KR101115501B1 - Multiparticle of ciprofloxacin-HCl encapsulated low molecular weight water-soluble chitosan microspheres coated with polymer and preparation method thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 시플로플록사신이 담지된 저분자량 수용성 키토산 미립자에 고분자가 코팅된 다중입자 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 미립자에 고분자 용액이 코팅된 다중입자는 저분자량 수용성 키토산의 강한 반응성으로 인해 간단한 방법으로 제조할 수 있으며, 독성이 없고, 항균 활성이 뛰어난 저분자량 수용성 키토산이 첨가되어 강력한 항균효과를 나타낼 수 있으며, 약물이 30일 이상의 장시간 동안 방출되므로, 바실러스 서브틸러스(KCTC 1918), 스타필로코쿠스 에피더미스(KCTC 1917), 스타필로코쿠스 아우레우스(KCTC 1621), 리스테리아 모노사이토제네스(KCTC 3710) 등과 같은 그람 양성균, 또는 대장균(KCTC 1682), 슈도모나스 에루기노사(KCTC 1637), 살모넬라 티피뮤리움(KCTC 1926) 등과 같은 그람 음성균에 대한 항생제로서 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to multi-particles coated with a polymer on low-molecular weight water-soluble chitosan microparticles loaded with siflofloxacin, and a method for preparing the same. The particles can be prepared by a simple method due to the strong reactivity of the low molecular weight water-soluble chitosan, the non-toxic, low-molecular weight water-soluble chitosan with excellent antibacterial activity can be added to show a strong antibacterial effect, the drug is released for a long time more than 30 days Gram-positive bacteria such as Bacillus subtilus (KCTC 1918), Staphylococcus epidermis (KCTC 1917), Staphylococcus aureus (KCTC 1621), Listeria monocytogenes (KCTC 3710), or E. coli (KCTC 1682), Pseudomonas Eruginosa (KCTC 1637), Salmonella Typhimurium (KCTC 1926), etc. As antibiotics for bacteria may be useful.
수용성 키토산, 시플로플록사신, 고분자, 다중입자, 서방성, 항생제 Water Soluble Chitosan, Ciflofloxacin, Polymer, Multi-Particle, Sustained Release, Antibiotic
Description
본 발명은 시플로플록사신이 담지된 저분자량 수용성 키토산 미립자에 고분자가 코팅된 다중입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to multiparticles coated with a polymer on low molecular weight water-soluble chitosan microparticles loaded with siflofloxacin and a method for preparing the same.
박테리아에 의한 인간의 감염은 인류의 생존을 위협하는 가장 위험한 질병 중의 하나이다. 이에 퀴놀론계 항생제를 비롯하여 수많은 항생제가 이러한 질병을 치료하기 위해 개발되고 사용되어 왔다.Human infection by bacteria is one of the most dangerous diseases that threaten human survival. Many antibiotics, including quinolone antibiotics, have been developed and used to treat these diseases.
상기 퀴놀론계 항생제는 광범위한 항박테리아 성능을 가지는 것으로 알려져 있으며 요도염(urinary tract infections), 장관염(respiratory tract infections), 전염성 성질환(sexually transmitted diseases), 피부감염증(skin infections), 만성 골수염(chronic osteomyelitis) 등에 특히 효과가 있는 것으로 알려져 있다. The quinolone antibiotics are known to have a wide range of antibacterial properties and include urinary tract infections, respiratory tract infections, sexually transmitted diseases, skin infections, and chronic osteomyelitis. Is particularly effective.
그중 시프로플록사신은 가장 널리 사용되는 퀴놀론계 항생제 중의 하나이며 임상적으로 중요한 그람음성(Gram-negative), 그람양성(Gram-positive) 병원균에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며 요도염, 장관염, 전염성 성질환, 피부감염증, 골수염 등에 널리 사용되고 있다. 특히, 상기 시프로플록사신은 동물 탄저(炭疽)에 항생 효과가 높아 미국식품의약국(FDA)에서 유일한 탄저병 치료제로 인정받은 제품이다.Ciprofloxacin is one of the most widely used quinolone antibiotics and is known to be effective against clinically important Gram-negative and Gram-positive pathogens, including urethritis, enteritis, infectious diseases, and skin. It is widely used for infectious diseases, osteomyelitis and the like. In particular, ciprofloxacin has a high antibiotic effect on animal anthrax and is a product recognized as the only anthrax treatment agent in the US Food and Drug Administration (FDA).
일반적으로 경구용 시프로플록사신 제제는 하루에 두 번 투약하게 되어 있으며 주사제 또한 하루에 한 번씩 주사하도록 되어 있다. 그러나, 예를 들어 탄저균에 감염되면 고단위로 60일 정도 계속 투여해야 하며, 장기 투여시 관절 손상 등의 부작용이 발생할 수 있다는 문제가 있기 때문에 복용방법을 간편하게 하는 것이 그의 약효 못지 않게 중요하다. 따라서, 1일 1회의 투여만으로도 30일 이상 치료학적으로 유효한 혈중농도가 지속적으로 유지될 수 있도록 서방화 제제로 제형화시키는 것이 필요하다.Generally, oral ciprofloxacin preparations are to be administered twice a day and injections are also to be injected once a day. However, for example, when anthrax is infected, it should be continuously administered at a high level for about 60 days, and there is a problem that side effects such as joint damage may occur during long-term administration. Therefore, it is necessary to formulate a sustained release formulation so that the therapeutically effective blood concentration can be maintained continuously for 30 days or more even with only once daily administration.
위와 같은 문제점을 해결하기 위하여 종래기술에는 서방성 제제로서 다양한 미립자 및 이를 제조하는 방법이 보고되어 있다. 일례로 대한민국 등록특허 제59710호에는 지효성 미크로 캡슐의 제조방법이 개시되어 있으며, 대한민국 등록특허 제202073호에는 마이크로캡슐형 서방성 제제 및 그 제조법이 개시되어 있다.In order to solve the above problems, the prior art has reported a variety of fine particles and a method for producing the same as a sustained release formulation. As an example, Korean Patent No. 59710 discloses a method for producing a sustained release microcapsule. Korean Patent No. 202073 discloses a microcapsule sustained release formulation and a method for manufacturing the same.
그러나, 상기 방법으로 제조된 미립자는 입자의 크기분포가 5 ~ 100 마이크로미터로 지나치게 광범위하므로 약물의 방출 속도제어가 상대적으로 어려운 점이 있고, 입자의 형태가 일정하지 않으므로 미립자의 분해속도 및 약물 방출속도 등을 예측하기 어렵다. 또한, 수용성인 약물을 고농도로 입자내에 봉입하기가 어려워 봉입효율이 낮기 때문에 제조과정에서 비싼 가격의 약물의 소실을 초래할 수 있다. 나아가, 상기 방법은 단순히 약물의 지속적인 방출이 목적이므로 주로 국부에 한정하여 투여할 수 밖에 없는 문제가 있다.However, the fine particles produced by the above method has a relatively difficult control of the release rate of the drug because the size distribution of the particles is too broad, 5 to 100 micrometers, and the decomposition rate and drug release rate of the fine particles are not constant. It is difficult to predict. In addition, since it is difficult to encapsulate a water-soluble drug in particles at high concentration, the encapsulation efficiency is low, resulting in the loss of the drug at an expensive price in the manufacturing process. Furthermore, since the method merely aims at sustained release of the drug, there is a problem that it can only be administered locally.
약물의 봉입효율을 높이는 종래 방법으로는 대한민국 등록특허 제162872호에 용매추출법을 이용하여 수용성 약물의 봉입효율을 높이는 방법이 개시되었으나 이 경우 용매의 완전한 제거가 힘들어 잔류 용매가 미립자내에 남아 있을 가능성이 있으며 입자의 크기분포를 조절하기 어려워 역시 약물의 조절방출이 어렵다는 문제가 있다. As a conventional method of increasing the encapsulation efficiency of the drug is disclosed in the Republic of Korea Patent No. 162872 using a solvent extraction method to increase the encapsulation efficiency of the water-soluble drug, but in this case it is difficult to completely remove the solvent to remain the residual solvent in the fine particles And it is difficult to control the size distribution of the particles also has a problem that difficult controlled release of the drug.
대한민국 등록특허 제481540호에는 치료약물이 함유된 나노입자의 제조방법으로써 유화중합법에 의하여 나노입자를 제조시 약물을 봉입하는 방법이 개시되어 있다. 상기 방법은 50~300 nm의 크기로 나노입자의 제조가 가능하지만 중합시의 온도가 40~90 ℃ 사이에서 이루어지기 때문에 이러한 높은 온도에서는 약물이 쉽게 활성을 잃을 수 있으며 중합개시제 및 계면활성제의 제거가 용이하지 않아 실제 치료용으로 사용하는 데 제약이 있다. 또한, 상기 방법 역시 제조과정에서 다량의 약물이 소실될 수 있다는 문제가 있다.Korean Patent No. 481540 discloses a method of preparing nanoparticles containing a therapeutic drug and encapsulating a drug when preparing nanoparticles by emulsion polymerization. Although the method is capable of producing nanoparticles with a size of 50 to 300 nm, since the temperature during polymerization is between 40 and 90 ° C., the drug may easily lose activity at such high temperatures, and the polymerization initiator and surfactant may be removed. It is not easy to use, so there is a limitation in using it for actual treatment. In addition, the method also has a problem that a large amount of drug can be lost in the manufacturing process.
