KR101118695B1 - Polymer nanoparticles coated with phasin or PHA depolymerase and its preparation method - Google Patents

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Abstract

본 발명은 페이신, PHA 디폴리머라제 등의 단백질을 고분자 약물전달체의 매트릭스 성분으로 사용하기 위한 것으로, 페이신 및 PHA 디폴리머라제로 이루어진 군에서 선택되는 단백질 및 생체적합성 고분자를 포함하는 생체적합성 고분자 나노입자 형성용 조성물, 상기 단백질로 코팅된 약물전달체용 고분자 나노입자, 상기 나노입자에 약물이 담지된 약물전달체 및 이들의 제조 방법에 관한 것이다.The present invention is to use a protein such as Pasin and PHA depolymerase as a matrix component of the polymer drug carrier, a biocompatible polymer comprising a protein and biocompatible polymer selected from the group consisting of Pasin and PHA depolymerase The present invention relates to a composition for forming nanoparticles, polymer nanoparticles for drug carriers coated with the protein, drug carriers carrying a drug on the nanoparticles, and methods for preparing the same.

폴리히드록시알칸산 DDS 매트릭스, PHA 나노입자, 자가분해성 PHA 나노입자, 자가분해 PHA 약물전달체, 세포내 PHA 디폴리머라제, 페이신 보조 나노입자 제조, 페이신 휴전 폴리펩타이드 약물 Polyhydroxyalkanoic acid DDS matrix, PHA nanoparticles, autolytic PHA nanoparticles, autolytic PHA drug carriers, intracellular PHA depolymerases, preparation of Pasin Assisted Nanoparticles, Paesine truncated polypeptide drugs

Description

페이신, ＰＨＡ 디폴리머라제로 코팅된 고분자 나노입자 및 그의 제조 방법 {Polymer nanoparticles coated with phasin or PHA depolymerase and its preparation method}Polymer nanoparticles coated with phasin or PHA depolymerase and its preparation method

본 발명은 페이신 및 PHA 디폴리머라제로 이루어진 군에서 선택되는 단백질 및 생체적합성 고분자를 포함하는 생체적합성 고분자 나노입자 형성용 조성물, 상기 단백질로 코팅된 약물전달체용 고분자 나노입자, 상기 나노입자에 약물이 담지된 약물전달체 및 이들의 제조 방법에 관한 것이다.The present invention is a composition for forming a biocompatible polymer nanoparticles comprising a protein and a biocompatible polymer selected from the group consisting of paysin and PHA depolymerase, polymer nanoparticles for drug carriers coated with the protein, drug to the nanoparticles The supported drug carriers and a method for producing the same.

페이신 단백질 (Phasin protein: PhaP)은 박테리아 세포에서 폴리하이드록시알카노익산(polyhydroxyalkanoic acid: PHA) 그래뉼의 크기와 개수의 조절에 관여한다. 세포질의 물과 소수성 PHA 응집체 사이의 계면 영역에 위치하는 페이신은 스타인뷰휄(Steinbuchel) 그룹에서 처음 보고되었다. Phasin protein (PhaP) is involved in the regulation of the size and number of polyhydroxyalkanoic acid (PHA) granules in bacterial cells. Paysin, located at the interface region between cytoplasmic water and hydrophobic PHA aggregates, was first reported in the Steinbuchel group.

자가조절 억제자 PhaR은 phaP 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 세포에서 페이신 단백질이 자가 조립형성에 어떻게 관련되어 있는지에 대한 정확한 기작은 알려지지 않았다. 양친매성 단백질 페이신은 PHA 그래뉼의 자가 조립 형성에서 크기 조절에 중요한 역할을 한다. The autoregulatory inhibitor PhaR is known to modulate phaP expression. However, the exact mechanism by which Paysin protein is involved in self-assembly in cells is unknown. Amphiphilic protein Paysin plays an important role in size control in the self-assembly formation of PHA granules.

페이신의 주요 서열구조는 속 (genus) 간에 꽤 다르다. SCL (short-chain-length) PHA 생산 박테리아에서 발견되는, PhaP는 서로 50% 상동성을 가지는 4개의 아형을 가진다 [Potter M et al., Microbiology 2004;150:2301-2311; Potter M et al., Microbiology 2002;148:2413-2426]. 아형 중에서, PhaP (Ralstonia eutropha 의 PhaP1) 만이 주 분획으로 발현되고 PHA 그래뉼 표면에 위치한다. 반면, MCL(medium-chain-length)-PHA 생성 슈도모나스 속 (Pseudomonas spp)에서 발견되는 PhaF는 아형이 존재하지 않고 같은 속(genus) 간에 높은 상동성을 가진다 [Prieto MA, Bhler B, Jung K, Witholt B, Kessler B. J Bacteriol 1999;181(3):858-68]. The major sequence of paysin is quite different from genus. Found in short-chain-length (SCL) PHA producing bacteria, PhaP has four subtypes with 50% homology with each other [Potter M et al., Microbiology 2004; 150: 2301-2311; Potter M et al., Microbiology 2002; 148: 2413-2426. Among the subtypes, PhaP ( Ralstonia eutropha Only PhaP1) is expressed in the main fraction and is located on the PHA granule surface. On the other hand, PhaF found in medium-chain-length ( PHA ) -producing Pseudomonas spp has no subtypes and has high homology between the same genus [Prieto MA, Bhler B, Jung K, Witholt B, Kessler B. J Bacteriol 1999; 181 (3): 858-68].

슈도모나스 PhaF 페이신은 C-말단에 반복된 A, K, 및 P가 풍부하다. 페이신 분자는 10 에서 20 kDa 사이의 크기를 가지고 소수성 아미노산-풍부 영역은 PHA 폴리머에 결합할 수 있다. 소수성 영역이 제거된 페이신은 PHA 그래뉼 표면에 결합할 수 없다. 페이신 단백질은 121℃에서 20 분간 열적으로 안정하다. 또한, 페이신은 C1-C8 알칸올, 아세톤, 아세토니트릴, 클로로포름 등과 같은 유기 용매 및 산, 알카리 노출에도 안정하다. Pseudomonas PhaF Paysin is rich in A, K, and P repeated at the C-terminus. The paysin molecule has a size between 10 and 20 kDa and the hydrophobic amino acid-rich region can bind to the PHA polymer. Paysin, from which the hydrophobic region has been removed, cannot bind to the PHA granule surface. Paisin protein is thermally stable at 121 ° C. for 20 minutes. Paysin is also stable to exposure to acids, alkalis and organic solvents such as C1-C8 alkanols, acetone, acetonitrile, chloroform and the like.

동물에서 폴리(3-하이드록시부틸레이트)(poly(3-hydroxybutyrate: PHB)의 생체 적합성과 생체 내 분해성 때문에, 약물 운반에 PHB를 사용하고자 하는 연구가 있었다. 그러나 생체 내 분해가 너무 느리게 일어나며 PHB의 경우에는 24- 30 개월 후에 완전히 분해되어 흡수된다. Because of the biocompatibility and biodegradability of poly (3-hydroxybutyrate (PHB) in animals, there have been studies to use PHB for drug delivery. However, in vivo degradation occurs too slowly and PHB In the case of 24-30 months after complete decomposition and absorption.

5-플루로우라실 (5-Fluorouracil) [Khang K et al., Bio-Med Mater Eng 2001;11:89-103] 또는 겐타마이신 설페이트 (gentamicin sulfate) [Khang G et al., Kor Polym J 2000;8:253-260] 는 지속적인 방출 (sustained release)을 위하여 각각 poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) 마이크로스피어 (직경 20 ~ 300 ㎛) 또는 웨이퍼 (wafers)로 로딩되었다. 5-Fluorouracil [Khang K et al., Bio-Med Mater Eng 2001; 11: 89-103] or gentamicin sulfate [Khang G et al., Kor Polym J 2000; 8: 253-260] were loaded into poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) microspheres (diameter 20-300 μm) or wafers, respectively, for sustained release.

약물 운반자로서 poly(3-hydroxybutyrate) 및 poly(ethylene glycol) 에 기반한 양친매성 트리블록 공중합폴리머의 나노입자는 계면활성제 없이 침전/용매증발 기술로 제조되었다. 크기는 ~20 및 150 nm 사이이다. BSA 와 계면활성제 존재하에 PHA 합성효소 (PHA synthase) 에 의한 (R)-3-hydroxybutyryl coenzyme A는 세포 외 효소 중합반응에 의하여 100 ~ 250 nm 그래뉼로 구성된 클러스터가 제조되었다. 안정한 폴리(3-하이드록시옥타노에이트) (poly(3-hydroxyoctanoate)) 라텍스는 하이포클로라이트(hypochlorite) 처리에 의해 Pseudomonas oleovorans 로부터 제조되었다. 유화(emulsification) 조건에 따라 10 -1000 nm 입자로 크기가 다양한 PHA 나노 입자가 효율적인 약물 운반 디바이스로 제조될 수 있었다.Nanoparticles of amphiphilic triblock copolymers based on poly (3-hydroxybutyrate) and poly (ethylene glycol) as drug carriers were prepared by precipitation / solvent evaporation techniques without surfactants. The size is between -20 and 150 nm. (R) -3-hydroxybutyryl coenzyme A by PHA synthase in the presence of BSA and surfactant was prepared by clustering granules 100 to 250 nm by extracellular enzyme polymerization. Stable poly (3-hydroxyoctanoate) latex was prepared from Pseudomonas oleovorans by hypochlorite treatment. Depending on the emulsification conditions, PHA nanoparticles of various sizes ranging from 10-1000 nm particles could be made into an efficient drug delivery device.

HA를 장기 적인 약물 운반 매트릭스로 사용하기 위해서는, PHA는 용매 증발법에 의해 약물이 로딩될 수 있도록 유기 용매에 용해가능 하여야 한다. 그러나, 약물이 폴리펩타이드이면 활성화에 대한 안정성 문제 때문에 상황은 꽤 복잡하다. In order to use HA as a long term drug delivery matrix, PHA must be soluble in organic solvents so that the drug can be loaded by solvent evaporation. However, if the drug is a polypeptide, the situation is quite complicated because of stability issues with activation.

이에 반해, 페이신은 PHA 그래뉼 표면에 특이적 결합을 하기 때문에, 만약 융합된 폴리펩타이드가 유화 공정 (emulsification process)에서 안정하다면, 페이신과 등의 단백질을 고분자 매트릭스의 구성 성분으로 사용할 수 있다.On the contrary, since Paesin binds specifically to the surface of PHA granules, if the fused polypeptide is stable in the emulsification process, Paesin and other proteins can be used as components of the polymer matrix.

