KR101111621B1 - Detection method of Orientina tsutsugamushi using high Orientina tsutsugamushi specific primers with specific structure of a reverse complementary sequence - Google Patents
Detection method of Orientina tsutsugamushi using high Orientina tsutsugamushi specific primers with specific structure of a reverse complementary sequence Download PDFInfo
- Publication number
- KR101111621B1 KR101111621B1 KR1020090086235A KR20090086235A KR101111621B1 KR 101111621 B1 KR101111621 B1 KR 101111621B1 KR 1020090086235 A KR1020090086235 A KR 1020090086235A KR 20090086235 A KR20090086235 A KR 20090086235A KR 101111621 B1 KR101111621 B1 KR 101111621B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- pcr
- orientia
- primer
- seq
- infection
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 사람에서 쯔쯔가무시증(tsutsugamushi disease)을 유발하는 주요 세균인 오리엔티아 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi)의 감염 여부를, 오리엔티아 쯔쯔가무시 유전체(genome)에서의 56 kDa의 형 특이적 항원(type-specific antigen; TSA) 유전자를 표적(target)으로 하는 네스티드-PCR(nested-PCR)로 구성된 방법을 통하여 검출할 수 있는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 개선된 PCR 증폭 특이성을 제공할 수 있는 특징적 구조를 가진 프라이머들과, 이들 프라이머들을 이용한 네스티드-PCR을 통하여 상기 오리엔티아 쯔쯔가무시 감염 여부를 검출 할 수 있는 PCR 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명은 오리엔티아 쯔쯔가무시 균에 대한 높은 민감도와 특이도에 기반한 효과적 검출을 가능하게 하여 상기 오리엔티아 쯔쯔가무시 균의 감염 여부 진단에 효과적으로 활용될 수 있으며, 또한 오리엔티아 쯔쯔가무시 균의 감염 진단 키트로도 구현이 가능하다.The present invention is a type-specific antigen (56 kDa) of 56 kDa in the Orientia tsutsugamushi genome whether or not the infection of Orientia tsutsugamushi , a major bacterium that causes tsutsugamushi disease in humans TSA) is a method that can be detected through a method consisting of nested-PCR (target-PCR) targeting the gene, more specifically, a characteristic structure that can provide improved PCR amplification specificity It relates to a PCR detection method capable of detecting the orientia Tsutsugamu infection through the primers and the nested-PCR using these primers. The present invention enables effective detection based on the high sensitivity and specificity of Orientia Tsutsugamu bacteria, and can be effectively used for diagnosing the infection of Orientia Tsutsugamu bacteria, and also implemented as an infection diagnosis kit of Orientia Tsutsugamu bacteria. This is possible.
쯔쯔가무시증, 오리엔티아 쯔쯔가무시, 검출, 프라이머, PCR Tsutsugamus, Orientia Tsutsugamus, Detection, Primer, PCR
Description
본 발명은 PCR(polymerase chain reaction)을 이용하여 사람에서 쯔쯔가무시증(tsutsugamushi disease)을 유발하는 질병 원인체인 오리엔티아 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi)의 감염 여부를 검출(detection)하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 오리엔티아 쯔쯔가무시를 특이적으로 검출할 수 있으면서도 개선된 PCR 증폭 특이성까지를 제공해 줄 수 있는 특징적 구조를 가진 프라이머들(primers), 및 이들 프라이머들을 이용한 PCR을 통하여 상기 오리엔티아 쯔쯔가무시의 감염 여부를 검출할 수 있는 PCR 검출 방법에 관한 것으로서, 오리엔티아 쯔쯔가무시 균의 감염 진단에 활용될 수 있는 검출 기술에 관한 것이다.The present invention relates to a method for detecting an infection of Orientia tsutsugamushi , a disease causing agent that causes tsutsugamushi disease in humans using a polymerase chain reaction (PCR). Specifically, primers having a characteristic structure capable of detecting the Orientia Tsutsugamu while providing improved PCR amplification specificity, and infection of the Orientia Tsutsugamu through PCR using these primers The present invention relates to a PCR detection method capable of detecting whether or not the present invention relates to a detection technique that can be utilized for diagnosing infection of Orientia Tsutsugamu bacteria.