한편, 키토산은 게, 가재 또는 새우 껍데기에 들어 있는 키틴을 탈아세틸화하여 얻어낸 물질로서 D-글루코사민이 β-1,4결합을 하고 있으며 2번 탄소 위치에 아민기를 가지고 있는 천연고분자이다. 키토산은 생리활성물질로서 면역활성(Y. Shigemasa et al., Chitin derivatives in Life Science, Japanese Society for Chitin/Chitosan, p86 (1992)), 콜레스테롤 저하작용(I. Ikeda et al ., J. Agric. Food Chem., 41, 431 (1993)), 및 상처치유작용(R.A.A. Muzzarelli et al., Carbohydr. Res., 8, 433 (1987))등과 같은 생체 기능성이 있으므로 건강식품, 식품보존제, 식물의 생장촉진제 및 인공피부, 의료용 재료 등으로 이용하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 또한, 키토산은 천연고분자 가운데 유일하게 아민기(NH2)를 가지고 있기 때문에 양이온(+)을 가진다. 양이온(+)은 화학적 성질로 음이온(-)과 결합하기 쉬운 성질을 가지고 있으므로 유전자 전달체(J. M. Dang and K.W. Leong, Adv. Drug Del. Rev. 58, 487, (2006))로서 뛰어난 성질을 가지고 있는 것으로 알려졌다. 흥미롭게 박테리아는 세포 표면에 (-)이온 성질을 가지는 카르복실기 (COOH)를 가지고 있어 (+)이온을 가지고 있는 키토산을 만나면 서로 결합하여 세균의 생육이 저지되고 결국 사멸에 이르게 되어 무해화된 형태로 체외로 배출된다. 특히 1,000~100,000 이내의 저분자량 수용성 키토산은 분자량이 큰 고분자량의 키토산보다 항균능력이 월등히 뛰어난 것으로 알려져 있다(표 3 참조).On the other hand, chitosan is a natural polymer obtained by deacetylating chitin contained in crab, crayfish, or shrimp shells. D-glucosamine has β-1,4 bond and has an amine group at the carbon position 2. Chitosan is a physiologically active substance (I. Shigemasa et. al ., Chitin derivatives in Life Science, Japanese Society for Chitin / Chitosan, p86 (1992)), cholesterol lowering activity (I. Ikeda et. al . , J. Agric. Food Chem., 41 , 431 (1993)), and wound healing (RAA Muzzarelli et. al ., Carbohydr. Res., 8 , 433 (1987)), and the like, such as health food, food preservatives, plant growth promoters, artificial skin, medical materials, etc. are being actively used. In addition, chitosan has a cation (+) because it has the amine group (NH 2 ) only among natural polymers. Cationic (+) is chemically easy to bind to anion (-), so it has excellent properties as a gene carrier (JM Dang and KW Leong, Adv. Drug Del. Rev. 58 , 487, (2006)). It is known. Interestingly, bacteria have a carboxyl group (COOH) on the cell surface, and when they encounter chitosans with (+) ions, they bind to each other, inhibit the growth of bacteria and eventually kill them, resulting in in vitro harmlessness. Is discharged. In particular, low molecular weight water-soluble chitosan within 1,000 to 100,000 is known to have superior antimicrobial ability than high molecular weight chitosan (see Table 3).
그러나, 상술한 특징 및 장점을 갖는 키토산은 서로 이웃하는 분자가 강한 수소결합으로 견고하게 결합되어 물에 녹지 않는 불용성 물질로서, 종래 키토산을 녹이기 위하여 젖산, 초산, 프로피온산, 포름산, 아스코르브산, 및 주석산을 포함하는 유기산 및 염산, 질산 및 황산으로 구성되는 무기산을 사용함으로 생체에 응 용하는 데 제한을 주고 있다는 문제점이 있었다. 본 발명자들은 이러한 문제를 해결할 수 있는 획기적인 수용성 키토산을 개발하고 이를 특허출원하여 등록받은 바 있다(대한민국 등록특허 제441270호). 이를 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.However, chitosan having the above-described features and advantages is an insoluble substance in which neighboring molecules are firmly bonded to each other by strong hydrogen bonds and are insoluble in water. In order to dissolve conventional chitosan, lactic acid, acetic acid, propionic acid, formic acid, ascorbic acid, and tartaric acid are used. There was a problem in that the application to the living body by using an inorganic acid consisting of organic acids and hydrochloric acid, nitric acid and sulfuric acid containing a. The present inventors have developed and patented a breakthrough water-soluble chitosan that can solve this problem (Korean Patent No. 441270). Specifically, it is as follows.
상기 대한민국 등록특허 제441270호는 "1) 키토산 올리고당의 유기산 또는 무기산 염의 용액을 염기인 트리알킬 아민으로 처리하고, 2) 상기 용액에 유기용매를 첨가하여 키토산 올리고당에 결합되어 있는 유기산 또는 무기산이 트리알킬 아민 염의 형태로 제거된 키토산 올리고당을 회수하고, 3) 상기에서 산이 제거된 키토산 올리고당 용액을 무기산 처리 후, 활성화된 탄소/이온교환수지(activated carbon/ion exchange resin) 컬럼으로 정제하여 1,000 ～100,000 Da의 분자량을 가진 순수한 수용성 유리 아민 키토산을 제조하는 방법"을 개시하고 있다.The Republic of Korea Patent No. 441270 is "1) treating a solution of an organic acid or inorganic acid salt of chitosan oligosaccharide with a trialkyl amine which is a base, and 2) adding an organic solvent to the solution to bind an organic acid or inorganic acid bound to chitosan oligosaccharide. The chitosan oligosaccharides removed in the form of alkyl amine salts are recovered, and 3) the chitosan oligosaccharide solution from which the acid is removed is treated with inorganic acid, and purified by activated carbon / ion exchange resin column to 1,000 to 100,000. A process for preparing pure water-soluble free amine chitosan with a molecular weight of Da is disclosed.
이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고 약효 및 서방성이 향상되는 항생제를 개발하기 위하여 연구한 결과, 시프로플록사신을 저분자량 수용성 키토산으로 봉입한 미립자를 고분자로 코팅한 다중입자에서 약효 및 서방성이 향상되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have studied to solve the above problems and to develop antibiotics that improve the efficacy and sustained release. As a result, the drug efficacy and sustained release are improved in the multi-particles coated with microparticles containing ciprofloxacin with low molecular weight water-soluble chitosan. It was confirmed that the present invention was completed.
본 발명의 목적은 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 미립자에 고분자로 코팅된 다중입자를 제공하는 데 있다.An object of the present invention is to provide a multi-particles coated with a polymer in the low molecular weight water-soluble chitosan fine particles enclosed with ciprofloxacin.
본 발명의 다른 목적은 상기 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 미립자에 고분자로 코팅된 다중입자의 제조방법을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a method for preparing multi-particles coated with a polymer in the low molecular weight water-soluble chitosan fine particles containing the ciprofloxacin.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 미립자에 고분자로 코팅된 다중입자를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides multi-particles coated with a polymer on the low molecular weight water-soluble chitosan microparticles containing ciprofloxacin.
또한, 본 발명은 상기 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 미립자에 고분자로 코팅된 다중입자의 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for producing multi-particles coated with a polymer on the low molecular weight water-soluble chitosan fine particles containing the ciprofloxacin.
본 발명에 따른 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 미립자에 고분자 용액이 코팅된 다중입자는 저분자량 수용성 키토산의 강한 반응성으로 인해 간단한 방법으로 제조할 수 있으며, 독성이 없고, 항균 활성이 뛰어난 저분자량 수용성 키토산이 첨가되어 강력한 항균효과를 나타낼 수 있으며, 약물이 30일 이상의 장시간 동안 방출되므로, 바실러스 서브틸러스(KCTC 1918), 스타필로코쿠스 에피더미스(KCTC 1917), 스타필로코쿠스 아우레우스(KCTC 1621), 리스테리아 모노사이토 제네스(KCTC 3710) 등과 같은 그람 양성균, 또는 대장균(KCTC 1682), 슈도모나스 에루기노사(KCTC 1637), 살모넬라 티피뮤리움(KCTC 1926) 등과 같은 그람 음성균에 대한 항생제로서 유용하게 사용될 수 있다.The multi-particles coated with a polymer solution on the low molecular weight water-soluble chitosan microparticles encapsulated with ciprofloxacin according to the present invention can be prepared by a simple method due to the strong reactivity of the low molecular weight water-soluble chitosan, and there is no toxicity and excellent low molecular weight water-soluble Chitosan can be added to show strong antibacterial effect, and the drug is released for a long time of 30 days or more, so Bacillus subtilis (KCTC 1918), Staphylococcus epidermis (KCTC 1917), Staphylococcus aureus (KCTC 1621), Gram-positive bacteria such as Listeria monocytogenes (KCTC 3710), or as Gram-negative bacteria such as Escherichia coli (KCTC 1682), Pseudomonas aeruginosa (KCTC 1637), Salmonella typhimurium (KCTC 1926), etc. It can be usefully used.
