KR101124364B1

KR101124364B1 - 간세포 보호 기능성 국화차 조성물

Info

Publication number: KR101124364B1
Application number: KR1020090027851A
Authority: KR
Inventors: 황용일; 전계식; 최선욱; 박은주; 이현정
Original assignee: (주)국심
Priority date: 2009-03-31
Filing date: 2009-03-31
Publication date: 2012-03-15
Also published as: KR20100109297A

Abstract

본 발명은 간세포 보호 기능성 국화차 조성물에 관한 것으로 국화차 추출물의 Superoxide dismutase 활성, DPPH 라디컬 소거능, 총 페놀함량, Comet assay를 이용한 DNA 손상보호 효과 및 간세포 손상보호 효과를 측정한 결과 간기능 보호 효과가 뛰어남을 개시하였다.

국화차, 간세포 보호, Superoxide dismutase, DPPH 라디컬 소거능, Comet assay

Description

간세포 보호 기능성 국화차 조성물{A functional compositoion consisting of Chrysanthemum morifolium tea for protectiong liver cells}

본 발명은 국화(Chrysanthemum morifolium)를 소재로 하는 한방 국화차의 간세포 보호 기능성에 관한 것을 개시한다.

국화에 대한 효능은 예로부터 민간요법으로 많이 이용되었고 중국에서는 불로장생의 영약으로 귀하게 여겨줬으며 현대에 와서는 국화차, 국화주 등의 상품으로도 사용되고 있다. 국화의 효능에 대한 약용식물사전에 의하면 "감기의 두통, 어지럼증을 다스리며, 생잎으로 즙을 내어 독충에 물린 부위와 치통 등에 바르면 좋다", "동의보감"에서는 "감국은 몸을 가볍게 하고 늙지 않게 하며 장수하게 한다. 그리고 근골을 강하게 하고 보하며 눈을 밝게 한다. 머리에 열이 있거나 풍사가 있어 어지러워 쓰러질듯한 증상, 뇌골 동통을 치료하며 온몸의 여러 가지 풍사를 흩어지게 한다" 본초강목에서는 “오랫동안 복용하면 혈기에 좋고 몸을 가볍게 하며 쉬 늙지 않는다. 위장을 편안케하고 오장을 도우며 사지를 고르게 한다. 그밖에도 감기, 두통, 현기증에 유효하다”라고 적혀있다. 이밖에도 풍열감기, 폐렴, 디프테리아, 위장염, 눈병, 명목, 고혈압, 기침, 두통, 풍간장, 구내염, 피부미용, 해열, 진정, 이명, 신열무한, 보음 등에 좋다고 알려져 있고 현대에서는 심리적 안정을 주고 두통을 없애 정신을 맑게 하여 특히 수험생에게 많은 인기를 얻고 있다. 또 혈액을 맑게 해주면서 몸에 열이 나는 것을 막아주고 대변을 잘 보게 해 주기 때문에 피부를 깨끗하게 해주며 혈액순환이 좋아져 노폐물 배출이 잘되고 비타민C가 풍부하여 피부에 윤기가 나며 부드러워지는 효과가 알려져 있다. 또한 현대인의 우울증, 두통, 대안관계 등에 상당히 효과가 있고 심리적으로 안정되고 성취감과 만족감이 향상되어 자아존중감이 상당히 향상된다는 보고도 있다.

이러한 효능은 국화의 성분 중에 눈과 간기능 회복에 좋은 비타민A, B1, B2, C, 철분, 콜린, 스타키드린, 아데닌, 트리메칠싸이크로 핵산, 카보시릭산, 아카세틴, 코린스타키드린, 크리산테민(황색색소), 정유 1.5% 등이 함유되어 있기 때문인 것으로 예측된다. 그렇지만 국화의 효능 및 기능성성분에 대한 연구는 아직 극소수에 불과한 것이 현실이다.