본 연구에서는 모델 단백질로 GST-페이신 융합 단백질을 사용하여, 2-상 유화 기술(two-phase emulsion technique)[Bonthrone KM et al., FEMS Microbiol Rev 1992 103: 269-. Horowitz DM et al., Can J Microbiol 1995 41(Suppl 1):115-; Horowitz DM et al., J Am Chem Soc 1994 116: 2695-; Barnard GN et al., J Biol Chem 1989 264: 3286-]로 인공적 PHB 그래뉼을 제조하고자 하였다. 또한, 자가-분해가능 PHB 그래뉼은 재조합 세포내 PHA 디폴리머라제를 그래뉼에 로딩하여 제조하였다. In this study, using a GST-paicin fusion protein as a model protein, a two-phase emulsion technique [Bonthrone KM et al., FEMS Microbiol Rev 1992 103: 269-. Horowitz DM et al., Can J Microbiol 1995 41 (Suppl 1): 115-; Horowitz DM et al., J Am Chem Soc 1994 116: 2695-; Barnard GN et al., J Biol Chem 1989 264: 3286-] attempted to prepare artificial PHB granules. In addition, self-degradable PHB granules were prepared by loading recombinant intracellular PHA depolymerase into the granules.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 약물운반체로 사용 가능한 생체적합성 고분자 나노입자를 제조함에 있어 박테리아에서 기원한 페이신, PHA 디폴리머라제 등의 단백질을 매트릭스 성분의 하나로 사용하여 나노입자의 분해 속도와 특성을 개질시킨 것을 특징으로 한다. In the present invention, in the preparation of biocompatible polymer nanoparticles that can be used as drug carriers, proteins such as Paesin, PHA depolymerase, etc., originated from bacteria, are used as one of the matrix components. It is done.

상기 약물운반체로 사용 가능한 생체적합성 고분자 나노입자 제조를 위하여, 페이신 및 PHA 디폴리머라제로 이루어진 군에서 선택되는 단백질 및 생체적합성 고분자를 포함하는, 나노입자 형성용 조성물을 제공한다.
보다 바람직하게는 페이신 및 폴리하이드록시알카노익산 (polyhydroxyalkanoic acid, PHA) 디폴리머라제인 단백질과, 폴리(3-하이드록시부틸레이트) 또는 폴리(3-하이드록시부틸레이트-코-3-하이드록시발레이트)로부터 선택된 생체적합성 고분자를 포함하여 이루어지는, 나노입자 형성용 조성물을 제공한다.In order to manufacture biocompatible polymer nanoparticles that can be used as the drug carrier, it provides a composition for forming nanoparticles comprising a protein and a biocompatible polymer selected from the group consisting of paysin and PHA depolymerase.
More preferably, the protein is a polysine and polyhydroxyalkanoic acid (PHA) dipolymerase, and poly (3-hydroxybutylate) or poly (3-hydroxybutylate-co-3-hydroxy It provides a composition for forming nanoparticles, comprising a biocompatible polymer selected from oxyvallate).

생체적합성 고분자 기반 나노입자의 제조에, 단독의 페이신 단백질 또는 단독의 PHA 디폴리머라제 단백질이 사용될 수 있으며, 또는 페이신 단백질과 PHA 디폴리머라제 단백질이 혼합하여 사용될 수 있다. 페이신 및 PHA 디폴리머라제 단백 질의 혼합비에 따라 나노입자의 기계적, 물리적 및 화학적 특성은 조절될 수 있다. 예를 들어, 단백질 함량이 높을수록 분해속도가 증가되며, 특히 PHA 디폴리머라제의 함량비가 높을수록 자가분해 속도는 더욱 증가하게 된다. In the preparation of biocompatible polymer-based nanoparticles, either a single paysin protein or a single PHA depolymerase protein may be used, or a mixture of paysin protein and PHA depolymerase protein may be used. The mechanical, physical and chemical properties of the nanoparticles can be adjusted depending on the mixing ratio of the paysin and PHA depolymerase protein. For example, the higher the protein content, the higher the rate of decomposition, and in particular, the higher the content ratio of PHA depolymerase, the higher the rate of autolysis.

본 발명에 사용되는 페이신과 PHA 디폴리머라제 단백질의 기원은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 페이신 단백질은 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha) 기원이며, PHA 디폴리머라제는 하이드로지노파가 슈도플라바(Hydrogenophaga pseudoflava) 기원이다.The origin of the Pacine and PHA depolymerase proteins used in the present invention is not particularly limited. For example, the Paesin protein is of Ralstonia eutropha origin and the PHA depolymerase is of Hydrogenophaga pseudoflava origin.

본 발명에 사용되는 페이신 또는 PHA 디폴리머라제는 야생형(wild type)의 아미노산 서열뿐만 아니라 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 야생형과 상이한 서열을 가지는 변이체를 포함한다. Paesin or PHA depolymerases used in the present invention may be used to identify variants in which the amino acid sequence as well as the wild type amino acid sequence differs from the wild type by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof. Include.

상기 변이체는 야생 단백질과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 기능적 등가물 또는 물리 화학적 성질을 증가 또는 감소시키는 변형을 가지는 단백질을 포함한다. 예를 들어, 온도, 수분, pH, 전해질, 환원당, 가압, 건조, 동결, 계면장력, 광선, 동결과 해동의 반복, 고농도 조건 등의 물리적 요인과 산, 알카리, 중성염, 유기용매, 금속이온, 산화환원제, 프로티아제 등의 화학적 요인의 외부 환경에 대한 구조적 안정성이 증대된 변이체이다. Such variants include proteins having modifications that increase or decrease functional equivalents or physicochemical properties with activities substantially equivalent to wild proteins. For example, physical factors such as temperature, moisture, pH, electrolytes, reducing sugars, pressurization, drying, freezing, interfacial tension, light rays, freezing and thawing, high concentration conditions, acids, alkalis, neutral salts, organic solvents, metal ions It is a variant with enhanced structural stability to the external environment of chemical factors such as redox, proteases and the like.

또한, 본 발명에 사용되는 상기 야생형 또는 변이체의 페이신, PHA 디폴리머라제는 융합단백질의 형태일 수 있다. 본 발명에서 "융합"이란 상이한 2개 이상의 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 펩타이드 결합(peptide bond)을 통하여 한가닥의 폴리펩타이드로 결합되어 있는 것을 의미하고, 페이신, PHA 디폴리머라제가 융합 파트너 등과 융합되어 하나의 프로모터에서 인 프레임(in flame)으로 한 가닥 단백질로 번역된다. 페이신, PHA 디폴리머라제의 N 말단 및/또는 C 말단 등에 융합 파트너가 결합할 수 있다. 페이신 또는 PHA 디폴리머라제 단백질과 결합될 수 있는 융합 파트너는 분리 또는 단백질의 특성 개선에 사용될 수 있는 융합 가능한 파트너라면, 특별히 제한되지 않으며, GST- 또는 His 태그- 등을 예시할 수 있다.In addition, the pecine, PHA depolymerase of the wild-type or variant used in the present invention may be in the form of a fusion protein. In the present invention, "fusion" means that two or more different peptides or polypeptides are bound to one strand of a polypeptide through a peptide bond, and fascin, PHA depolymerase is fused with a fusion partner, or the like. It is translated into a strand of protein in flame in the promoter of. The fusion partner can be bound to the Payne, the N terminus and / or the C terminus of the PHA depolymerase, and the like. The fusion partner that can be combined with the paysin or PHA depolymerase protein is not particularly limited as long as it is a fusionable partner that can be used for separation or improving the properties of the protein, and may exemplify GST- or His tag- and the like.

본 발명의 페이신 또는 PHA 디폴리머라제는 천연 기원의 공급원으로부터 분리하는 방법; 화학적 합성하는 방법; 또는 페이신 또는 PHA 디폴리머라제를 코딩하는 재조합 발현 벡터를 적합한 숙주 내로 도입하여 발현시킨 후 이로부터 분리하는 방법 등으로 획득할 수 있다. Paisin or PHA depolymerases of the invention may be isolated from a source of natural origin; Chemical synthesis; Or a recombinant expression vector encoding a paysin or PHA depolymerase can be obtained by introducing into a suitable host, expressing it, and isolating therefrom.

본 발명의 나노입자를 구성하는 고분자는 생체적합한 고분자이면, 특별히 제한되지 않는다. “생체적합”이란 생물학적 작용을 수행가능하거나 적절한 반응을 도출하여 효과적인 기능을 하는 의료용 재료로 생체 적용가능한 물질을 의미한다. 생체적합한 고분자의 구체적인 예로, 폴리글리코라이드(Polyglycolide), 글리코라이드 공중합체(Copolymers of glycolide), 글리코라이드-락티드 공중합체(Glycolide-lactide copolymers), 글리코라이드-트리메틸렌 카보네이트 공중합체(Glycolide-trimethylene carbonate copolymers), 폴리락티드(Polylactides), 폴리-L-락티드(Poly-L-lactide), 폴리-D-락티드(Poly-D-lactide), 폴리-DL-락티드(Poly-DL-lactide), L-락티드/DL-락티드 공중합체, L-락티드/D-락티드 공중합체, 폴리락티드 공중합체, 락티드-트리메틸렌 글리코라이드 공중합체, 락티드-트리메틸 렌 카보네이트 공중합체, 락티드/δ-바레로락톤(δ-valerolactone) 공중합체, 락티드/ε-카프로락톤 공중합체, 폴리데프시펩티드(글리신-DL-락티드 공중합체)[Polydepsipeptides(glycine-DL-lactide copolymer)], 폴리락티드/에틸렌옥사이드 공중합체, 애시미트리컬리 3,6-서브스티튜티드 폴리-1,4-디옥산-2,5-디온스 (Asymmetrically 3,6-substituted poly-1,4-dioxane-2,5-diones), 폴리(3-하이드록시부틸레이트)((Poly(3-hydroxybutyrate)), 폴리-3-하이드록시부틸레이트/3-하이드록시바레레이트(β-hydroxyvalerate) 공중합체, 폴리-β-하이드록시프로피오네이트(Poly-β-hydroxypropionate), 폴리-p-디옥산온, 폴리-δ-바레로락톤(Poly-δ-valerolactone), 폴리-ε-카프로락톤, 이들의 공중합체 또는 이들의 블랜드 등을 예시할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는, 폴리(3-하이드록시부틸레이트) 또는 폴리-3-하이드록시부틸레이트/3-하이드록시바레레이트 공중합체인 폴리(3-하이드록시부틸레이트-코-3-하이드록시발레이트) 이다.The polymer constituting the nanoparticles of the present invention is not particularly limited as long as it is a biocompatible polymer. "Biocompatibility" means a material that is biocompatible as a medical material capable of performing a biological action or eliciting an appropriate response to function effectively. Specific examples of biocompatible polymers include Polyglycolide, Copolymers of glycolide, Glycolide-lactide copolymers, Glycolide-trimethylene carbonate copolymers. carbonate copolymers, Polylactides, Poly-L-lactide, Poly-D-lactide, Poly-DL-lactide lactide), L-lactide / DL-lactide copolymer, L-lactide / D-lactide copolymer, polylactide copolymer, lactide-trimethylene glycolide copolymer, lactide-trimethylene carbonate aerial Copolymer, lactide / δ-valerolactone copolymer, lactide / ε-caprolactone copolymer, polydepeptide (glycine-DL-lactide copolymer) [Polydepsipeptides (glycine-DL-lactide) copolymer)], polylactide / ethylene oxide copolymer, ash triglycerides 3,6-subs Asymmetrically 3,6-substituted poly-1,4-dioxane-2,5-diones, poly (3-hydroxybutylate) (( Poly (3-hydroxybutyrate), poly-3-hydroxybutylate / 3-hydroxyvalerate copolymer, poly-β-hydroxypropionate, poly- p-dioxone, poly-δ-valerolactone, poly-ε-caprolactone, copolymers thereof, or blends thereof may be exemplified, but is not limited thereto. Is poly (3-hydroxybutylate-co-3-hydroxyvalate) which is a poly (3-hydroxybutylate) or a poly-3-hydroxybutylate / 3-hydroxybarerate copolymer.