본 발명은 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 미립자에 고분자로 코팅된 다중입자를 제공한다.The present invention provides multiparticulates coated with a polymer on low molecular weight water-soluble chitosan fine particles containing ciprofloxacin.
본 명세서에서 저분자량 수용성 키토산은 유리 아민기를 갖는 저분자량 수용성 키토산을 의미한다.As used herein, low molecular weight water soluble chitosan means low molecular weight water soluble chitosan having a free amine group.
본 발명에 따른 다중입자는 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 미립자에 고분자 코팅막이 둘러싸인 형태로 이루어진다.The multi-particles according to the present invention are formed in a form surrounded by a polymer coating film in the low molecular weight water-soluble chitosan microparticles containing ciprofloxacin.
이때, 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 미립자의 형태는 저분자량 수용성 키토산이 시프로플록사신 분자들을 둘러싸고 있는 구형의 코어쉘(core-shell) 형태를 띠고 있다(도 1 참조). 따라서, 이러한 구형의 코어쉘 형태가 갖는 구조적 특성에 의해, 저분자량 수용성 키토산의 내부에 위치하게 되는 시프로플록사신은 빛, 열, 공기 중의 수분 등과 접촉이 차단되고, 그 결과 시프로플록사신의 안정성 확보가 가능하게 된다.At this time, the form of the low molecular weight water-soluble chitosan particles in which ciprofloxacin is enclosed has a spherical core-shell form in which the low molecular weight water-soluble chitosan surrounds the ciprofloxacin molecules (see FIG. 1 ). Therefore, due to the structural characteristics of the spherical core shell form, ciprofloxacin, which is located inside the low molecular weight water-soluble chitosan, is blocked from contact with light, heat, and moisture in the air, and as a result, the stability of ciprofloxacin can be ensured. .
상기 저분자량 수용성 키토산은 500~100,000 Da의 분자량을 갖는 순수한 유 리 아민기를 갖는 저분자량의 수용성 키토산이 바람직하고, 1,000~50,000 Da인 것이 더욱 바람직하다. 예를 들면, 불수용성인 키토산 올리고당의 유기산 또는 무기산 염의 용액을 염기로 처리하고, 이를 유기용매로 처리하여 상기 키토산 올리고당에 결합되어 있는 유기산 또는 무기산을 상기 염기 염의 형태로 제거한 키토산 올리고당을 회수하고, 간단한 처리 후 정제하여 얻어지는 수용성 키토산으로서, 본 발명자들의 대한민국 등록특허 제441,270호에 개시되어 있는 것을 사용할 수 있다.The low molecular weight water-soluble chitosan is preferably a low molecular weight water-soluble chitosan having a pure free amine group having a molecular weight of 500 to 100,000 Da, more preferably 1,000 to 50,000 Da. For example, a solution of an organic or inorganic acid salt of water-insoluble chitosan oligosaccharide is treated with a base and treated with an organic solvent to recover the chitosan oligosaccharide from which the organic or inorganic acid bound to the chitosan oligosaccharide is removed in the form of the base salt, As the water-soluble chitosan obtained by purification after a simple treatment, those disclosed in Korean Patent No. 441,270 of the present inventors can be used.
상기 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 미립자는 효과적인 형성을 위해 상기 시프로플록사신과 저분자량 수용성 키토산이 1:2 ~ 1:50, 더욱 바람직하게는 1:9의 무게 비율로 구성되는 것이 바람직하다.The low molecular weight water-soluble chitosan microparticles containing the ciprofloxacin are preferably composed of the ciprofloxacin and the low molecular weight water-soluble chitosan in a weight ratio of 1: 2 to 1:50, more preferably 1: 9.
본 발명에 따른 다중입자에 있어서, 상기 고분자는 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 미립자 표면에 코팅막으로 형성되어 있는데, 이는 상기 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 미립자가 수용액 등에서 분산시 형태를 오랜 시간 동안 유지하지 못하고 빠른 시간 내에 용해되어 시프로플록사신을 조절 방출할 수 없기 때문이다. 이때 코팅막으로서 형성되는 상기 고분자로는 생분해성 고분자로서 PLGA 공중합체(poly(DL-lactide-co-glycolide)), 폴리디엘락타이드-코-카프롤락톤(poly(DL-lactide-co-caprolactone)), 폴리엘락타이드(poly(L-lactide)), 폴리디엘락타이드(poly(DL-lactide)), 폴리글리콜라이드(polyglycolide), 폴리디엘락타이드카프롤락톤글리콜라이드(poly(DL-lactide-co-caprolactone-co-glycolide)), 폴리엘락타이드카프롤락톤글리콜라이드(poly(L- lactide-co-caprolactone-co-glycolide)), 폴리카프롤락톤(poly(ε-caprolactone)(PCL)), 폴리에틸렌글리콜폴리디엘락타이드 블록공중합체 (poly(ethylene glycol)-poly(DL-lactide) block copolymer), 폴리에틸렌글리콜폴리엘락타이드 블록공중합체(poly(ethylene glycol)-poly(L-lactide) block copolymer), 폴리에틸렌글리콜폴리카프롤락톤블록공중합체(poly(ethylene glycol)-poly(ε-caprolactone) block copolymer), 폴리에틸렌글리콜폴리글리콜라이드블록공중합체(poly(ethylene glycol)-poly(glycolide) block copolymer), 폴리락타이드폴리에틸렌글리콜폴리락타이드 삼중블록공중합체(polylactide-poly(ethylene glycol)-polylactide triblock copolymer) 등이 있고, 그 외에 생체에 사용가능한 고분자로서 유드라짓(Eudragit) 계통의 모든 고분자, 카보폴(Carbopol) 계통의 모든 고분자, 에칠셀룰로오스(ethyl cellulose), 셀룰로오스아세테이트부티레이트(cellulose acetate butyrate), 셀룰로오스아세테이트프탈레이트(cellulose acetate phthalate), 하이드록시프로필셀룰로오스(hydroxypropyl cellulose), 하이드록시프로필메칠셀룰로오스(hydroxypropyl methyl cellulose), 하이드록시프로필메칠셀룰로오스 프탈레이트(hydroxypropyl methyl cellulose phthalate) 등을 포함한 모든 셀룰로오스계통 고분자 등을 사용할 수 있다.In the multi-particle according to the present invention, the polymer is formed as a coating film on the surface of the low molecular weight water-soluble chitosan microparticles containing ciprofloxacin, which is a long time when the low molecular weight water-soluble chitosan microparticles containing the ciprofloxacin are dispersed in an aqueous solution, etc. This is because they cannot maintain and dissolve in a short time and cannot release controlled ciprofloxacin. At this time, the polymer formed as a coating film is a biodegradable polymer as a PLGA copolymer (poly (DL-lactide-co-glycolide)), polydielactide-co-caprolactone (poly (DL-lactide-co-caprolactone) ), Polyelactide (poly (L-lactide)), polydielactide (poly (DL-lactide)), polyglycolide, polydielactide caprolactone glycolide (poly (DL-lactide-) co-caprolactone-co-glycolide)), polyelactide caprolactone glycolide (poly (L-lactide-co-caprolactone-co-glycolide)), polycaprolactone (poly (ε-caprolactone) (PCL)) , Polyethylene glycol polydietamide block copolymer (poly (ethylene glycol) -poly (DL-lactide) block copolymer), polyethylene glycol polyelactide block copolymer (poly (ethylene glycol) -poly (L-lactide) block copolymer ), Polyethylene glycol polycaprolactone block copolymer (poly (ethylene glycol) -poly (ε-caprolactone) block copolymer), polyethyleneglycol Poly (ethylene glycol) -poly (glycolide) block copolymers, polylactide-poly (glycol glycol) -polylactide triblock copolymers, and the like. As other polymers that can be used in vivo, all polymers of Eudragit type, all polymers of Carbopol type, ethyl cellulose, cellulose acetate butyrate, cellulose acetate phthalate ( Any cellulose polymer such as cellulose acetate phthalate, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose phthalate, and the like can be used.