쯔쯔가무시증(tsutsugamushi disease)은 초원열(scrub typhus), 잡목열 또는 양충병이라고도 불리며, 매개충인 털진드기(Trombiculidae) 유충(chigger)이 사람의 피부에 부착하여 체액을 흡인할 때 털진드기 유충 안에 있던 오리엔티아 쯔쯔가 무시(Orientia tsutsugamushi)가 인체 내로 들어가면서 감염된다. 증상은 감염된 털진드기의 유충에 물린 뒤 1~3주의 잠복기를 거친 후 초기증상으로 갑자기 시작되는 오한과 40℃ 이상의 발열 및 두통이 나타나며, 기침, 구토, 근육통, 복통 및 인후염을 동반하기도 하며 홍반성 반점과 구진성 발진이 발병 3~7일에 가슴, 배, 몸통 혹은 상하지 및 드문 경우 얼굴이나 손바닥, 발바닥에 나타나고 이것은 2~10일간 지속된다. 털진드기에 물린 자리에는 발병 수일 내에 까만 딱지로 덮이는 가피(eschar)가 생기며, 대부분의 경우 통증이나 가려움증 등의 증상은 없다. 가피는 쯔쯔가무시증 환자의 70~90%에서 관찰된다. 일부 환자는 가피가 없는 경우도 있으며 열이 나는 기간이 짧고 피부발진이 더욱 많이 나타나기도 한다. 경우에 따라서는 비장비대, 결막염 등의 증상과 심한 경우 의식장애와 폐렴 및 순환기 장애가 나타나기도 한다. 이러한 임상증상의 경중은 개인에 따라 다르며 지역에 따라 유행하는 원인균의 혈청형의 차이에 따라 달라진다. 쯔쯔가무시증은 오래전부터 일본의 풍토병으로 알려져 왔을 뿐 아니라 우리나라, 중국, 태국, 인도, 파키스탄, 말레이시아, 필리핀, 호주 등 광범위한 지역에서 발생하고 있다. 우리나라에서는 1951년 주한 UN군에서 첫 환자 발생보고가 있었으며 1994년부터 1997년까지 매년 200여명이 발생하다가 1998년에는 1,140명으로 증가하였으며 2001년에는 2,638명, 2004년에는 4,699명으로 급증하여 2008년 6057명으로 지속적인 증가추세에 있다. 10월 중순부터 12월 초순까지의 기간에 주로 발생한다. Tsutsugamushi disease, also called scrub typhus, scrub typhus or caterpillar disease, is known as a sclero typhus, which was found in the hair mite larva when the mediator, Trombiculidae chigger, adheres to human skin and aspirates fluids. Orientia tsutsugamushi is infected as it enters the body. Symptoms include cold chills, fever and headache above 40 ° C, sudden cough, vomiting, sore throat, and sore throat. Spots and papular rashes appear on the chest, abdomen, torso or lower extremity and rarely on the face, palms or soles on days 3-7 of the onset, which last 2 to 10 days. Hair mite bites produce eschar covered with black scab within days of onset, and in most cases there are no symptoms such as pain or itching. Crust is observed in 70-90% of Tsutsuga's patients. Some patients have no skin, short fever, and more skin rashes. In some cases, symptoms such as cranial bands, conjunctivitis, and severe cases of consciousness, pneumonia, and circulatory disorders may occur. The severity of these clinical symptoms varies from person to person and depends on the difference in serotypes of causative organisms prevalent in the region. Tsutsugamushi has long been known as an endemic disease in Japan, and occurs in a wide range of regions including Korea, China, Thailand, India, Pakistan, Malaysia, the Philippines and Australia. In Korea, there was a report of the first case of the UN armed forces in 1951, and about 200 cases occurred each year from 1994 to 1997, then increased to 1,140 in 1998, and increased to 2,638 in 2001 and 4,699 in 2004. 6057 people are on a steady increase. It usually occurs in the period from mid-October to early December.