또한, 상기 본 발명의 생체적합성 나노입자 형성용 조성물은 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 즉, 폴리머가 용해된 유상과의 유화에 계면활성제 성분 없이 페이신, PHA 디폴리머라제 또는 페이신과 PHA 디폴리머라제 단백질만 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 상기 단백질 성분에 계면활성제가 함께 첨가될 수 있다. In addition, the composition for forming biocompatible nanoparticles of the present invention may further include a surfactant. That is, in addition to the surfactant component may be used without emulsifying the oil phase in which the polymer is dissolved, only the fascin, PHA depolymerase or the fascin and PHA depolymerase protein may be added together with the surfactant.

사용가능한 계면활성제는 임의의 음이온성 계면활성제와 임의의 양이온성 계면활성제를 포함한다. 음이온성 계면화성제로는 SDS(sodium dodecyl sulfate를, 양이온성 계면활성제로는 CTAB(cetyl trimethylammonium bromide)를 예시할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 단백질에 첨가되는 계면활성제는 단독 또는 1 이상 의 혼합 성분일 수 있으며, 첨가되는 계면활성제 함량은 목적에 맞게 조절될 수 있다.Surfactants that can be used include any anionic surfactant and any cationic surfactant. Anionic surfactants include, but are not limited to, sodium dodecyl sulfate (SDS), and cationic surfactants such as CTAB (cetyl trimethylammonium bromide), but are not limited thereto. The surfactant content added may be adjusted to suit the purpose.

또한, 본 발명은 페이신 및 PHA 디폴리머라제로 이루어진 군에서 선택되는 단백질로 코팅된 생체적합성 고분자 나노입자에 관한 것이다.The present invention also relates to biocompatible polymer nanoparticles coated with a protein selected from the group consisting of paysin and PHA depolymerase.

본 발명의 생체적합성 고분자 매트릭스 나노입자에 페이신 및 PHA 디폴리머라제에서 선택되는 단백질이 코팅된 형태학적 특성을 가지며, 첨가된 성분에 따라 기계적, 화학적, 물리적 특성도 개질된다. 예를 들어, 단백질의 농도가 높을수록 입자 크기가 커지며 분해속도도 증가하게 된다. 본 발명의 나노입자는, 첨가되는 성분의 조성과 농도, 예를 들어 단백질 및 계면활성제의 조성과 농도, 에멀젼화 공정 조건, 예를 들어 초음파 에너지 함수 등의 조건을 조절하여 목적에 맞도록 나노입자 직경을 조절할 수 있다. 구체적으로는, 20 nm 내지 5 ㎛의 직경, 보다 바람직하게는 20 내지 500 nm의 직경을 갖는 것을 특징으로 한다.The biocompatible polymer matrix nanoparticles of the present invention have morphological properties coated with proteins selected from paysin and PHA depolymerase, and the mechanical, chemical and physical properties are also modified according to the added components. For example, the higher the protein concentration, the larger the particle size and the faster the degradation rate. Nanoparticles of the present invention, the composition and concentration of the components to be added, for example, the composition and concentration of the protein and surfactant, the emulsification process conditions, for example, the conditions such as ultrasonic energy function to adjust the nanoparticles to suit the purpose. The diameter can be adjusted. Specifically, it is characterized by having a diameter of 20 nm to 5 μm, more preferably 20 to 500 nm.

본 발명의 페이신 및 PHA 디폴리머라제로 이루어진 군에서 선택되는 단백질로 코팅된 생체적합성 고분자 나노입자의 용도와 관련하여, 공지된 모든 용도에 적용할 수 있으며, 구체적으로, 약물전달체로 사용될 수 있다.Regarding the use of biocompatible polymer nanoparticles coated with a protein selected from the group consisting of paysin and PHA depolymerase of the present invention, it can be applied to all known uses, and in particular, can be used as a drug carrier. .

본 발명은 페이신 및 PHA 디폴리머라제로 이루어진 군에서 선택되는 단백질로 코팅된 생체적합성 고분자 나노입자에 약물이 담지된 약물전달체에 관한 것이다.The present invention relates to a drug carrier in which a drug is supported on biocompatible polymer nanoparticles coated with a protein selected from the group consisting of paysin and PHA depolymerase.

본 발명의 “약물전달체”는 장기간 동안 약물의 지속성 방출이 제어 가능한 약물전달체이다. 본 발명의 약물전달체는 제조된 나노입자의 조성에 따라 예정된 부위에서 예정된 시간에 걸쳐서 일정하게 전달될 수 있도록, 나노입자 분해속도와 약물의 방출 속도를 조절할 수 있다. 본 발명에 따른 약물전달체는, 예를 들어, 약물전달체의 크기와 형상, 공극의 모양과 크기를 분자와 고분자, 단백질, 계면활성제 등의 종류와 조성비 등으로 조절할 수 있다. 본 발명의 약물전달체에는 한가지 이상의 약물이 봉입될 수 있으며, 약물의 종류와 투여 목적에 맞도록 분해 속도 조절이 자유로우며 효율적인 약물방출 제어에 효율적이다. 당업자는 제조된 약물전달체의 약물봉입률, 물리화학적 물성, 약효 및 안정성, 고분자 재료의 분해능 및 형상 조건에 따른 성능데이터 등을 평가 및 비교하여 전달체 특성을 효과적으로 제어 및 개선시킬 수 있다. 본 발명의 약물전달체에 담지된 약물은 세포내에서 확산, 용해, 삼투압 또는 이온교환 등에 의하여 방출된다. The “drug carrier” of the present invention is a drug carrier that can control the sustained release of the drug for a long time. The drug carrier of the present invention may control the rate of nanoparticle degradation and the rate of release of the drug so that the drug delivery agent may be constantly delivered over a predetermined time at a predetermined site according to the composition of the prepared nanoparticles. In the drug carrier according to the present invention, for example, the size and shape of the drug carrier and the shape and size of the pores can be controlled by the type and composition ratio of molecules, polymers, proteins, surfactants and the like. One or more drugs may be encapsulated in the drug delivery system of the present invention, and according to the type of drug and the purpose of administration, the rate of decomposition is free and efficient for effective drug release control. Those skilled in the art can effectively control and improve the carrier properties by evaluating and comparing the drug encapsulation rate, physicochemical properties, drug efficacy and stability, performance data according to the resolution and shape conditions of the polymer material, and the like of the prepared drug carrier. The drug supported on the drug carrier of the present invention is released by diffusion, lysis, osmotic pressure or ion exchange in the cell.

본 발명의 약물전달체에 의해 운반될 수 있는 약물은 질병의 예방, 치료, 완화 또는 경감을 위해 사용되는 모든 생물학적, 화학적 물질을 포함한다. 약물은 구체적으로, 단백질, 펩타이드, 화합물, 추출물, 핵산(DNA, RNA, 올리코뉴클레오티드, 벡터) 등의 다양한 형태를 포함한다. 또한, 본 발명에 사용될 수 있는 약물은 특정 약제나 분류에 의해 제한되지 않으며, 예를 들어, 항생제, 항암제, 소염진통제, 항바이러스제, 항균제, 호르몬 등 일 수 있다. 약제에는 희석제, 방출 지연제, 비활성 오일, 결합제 등의 당 기술 분야의 다양한 부형제가 선택적으로 혼합될 수 있다. Drugs that can be carried by the drug carrier of the present invention include all biological and chemical substances used for the prevention, treatment, alleviation or alleviation of the disease. Drugs specifically include various forms, such as proteins, peptides, compounds, extracts, nucleic acids (DNA, RNA, oligonucleotides, vectors) and the like. In addition, the drug that can be used in the present invention is not limited by a specific drug or classification, and may be, for example, antibiotics, anticancer agents, anti-inflammatory drugs, antiviral agents, antibacterial agents, hormones and the like. The medicament may optionally be mixed with various excipients in the art, such as diluents, release retardants, inert oils, binders and the like.

본 발명의 약물전달체는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 적절한 방법으로 투여될 수 있다. The drug carrier of the present invention can be administered by any suitable method, including a pharmaceutically acceptable carrier.

또한, 본 발명은 페이신 및 PHA 디폴리머라제로 이루어진 군에서 선택되는 단백질로 코팅된 생체적합성 고분자 나노입자 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 나노입자는 고분자 나노입자를 제조하는 당 분야에 공지된 모든 방법, 또는 이를 응용한 방법으로 제조 가능한다. 이런 방법의 한 예로, 유상과 수상을 유화시켜 에멀젼을 형성하는 일반적인 2 상 에멀젼 기술 (two-phase emulsion technique)을 사용하는 하기 방법을 예시할 수 있으나, 이는 구현의 한 예일 뿐, 이로 제한되는 것은 아니다.The present invention also relates to a method for producing biocompatible polymer nanoparticles coated with a protein selected from the group consisting of paysin and PHA depolymerase. The nanoparticles of the present invention can be prepared by any method known in the art for preparing polymer nanoparticles, or by applying the same. As an example of such a method, the following method can be illustrated using a common two-phase emulsion technique that emulsifies the oil phase and the water phase to form an emulsion, but this is only one example of an implementation, but is not limited thereto. no.