본 발명에 따른 다중입자에 있어서, 상기 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 미립자와 고분자의 구성 비율은 상기 고분자 1 중량부에 대하여 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 미립자 0.04 ~ 0.7 중량부로 이루어지는 것이 바람직하다. 무게 비율로 구성되는 것이 바람직하다. 상기한 범위에 서 서방성제제로서 이용될 수 있는 코팅두께를 형성할 수 있다.In the multi-particle according to the present invention, the composition ratio of the low molecular weight water-soluble chitosan particles and the polymer containing the ciprofloxacin is preferably composed of 0.04 to 0.7 parts by weight of the low molecular weight water-soluble chitosan particles containing ciprofloxacin relative to 1 part by weight of the polymer. . It is preferable to consist of a weight ratio. It is possible to form a coating thickness that can be used as a sustained release agent in the above range.
또한, 본 발명은 In addition,
용매 하에서 저분자량 수용성 키토산과 시프로플로사신을 혼합 및 교반하는 단계(단계 1);Mixing and stirring low molecular weight water soluble chitosan and ciprofloxacin under solvent (step 1);
상기 단계 1에서 혼합된 혼합 용액을 분사 건조시켜 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 미립자를 제조하는 단계(단계 2);Spray-drying the mixed solution mixed in step 1 to prepare low molecular weight water-soluble chitosan fine particles containing ciprofloxacin (step 2);
고분자 용액을 제조하는 단계(단계 3); 및Preparing a polymer solution (step 3); And
상기 단계 2에서 제조한 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 미립자를 상기 단계 3에서 제조한 고분자 용액에 분산시켜 고분자 용액으로 코팅된 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 다중입자를 제조하는 단계(단계 4)를 포함하는 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 미립자에 고분자 코팅된 다중입자의 제조방법을 제공한다.Dispersing the low molecular weight water-soluble chitosan fine particles containing the ciprofloxacin prepared in step 2 in the polymer solution prepared in step 3 to prepare a low molecular weight water-soluble chitosan multi-particles encapsulated with the ciprofloxacin coated with a polymer solution (step 4) It provides a method for producing a polymer-coated multi-particles in the low molecular weight water-soluble chitosan fine particles containing ciprofloxacin containing a.
이하, 상기 제조방법을 단계별로 상세히 설명한다.Hereinafter, the manufacturing method will be described in detail step by step.
먼저, 단계 1은 용매 하에서 저분자량 수용성 키토산과 시프로플로사신을 혼합 및 교반하는 단계이다.First, step 1 is a step of mixing and stirring the low molecular weight water-soluble chitosan and ciprofloxacin under a solvent.
상기 단계에서는 적당량의 저분자량 수용성 키토산을 증류수에 용해시키고 시프로플로사신을 혼합 및 교반시킴으로써 수행될 수 있다. 이때 사용되는 저분자량 수용성 키토산은 본 발명자들의 상기 등록특허 제4,412,705호에 기재되어 있는 방법에 의해 제조된 것을 사용할 수 있다. 상기 저분자량 수용성 키토산은 분자량이 500~100,000 Da인 것이 바람직하고, 1,000~50,000 Da인 것이 더욱 바람직하다.In this step, it may be carried out by dissolving an appropriate amount of low molecular weight water-soluble chitosan in distilled water and mixing and stirring ciprofloxacin. The low molecular weight water-soluble chitosan used at this time may be prepared by the method described in the Patent No. 4,412,705 of the present inventors. It is preferable that molecular weight is 500-100,000 Da, and, as for the said low molecular weight water-soluble chitosan, it is more preferable that it is 1,000-50,000 Da.
또한, 상기 시프로플록사신과 저분자량 수용성 키토산의 혼합비는 1:2 ~ 1:50의 무게 비율로 혼합하는 것이 바람직하다. 만일 상기 시프로플록사신과 저분자량 수용성 키토산의 혼합비가 1:2 미만일 경우에는 시프로플록사신이 충분히 키토산 미립자 내에 봉입되지 않고 별개로 분리되거나, 입자가 둥근 모양이 되지 않을 수 있으며, 1:50을 초과할 경우에는 미립자 내에 일부 약물이 봉입되지 않은 미립자가 생성될 가능성이 있고 시프로플록사신의 함량이 지나치게 낮아 최종 미립자에서 약물의 방출이 짧은 문제가 있다. 상기 혼합시에는 고압 균질기 등을 이용하여 교반하는 것이 바람직하며, 이때 교반은 혼합에 의해 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 나노입자가 물리적인 힘에 의해 파괴되지 않도록 적당한 시간 동안 수행한다. 바람직하게는 25~35분 동안 수행한다.In addition, the mixing ratio of the ciprofloxacin and the low molecular weight water-soluble chitosan is preferably mixed at a weight ratio of 1: 2 to 1:50. If the mixing ratio of the ciprofloxacin and the low molecular weight water-soluble chitosan is less than 1: 2, the ciprofloxacin may not be sufficiently enclosed in the chitosan fine particles, and may be separated separately, or the particles may not be rounded. There is a possibility that microparticles are formed in which some drugs are not enclosed, and the content of ciprofloxacin is too low, resulting in short release of the drug from the final microparticles. In the mixing, it is preferable to use a high pressure homogenizer or the like, and the stirring is performed for a suitable time such that the low molecular weight water-soluble chitosan nanoparticles containing ciprofloxacin by mixing are not destroyed by physical force. Preferably it is carried out for 25 to 35 minutes.
다음으로, 단계 2는 상기 단계 1에서 혼합된 혼합 용액을 분사 건조시켜 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 미립자를 제조하는 단계이다.Next, step 2 is a step of preparing the low molecular weight water-soluble chitosan particles containing ciprofloxacin by spray drying the mixed solution mixed in step 1 above.
상기 단계는 통상적으로 사용되는 분사건조장치를 사용하여 수행될 수 있으며, 열풍에 의해 미립자 내의 수분을 주위의 기류 속에서 효과적으로 증발시킴으로써 그 결과 고체 형태의 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 미립자를 얻을 수 있다.This step can be carried out using a conventionally used spray drying apparatus, by effectively evaporating the moisture in the particulates in the surrounding air stream by hot air, and as a result, it is possible to obtain low molecular weight water-soluble chitosan particulates containing ciprofloxacin in solid form. have.
다음으로, 단계 3은 고분자 용액을 제조하는 단계이다.Next, step 3 is to prepare a polymer solution.
상기 고분자 용액은 적당량의 고분자를 용매에 용해시킴으로써 제조할 수 있다. 이때, 사용되는 고분자로는 상기 고분자로는 생분해성 고분자로서 PLGA 공중합체(poly(DL-lactide-co-glycolide)), 폴리디엘락타이드-코-카프롤락톤(poly(DL-lactide-co-caprolactone)), 폴리엘락타이드(poly(L-lactide)), 폴리디엘락타이드(poly(DL-lactide)), 폴리글리콜라이드(polyglycolide), 폴리디엘락타이드카프롤락톤글리콜라이드(poly(DL-lactide-co-caprolactone-co-glycolide)), 폴리엘락타이드카프롤락톤글리콜라이드(poly(L-lactide-co-caprolactone-co-glycolide)), 폴리카프롤락톤(poly(ε-caprolactone)(PCL)), 폴리에틸렌글리콜폴리디엘락타이드 블록공중합체 (poly(ethylene glycol)-poly(DL-lactide) block copolymer), 폴리에틸렌글리콜폴리엘락타이드 블록공중합체(poly(ethylene glycol)-poly(L-lactide) block copolymer), 폴리에틸렌글리콜폴리카프롤락톤블록공중합체(poly(ethylene glycol)-poly(ε-caprolactone) block copolymer), 폴리에틸렌글리콜폴리글리콜라이드블록공중합체(poly(ethylene glycol)-poly(glycolide) block copolymer), 폴리락타이드폴리에틸렌글리콜폴리락타이드 삼중블록공중합체(polylactide-poly(ethylene glycol)-polylactide triblock copolymer) 등이 있고, 그 외에 생체에 사용가능한 고분자로서 유드라짓(Eudragit) 계통의 모든 고분자, 카보폴(Carbopol) 계통의 모든 고분자, 에칠셀룰로오스(ethyl cellulose), 셀룰로오스아세테이트부티레이트(cellulose acetate butyrate), 셀룰로오스아세테이트프탈레이트(cellulose acetate phthalate), 하이드록시프로필셀룰로오스(hydroxypropyl cellulose), 하이 드록시프로필메칠셀룰로오스(hydroxypropyl methyl cellulose), 하이드록시프로필메칠셀룰로오스 프탈레이트(hydroxypropyl methyl cellulose phthalate) 등을 포함한 모든 셀룰로오스계통 고분자 등을 사용할 수 있으며, 이중 PLGA 공중합체를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 사용되는 용매로는 아세토니트릴, 아세톤 등을 사용할 수 있다.The polymer solution can be prepared by dissolving an appropriate amount of polymer in a solvent. At this time, as the polymer used is a biodegradable polymer as the polymer PLGA copolymer (poly (DL-lactide-co-glycolide)), poly diel lactide-co-caprolactone (poly (DL-lactide-co- caprolactone)), polyelactide (poly (L-lactide)), polydielactide (poly (DL-lactide)), polyglycolide, polydielactide caprolactone glycolide (poly (DL- lactide-co-caprolactone-co-glycolide)), polyelactide caprolactone glycolide (poly (L-lactide-co-caprolactone-co-glycolide)), polycaprolactone (poly (ε-caprolactone) (PCL) ), Poly (ethylene glycol) -poly (DL-lactide) block copolymer, polyethylene glycol polyelactide block copolymer (poly (ethylene glycol) -poly (L-lactide) block copolymer), polyethylene glycol polycaprolactone block copolymer (poly (ethylene glycol) -poly (ε-caprolactone) block copolymer), polyethylene glycol Poly (ethylene glycol) -poly (glycolide) block copolymer, polylactide-poly (glycol glycol) -polylactide triblock copolymer, and the like. In addition, as a polymer that can be used in vivo, all polymers of Eudragit type, all polymers of Carbopol type, ethyl cellulose, cellulose acetate butyrate, cellulose acetate phthalate All cellulose polymers including acetate phthalate, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose phthalate, etc. can be used. It is better to use a double PLGA copolymer Preferable. In addition, acetonitrile, acetone, etc. can be used as a solvent used.