인체에서 중요한 역할을 하는 간의 기능은 음식의 소화, 주요 기능성영양성분의 합성, 흡수된 독성물질의 해독과 면역기능 등 주요한 생명유지 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 영양장해, 독성물질, 바이러스 등에 의한 발생되는 간질환에 대하여 다양한 치료용 약물, 우르소데옥시콜린산, 실라마린, 버섯다당체, 항바이러스제 등이 판매되고 있으나 그 효과에 대해서는 아직 만족스럽지 못한 상황이다. 이들 단점을 보충하고자 식한약재 및 이들 추출물에 대한 가능성이 보고되고 있으 며, 아마시나 들깨의 감마리롤렌산을 이용한 조성물(대한민국 공개 특허 제2000-0061327호), 황기, 백복령, 생강, 산수유 등을 이용한 식품(대한민국 공개 특허 제1990-0005901호), 황기 유래의 이소플라본을 함유하는 간기능 개선제(대한민국 공개 특허 제1998-0048620호), 클로렐라 성분이 함유된 해조류와 야채류 혼합물의 분말 및 식품(대한민국 공개 특허 제1998-057575호), 백출, 황기, 유황 등의 약재를 함유하는 혈액순환 개선용 조성물(대한민국공개 특허 제1994-23492호), 간 기능 개선 및 간 질환 치료를 위한 기능성 식품 조성물(대한민국 공개 특허 제2004-0084475호) 등의 내용이 보고되어 있으나 간기능 개선 및 질환치료에 관한 내용으로 실재 간세포의 보호 기능에 대해서의 구체적인 보고는 거의 전무한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 점들을 감안하여 안출한 것으로 상승적 간세포 보호 기능성이 있는 국화차를 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 상기 목적은 시료 추출단계와; Superoxide dismutase(SOD) 유사활성 측정단계와; DPPH 라디컬 소거능 측정단계와; 총 폴리페놀 함량 측정단계와; 백혈구의 DNA손상 측정(Comet assay)단계와; 간세포의 DNA손상측정(Comet assay)측정단계를 통하여 달성하였다.

본 발명 국화차 추출물은 SOD ED₅₀, DPPH 라디컬 소거능이 우수한 효과가 있을 뿐 아니라, DNA손상 보호 기능에 뛰어난 효과가 있다.

시료추출방법

열수추출

황국, 백국, 산수유, 오미자 50 g에 500 mL의 물을 첨가하여 실온, 50, 90℃에서 추출하여 각각의 추출 시료는 여과지로 여과한 후 회전 진공농축기에서 농축하여 동결건조하여 시료로 사용하였다. 건조된 시료는 필요한 적정 농도로 희석하여 분석에 사용하였다.

용매추출

황국, 백국, 산수유, 오미자 50 g에 500 mL의 용매(acetone, ethanol, methanol)를 첨가하여 실온에서 추출하였고 각각의 추출 시료는 여과지로 여과한 후 회전 진공농축기에서 농축하여 동결건조하여 시료로 사용하였다. 건조된 시료는 필요한 적정 농도로 희석하여 분석에 사용하였다.

한방국화차 추출

황국, 백국, 산수유, 오미자를 하기 배합비(표1)와 같이 구성하여 500 mL의 물을 첨가하여 실온에서 추출하여 각각의 추출 시료는 여과지로 여과한 후 회전 진공농축기에서 농축하여 동결건조하여 시료로 사용하였다. 건조된 시료는 필요한 적정 농도로 희석하여 분석에 사용하였다.

Superoxide dismutase(SOD) 유사활성 측정

추출 시료 50 μL에 pH 8.5로 보정한 Tris-HCl buffer 50 μL, 7.2 mM pyrogallol 50 μL를 첨가하여 항온수조 25℃에서 45분간 반응시켰다. 반응액 중 산화된 pyrogallol의 양은 405 nm에서 흡광도를 측정하여 시료 용액의 첨가구와 시료 무첨가구 사이의 흡광도 차이를 백분율로 나타내었다.