본 발명의 페이신 및 PHA 디폴리머라제로 이루어진 군에서 선택되는 단백질로 코팅된 생체적합성 고분자 나노입자는 (i) 유기용매에 생체적합성 고분자를 용해시킨 유상 용액을 제조하는 공정 및 (ii) 본 발명의 나노입자 형성용 조성물을 상기 공정 (i)의 유상 용액에 첨가 후 유화시켜 에멀젼을 형성하는 공정으로 제조할 수 있다.The biocompatible polymer nanoparticles coated with a protein selected from the group consisting of paysin and PHA depolymerase of the present invention are prepared by (i) preparing an oily solution in which a biocompatible polymer is dissolved in an organic solvent, and (ii) the present invention. The composition for forming nanoparticles may be prepared by adding to the oily solution of step (i) and then emulsifying to form an emulsion.

구체적으로, 고분자는 유상 용액에 용해되어 있으며, 페이신, PHA 디폴리머라제 등의 단백질 및/또는 계면활성제는 수상 용액에 용해되어 있다. Specifically, the polymer is dissolved in an oily solution, and proteins and / or surfactants such as Paysine and PHA depolymerase are dissolved in the aqueous solution.

공정 (i)에서 사용 가능한 유기용매는 디클로로메탄, 클로로포름, 옥탄올, 사이클로핵산, 에틸아세테이트, 다이메틸설폭사이드, 다이메틸포름아마이드, N-메틸피롤리돈, 다이옥산, 테트라하이드로퓨란, 에틸아세테이트, 메틸에틸케톤 또는 아세토 나이트릴 등을 예시할 수 있으나, 이로 제한되지 않으며, 단일 성분 또는 혼합물 형태의 유기용매를 사용할 수 있다. 사용가능한 고분자의 종류, 페이신 및 PHA 디폴리머라제 등의 형태 등은 상기한 바와 같다.Organic solvents usable in step (i) include dichloromethane, chloroform, octanol, cyclonucleic acid, ethyl acetate, dimethylsulfoxide, dimethylformamide, N-methylpyrrolidone, dioxane, tetrahydrofuran, ethyl acetate, Methyl ethyl ketone or acetonitrile may be exemplified, but is not limited thereto, and an organic solvent in the form of a single component or a mixture may be used. The types of polymers that can be used, the forms of paysin and PHA depolymerase and the like are as described above.

공정 (ii)의 유화 공정은 초음파 처리하는 방법 또는 기계 교반 하는 방법 등으로 수행될 수 있다.The emulsification step of step (ii) may be carried out by a method of ultrasonication or mechanical stirring.

상기 제조 공정은 본 발명의 목적을 해하지 않는 범위에서 공정을 추가하거나 다양한 응용을 가할 수 있다. 제조된 나노입자는 통상의 방법으로 여과 및/또는 세척될 수 있다.The manufacturing process may add a process or add various applications without departing from the object of the present invention. The prepared nanoparticles can be filtered and / or washed in a conventional manner.

또한, 본 발명은 생체적합성 나노입자에 약물이 담지된 약물전달체의 제조방법에 관한 것이다. The present invention also relates to a method for preparing a drug carrier in which a drug is supported on biocompatible nanoparticles.

약물의 담지는 당업계에 알려진 방법으로 이루어질 수 있으며, 담지 가능한 약물은 상기 언급한 바와 같다. 약물이 나노입자에 담지되는 시점은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 약물은 에멀젼을 형성하기 전에 혼합될 수 있으나, 또는 에멀젼 형성 후에 담지할 수 있다. The supporting of the drug may be made by a method known in the art, and the supporting drug is as mentioned above. The time point at which the drug is supported on the nanoparticles is not particularly limited. For example, the drugs may be mixed before forming the emulsion, or may be supported after forming the emulsion.

에멀젼 형성 전 약물 담지의 한 구현 예로서, 약물은 미리 고분자 용액 또는 본 발명의 나노입자 형성용 조성물에 적절하게 복합재 형태로 혼합시킨 후에 에멀젼화시키는 공정으로 제조될 수 있다. 복합재는 약물 일정량을 미리 고분자 용액 또는 본 발명의 나노입자 형성용 조성물에 첨가한 후 기계적 또는 물리적으로 혼합하여 제조할 수 있다. As one embodiment of the drug loading before the emulsion is formed, the drug may be prepared by a process of emulsifying after mixing the polymer solution or the composition for forming nanoparticles of the present invention as appropriate in the form of a composite. The composite material may be prepared by adding a predetermined amount of the drug to the polymer solution or the composition for forming nanoparticles of the present invention and then mechanically or physically mixing the drug.

구체적으로, (i) 유기용매에 생체적합성 고분자를 용해시킨 유상 용액을 제조하는 공정; 및 (ii) 본 발명의 나노입자 형성용 조성물 및 약물을 상기 공정 (i)에서 제조된 유상 용액에 첨가 후 유화시켜 에멀젼을 형성하는 공정으로 제조될 수 있다. 또는 (i) 유기용매에 생체적합성 고분자 및 약물을 용해시킨 유상 용액을 제조하는 공정; 및 (ii) 본 발명의 나노입자 형성용 조성물을 상기 공정 (i)에서 제조된 유상 용액에 첨가 후 유화시켜 에멀젼을 형성하는 공정으로 제조될 수 있다.Specifically, (i) preparing an oily solution in which a biocompatible polymer is dissolved in an organic solvent; And (ii) the composition and drug for forming nanoparticles of the present invention may be prepared by a process of forming an emulsion by emulsification after addition to the oily solution prepared in step (i). Or (i) preparing an oily solution in which a biocompatible polymer and a drug are dissolved in an organic solvent; And (ii) the composition for forming nanoparticles of the present invention is added to the oily solution prepared in step (i) and then emulsified to form an emulsion.

에멀젼 형성 후 약물 담지의 한 예로는, (i) 유기용매에 생체적합성 고분자를 용해시킨 유상 용액을 제조하는 공정; (ii) 본 발명의 나노입자 형성용 조성물을 상기 공정 (i)의 유상 용액에 첨가 후 유화시켜 에멀젼을 형성하는 공정; 및 (iii) 상기 에멀젼을 약물과 접촉시키는 공정으로 제조될 수 있다.Examples of drug loading after emulsion formation include: (i) preparing an oily solution in which a biocompatible polymer is dissolved in an organic solvent; (ii) adding the composition for forming nanoparticles of the present invention to an oily solution of step (i) and then emulsifying to form an emulsion; And (iii) contacting the emulsion with a drug.

상기 예시된 방법으로 약물의 초기 과다 방출은 억제되고 약물의 지속적인 방출이 유도되는 생체적합성 나노입자에 약물이 담지된 약물전달체를 효과적으로 제조할 수 있다. 그러나 상기 방법들은 약물이 담지된 약물전달체 제조의 예시일 뿐이며, 당업계에 공지된 다양한 방법으로 제조될 수 있다. 또한 각 공정은 본 발명의 목적을 해하지 않는 범위에서 공정을 추가하거나 다양한 응용을 가할 수 있다.By the method exemplified above, it is possible to effectively prepare a drug carrier in which the drug is supported on the biocompatible nanoparticles in which initial over-release of the drug is suppressed and continuous release of the drug is induced. However, the above methods are merely examples of drug carriers carrying a drug, and may be prepared by various methods known in the art. In addition, each process can add a process or can apply various applications in the range which does not impair the objective of this invention.

본 발명의 방법으로, 약물전달체 등으로 사용 가능한 나노입자를 페이신, PHA 디폴리머라제 등의 단백질을 주요 성분으로 하여 효과적으로 제조할 수 있었다.According to the method of the present invention, nanoparticles that can be used as drug carriers and the like can be effectively produced using proteins such as paysin and PHA depolymerase as main components.

이하, 실시예와 비교예를 통하여 본 발명을 상세히 설명한다. 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in detail through Examples and Comparative Examples. The following examples are illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited by the examples.

실시예 1: 재료 및 방법Example 1: Materials and Methods

1-1: 박테리아 균주 및 플라스미드1-1: Bacterial Strains and Plasmids

본 실험에 사용된 박테리아 스트레인 및 플라스미드는 표 1에 기재하였다. 이. 콜라이 XL Ⅰ은 플라스미드의 클로닝에, E. coli BL21(DE3)은 재조합 단백질의 발현을 위한 것이다. The bacterial strains and plasmids used in this experiment are listed in Table 1. this. E. coli BL21 (DE3) is for the expression of recombinant proteins.

Figure 112008089443831-pat00001
Figure 112008089443831-pat00001

-2: DNA 조작 및 플라스미드 제조-2: DNA manipulation and plasmid preparation

플라스미드 분리, 젤 전기영동, 형질전환, PCR 및 벡터 제조를 위한 클로닝은 표준 절차에 따라 수행하였다 (Sambrook J, and D.W Russel. Molecular cloning: A laboratory manual. 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001). R. eutropha 염색체 DNA에서 phaP1 유전자(4개의 아형, phaP1, phaP2, phaP3 및 phaP4 (Potter M et al., 2004;150:2301-2311) 에 주요 단백질을 코딩하는) 는 번역 시작 코돈 영역에서 BamH Ⅰ부위를 가지는 서열번호 1의 RephaP-Bam 프라이머 및 종결 코돈 영역에서 EcoR Ⅰ부위를가지는 서열번호 2의 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하였다. 증폭된 분절 (fragment)을 His6-태그 발현을 위한 pET-28a (Novagen) 벡터와 글루타치온 S-트랜스퍼라제 (GST, Schistosoma japonicum, protein size: 26 kDa) 융합 발현 생성을 위한 pGEX-linker2 (GE Healthcare Life Sciences) 벡터로 삽입되어, 각각 pET-WephaP 및 pGEX-WephaP를 생성하였다. 2개의 구축된 플라스미드, pET-WephaP 및 pGEX-WephaP을 이.콜라이 BL21(DE3)로 일렉트로포레이션법(O'connell K et al., Appl Environ Microbiol 2000; 66:401-405)으로 도입하였다. pET-WephaP 및 pGEX-WephaP를 가지는 2개의 재조합 E. coli BL21(DE3)는 각각 카나마이신 및 앰피실린을 포함하는 30℃의 LB 배지에서 선택하였다. pET-WephaP를 가지는 E. coli BL21(DE3) 는 카나마이신 (30 ㎍/ml) LB 배지로 접종하고 37℃에서 3시간 배양하였다. 다음, 0.1 mM IPTG 존재하에 37℃에서 3시간 추가 배양하고 수집하였다. pGEX-WephaP를 가지는 E. coli BL21(DE3) 는 앰피실린(50 ㎍/ml)을 포함하는 LB 배지에 접종하고 37℃에서 3시간 배양하였다. 그리고 0.1 mM IPTG 존재하에 20℃에서 12시간 더 배양하고 수집하였다.Cloning for plasmid isolation, gel electrophoresis, transformation, PCR and vector preparation was performed according to standard procedures (Sambrook J, and DW Russel. Molecular cloning: A laboratory manual. 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001). In R. eutropha chromosome DNA, the phaP1 gene (which encodes the major proteins in four subtypes, phaP1 , phaP2 , phaP3 and phaP4 (Potter M et al., 2004; 150: 2301-2311)) is BamH I in the translation start codon region. PCR was amplified using the RephaP-Bam primer of SEQ ID NO: 1 having the site and the primer of SEQ ID NO: 2 having the EcoR I site in the stop codon region. The amplified fragment was used to generate pG-28a (Novagen) vector and glutathione S-transferase (GST, Schistosoma japonicum , protein size: 26 kDa) fusion expression for His 6 -tag expression (GE Healthcare). Life Sciences) were inserted into the vector to generate pET-WephaP and pGEX-WephaP, respectively. Two constructed plasmids, pET-WephaP and pGEX-WephaP, were introduced by E. coli BL21 (DE3) by electroporation (O'connell K et al., Appl Environ Microbiol 2000; 66: 401-405). Two recombinant E. coli BL21 (DE3) with pET-WephaP and pGEX-WephaP were selected in LB medium at 30 ° C. containing kanamycin and ampicillin, respectively. E. coli BL21 (DE3) with pET-WephaP was inoculated with kanamycin (30 μg / ml) LB medium and incubated at 37 ° C. for 3 hours. Next, the cells were further incubated for 3 hours at 37 ° C in the presence of 0.1 mM IPTG and collected. E. coli BL21 (DE3) with pGEX-WephaP was inoculated in LB medium containing ampicillin (50 μg / ml) and incubated at 37 ° C. for 3 hours. And further incubated for 12 hours at 20 ℃ in the presence of 0.1 mM IPTG and collected.