다음으로, 단계 4는 상기 단계 2에서 제조한 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 미립자를 상기 단계 3에서 제조한 고분자 용액에 분산시켜 고분자 용액으로 코팅된 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 다중입자를 제조하는 단계이다.Next, step 4 is to disperse the low molecular weight water-soluble chitosan microparticles containing the ciprofloxacin prepared in step 2 in the polymer solution prepared in step 3 to prepare a low molecular weight water-soluble chitosan multi-particles coated with ciprofloxacin coated with a polymer solution It's a step.
상기 분산은 단계 3에서 제조한 고분자 용액을 교반시키면서 상기 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 미립자를 서서히 적하하는 방법으로 수행될 수 있다. 이때, 상기 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 미립자와 고분자 용액의 혼합은 고분자 1 중량부에 대하여 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 미립자 0.04 ~ 0.7 중량부로 이루어지는 것이 바람직하다.The dispersion may be performed by slowly dropping the low molecular weight water-soluble chitosan particles in which ciprofloxacin is enclosed while stirring the polymer solution prepared in step 3. In this case, the mixing of the low molecular weight water-soluble chitosan fine particles and the polymer solution in which the ciprofloxacin is sealed is preferably made of 0.04 ~ 0.7 parts by weight of the low molecular weight water-soluble chitosan fine particles containing ciprofloxacin per 1 part by weight of the polymer.
상기 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 미립자가 충분히 분산되도록 자석식 교반기 등을 이용하여 적당 시간, 바람직하게는 25~35분 동안 교반을 수행한다. 이로써 본 발명에 따른 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 미립자에 고분자 용액이 코팅된 다중입자를 제조할 수 있다.Stirring is performed for a suitable time, preferably 25 to 35 minutes, using a magnetic stirrer or the like so that the low molecular weight water-soluble chitosan microparticles containing the ciprofloxacin are sufficiently dispersed. As a result, it is possible to prepare multiparticles coated with a polymer solution on the low molecular weight water-soluble chitosan fine particles containing ciprofloxacin according to the present invention.
상기 방법으로 얻어진 화합물은 투석 및 동결 건조하는 단계를 더 포함하여 이루어질 수 있다.The compound obtained by the above method may further comprise dialysis and lyophilization.
상기 화합물은 미네랄 오일, 헥산 등을 넣고 교반시킴으로써 부생성물 및 유기용매를 제거한 후, 진공건조 할 수 있다. 이때, 진공건조는 통상적으로 사용되는 진공건조 방법 또는 진공건조기를 사용하여 수행될 수 있고, 그 결과 부생성물이 제거된 고체형태의 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 미립자에 고분자 용액이 코팅된 다중입자를 얻을 수 있다.The compound may be dried in a vacuum after removing the by-products and the organic solvent by adding and stirring mineral oil, hexane and the like. At this time, vacuum drying may be performed using a vacuum drying method or a vacuum dryer, which is commonly used, and as a result, multi-particles coated with a polymer solution on low molecular weight water-soluble chitosan fine particles containing ciprofloxacin in solid form from which byproducts are removed. Can be obtained.
본 발명에 따른 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 미립자에 고분자 용액이 코팅된 다중입자는 저분자량 수용성 키토산의 강한 반응성으로 인해 간단한 방법으로 제조할 수 있으며, 독성이 없고, 항균 활성이 뛰어난 저분자량 수용성 키토산(표 3 참조)이 첨가되어 강력한 항균효과를 나타낼 수 있으며, 약물이 30일 이상의 장시간 동안 방출되므로(도 3 내지 5 참조), 바실러스 서브틸러스(KCTC 1918), 스타필로코쿠스 에피더미스(KCTC 1917), 스타필로코쿠스 아우레우스(KCTC 1621), 리스테리아 모노사이토제네스(KCTC 3710) 등과 같은 그람 양성균, 또는 대장균(KCTC 1682), 슈도모나스 에루기노사(KCTC 1637), 살모넬라 티피뮤리움(KCTC 1926) 등과 같은 그람 음성균에 대한 항생제로서 유용하게 사용될 수 있다.The multi-particles coated with a polymer solution on the low molecular weight water-soluble chitosan microparticles encapsulated with ciprofloxacin according to the present invention can be prepared by a simple method due to the strong reactivity of the low molecular weight water-soluble chitosan, and there is no toxicity and excellent low molecular weight water-soluble Chitosan (see Table 3) can be added to show a strong antimicrobial effect, since the drug is released for a long time of 30 days or more (see FIGS. 3 to 5 ), Bacillus subtilis (KCTC 1918), Staphylococcus epidermis (KCTC 1917), Gram-positive bacteria such as Staphylococcus aureus (KCTC 1621), Listeria monocytogenes (KCTC 3710), or E. coli (KCTC 1682), Pseudomonas aeruginosa (KCTC 1637), Salmonella typhimurium It may be usefully used as an antibiotic against Gram-negative bacteria such as (KCTC 1926).
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러 나, 이들 실시예는 예시적인 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Experimental Examples. However, these examples are illustrative only, and the present invention is not limited thereto.
<< 실시예Example 1> 1> 시프로플록사신이Ciprofloxacin 담지된Supported 저분자량Low molecular weight 수용성 키토산 미립자에 고분자가 코팅된 다중입자의 제조 1 Preparation of multi-particles coated with a polymer on water-soluble chitosan fine particles 1
(1) (One) 시프로플록사신이Ciprofloxacin 담지된Supported 저분자량Low molecular weight 수용성 키토산 미립자의 제조 Preparation of Water Soluble Chitosan Fine Particles
저분자량 수용성 키토산(LMWSC)을 (주)키토라이프(KITTOLIFE Co. Ltd.)에서 제공받아 사용하였고, PLGA는 보에르힝거 인겔헤인사(Boerhinger Ingelhein, Co. Ltd, Germany)에서 구입하여 사용하였다. 기타 시약들은 알드리치 케미컬사(Aldrich Chem. Co. USA)에서 구입하여 사용하였다.Low molecular weight water soluble chitosan (LMWSC) was used by KITTOLIFE Co. Ltd. and PLGA was purchased from Boerhinger Ingelhein (Co. Ltd, Germany). Other reagents were purchased from Aldrich Chem. Co. USA and used.
먼저, 분자량이 10,000 g/mol인 저분자량 수용성 키토산 9.0 g, 시프로플록사신 1.0 g 및 증류수 500 ml를 고압균질기(High-pressure homogenizer 400 bar 3 cycle; R5-12.38, SMT Co. Japan)에 넣어 고르게 혼합한 후 분사건조장치(spray dry; SD-06, Lab-plant Ltd., U.K.)를 이용하여 열풍과 접촉시켜, 미립자 내의 수분을 주위의 기류 속에서 효율적으로 증발시켜 미립자를 제조하였다. 제조된 저분자량 수용성 키토산 미립자 용액은 20 mg/ml의 농도로 1 ml/min의 속도로 분사시켜 건조하였다.First, 9.0 g of low molecular weight water-soluble chitosan with molecular weight of 10,000 g / mol, 1.0 g of ciprofloxacin and 500 ml of distilled water are mixed in a high-pressure homogenizer 400 bar 3 cycle; R5-12.38, SMT Co. Japan, and evenly mixed. After contacting with hot air using a spray dry device (spray dry; SD-06, Lab-plant Ltd., UK), the fine particles were produced by efficiently evaporating moisture in the fine particles in the surrounding air stream. The prepared low molecular weight water soluble chitosan particulate solution was dried by spraying at a rate of 1 ml / min at a concentration of 20 mg / ml.