SOD-like activity (%) = (1-absorbance of sample/absorbance of blank)×100

<국화, 오미자, 산수유의 SOD 유사활성 측정>

각 시료의 항산화력을 측정하기 위해 SOD 유사활성을 측정하여 대조군의 흡광도와 비교하여 표 2에 나타내었다. 그 결과, 국화는 추출온도가 상승할수록 SOD 유사활성이 증가한 반면, 산수유의 SOD 유사활성은 추출온도에 영향을 받지 않고 오미자의 경우 추출 온도가 증가할수록 SOD 유사활성이 감소하였다.

<국화 용매추출물의 SOD 유사활성 측정>

백국 추출물은 모든 용매에서 농도 의존적으로 SOD 유사활성이 증가하였고, 황국 추출물의 아세톤 추출물은 농도에 영향을 받지 않았다. 반면, 황국추출물의 에탄올, 메탄올 추출물의 SOD 유사활성은 농도 의존적으로 증가하다 50 μg/mL 농도에서 감소하였다.

<한방국화차 추출물의 SOD 유사활성측정>

한방국화차 추출물 1, 3에서 농도 의존적으로 SOD 유사활성이 증가하였고, 한방국화차 추출물 2 는 농도의존적으로 증가하다가 50 μg/mL 농도에서 감소하였 다. 1, 5, 10 μg/mL농도에서 SOD 유사활성을 검토해보았을 때 한방국화차 추출물 2가 가장 높은 상승을 나타내었다.

DPPH radical scavenging ability 측정

추출 시료 20 μL에 0.2mM DPPH 용액 80μL를 첨가하여 10초간 vortex하고 실온에 10분간 방치하였다. 시료와 반응에 의하여 DPPH 라디컬이 감소하는 정도는 492nm에서 흡광도를 측정하여 간접적인 시료의 항산화 활성을 측정하였다.

EDA (%) = (1-absorbance of sample/absorbance of blank)×100

<국화 용매 추출물의 DPPH 소거능 측정>

백국 및 황국 용매추출물의 DPPH 소거능은 모든 처리군에서 농도의존적으로 증가하였으며, 1000 μg/mL 고농도의 추출물 처리시 모든 처리군에서 가장 높은 활성을 보였다. 황국 아세톤추출물, 황국 에탄올추출물에서 극적인 증가를 보였으며 백국추출물보다 황국추출물에서 더 높게 나타났다.

<한방국화차 추출물의 DPPH 측정>

한방국화차 추출물에서 DPPH 소거능은 농도의존적으로 증가하였으며, 50 μg/mL 저농도 조건에서는 모든 처리군에서 활성이 나타나지 않았다. 한방국화추출물 2에서 극적인 증가를 나타내었다. DPPH 소거능을 나타낼 때 50, 100 μg/mL의 저농도의 추출물 처리는 적합하지 않은 것으로 보인다.

총 폴리페놀 함량 측정

추출 시료 100 μL에 증류수 900 μL를 넣고 1 N Folin 시약 1 mL를 혼합하여 실온에서 3분 방치 후 10% NaCO 1 mL를 첨가하여 암실에서 1시간 동안 반응시켜 690 nm에서 흡광도를 측정한다. 총 폴리페놀은 gallic acid로 표준 검량곡선을 작성하여 계산하였으며 100 g 건식중량에 대한 g gallic acid equivalent(GAE)로 나타내었다.

일반적으로 식물성분의 항산화 활성은 페놀성 화합물이 원인물질로 관련되어 있는 것으로 알려져 있어 gallic acid를 표준용액으로 하여 작성한 검정곡선으로부 터 각 추출물의 총 페놀함량을 조사하였다. 그 결과, 한방국화차추출물에서는 비슷한 수준으로 나타났으며, 국화용매추출물에서는 백국, 황국 공통적으로 아세톤 < 에탄올 < 메탄올 순으로 높은 함량을 나타내었다. 또한 황국메탄올 추출물에서 5.09g/100g GAE로 가장 함량이 높았다.