PHA 디폴리머라제 phaZ 유전자는 하이드로지노파가 슈도플라 ATCC33668에서 분리되었고 GenBank에 기탁번호 EU622638로 기탁하였다. H. 슈도플라바 ATCC33668 게노믹 DNA에서 phaZ 유전자는 번역 시작 코돈 영역에 BamH Ⅰ부위를 가지는 서열번호 3의 HpfZ-Bam 프라이머와 종결 코돈 영역에서 Hind III 부위를 가지는 서열번호 4의 HpfZ-Hind 프라이머를 이용하여 PCR-증폭되었다. 증폭된 DNA 단편은 BamH Ⅰ와 Hind III로 분해된 pET-28a 벡터로 클로닝되어 pET-HpfphaZ를 생성하였다. 플라스미드는 E. coli BL21(DE3)로 도입되었다. pET-HpfphaZ를 가지는 E. coli BL21(DE3) 는 pET-WephaP를 가지는 E. coli BL21(DE3)와 유사하게 배양하였다. PHA depolymerase phaZ gene was hydrozinopa isolated from Pseudofla ATAT33668 and deposited with GenBank under accession number EU622638. In H. pseudoflava ATCC33668 genomic DNA, the phaZ gene contains the HpfZ-Bam primer of SEQ ID NO: 3 having the BamH I site in the translation start codon region and the HpfZ-Hind primer of SEQ ID NO: 4 having the Hind III site in the stop codon region. PCR-amplified using. The amplified DNA fragment was cloned into pET-28a vector digested with BamH I and Hind III to generate pET-HpfphaZ. The plasmid was introduced into E. coli BL21 (DE3). E. coli BL21 (DE3) with pET-HpfphaZ was cultured similarly to E. coli BL21 (DE3) with pET-WephaP.

1-3: 재조합 단백질의 정제 및 재폴딩1-3: Purification and Refolding of Recombinant Proteins

His-태그 R. 유트로파 PhaP 및 GST-융합된 PhaP는 가용성 단백질로 과발현시켰다. His-태그 PhaP 단백질은 제조사의 프로토콜에 따라 Ni-NTA 킬레이팅 아가로즈 CL-6B (Peptron, Korea) 로딩된 금속 킬레이션 크로마토그래피를 이용하여 정제되고, GST 융합 단백질은 글루타치온 세파로즈TM 4 패스트 플로우 (GE Healthcare, USA)가 로딩된 글루타티온 어피니티 크로마토그래피를 이용하여 정제되었다. His-tag R. Eutropa PhaP and GST-fused PhaP were overexpressed as soluble proteins. His-tagged PhaP protein was purified using Ni-NTA chelating agarose CL-6B (Peptron, Korea) loaded metal chelation chromatography according to the manufacturer's protocol, and GST fusion protein was glutathione Sepharose ™ 4 fast flow (GE Healthcare, USA) was purified using loaded glutathione affinity chromatography.

His-태그 H. 슈도플라바 PhaZ는 세포에서 응집체 (inclusion body) 로 축적되었다. GST/PhaZ 융합단백질은 하기와 같이 재폴딩되었다. 과발현된 세포를 20 mM Tris-HCl(pH 8.0)에서 재현탁시키고 20 kHz에서 10분간 초음파 처리하였다. 세포를 분리버퍼(isolation buffer)(2 M urea, 20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 2% Triton X-100, pH 8.0)에서 재현탁시키고 20 kHz에서 1분간 초음파 처리하고 펠렛으로 분리하기 위하여 원심분리하였다. 상기 분리 절차를 2번 반복한 후에, 결과로 생긴 펠렛을 결합버퍼(binding buffer)(6 M urea, 20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 5 mM imidazole, 1 mM 2-mercaptoethanol, pH 8.0)에서 재현탁시고 1 시간 동안 교반 하였다. 현탁 혼합물로부터 상층액을 회수하고 0.45 ㎛ 필터로 여과하였다. 여과액을 금속 킬레이션 컬럼에 로딩하였다. 변성된 His-태그 PhaZ 단백질은 컬럼에서 재폴딩되는 방법을 사용하였다 (Colangeli R et al., J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1998;714(2):223-235). 재폴딩된 His-태그 PhaZ 단백질을 용출버퍼(elution buffer)(20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 500 mM imidazole, 1 mM 2-mercaptoethanol, pH 8.0)로 용출시켜 정제하였다. His-tag H. pseudoflava PhaZ accumulated in the cells as an inclusion body. GST / PhaZ fusion proteins were refolded as follows. Overexpressed cells were resuspended in 20 mM Tris-HCl, pH 8.0 and sonicated for 10 minutes at 20 kHz. Cells were resuspended in isolation buffer (2 M urea, 20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 2% Triton X-100, pH 8.0), sonicated for 1 minute at 20 kHz and separated by pellets. Centrifuged. After repeating the separation procedure twice, the resulting pellets were placed in a binding buffer (6 M urea, 20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 5 mM imidazole, 1 mM 2-mercaptoethanol, pH 8.0). Resuspend and stir for 1 h. The supernatant was recovered from the suspension mixture and filtered through a 0.45 μm filter. The filtrate was loaded onto a metal chelation column. Denatured His-tagged PhaZ protein was used to refold in the column (Colangeli R et al., J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1998; 714 (2): 223-235). The refolded His-tagged PhaZ protein was purified by eluting with an elution buffer (20 mM Tris-HCl, 0.5 M NaCl, 500 mM imidazole, 1 mM 2-mercaptoethanol, pH 8.0).

1-4: 계면활성제 (detergent) 또는 단백질 이용한 PHB 그래뉼의 제조1-4: Preparation of PHB Granules Using Detergent or Protein

인공 무정형 PHB 그래뉼 (artificial amorphous PHB granules)은 공지방법으로 제조하였다 (Horowitz DM et al., J Am Chem Soc 1994 116: 2695-). 계면활성제 처리법에서, 2가지 형태 계면활성제, SDC (sodium deoxycholate) [Kobayashi T et al., J Bacteriol 2003;185:3485-3490] 와 CTAB (cetyltrimethyl-ammonium bromide)가 음이온 및 양이온 계면활성제로 사용되었다. SDC 방법에서,(R. eutropha H16에서 합성된) P(3HB) 호모폴리머 (Song JJ, et al., J Microbiol Biotechnol 1993;3:115-122)를 1ml 클로로포름 용액에 (5 (w/v)%) 녹이고 적정량의 SDC 용액을 클로로포름 용액에 첨가하였다 (혼합비 20:1). 두 층의 용액을 20 kHz, 3분간 실온에서 초음파처리하고 유화시켜 에멀젼을 형성시킨다. 에멀젼 용액에서 클로로포름을 제거하고자 65 ℃에서 1 시간, 실온에서 4 시간 섞어주었다. 응집된 폴리머 입자는 종이 필터(pore size, 5 ㎛)로 여과하여 제거하였다. 여과액을 0.01 (w/v)% SDC로 24시간 동안 셀룰로즈 아세테이트 막 (MW cut-off 3,500, Membrane Filtration Product, USA)으로 투석하였다. 원심분리(1,500xg) 로 분리된 그래뉼은 인산 버퍼 (50 mM sodium phosphate, pH 8.0)에 보관하였다. 여과액에서 원심분리로 분리된 CTAB 처리된 그래뉼은 투석하지 않고 동일 버퍼에 보관하였다. His6-태그된 PhaP, GST-융합 PhaP 또는 His6-태그된 PhaZ 단백질 (0.0001 w/v%)을 이용하여 제조된 다른 그래뉼도 같은 방법으로 제조되었다. Artificial amorphous PHB granules were prepared by known methods (Horowitz DM et al., J Am Chem Soc 1994 116: 2695-). In the surfactant treatment, two forms of surfactant, sodium deoxycholate (SDC) [Kobayashi T et al., J Bacteriol 2003; 185: 3485-3490] and cetyltrimethyl-ammonium bromide (CTAB), were used as anionic and cationic surfactants. . In the SDC method, P (3HB) homopolymer (synthesized in R. eutropha H16) (Song JJ, et al., J Microbiol Biotechnol 1993; 3: 115-122) was added to (5 (w / v) in 1 ml chloroform solution. %) And an appropriate amount of SDC solution was added to the chloroform solution (mix ratio 20: 1). The two layers of solution are sonicated and emulsified at 20 kHz for 3 minutes at room temperature to form an emulsion. To remove chloroform from the emulsion solution, the mixture was mixed at 65 ° C. for 1 hour and at room temperature for 4 hours. Aggregated polymer particles were removed by filtration with a paper filter (pore size, 5 μm). The filtrate was dialyzed with cellulose acetate membrane (MW cut-off 3,500, Membrane Filtration Product, USA) for 24 hours at 0.01 (w / v)% SDC. Granules separated by centrifugation (1,500 × g) were stored in phosphate buffer (50 mM sodium phosphate, pH 8.0). CTAB treated granules separated from the filtrate by centrifugation were stored in the same buffer without dialysis. Other granules prepared using His 6 -tagged PhaP, GST-fused PhaP or His 6 -tagged PhaZ protein (0.0001 w / v%) were prepared in the same manner.