(2) 고분자를 이용한 다중입자의 제조(2) Preparation of Multiple Particles Using Polymers
다음으로, PLGA 공중합체(RG503H) 100 mg을 5 ml의 아세토니트릴에 녹인 후, (1)에서 제조한 시프로플록사신이 담지된 저분자량 수용성 키토산 미립자 70 mg을 넣고 분산시켰다. 이후, 상기 저분자량 수용성 키토산 미립자가 충분히 분산되도 록 약 30분간 자석식 교반기로 교반 후, 미네랄 오일(mineral oil) 100 (heavy weight, Span-80 4.0 % (v/v))을 첨가하고 교반기(Top-loading stirrer, Direct Driven Digital Stirrer SS-11D, Young HANA Tech., Co. Ltd. Korea)로 1000 rpm에서 6시간 동안 교반하여 유기용매를 제거하였다. 이후, 헥산 100 ml을 첨가하여 1시간 동안 600 rpm에서 추가로 교반한 후, 여과지(Whatman No. 2 filter paper)를 이용하여 여과하고, 잔사를 약 3일 동안 실온에서 진공상태로 건조하여 고체형태의 PLGA가 코팅된 키토산 다중입자(수득량 : 166 mg, 수득률 : 97.6 % (w/w))를 수득하였다.Next, 100 mg of PLGA copolymer (RG503H) was dissolved in 5 ml of acetonitrile, and then 70 mg of low molecular weight water-soluble chitosan microparticles loaded with ciprofloxacin prepared in (1) were added and dispersed. Then, after stirring for about 30 minutes with a magnetic stirrer to sufficiently disperse the low molecular weight water-soluble chitosan fine particles, mineral oil 100 (heavy weight, Span-80 4.0% (v / v)) is added and the stirrer (Top -loading stirrer, Direct Driven Digital Stirrer SS-11D, Young HANA Tech., Co. Ltd. Korea) to remove the organic solvent by stirring at 1000 rpm for 6 hours. Thereafter, 100 ml of hexane was added thereto, followed by further stirring at 600 rpm for 1 hour, followed by filtration using a filter paper (Whatman No. 2 filter paper), and the residue dried in vacuo at room temperature for about 3 days to form a solid. PLGA coated chitosan multiparticulate (yield: 166 mg, yield: 97.6% (w / w)) was obtained.
<< 실시예Example 2> 2> 시프로플록사신이Ciprofloxacin 담지된Supported 저분자량Low molecular weight 수용성 키토산 미립자에 고분자가 코팅된 다중입자의 제조 2 Preparation of Multi-particles Coated with Water-soluble Chitosan Fine Particles 2
PLGA 공중합체의 첨가량을 200 mg으로 변화시켜 첨가하는 것을 제외하고는 실시예 1에서와 동일한 방법으로 시프로플록사신이 담지된 저분자량 수용성 키토산 미립자에 PLGA가 코팅된 키토산 다중입자(수득량 : 259 mg, 수득률 : 95.9 % (w/w))를 얻었다.Chitosan multiparticulates with PLGA coated on low molecular weight water-soluble chitosan microparticles loaded with ciprofloxacin in the same manner as in Example 1 except that the amount of PLGA copolymer was changed to 200 mg (yield: 259 mg, yield) : 95.9% (w / w)) was obtained.
<< 실시예Example 3> 3> 시프로플록사신이Ciprofloxacin 담지된Supported 저분자량Low molecular weight 수용성 키토산 미립자에 고분자가 코팅된 다중입자의 제조 3 Preparation of Multi-particles Coated with Water-soluble Chitosan Fine Particles 3
PLGA 공중합체의 첨가량을 400 mg으로 변화시켜 첨가하는 것을 제외하고는 실시예 1에서와 동일한 방법으로 시프로플록사신이 담지된 저분자량 수용성 키토산 미립자에 PLGA가 코팅된 키토산 다중입자(수득량 : 451 mg, 수득률 : 96.0 % (w/w))를 얻었다.PLGA-coated chitosan multiparticulates (yield: 451 mg, yield) in the same manner as in Example 1 except that the addition amount of PLGA copolymer was changed to 400 mg and added to ciprofloxacin. : 96.0% (w / w)) was obtained.
<< 실시예Example 4> 4> 시프로플록사신이Ciprofloxacin 담지된Supported 저분자량Low molecular weight 수용성 키토산 미립자에 고분자가 코팅된 다중입자의 제조 4 Preparation of Multiparticulates Coated with Water-Soluble Chitosan Fine Particles 4
PLGA 공중합체의 첨가량을 200 mg으로, PLGA 공중합체의 종류를 RG502H로 변화시켜 첨가하는 것을 제외하고는 실시예 1에서와 동일한 방법으로 시프로플록사신이 담지된 저분자량 수용성 키토산 미립자에 PLGA가 코팅된 키토산 다중입자(수득량 : 250 mg, 수득률 : 92.6 % (w/w))를 얻었다.PLGA-coated chitosan multiple on low molecular weight water-soluble chitosan microparticles carrying ciprofloxacin in the same manner as in Example 1, except that the addition amount of PLGA copolymer was changed to 200 mg and the type of PLGA copolymer was changed to RG502H. Particles (yield: 250 mg, yield: 92.6% (w / w)) were obtained.
<< 실시예Example 5> 5> 시프로플록사신이Ciprofloxacin 담지된Supported 저분자량Low molecular weight 수용성 키토산 미립자에 고분자가 코팅된 다중입자의 제조 5 Preparation of Multi-particles Coated with Water-soluble Chitosan Fine Particles 5
PLGA 공중합체의 첨가량을 200 mg으로, PLGA 공중합체의 종류를 RG504H로 변화시켜 첨가하는 것을 제외하고는 실시예 1에서와 동일한 방법으로 시프로플록사신이 담지된 저분자량 수용성 키토산 미립자에 PLGA가 코팅된 키토산 다중입자(수득량 : 260 mg, 수득률 : 96.3 % (w/w))를 얻었다.PLGA-coated chitosan multiple on low molecular weight water-soluble chitosan microparticles carrying ciprofloxacin in the same manner as in Example 1, except that the addition amount of PLGA copolymer was changed to 200 mg and the type of PLGA copolymer was changed to RG504H. Particles (yield: 260 mg, yield: 96.3% (w / w)) were obtained.
<< 실시예Example 6> 6> 시프로플록사신이Ciprofloxacin 담지된Supported 저분자량Low molecular weight 수용성 키토산 미립자에 고분자가 코팅된 다중입자의 제조 6 Preparation of Multiparticulates Coated with Water-Soluble Chitosan Fine Particles 6
PLGA 공중합체의 첨가량을 200 mg으로, 용매를 아세톤으로 변화시켜 첨가하 는 것을 제외하고는 실시예 1에서와 동일한 방법으로 시프로플록사신이 담지된 저분자량 수용성 키토산 미립자에 PLGA가 코팅된 키토산 다중입자(수득량 : 257 mg, 수득률 : 95.2 % (w/w))를 얻었다.PLGA-coated chitosan multiparticulates containing PLGA-coated low molecular weight water-soluble chitosan microparticles containing ciprofloxacin in the same manner as in Example 1, except that the addition amount of the PLGA copolymer was changed to 200 mg and the solvent was changed to acetone. Yield: 257 mg, yield: 95.2% (w / w)).
상기 실시예 1~6에 사용된 키토산 미립자의 첨가량, PLGA 공중합체의 종류의 투입량, 사용된 용매를 하기 표 1에 정리하였다.The addition amount of the chitosan microparticles used in Examples 1 to 6, the input amount of the type of PLGA copolymer, and the solvent used were summarized in Table 1 below.
(mg)Addition of PLGA
(mg)
<분석><Analysis>
(1) 형태(1) form
상기 수득한 다중입자의 형태를 주사전자현미경(Scanning electron microscopy, SEM; S-3500N, Hitachi Co. Ltd. Japan)을 이용하여 관찰하였다.The morphology of the obtained multiparticle was observed using a scanning electron microscopy (SEM; S-3500N, Hitachi Co. Ltd. Japan).
평균 크기는 입도 분석기(Laser Diffraction Particle Size Analyzer, SALD-2001, Shimadzu Co. Ltd. Japan)를 이용하여 측정하였다.The average size was measured using a particle size analyzer (Laser Diffraction Particle Size Analyzer, SALD-2001, Shimadzu Co. Ltd. Japan).
(3) 약물의 (3) of drugs 봉입효율Encapsulation efficiency
수득한 저분자량 수용성 키토산 미립자 및 다중입자의 시프로플록사신 봉입효율은 하기와 같이 측정하였다.The ciprofloxacin encapsulation efficiency of the obtained low molecular weight water-soluble chitosan fine particles and multiparticles was measured as follows.