백혈구의 DNA 손상 측정 (Comet assay)

<혈액 내 백혈구 분리>

채혈한 신선한 전혈 200 μL을 800 μL PBS와 Picol　(Histopaque 1077) 200 μL 에 처리하여 분리된 백혈구를 본 실험에 사용하였다.

<시료의 처리 및 산화적 스트레스 유발>

준비된 백혈구 세포에 각 추출물 시료를 1, 5, 10, 50 μg/mL의 농도로 처리하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 백혈구를 PBS　(phosphate buffered saline)로 세척한 후 인위적으로 산화적 스트레스를 유발하기 위하여 200 mM의 H2O2를 백혈구에 처리하여 4℃에 5분간 반응시킨 다음 다시 PBS로 세척하였다. Positive control을 위해 시료 대신 용매인 DMSO를 처리한 후 200 mM H2O2를 처리하였고, negative control의 경우에는 H2O2를 처리하지 않았다.

<DNA 손상 측정 (Comet assay)>

Comet assay를 위해 반응을 끝낸 백혈구를 0.7% low melting agarose gel(LMA)과 섞은 후, 1.0% normal melting agarose　(NMA)가 precoating된 슬라이드 위에 백혈구와 LMA의 현탁액이 골고루 분산되게 한 후 커버글래스로 덮어 4℃ 냉장고에 보관하였다. 젤이 굳으면 커버글래스를 벗기고 그 위에 다시 0.7% LMA 용액 75 μL로 한겹 더 덮었다. 미리 준비해 둔 차가운 알칼리 lysis 완충용액(2.5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM tris)에 사용 직전에 1% Triton X-100을 섞은 후 슬라이드를 담가 저온, 암실에서 1시간 동안 침지시켜 백혈구를 용해시켰다. Lysis가 끝난 후, 슬라이드를 전기영동수조에 배열하고 4℃의 차가운 전기영동 완충용액(300 mM NaOH, 10 mM Na2EDTA, pH>13)을 채워 40분 동안 unwinding 시켜 DNA의 alkali labile sites가 드러나게 한 후 25 V/300±3 mA의 전압을 걸어 20분간 전기 영동을 실시하였다. 빛에 의해 DNA가 부가적으로 손상되는 것을 방지하기 위해 위의 과정은 전기영동수조를 어두운 천으로 덮은 채 실시하였다. 전기영동이 끝난 후 0.4 M Tris 완충용액(pH 7.4)에 10분씩 담가 세척하는 과정을 3회 반복하여 슬라이드를 건조시켰다. 20 μL/mL 농도의 ethidium bromide로 핵을 염색하여 커버글래스로 덮은 뒤 형광현미경(Leica, Germany) 상에서 관찰하였다. CCD 카메라(Nikon, Japan)를 통해 보내진 각각의 세포핵 이미지는 Komet 5.0 comet image analyzing system(Kinetic Imaging, UK)이 설치된 컴퓨터 상에서 분석하였다. 백혈구의 H2O2에 의한 DNA 손상 및 각 추출물에 의한 손상 보호 효과는 핵으로부터 이동해서 꼬리 부분으로 떨어져 나간 꼬리 부분 내 DNA 함량(Tail Intensity)을 측정하여 나타내었다. 각각의 처리구에서 2개의 슬라이드를 만들어 각각 100개 세포의 DNA 손상 정도를 측정하고 각 처리구는 3회 반복 실험하였다.

간세포의 DNA 손상 측정 (Comet assay)

<간세포의 분리>

신선한 간 1　g을 취하여 4~6등분으로 잘라 collagenase solution (150unit/g liver) 10ml에 넣어 37℃에서 10분간 방치한다. 40　g에서 5분간 원심분리하여 상등액을 취한후 다시 700　g에서 10분간 원심분리하여 가라않은 간세포를 실험에 사용하였다.

<시료의 처리 및 산화적 스트레스 유발>

준비된 간세포에 각 추출물 시료를 1, 5, 10, 50 μg/mL의 농도로 처리하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 간세포를 PBS　(phosphate buffered saline)로 세척한 후 슬라이드에 처리하였다.