1-5: 주사전자 현미경(Scanning electron microscopy)1-5: Scanning electron microscopy

가시화를 위하여 그래뉼 시료를 0.2 M 인산 나트륨 버퍼(pH 7.2) 내 2.5% 글루타르알데하이드 (Electron Microscopy Sciences) 의 용액으로 4℃에서 3시간 동안 고정시키고 시료를 글루타르알데하이드로 고정시키고 인산 버퍼로 2 번 세척한 다음, 신선한 1% 오스뮴-테트라-옥사이드 (osmium-tetra-oxide) 용액으로 4℃에서 2시간 동안 2차 고정하였다. 오스뮴-테트라-옥사이드 고정된 시료를 단계별 에탄올 농도(각 5분간 50, 60, 70, 80, 90 및 100%)로 탈수시켰다. 시료를 금박막(fine coat sputter JFC-1100, JEOL)으로 코팅시키고 장방출 주사전자현미경(field emission scanning electron microscope: FE-SEM) (Philips XL30 S FEG, Netherlands)을 이용하여 관찰하였다. Granulate samples for visualization Fix with a solution of 2.5% glutaraldehyde (Electron Microscopy Sciences) in 0.2 M sodium phosphate buffer (pH 7.2) at 4 ° C. for 3 hours, fix the sample with glutaraldehyde and wash twice with phosphate buffer, then fresh 1 Second fixation was performed at 4 ° C. for 2 hours with a% osmium-tetra-oxide solution. Osmium-tetra-oxide fixed samples were dehydrated at stepwise ethanol concentrations (50, 60, 70, 80, 90 and 100% for 5 minutes each). Samples were coated with a fine coat sputter JFC-1100, JEOL and observed using a field emission scanning electron microscope (FE-SEM) (Philips XL30 S FEG, Netherlands).

1-6: 1-6: H.H. 슈도플라바 (His) Pseudoflava (His) 66 -PhaZ 로딩된 PHB 그래뉼의 분해 실험 Of PHAZ Loaded PHB Granules

H. 슈도플라바 (His)6-PhaZ에 의해 로딩된 PHB 그래뉼 분해는 에멀젼 용액에 대하여 650 nm에서 광학밀도의 감소를 측정하여 모니터하였다. 400 ㎍의 (His)6-PhaZ 로딩된 젖은(비건조) PHB 그래뉼 (A650nm=2.0)을 1 ml 의 테스터 튜브에서 50 mM Tris-HCl (pH 8.0, 1 mM CaCl2) 버퍼 용액에서 현탁시켰다. 현탁액을 측정 사이에 시간 간격을 두고 37℃, 100 rpm에서 보관 및 진탕시킨 후, 용액을 UV 셀 큐벳으로 이동시키고 흡광도를 측정하였다 [Doi Y et al., Biomacromolecules 2000;1:320-324]PHB granule digestion loaded with H. pseudoflava (His) 6- PhaZ was monitored by measuring a decrease in optical density at 650 nm for the emulsion solution. 400 μg (His) 6- PhaZ loaded wet (non-dry) PHB granules (A 650 nm = 2.0) were suspended in 50 mM Tris-HCl (pH 8.0, 1 mM CaCl 2 ) buffer solution in 1 ml tester tube. I was. After the suspension was stored and shaken at 37 ° C., 100 rpm with time interval between measurements, the solution was transferred to a UV cell cuvette and the absorbance measured [Doi Y et al., Biomacromolecules 2000; 1: 320-324].

1-7: 재조합 페이신(recombinant phasin)의 유화 특징 1-7: Emulsification Characteristics of Recombinant Phasin

페이신 단백질 (His)6-PhaP 의 유화 특징을 관찰하고자, 10 mM 스테아르산 (stearic acid)을 5 ml 옥탄올 (octanol) 또는 클로로포름 (chloroform)에 용해시켰다. 유기 용매 혼합물을 10 mM 인산 나트륨 버퍼 (pH 7.2) 에 용해된 페이신 수용액 1 ml 과 혼합시키고 10 ml 테스트 튜브의 혼합물을 실온에서 12 시간 50 rpm 으로 인버트(invert) 시켰다. To observe the emulsification characteristics of Paisin Protein (His) 6 -PhaP, 10 mM stearic acid was dissolved in 5 ml octanol or chloroform. The organic solvent mixture was mixed with 1 ml of aqueous solution of pasin in 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.2, and the mixture of 10 ml test tubes was inverted at room temperature for 12 hours and 50 rpm.

1-8: 기타 분석법1-8: Other Methods

단백질 함량을 로우리(Lowry) 등의 방법으로 측정하고 (Lowry OH et al., J Biol Chem 1951;193:265-275), SDS-PAGE를 하였다 (Laemmli UK. Nature 1970;227:680-685)Measuring the protein content, for example by Lowry (Lowry) and (Lowry OH et al, J Biol Chem 1951; 193:. 265-275), was an SDS-PAGE (Laemmli UK Nature 1970 ; 227:. 680-685)

실시예 2: PHB 그래뉼의 특성Example 2: Properties of PHB Granules

모든 재조합 단백질, 2개의 PhaPs인 (His)6-PhaP 및 GST-PhaP, 및 (His)6-PhaZ은 단일 전기영동 밴드를 보이도록 충분히 각각 정제하였다 (도 1). 유전자 서열에서 R. 유트로파 PhaP 와 H. 슈도플라바 PhaZ에서 추론한 크기는 각각 19 및 54 kDa이다. 따라서, (His)6-PhaP, GST-PhaP 및 (His)6-PhaZ는 원래 크기와 비교하여 합당한 크기를 보여준다.All recombinant proteins, two PhaPs (His) 6 -PhaP and GST-PhaP, and (His) 6 -PhaZ, were each purified sufficiently to show a single electrophoretic band (FIG. 1). The sizes inferred from R. eutropha PhaP and H. pseudoflava PhaZ in the gene sequence are 19 and 54 kDa, respectively. Thus, (His) 6 -PhaP, GST-PhaP and (His) 6 -PhaZ show reasonable sizes compared to the original size.

페이신 및 페이신-유사 단백질은 유기용매 노출에 안정한 것으로 알려져 있다 [Handrick R et al., FEMS Microbiol Lett 2004;230:265-274]. 단백질은 지질을 둘러싼 PHA 그래뉼[Steinbuchel A et al., Can J Microbiol 1995;41(Suppl. 1): 94-105; Pieper-Furst U et al., J Bacteriol 1994;176. 4328-4337; Pieper-Furst U et al., J Bacteriol 1995;177: 2513-2523; Handrick R et al., J. Bacteriol. 2004;186: 2466-2475; Potter M et al., Microbiology 2004;150:2301-2311; Potter M et al., Microbiology 2002;148:2413-2426; Maehara A et al., J Bacteriol 2002;184:3992-4002; Potter M et al., Biomacromolecules 2005;6:552-560; Jurasek L et al., Biomacromolecules 2002;3:256-261; Prieto MA et al., J Bacteriol 1999;181(3):858-688]과 함께 세포에서 PHA 그래뉼 표면에 위치하고, 이는 단백질이 소수성/친수성의 양친매성 특성을 가지는 것을 의미한다. 유기용매/물 상의 24 시간 인버팅(inverting)은 오일에서 소수성 스테아르산을 유화시키기 위하여 페이신 분자가 오일 상으로 이동하여 W/O (water-in-oil) 에멀젼이 형성되었다 (도 2). 클로로포름은 옥탄올 보다 우수한 유화를 보여주었다. 이런 계면활성제-유사 특성은 2 상 유화 기술을 이용한 인공 PHA 그래뉼 형성에서의 페이신의 잠재적 역할을 증명하는 것이다. Paisin and paysin-like proteins are known to be stable to organic solvent exposure (Handrick R et al., FEMS Microbiol Lett 2004; 230: 265-274). Proteins include PHA granules surrounding lipids (Steinbuchel A et al., Can J Microbiol 1995; 41 (Suppl. 1): 94-105; Pieper-Furst U et al., J Bacteriol 1994; 176. 4328-4337; Pieper-Furst U et al., J Bacteriol 1995; 177: 2513-2523; Handrick R et al., J. Bacteriol. 2004; 186: 2466-2475; Potter M et al., Microbiology 2004; 150: 2301-2311; Potter M et al., Microbiology 2002; 148: 2413-2426; Maehara A et al., J Bacteriol 2002; 184: 3992-4002; Potter M et al., Biomacromolecules 2005; 6: 552-560; Jurasek L et al., Biomacromolecules 2002; 3: 256-261; Prieto MA et al., J Bacteriol 1999; 181 (3): 858-688] and are located on the PHA granule surface in cells, meaning that the protein has hydrophobic / hydrophilic amphiphilic properties. 24 hour inverting of the organic solvent / water resulted in the migration of the paysin molecules to the oil phase to emulsify hydrophobic stearic acid in the oil, forming a water-in-oil (W / O) emulsion (FIG. 2). Chloroform showed better emulsification than octanol. These surfactant-like properties demonstrate the potential role of paysin in artificial PHA granule formation using two-phase emulsification techniques.