상기 수득한 저분자량 수용성 키토산 미립자 5 mg을 5 ml의 디클로로메탄에 녹인 후 증류수 5 ml을 첨가하여 3시간 동안 교반하였다. 이후, 증류수 층에서 1 ml을 채취하여 100배 희석한 후, UV 분광광도계(UV-spectrophotometer 1601, Shamdzu Co. Ltd. Japan)를 이용하여 277 nm에서 흡광도를 측정하고, 하기 수학식 1 및 수학식 2를 이용하여 봉입 함량 및 봉입 효율을 측정하였다. 또한, 바탕시험(blank test)을 위하여 동량의 저분자량 수용성 키토산을 사용하였다.5 mg of the obtained low molecular weight water-soluble chitosan fine particles were dissolved in 5 ml of dichloromethane, and 5 ml of distilled water was added thereto, followed by stirring for 3 hours. Then, after diluting 1 ml from the distilled water layer and diluting 100 times, the absorbance at 277 nm was measured using a UV spectrophotometer (UV-spectrophotometer 1601, Shamdzu Co. Ltd. Japan), and the following Equations 1 and The encapsulation content and encapsulation efficiency were measured using 2. In addition, the same amount of low molecular weight water-soluble chitosan was used for the blank test.
분석 결과를 도 1, 도 2 및 표 2에 나타내었다.The analysis results are shown in FIGS. 1 , 2 and Table 2.
(%, w/w)Encapsulation efficiency
(%, w / w)
(㎛)Average particle size
(Μm)
도 1은 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 미립자의 전자 현미경 사진이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 미립자는 구형의 모양을 갖는 입자들이 것을 알 수 있다. 이때, 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 미립자의 평균입자 크기는 약 3 ㎛이고, 시프로플록사신의 봉입 함량(Drug contents)은 10.01% (w/w)로 측정되었으며 이는 이론치인 10.0%와 거의 동일한 것을 알 수 있다. 1 is an electron micrograph of low molecular weight water soluble chitosan fine particles enclosed with ciprofloxacin. As shown in Figure 1, it can be seen that the low molecular weight water-soluble chitosan fine particles containing the ciprofloxacin are particles having a spherical shape. In this case, the average particle size of the low molecular weight water-soluble chitosan particles containing ciprofloxacin was about 3 μm, and the drug contents of ciprofloxacin were measured at 10.01% (w / w), which is almost the same as the theoretical value of 10.0%. Can be.
그러나 상기 미립자는 저분자량 수용성 키토산을 이용하여 제조하였기 때문에 수용액 등에서 분산시 형태를 오랜 시간 동안 유지하지 못하고 빠른 시간 내에 용해되어 담지된 활성성분인 시프로플록사신을 조절 방출하는 것이 어려운 문제가 있다. 따라서, 상기 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 미립자를 서방성제제로서 이용하기 위해서는 개질이 필요하며, 본 발명에서는 이를 위해 생분해성 공중합체를 이용하여 저분자량 수용성 키토산 미립자를 다중입자로 코팅하였으며, 이렇게 제조된 다중입자의 주사전자현미경 사진을 도 2에 나타내었다.However, since the microparticles are prepared using low molecular weight water-soluble chitosan, it is difficult to control and release the active ingredient ciprofloxacin that is dissolved and supported within a short time without maintaining the form for a long time when dispersed in an aqueous solution. Therefore, in order to use the low molecular weight water-soluble chitosan particles encapsulated with ciprofloxacin as a sustained release agent, modification is required in the present invention, and the low-molecular weight water-soluble chitosan particles are coated with multi-particles by using a biodegradable copolymer. Scanning electron micrographs of the prepared multiparticles are shown in FIG. 2 .
도 2에서 보는 바와 같이 저분자량 수용성 키토산 미립자가 들어 있는 다중입자는 표면이 고른 부분이 있는 반면 울퉁불퉁한 부분이 있는데 이 부분은 저분자량 수용성 키토산 미립자가 다중입자의 표면에 분산되어 나타난 것으로 판단된다.As shown in FIG. 2 , the multiparticulates containing the low molecular weight water-soluble chitosan fine particles have an uneven surface, but have an uneven surface. This part is determined to be the low molecular weight water-soluble chitosan fine particles dispersed on the surface of the multiparticulates.
또한, 표 2는 상기 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 미립자를 PLGA 공중합체로 코팅한 다중입자의 내의 약물 함량의 변화 및 봉입효율의 변화를 나타낸 것이다. 상기 표 2에서 나타낸 바와 같이, 첨가하는 PLGA의 양이 증가 할수록 약물의 봉입효율이 증가하는 것으로 나타났으며, 입자의 크기 또한 증가하는 것으로 나타났다. 나아가, PLGA의 분자량이 클수록, 즉 504H를 사용한 경우 봉입 효율이 가장 높은 것으로 나타났으며 입자의 크기 또한 다소 증가하였다.In addition, Table 2 shows the change in the drug content and the encapsulation efficiency of the multi-particles coated with the PLGA copolymer of the low molecular weight water-soluble chitosan particles containing the ciprofloxacin. As shown in Table 2, as the amount of PLGA added was found to increase the encapsulation efficiency of the drug, the size of the particles also appeared to increase. Furthermore, the higher the molecular weight of PLGA, ie, the use of 504H, the highest encapsulation efficiency was observed and the particle size was also slightly increased.
용매에 있어서, 아세토니트릴 대신 아세톤을 사용한 경우에는 큰 차이는 보이지 않았으나 약물의 봉입 효율이 다소 감소하는 것으로 나타났으며 입자의 평균크기는 큰 차이가 없는 것으로 나타났다.In the solvent, when acetone was used instead of acetonitrile, no significant difference was observed, but the encapsulation efficiency of the drug was slightly decreased, and the average size of the particles was not significantly different.
<< 실험예Experimental Example 1> 1> 저분자량Low molecular weight 수용성 키토산의 항균활성 실험 Antimicrobial Activity Test of Water Soluble Chitosan
본 발명에 따른 시플로플록사신이 담지된 저분자량 수용성 키토산 미립자에 고분자가 코팅된 다중입자에 사용되는 저분자량 수용성 키토산의 항균활성 정도를 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.In order to determine the antimicrobial activity of the low molecular weight water-soluble chitosan used in the multi-particles coated with the polymer on the low molecular weight water-soluble chitosan microparticles loaded with siflofloxacin according to the present invention, the following experiment was performed.
우선 항균활성의 측정을 위하여 그람 양성균으로 바실러스 서브틸러스(KCTC 1918), 스타필로코쿠스 에피더미스(KCTC 1917), 스타필로코쿠스 아우레우스(KCTC 1621), 리스테리아 모노사이토제네스(KCTC 3710)를, 그람 음성균으로 대장균(KCTC 1682), 슈도모나스 에루기노사(KCTC 1637), 살모넬라 티피뮤리움(KCTC 1926)을 생명공학연구소 유전자은행으로부터 분양받아 각 균주를 LB배지(1 % 박토트립톤, 0.5 % 박토이스트 추출물, 1 % 염화나트륨, Sigma)에서 중간 로그상까지 배양한 후 1 % 박토펩톤배지(Difco)로 1×104 세포/100 ㎕의 균체농도로 희석하여 마이크로 타이트레이트 플레이트(Nunc)에 접종하였다. 이후, 분자량이 1,000, 3,000, 5,000, 10,000, 20,000, 30,000 g/mol인 저분자량 수용성 키토산을 각각 2.5 mg/well부터 1/2배씩 희석하여 플레이트에 첨가한 후 37 ℃에서 6시간 동안 배양하였고, 마이크로 타이트레이트 플레이트 판독기(Merck Elisa reader)를 이용하여 620 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 각 균주의 생육최소저해농도(MIC) 값을 결정하였다.First, Bacillus subtilis (KCTC 1918), Staphylococcus epidermis (KCTC 1917), Staphylococcus aureus (KCTC 1621), Listeria monocytogenes (KCTC 3710) ), E. coli (KCTC 1682), Pseudomonas aeruginosa (KCTC 1637), and Salmonella typhimurium (KCTC 1926) were distributed as gram-negative bacteria from the Biotechnology Research Institute Gene Bank, and each strain was treated with LB medium (1% bactotripton, Incubate in 0.5% bactoist extract, 1% sodium chloride, Sigma) to medium log phase, and dilute to 1 × 10 4 cells / 100 μl of cell concentration with 1% bactopepton medium (Difco) to micro titrate plate (Nunc). Was inoculated. Subsequently, the low molecular weight water-soluble chitosans having molecular weights of 1,000, 3,000, 5,000, 10,000, 20,000, and 30,000 g / mol were diluted 1/2 fold from 2.5 mg / well, respectively, and added to the plates, followed by incubation at 37 ° C. for 6 hours. The minimum growth concentration (MIC) value of each strain was determined by measuring absorbance at a wavelength of 620 nm using a micro titrate plate reader (Merck Elisa reader).