<DNA 손상 측정 (Comet assay)>

Comet assay를 위해 반응을 끝낸 백혈구를 0.7% low melting agarose gel(LMA)과 섞은 후, 1.0% normal melting agarose　(NMA)가 precoating된 슬라이드 위에 백혈구와 LMA의 현탁액이 골고루 분산되게 한 후 커버글래스로 덮어 4℃ 냉장고에 보관하였다. 젤이 굳으면 커버글래스를 벗기고 그 위에 다시 0.7% LMA 용액 75 μL로 한겹 더 덮었다. 미리 준비해 둔 차가운 알칼리 lysis 완충용액(2.5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM tris)에 사용 직전에 1% Triton X-100을 섞은 후 슬라이드를 담가 저온, 암실에서 1시간 동안 침지시켜 백혈구를 용해시켰다. Lysis가 끝난 후, 슬라이드를 전기영동수조에 배열하고 4℃의 차가운 전기영동 완충용액(300 mM NaOH, 10 mM Na2EDTA, pH>13)을 채워 40분 동안 unwinding 시켜 DNA의 alkali labile sites가 드러나게 한 후 25 V/300±3 mA의 전압을 걸어 20분간 전기영동을 실시하였다. 빛에 의해 DNA가 부가적으로 손상되는 것을 방지하기 위해 위의 과정은 전기영동수조를 어두운 천으로 덮은 채 실시하였다. 전기영동이 끝난 후 0.4 M Tris 완충용액(pH 7.4)에 10분씩 담가 세척하는 과정을 3회 반복하여 슬라이드를 건조시켰다. 20 μL/mL 농도의 ethidium bromide로 핵을 염색하여 커버글래스로 덮은 뒤 형광현미경(Leica, Germany) 상에서 관찰하였다. CCD 카메라(Nikon, Japan)를 통해 보내진 각각의 세포핵 이미지는 Komet 5.0 comet image analyzing system(Kinetic Imaging, UK)이 설치된 컴퓨터 상에서 분석하였다. 백혈구의 H2O2에 의한 DNA 손상 및 각 추출물에 의한 손상 보호 효과는 핵으로부터 이동해서 꼬리 부분으로 떨어져 나간 꼬리 부분 내 DNA 함량(Tail Intensity)을 측정하여 나타내었다. 각각의 처리구에서 2개의 슬라이드를 만들어 각각 100개 세포의 DNA 손상 정도를 측정하고 각 처리구는 최소 3회 반복 실험하였다.

<추출물의 ED ₅₀ 측정>

본 발명에서 연구한 다양한 추출물들의 항산화 활성을 비교하기위하여 ED₅₀ 을 측정하였다.

국화열수추추물의 SOD ED₅₀은 백국보다 황국이 높게 나타났고, 국화용매추출물의 SOD ED₅₀은 백국과 황국모두에서 열수추출물이 높게 나나났다. 한방국화차 추출물은 배합 1에서 가장 높은 수치를 나타내었다. DPPH SOD ED₅₀의 열수 및 용매추출물은 공통적으로 백국보다 황국이 더 높았고, 한방국화차 추출물은 배합간의 차이는 없었다.

산화적 DNA 손상 보호효과

국화 물 추출물의 산화적 DNA 손상 보호 효과

Comet assay를 이용한 국화 물 추출물의 H₂O₂로 유발된 산화적 DNA 손상 보호 효과 실험의 결과는 표 9 ~ 11에 제시하였다. 백국 물 추출물을 1, 10, 25, 50 μg/mL의 농도로 백혈구에 처리한 후 H₂O₂200 μM의 농도로 DNA 손상을 유도한 결과 손상된 DNA tail 부분의 DNA 함량을 측정한 tail intensity는 각 추출물 별로 다양한 양상을 보여주었다. RT 추출물에서 농도에 비례적으로 DNA 손상정도가 감소하는 경향을 나타내었다. 또한 RT, 50 및 90℃ 추출물의 50 μg/mL의 고농도에서 200 μM H₂O₂ 처리 양성대조구에 비해 가장 낮은 DNA 손상정도가 나타났다.