인공 PHB 그래뉼은 CTAB 및 SDC 같은 0.05 w/v% 계면활성제 존재하에 제조되었다. 하이포클로라이트 처리에 의하여 H. 슈도플라바 세포에서 분리된 원래 그래뉼 (native granules)과 비교하여, 2종류의 인공 그래뉼은, 구조적으로 음이온 SDC 처리 그래뉼이 양이온 CTAB 처리된 그래뉼보다 더 우수하여 보이고 크기가 균일하였다 (도 3). SDC 처리 그래뉼은 바이모델(bimodal) 크기 분포를 보여준다: 적은 것은 ~100 ~ 200 nm 범위이고, 큰 것은 ~400 ~ 500 nm이다. 회수율은 ~ 50% 였다. 페이신은 세포내 그래뉼의 수와 크기를 모두 조절하는 것으로 알려져 있다 [Steinbuchel A et al., Can J Microbiol 1995;41(Suppl. 1): 94-105; Pieper-Furst U et al., J Bacteriol 1994;176. 4328-4337; Pieper-Furst U et al., J Bacteriol 1995;177: 2513-2523; Handrick R et al., J. Bacteriol. 2004;186: 2466-2475; Potter M et al., Microbiology 2004;150:2301-2311; Potter M et al., Microbiology 2002;148:2413-2426; Maehara A et al., J Bacteriol 2002;184:3992-4002; Potter M et al., Biomacromolecules 2005;6:552-560; Jurasek L et al., Biomacromolecules 2002;3:256-261; Prieto MA et al., J Bacteriol 1999;181(3):858-688]. 따라서, 계면활성제 처리 시스템에 0.0001 또는 0.001 w/v% 페이신으로 동시 첨가하였다 (도 4). 페이신-프리 시스템과 비교하여, 0.05 w/v% SDC 처리가 상대적으로 보다-정교한 구형 그래뉼을 형성되게 하였다. SDC를 10배 이상 첨가 (0.5 wt/v%)하면 PHB입자의 직경을 최대 2배 증가하게 하였다. 이는 페이신이 인비보 뿐만 아니라 인비트로에서도 그래뉼 형성에 영향을 주는 것을 의미한다. 인비보에서 페이신의 고발현은 그래뉼의 크기를 감소시키고 수를 증가시키는 것으로 알려져 있다 [Pieper-Furst U et al., J Bacteriol 1995;177: 2513-2523; Jurasek L et al., 2002;3:256-261]. 그래뉼 형성에 대한 페이신의 인비트로 효과를 보다 잘 이해하기 위하여, 농도 의존적 실험을 2가지 형태의 페이신, (His)6-PhaP 및 GST-PhaP에 대하여 수행하였다 (도 5). 0.0001 ~ 0.001w/v% 사이의 단백질 농도에서, (His)6-PhaP 및 GST-PhaP은 PHB 그래뉼 형성을 유도하였다 (sonication condition; 20 KHz, 3 min, pulse 0.5 sec: 모든 granule prep에서 동일 조건). 또한, 인비보 형성과 달리 페이신 농도 증가는 PHB 그래뉼의 크기를 증가시켰다. 양 타입의 페이신은, 단백질 저농도에서 크기 분포는 넓었으나 고농도에서는 2가지 다른 그룹의 크기 그래뉼 (Musyanovych A et al., Langmuir 2007;23:5367-5376) 특히, GST-PhaP의 경우, 100 ~ 200 및 400 ~ 500 nm)가 우세하였다. 바이모달(bimodal) 크기 분포는 2개의 다른 타입의 결정핵생성(nucleation) 기원이 존재함을 의미한다. 0.001 w/v% 농도에서, GST-PhaP 처리 그래뉼은 (His)6-PhaP 처리 그래뉼 보다 더 일정한 크기 분포 및 우수한 모양과 표면 형태를 보여주었다. (His)6-PhaP 처리는 3배 이상 크고 그러나 거칠게 형성된 그래뉼을 형성시켰다. GST-PhaP의 긴 극성 GST 사슬분자가 형태형성을 조절하는 역할을 하는 것으로 생각된다.Artificial PHB granules were prepared in the presence of 0.05 w / v% surfactant such as CTAB and SDC. Compared to the native granules isolated from H. pseudoflava cells by hypochlorite treatment, the two artificial granules show structurally superior anionic SDC treated granules than the cationic CTAB treated granules. Was uniform (FIG. 3). SDC treated granules show a bimodal size distribution: the smaller range is ~ 100-200 nm and the larger range is ~ 400-500 nm. Recovery was -50%. Paysin is known to regulate both the number and size of intracellular granules. Steinbuchel A et al., Can J Microbiol 1995; 41 (Suppl. 1): 94-105; Pieper-Furst U et al., J Bacteriol 1994; 176. 4328-4337; Pieper-Furst U et al., J Bacteriol 1995; 177: 2513-2523; Handrick R et al., J. Bacteriol. 2004; 186: 2466-2475; Potter M et al., Microbiology 2004; 150: 2301-2311; Potter M et al., Microbiology 2002; 148: 2413-2426; Maehara A et al., J Bacteriol 2002; 184: 3992-4002; Potter M et al., Biomacromolecules 2005; 6: 552-560; Jurasek L et al., Biomacromolecules 2002; 3: 256-261; Prieto MA et al., J Bacteriol 1999; 181 (3): 858-688]. Therefore, it was co-added with 0.0001 or 0.001 w / v% paysin to the surfactant treatment system (FIG. 4). Compared to the Paysin-free system, 0.05 w / v% SDC treatment resulted in the formation of relatively more precise spherical granules. Addition of more than 10 times SDC (0.5 wt / v%) resulted in up to 2 times increase in diameter of PHB particles. This means that paysin affects granule formation not only in vivo but also in vitro. High expression of paysin in in vivo is known to reduce the size of granules and increase the number [Pieper-Furst U et al., J Bacteriol 1995; 177: 2513-2523; Jurasek L et al., 2002; 3: 256-261. To better understand the in vitro effect of paysin on granule formation, concentration dependent experiments were performed on two forms of paysin, (His) 6 -PhaP and GST-PhaP (FIG. 5). At protein concentrations between 0.0001 and 0.001 w / v%, (His) 6 -PhaP and GST-PhaP induced PHB granule formation (sonication condition; 20 KHz, 3 min, pulse 0.5 sec: identical conditions at all granule prep) ). In addition, unlike in vivo formation, increasing the concentration of paysin increased the size of the PHB granules. Both types of paysin have a broad size distribution at low protein concentrations, but at high concentrations two different groups of size granules (Musyanovych A et al., Langmuir 2007; 23: 5367-5376), especially for GST-PhaP. And 400-500 nm) were dominant. Bimodal size distribution means that there are two different types of nucleation origins. At a concentration of 0.001 w / v%, the GST-PhaP treated granules showed a more consistent size distribution and better shape and surface morphology than the (His) 6 -PhaP treated granules. (His) 6 -PhaP treatment formed granules that were three times larger but rougher. The long polar GST chain molecules of GST-PhaP are thought to play a role in regulating morphogenesis.

유기용매/물 에멀젼 시스템에서, 페이신은 그래뉼 형성에 농도 의존성을 보이고 인비보 세포에서와는 완전히 다르다. 이는 다른 환경적 요인 (유기 용매, 온도, 이온강도, pH, 기계적 교반)과 유기용매/물 경계에서 페이신 분자의 유기용매-유도된 형태 변화 때문일 것이며, 전체적으로 인비보에서와는 다른 계면 에너지의 페이신을 만든다. 따라서, 인비보에서의 PHB 그래뉼 형성을 모사시키기 위해서는, 전체적으로 다른 새로운 프로토콜이 개발되어야한다. 20 ~ 300 ㎛ 구형 그래뉼[Khang K et al., Bio-Med Mater Eng 2001;11:89-103]을 생성하는 블렌더 교반 에멀젼 기술과 비교하여, 본 기술은 기계적 교반기술 보다 103 배 작은 나노레벨의 50 ~ 500 nm 구형입자를 제조하는데 매우 유용한 것으로 여겨진다. In organic solvent / water emulsion systems, paysin shows concentration dependence on granule formation and is completely different from in vivo cells. This may be due to other environmental factors (organic solvent, temperature, ionic strength, pH, mechanical agitation) and organic solvent-induced morphological changes of the pascine molecule at the organic solvent / water interface, which in turn results in Pascine of different interfacial energy than in vivo. Make. Thus, to mimic PHB granule formation in vivo, a whole new protocol has to be developed. 20 ~ 300 ㎛ spherical granules [Khang K et al, Bio- Med Mater Eng 2001; 11:. 89-103] compared to the blender stirred emulsion technique to generate, this technology is 10 3 times smaller than a nano-level mechanical stirring technique It is believed to be very useful for the preparation of 50-500 nm spherical particles.

도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 어떤 계면활성제 첨가 없이 단백질 첨가만으로 인공 PHB 그래뉼을 형성할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 분해 조절 PHB 그래뉼의 디자인을 위하여, 인비보 세포 표면에 존재하고 PHB를 분해하는 것으로 알려진 소수성 세포내 PHA 디폴리머라제 [Kobayashi T et al., J Bacteriol 2003;185:3485-3490; Merrick JM et al., Inter J Biol Macromol 1999;25:129-134; York GM et al., J Bacteriol 2003;185:3788-3794]이 PHB 그래뉼의 형성에 미치는 효과를 조사하였다. 도 6 (A)에서 볼 수 있는 바와 같이, 그래뉼 형태는 상대적으로 덜 정교하나, (His)6-PhaZ (0.0001 w/v%) 은 불규칙적 형태로 PHB 그래뉼 형성을 보조하였다. 공정의 거친 조건 (클로로포름 존재하 65 ℃에서 1시간 가열) 에 효소가 노출되었음에도 불구하고, 재조합 효소는 분해 활성을 나타냈다. 디폴리머라아제가 없는 그래뉼은 분해가 되지 않았다 (control). 디폴리머라아제만을 이용하여 만든 인공 그래뉼의 분해속도는 느렸다. 그러나 2가 양이온을 (MgCl2) 분해반응 용액에 첨가 하였을 경우에 매우 빠른 속도로 분해가 되는 것을 볼 수 있었다. 또한 디폴리머라아제와 더불어 페이신을 함께 이용하여 만든 그래뉼의 경우에는 2가 양이온의 존재 유무와 상관없이 분해가 일정하게 일어나는 것을 볼 수 있다 (도 6(B)). 세포내 PhaZ는 결정화된 PHB를 분해할 수 없기 때문에 [Merrick JM et al., Inter J Biol Macromol 1999 25:129-134], 본 연구에서 제조된 인공 PHB 그래뉼은 무정형(amorphous)으로 생각되었으며, 이는 X-ray 회절 분석으로 확인하였다. 따라서, PHB 그래뉼 제조공정에서 분해효소와 페이신의 첨가는 기능성 분자를 운반하고 분해 속도를 조절함으로써 [Chen C et al., Biomaterials 2006;27:4804-4814; Soppimath KS et al., J Control Rel 2001;70:1-20] 해당 분자를 적시에 방출하는 무정형 PHB 나노입자 디자인에 도움이 될 것이다. As can be seen in FIG. 5, it has been found that artificial PHB granules can be formed with only protein addition without any surfactant addition. Thus, for the design of degradation regulating PHB granules, hydrophobic intracellular PHA depolymerases present on the in vivo cell surface and known to degrade PHB [Kobayashi T et al., J Bacteriol 2003; 185: 3485-3490; Merrick J M et al., Inter J Biol Macromol 1999; 25: 129-134; York GM et al., J Bacteriol 2003; 185: 3788-3794], investigated the effect of PHB granule formation. As can be seen in Figure 6 (A), the granule form is relatively less sophisticated, but (His) 6 -PhaZ (0.0001 w / v%) assisted PHB granule formation in an irregular form. Despite the exposure of the enzyme to the harsh conditions of the process (heating at 65 ° C. for 1 hour in the presence of chloroform), the recombinant enzyme showed degradation activity. Granules without depolymerase were not degraded (control). The degradation rate of artificial granules made using only depolymerase was slow. However, when divalent cations were added to the (MgCl 2 ) decomposition solution, it was found to decompose at a very high rate. In addition, in the case of granules made with Paysin together with the dipolymerase, degradation can be seen regardless of the presence or absence of divalent cations (FIG. 6 (B)). Since intracellular PhaZ cannot degrade crystallized PHB (Merrick JM et al., Inter J Biol Macromol 1999 25: 129-134), the artificial PHB granules prepared in this study were thought to be amorphous. Confirmed by X-ray diffraction analysis. Thus, the addition of degrading enzymes and paysin in the PHB granule manufacturing process is carried out by carrying functional molecules and controlling degradation rates [Chen C et al., Biomaterials 2006; 27: 4804-4814; Soppimath KS et al., J Control Rel 2001; 70: 1-20]. This will aid in the design of amorphous PHB nanoparticles that release the molecules in a timely manner.