분자량이 1,000, 3,000, 5,000, 10,000, 20,000, 30,000 g/mol인 저분자량 수용성 키토산을 S.아우레우스, B.서브틸리스, L.모노사이토제네스, S.에피더미디스의 그람양성균과 대장균, S.티피무리움, B.우리기노사의 그람양성균에 대하여 다양한 농도로 배양된 배지에 넣고 저해 정도를 측정하여 생육 최소 저해농도를 구하여 표 3에 나타내었다.Low molecular weight water-soluble chitosans with molecular weights of 1,000, 3,000, 5,000, 10,000, 20,000, and 30,000 g / mol were converted to S. aureus, B. subtilis, L. monocytogenes, S. epidermidis, Gram-positive bacteria and E. coli. , Gram-positive bacteria of S. typhimurium, B. urinosa were added to the culture medium at various concentrations and the degree of inhibition was measured to obtain the minimum growth concentration.
분자량
(g/mol)
LMWSC
Molecular Weight
(g / mol)
표 3에 나타낸 바와 같이, 상기 저분자량 수용성 키토산은 약한 농도에서도 미생물의 발육을 억제하는 것으로 나타났으며, 이중 분자량 10,000 g/mol의 저분자량 수용성 키토산은 분자량 1,000에 비해 균주에 따라 16배 이상 높은 항균활성을 나타내고, 분자량 5,000에 비해서는 약 8배 이상의 높은 항미생물활성을 나타냄을 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 다중입자는 저분자량 수용성 키토산에 시프로플록사신을 담지시켜 시프로플록사신의 항생활성에 저분자량 수용성 키토산의 항균 활성이 첨가되어 강력한 항균효과를 나타낼 수 있다.As shown in Table 3, the low molecular weight water-soluble chitosan was found to inhibit the growth of microorganisms even at weak concentrations, and the low molecular weight water-soluble chitosan having a molecular weight of 10,000 g / mol was 16 times higher than the molecular weight of 1,000 depending on the strain. It showed an antimicrobial activity and showed an antimicrobial activity about 8 times higher than the molecular weight of 5,000. Therefore, the multiparticulate according to the present invention may support ciprofloxacin in low molecular weight water soluble chitosan, thereby adding antimicrobial activity of low molecular weight water soluble chitosan to the antimicrobial activity of ciprofloxacin, thereby exhibiting strong antimicrobial effect.
<< 실험예Experimental Example 2> 약물방출실험 2> Drug Release Experiment
실시예 1~6에서 제조된 다중입자 20 mg을 5 ml의 인산완충용액(phosphate buffered saline, 0.1 M, pH 7.4)에 분산시켜 투석막(dialysis bag, MWCO: 12,000 g/mol)에 넣고 이것을 200 ml 크기의 유리병에 95 ml의 인산완충용액(phosphate-buffered saline, PBS, pH 7.4, 0.1 M, contains 2.0 %, (w/v) sodium dodecyl sulfate)과 함께 넣었다. 방출실험은 교반기에서 37 C, 100 rpm의 조건으로 수행하였다. 일정한 조건을 유지하기 위해 인산완충용액을 매일 교환하였으며 일정한 시간 간격으로 방출된 약물의 농도를 UV 분광광도계(UV-1601, Shamdzu Co. Ltd. Japan)를 이용하여 277 nm에서 측정하였다. 모든 실험은 세 번 반복하였다.20 mg of the multiparticulates prepared in Examples 1 to 6 were dispersed in 5 ml of phosphate buffered saline (0.1 M, pH 7.4) and placed in a dialysis membrane (MWCO: 12,000 g / mol), which was 200 ml. In a glass vial of size was added with 95 ml of phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4, 0.1 M, contains 2.0%, (w / v) sodium dodecyl sulfate). The release experiment was carried out in a stirrer at 37 C, 100 rpm. The phosphate buffer solution was exchanged daily to maintain a constant condition, and the concentration of the drug released at regular time intervals was measured at 277 nm using a UV spectrophotometer (UV-1601, Shamdzu Co. Ltd. Japan). All experiments were repeated three times.
실험 결과를 도 3 내지 도 5에 나타내었다.Experimental results are shown in FIGS . 3 to 5 .
도 3은 PLGA의 첨가량이 약물의 방출속도에 미치는 영향을 나타낸 것으로 약 3일간 초기과다방출(initial burst effect)현상을 보였으며 그 이후로 약 30일간 서서히 약물이 방출되는 결과를 보였다. 또한 실시예 2와 실시예 3의 경우 약 10일간 초기과다방출 현상을 보인 후 40 여일 이상 서서히 약물이 방출되는 것으로 나타났다. 초기의 PLGA 투여량이 많을수록 약물의 방출속도가 느려지는 것으로 나타났으며 상대적으로 초기과다방출의 비율도 적은 것으로 나타났다. FIG. 3 shows the effect of the addition of PLGA on the release rate of the drug, which showed an initial burst effect for about 3 days, and the drug was released slowly for about 30 days thereafter. In addition, in the case of Example 2 and Example 3 after the initial excessive release for about 10 days, the drug was released slowly over 40 days. The higher the initial PLGA dose, the slower the rate of drug release, and the lower the rate of initial overdose.
도 4는 서로 다른 종류의 PLGA를 사용했을 때 약물의 방출속도에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 도 4에서 나타낸 바와 같이, 약물의 방출속도는 PLGA의 분자량이 클수록 느린 것으로 나타났다. 구체적으로 502H를 사용한 경우(실시예 4), 3일 동안 초기과다 방출 현상을 보인 후 서서히 방출되는 것으로 나타났으며 503H(실시예 2)는 약 10일간, 504H(실시예 5)는 약 7일간 초기과다 과다 방출 현상을 보인 후 한 달 이상 서서히 약물을 방출하는 것으로 나타났다. Figure 4 shows the effect on the release rate of the drug when using different types of PLGA. As shown in FIG . 4 , the release rate of the drug was found to be slower as the molecular weight of PLGA increased. Specifically, when 502H was used (Example 4), the initial excessive release was observed for 3 days, and then gradually released. 503H (Example 2) was about 10 days, and 504H (Example 5) was about 7 days. The drug was released slowly over a month after the initial overdose.
도 5는 다중입자 제조시 유기용매를 달리했을 때 약물의 방출속도에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 도 5에서 나타낸 바와 같이, 아세톤을 사용했을 때 초기 10일 동안 약물의 초기과다 방출이 더 높았던 것으로 나타났으나 전체적으로는 거의 비슷한 방출속도를 보였다. Figure 5 shows the effect on the release rate of the drug when different organic solvents in the production of multi-particles. As shown in FIG . 5 , the initial overdose of the drug was higher during the initial 10 days when using acetone, but the overall release rate was almost the same.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 시프로플록사신이 봉입된 저분자량 수용성 키토산 미립자를 고분자인 PLGA를 이용하여 코팅한 다중입자는 항균활성을 향상되고 약물이 오랜 시간 동안 방출되어 새로운 서방성 항생제로서 유용하게 사용될 수 있다.As described above, multiparticulates coated with low molecular weight water-soluble chitosan fine particles containing ciprofloxacin according to the present invention using PLGA as a polymer improve antimicrobial activity and release the drug for a long time, thereby making it useful as a new sustained-release antibiotic. Can be used.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 시프로플록사신이 담지된 저분자량 수용성 키토산 미립자를 나타내는 주사전자현미경 사진이다. 1 is a scanning electron micrograph showing the low molecular weight water-soluble chitosan particles loaded with ciprofloxacin according to an embodiment of the present invention.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 시프로플록사신이 담지된 저분자량 수용성 키토산 미립자에 고분자가 코팅된 다중입자를 나타내는 주사전자현미경 사진이다. Figure 2 is a scanning electron micrograph showing the multi-particles coated with the polymer on the low molecular weight water-soluble chitosan particles loaded with ciprofloxacin according to an embodiment of the present invention.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 다중입자의 고분자의 첨가량에 따른 약물 방출속도를 나타내는 그래프이다. Figure 3 is a graph showing the drug release rate according to the amount of the polymer of the multi-particles according to an embodiment of the present invention.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 다중입자의 고분자의 분자량에 따른 약물 방출속도를 나타내는 그래프이다. Figure 4 is a graph showing the drug release rate according to the molecular weight of the polymer of the multi-particles according to an embodiment of the present invention.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 다중입자의 제조시 사용된 용매에 따른 약물 방출속도를 나타내는 그래프이다. Figure 5 is a graph showing the drug release rate according to the solvent used in the preparation of the multi-particles according to an embodiment of the present invention.
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| KR20220151818A (en) | 2021-05-07 | 2022-11-15 | 주식회사 키토라이프 | Tropolone encapsulated chitosan nanoparticle and preparation method thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20090056314A (en) | 2009-06-03 |
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