy, and SWD is reduced when the treatment of Apex epilepsy is administered, verifying the effect of the Apex epilepsy treatment for PLCβ4 gene-deficient mice It can be usefully used as an animal model.
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Claims (6)
2) 상기 피검 물질을 투여한 동물에서, 압상스 간질 관련 증상 또는 지표를 측정하는 단계; 및
3) 상기 피검 물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 상기 압상스 간질 관련 증상 또는 지표를 감소시키는 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는 압상스 간질 치료제 스크리닝 방법.
1) administering a test substance to a phospholipase β4 (PLβ4) gene-deficient animal, wherein the animal is an animal other than a human;
2) measuring symptoms or indicators related to Apnea epilepsy in the animal administered the test substance; And
3) A method for screening an Apex epilepsy therapeutic agent comprising selecting a test substance that reduces the symptoms or indicators related to Apex epilepsy in comparison to a control group not administered the test substance.
The method of claim 1, wherein the animal is any one selected from the group consisting of rats, mice, hamsters, rabbits, guinea pigs, mice, dogs, pigs, cattle and primates available as experimental animals. Screening method.
The method of claim 2, wherein the animal is a mouse.
2. The method of claim 1, wherein the symptomatic epilepsy-related symptoms are any one or more selected from the group consisting of seizures, tension-induced symptoms, fainting, and spike-and waves.
The method of claim 1, wherein the indicator for epilepsy epilepsy is Spike-and-wave discharge (SWD).
The method of claim 5, wherein the SWD is measured by recording an electroencephalogram.
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