국화 용매 추출물의 산화적 DNA 손상 보호 효과

Comet assay를 이용한 국화 용매 추출물의 H₂O₂로 유발된 산화적 DNA 손상 보호 효과 실험의 결과는 표 12 ~ 14에 제시하였다. 백국 및 황국 아세톤, 에탄올, 메탄올 추출물을 1, 10, 25, 50 μg/mL의 농도로 백혈구에 처리한 후 200 μM H₂O₂ 의 농도로 DNA 손상을 유도한 결과 손상된 DNA의 tail 은 모든 처리군에서 DNA 손상정도가 감소하는 경향을 나타내었다. 백국 아세톤의 처리에는 고농도에서 DNA 손상 억제능을 나타내었으며, 에탄올 및 메탄올의 처리에는 백국의 산화적 DNA 손상 보호 효과를 볼 수 있었다.

또한 황국용매추출물의 농도별 처리에서 아세톤과 에탄올의 1,10,25 μg/mL 처리시 H₂O₂ 에 의한 산화적 DNA 손상 억제능이 나타났다. 고농도에서는 산화적손상이 상승하는 경향을 볼 수 있었으며 저농도의 용매추출물이 유의적으로 높은 항산화활성을 나타내었다.

국화 열수, 용매 추출물의 간세포 손상 보호 효과

정상 간세포에 백국 및 황국의 열수, 용매 추출물을 처리하여 간세포의 손상정도를 확인하였다(표 15). 모든 처리군에서 control과 같은 정도의 손상을 보였으 며 이는 백국 및 황국 추출물의 독성으로 인한 DNA 손상이 나타나지 않았음을 알 수 있었다. 또한 백국 열수 추출물의 1, 10 μM 저농도의 처리가 control보다 낮은 경향을 나타내었으며, 용매추출물은 열수 추출물과 비슷한 경향을 나타내었다. 황국추출물은 백국추출물과 마찬지로 1, 10, 25 μM 저농도 처리에 DNA 손상 보호효과가 높은 경향을 나타내었다. 이 결과를 바탕으로 저농도의 국화추출물의 간 기능 보호효과를 기대할 수 있을 것이다.

통계처리

각 결과치는 SPSS-PC+ 통계 package를 사용하여 처리하였다. 각 항목에 따라 백분율과 평균치±표준오차(SE)를 구하고 one-way 분산분석(ANOVA)을 시행하여 F 값을 구한 후 Duncan's multiple range test를 이용하여 각 구간의 유의성 차이를 검증하였다. 통계적 유의성은 5% 수준에서 평가하였다.

본 발명은 SOD ED₅₀, DPPH 라디컬 소거능, DNA손상 보호 효과가 뛰어날 뿐 아니라 간세포 손상 보호 효과가 뛰어난 효과가 있으므로 식품산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1은 황국의 열수 추출물(A), Solvent 추출물(B) 및 국화차 추출물(C)의 Superoxide dismutase ED₅₀ 효과를 보인 그래프이다.

도 2는 황국의 열수 추출물(A), Solvent 추출물(B) 및 국화차 추출물(C)의 DPPH 라디컬 소거능을 보인 그래프이다.

도 3은 황국의 아세톤, 에탄올 및 메탄올 추출물의 항산화효과를 보인 그래프이다.

도 4는 in vitro에서 본 발명 황국차의 다양한 농도의 첨가효과를 보인 그래프이다.

Claims

황국 80~90중량%, 백국 5~10중량%, 산수유 3~8중량%, 오미자 2중량%를 열수 또는 용매추출한 후 여과하고 감압농축하여 동결건조한 것을 특징으로 하는 한방 국화차 조성물.
제 1항의 국화차 조성물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 간세포 손상 보호 기능성 국화차.