본 발명의 약물전달체로 사용 가능한 페이신, PHA 디폴리머라제 등의 단백질이 코팅된 생체적합성 고분자 나노입자는 제약학적, 의학적 분야 등에서도 다양하게 이용이 가능하다. Biocompatible polymer nanoparticles coated with proteins, such as paysin and PHA depolymerase, which can be used as the drug carrier of the present invention, can be used in various fields, such as pharmaceutical and medical fields.

도 1은 재조합 단백질의 SDS-PAGE 결과이다. (A) His6 -태그 PhaP. M: 크기마커, 1: 전체 세포, 2: 세포질, 3: 펠렛, 4: 금속 킬레이션 컬럼으로 정제 후, (B) GST-융합 PhaP. M: 크기 마커, 1: 세포질, 2: GST 컬럼으로 정제 후. (C) His6 -태그 PhaZ. M: 크기마커, 1: 전체 세포, 2: 결합버퍼 3: 금속 킬레이션 컬럼으로 정제 후의 결과이다.1 shows SDS-PAGE results of recombinant proteins. (A) His 6 -tag PhaP. M: size marker, 1: whole cell, 2: cytoplasm, 3: pellet, 4: metal chelation column, followed by (B) GST-fused PhaP. M: size marker, 1: cytoplasm, 2: after purification with GST column. (C) His 6 -tag PhaZ. M: size marker, 1: whole cell, 2: binding buffer 3: metal chelation column.

도 2는 (His)6 태그 페이신의 유화 특성을 나타내는 결과이며, 페이신 농도는 200 ㎍/ml 이다. 2 is a result showing the emulsification characteristics of (His) 6 tag Paisin, Paisin concentration is 200 μg / ml.

도 3은 계면활성제를 이용하여 P(3HB) 인공 그래뉼을 제조한 결과로서, CTAB 는 양이온 계면활성제 헥사데실 트리메틸-암모늄 브로마이드를, SDC는 음이온 계면활성제 소듐 디옥시콜린산 (sodium deoxycholate)을 의미한다. 30000 X SEM 촬영 결과이다. 3 is a result of preparing a P (3HB) artificial granule using a surfactant, CTAB means a cationic surfactant hexadecyl trimethyl-ammonium bromide, SDC means anionic surfactant sodium deoxycholate . 30000 x SEM results.

도 4는 계면활성제 SDC 와 페이신 농도에 따른 P(3HB) 인공 그래뉼 제조 결과로, 30000 X 촬영한 것이다.Figure 4 is a P (3HB) artificial granules prepared according to the surfactant SDC and Paysin concentration, it was taken 30000 X.

도 5는 페이신을 이용한 P(3HB) 인공 그래뉼 제조 결과로, 30000 X 촬영힌 것이다. Figure 5 is a result of preparing a P (3HB) artificial granules using paysin, 30000 X was taken.

도 6 (A) H. pseudoflava 세포내 PHA 디폴리머라제가 로딩된 P(3HB) 인공 그래뉼 제조 결과이고 (B)는 디폴리머라제가 포함된 인공 그래뉼의 자가-분해 활성을 나타낸다. FIG. 6 (A) P (3HB) artificial granules prepared with H. pseudoflava intracellular PHA depolymerase and (B) shows the auto-degradation activity of artificial granules containing depolymerase.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> Poly(3-hydroxybutyric acid) nanoparticles coated with phasin or PHA depolymerase and its preparation method <130> 1.66P <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RephaP-Bam primer <400> 1 catggatcca tgatcctcac cccg 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RephaP-Eco primer <400> 2 ggagaattct caggcagccg tcgt 24 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpfZ-Bam primer <400> 3 catggatcca tgctctacca gatctac 27 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpfZ-Hind primer <400> 4 cctaagcttg gaggtcttgc gcgc 24 <110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> Poly (3-hydroxybutyric acid) nanoparticles coated with phasin or          PHA depolymerase and its preparation method <130> 1.66P <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RephaP-Bam primer <400> 1 catggatcca tgatcctcac cccg 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RephaP-Eco primer <400> 2 ggagaattct caggcagccg tcgt 24 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpfZ-Bam primer <400> 3 catggatcca tgctctacca gatctac 27 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpfZ-Hind primer <400> 4 cctaagcttg gaggtcttgc gcgc 24  

Claims (21)

페이신 및 폴리하이드록시알카노익산 (polyhydroxyalkanoic acid, PHA) 디폴리머라제인 단백질과, 폴리(3-하이드록시부틸레이트) 또는 폴리(3-하이드록시부틸레이트-코-3-하이드록시발레이트)로부터 선택된 생체적합성 고분자를 포함하여 이루어지는, 나노입자 형성용 조성물.Paysin and polyhydroxyalkanoic acid (PHA) dipolymerase and poly (3-hydroxybutylate) or poly (3-hydroxybutylate-co-3-hydroxyvalate) A composition for forming nanoparticles, comprising a biocompatible polymer selected from. 제 1항에 있어서, 추가로 양이온 계면활성제 또는 음이온 계면활성제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.The composition of claim 1, further comprising a cationic surfactant or an anionic surfactant. 제 1항에 있어서, 상기 페이신은 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha) 기원인 것을 특징으로 하는 조성물.The composition of claim 1, wherein the paysin is of Ralstonia eutropha origin. 제 1항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노익산 (polyhydroxyalkanoic acid, PHA) 디폴리머라제는 하이드로지노파가 슈도플라바 (Hydrogenophaga pseudoflava) 기원인 것을 특징으로 하는 조성물.The composition of claim 1, wherein the polyhydroxyalkanoic acid (PHA) depolymerase is of hydrogenophaga pseudoflava origin. 제 1항에 있어서, 상기 단백질의 조성은 페이신과 폴리하이드록시알카노익산 (polyhydroxyalkanoic acid, PHA) 디폴리머라제의 혼합 성분이거나 혹은 융합단백질 형태인 것을 특징으로 하는 조성물. According to claim 1, wherein the composition of the protein is a composition characterized in that the mixture of phosphine and polyhydroxyalkanoic acid (PHA) dipolymerase or a fusion protein form. 제 5항에 있어서, 상기 단백질은 GST 또는 His6태그로 융합된 융합단백질의 형태인 조성물.6. The composition of claim 5, wherein the protein is in the form of a fusion protein fused with a GST or His 6 tag. 페이신 및 폴리하이드록시알카노익산 (polyhydroxyalkanoic acid, PHA) 디폴리머라제인 단백질로 코팅된 폴리(3-하이드록시부틸레이트) 또는 폴리(3-하이드록시부틸레이트-코-3-하이드록시발레이트)인 생체적합성 고분자 나노입자.Poly (3-hydroxybutylate) or poly (3-hydroxybutylate-co-3-hydroxyvalate coated with a protein that is Fascine and polyhydroxyalkanoic acid (PHA) dipolymerase ) Biocompatible polymer nanoparticles. 제 7항에 있어서, 상기 단백질의 조성은 페이신과 폴리하이드록시알카노익산 (polyhydroxyalkanoic acid, PHA) 디폴리머라제의 혼합 성분인 것을 특징으로 하는 나노입자.8. The nanoparticles of claim 7, wherein the protein composition is a mixed component of paysin and polyhydroxyalkanoic acid (PHA) depolymerase. 제 7항에 있어서, 상기 페이신은 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha) 기원인 것을 특징으로 하는 나노입자.8. The nanoparticles of claim 7 wherein the paysin is of Ralstonia eutropha origin. 제 7항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노익산 (polyhydroxyalkanoic acid, PHA) 디폴리머라제는 하이드로지노파가 슈도플라바(Hydrogenophaga pseudoflava) 기원인 것을 특징으로 하는 나노입자.8. The nanoparticle of claim 7, wherein the polyhydroxyalkanoic acid (PHA) depolymerase is of hydrogenophaga pseudoflava origin. 제 7항에 있어서, 상기 단백질은 GST 또는 His6 태그로 융합된 융합단백질 형태인 것을 특징으로 하는 나노입자.8. The nanoparticle of claim 7, wherein the protein is in the form of a fusion protein fused with a GST or His 6 tag. 제 7항에 있어서, 상기 나노입자는 20 nm 내지 5 ㎛의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 나노입자.The nanoparticle of claim 7, wherein the nanoparticles have a diameter of 20 nm to 5 μm. 삭제delete 삭제delete (i) 유기용매에 폴리(3?하이드록시부틸레이트) 또는 폴리(3?하이드록시부틸레이트?코?3?하이드록시발레이트)로부터 선택된 생체적합성 고분자를 용해시킨 유상 용액을 제조하는 공정; 및 (ii) 제 1 항 또는 제 2항의 조성물을 상기 공정 (i)의 유상 용액에 첨가 후 유화시켜 에멀젼을 형성하는 공정; (i) preparing an oily solution in which a biocompatible polymer selected from poly (3? hydroxybutylate) or poly (3? hydroxybutylate? co? 3? hydroxyvallate) is dissolved in an organic solvent; And (ii) adding the composition of claim 1 or 2 to the oily solution of step (i) and then emulsifying to form an emulsion; 을 포함하는, 페이신 및 폴리하이드록시알카노익산 (polyhydroxyalkanoic acid, PHA) 디폴리머라제로 이루어진 단백질로 코팅된 생체적합성 고분자 나노입자 제조 방법.Method for producing a biocompatible polymer nanoparticles coated with a protein consisting of, and a composition consisting of the Fassin and polyhydroxyalkanoic acid (polyhydroxyalkanoic acid, PHA) depolymerase. 제 15항에 있어서, 상기 공정 (ii)에서 유화는 초음파를 처리하여 유화시키는 것을 특징으로 하는 방법.16. The method according to claim 15, wherein the emulsifying in step (ii) is emulsified by treating with ultrasound. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete
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J. Microbiol. Biotechnol., vol.15, pp.1330-1336 (2005)*
Journal of Bacteriology, vol.190, pp.2911-2919 (2008.4)*

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