쯔쯔가무시증의 원인 병원체인 오리엔티아 쯔쯔가무시는 항원에 따라 길리암(Gilliam), 카프(Karp) 및 카토(Kato) 등의 3주가 주요 원형균주이며, 근래에는 일본, 태국, 우리나라에서 새로운 형의 균주가 보고되기도 하였다. 오리엔티아 쯔쯔가무시는 직경 0.5~0.7 ㎛, 길이 1.2~2.5 ㎛ 크기의 단간구균이며, 김자 염색 후 광학현미경으로 쉽게 관찰할 수 있다. 오리엔티아 쯔쯔가무시의 구성 폴리펩티드(polypeptide)를 SDS-PAGE로 분석하면 약 30개의 폴리펩티드 밴드가 나타난다. 주요 폴리펩티드의 크기는 110, 80, 70, 60, 56, 46, 42, 35, 28, 25 kDa이다. 이 중 56 kDa의 폴리펩티드는 형 특이적 항원(type-specific antigen; TSA)이며 오리엔티아 쯔쯔가무시를 구성하는 폴리펩티드 중 가장 풍부한 주요 구성 폴리펩티드라 할 수 있다. 상기 56 kDa의 폴리펩티드는 주요 면역항원으로 형 특이적 항원성을 가지며, 트립신 처리로 쉽게 분해되는 것으로 보아 가장 외층에 존재함을 알 수 있다. 오리엔티아 쯔쯔가무시는 인공배지에서는 배양되지 않으며 세포배양과 유정란 배양법이 주로 이용되며 마우스 등 감수성 동물에 접종하여 계대 배양 할 수도 있다. Orientia Tsutsugamu, the causative agent of Tsutsugamosis, has three main strains, Gilliam, Karp, and Kato, depending on the antigen. Recently, new strains in Japan, Thailand, and Korea Some have been reported. Orientia Tsutsugamushi is a monococci with a diameter of 0.5-0.7 μm and a length of 1.2-2.5 μm, and can be easily observed by optical microscopy after laver staining. Orientia Tsutsugamushi's constituent polypeptides (polypeptides) were analyzed by SDS-PAGE, about 30 polypeptide bands appeared. The major polypeptides are 110, 80, 70, 60, 56, 46, 42, 35, 28, 25 kDa. Of these, the 56 kDa polypeptide is a type-specific antigen (TSA) and is the most abundant major constituent polypeptide among the polypeptides constituting Orientia Tsutsugashishi. The 56 kDa polypeptide has a type-specific antigenicity as a major immunoantigen, and it can be seen that it is present in the outermost layer because it is easily degraded by trypsin treatment. Orientia Tsutsugamushi is not cultured in artificial media. Cell culture and fertilized egg culture are mainly used. Orientia Tsutsugamu can also be subcultured by inoculating susceptible animals such as mice.
쯔쯔가무시증에 대한 진단법으로는 간접 면역 형광 항체법 및 면역 효소 측정법이 가장 널리 사용되고 있는데, 이 두 가지 방법은 감수성과 특이도가 높으면서 초기감염과 재감염을 구별할 수 있다는 장점이 있어 현재 WHO에서도 우선적으로 추천되고 있는 방법이다. 반면, 간접 면역 형광 항체법 검사는 필요한 항원을 얻기 위하여 조직 배양이나 계란 부화 등을 할 수 있는 시설이 요구되며 형광 현미경을 갖춘 검사실에서만 검사를 할 수 있다는 단점을 지니고 있다. 또한, 면역 효소 측정법은 자주 위양성(false-positive)을 나타낸다는 단점이 있다. 이에 더하여, 이와 같은 혈청학적 진단에 사용되는 방법은 모두가 다량의 항원을 필요로 하고 있 어, 필요한 항원을 얻기 위한 균의 배양이 반드시 필요하다는 단점도 있다. 이러한 종래의 검사 방법들은 검사 과정이 복잡하여 검사에 시간이 많이 소요될 뿐만 아니라 시료를 처리하고 결과를 판독하는데 있어 정밀기기를 필요로 하며, 또한 고도로 숙련된 전문기술을 요한다는 문제점을 가지고 있었다. 따라서 보다 신속하고 판정이 용이한 새로운 검출법이 필요하다 할 수 있다. Indirect immunofluorescence and immunoassay methods are the most widely used diagnostic methods for Tsutsuga's disease.These two methods have the advantage of distinguishing early infection from reinfection with high sensitivity and specificity. It is the recommended method. On the other hand, indirect immunofluorescence antibody test requires a facility for tissue culture or egg hatching in order to obtain the necessary antigen, and has the disadvantage that can be tested only in a laboratory equipped with a fluorescence microscope. In addition, immunoassay methods often have the disadvantage of being false-positive. In addition, all of the methods used for such serological diagnosis require a large amount of antigens, and there is a disadvantage in that culturing of bacteria to obtain necessary antigens is necessary. These conventional inspection methods have a problem that the inspection process is complicated and time consuming, and requires precision instruments to process the sample and read the results, and also requires highly skilled expertise. Therefore, there is a need for a new detection method that is faster and easier to determine.
용이한 대체 진단법으로 PCR에 기반한 검출법들이 제안되고 있다. PCR은 DNA의 원하는 부분의 복사본(copy)의 수를 기하급수적(exponentially)으로 증폭시킬 수 있는 분자생물학적(molecular biological) 방법이다. DNA의 어느 부분이든지 그 서열(sequence)만 알면 PCR을 통해서 증폭할 수 있다. PCR은 1980년대 중반 케이 뮬리스(K. Mullis)에 의해서 처음 고안된 후, 유전자를 연구 및 분석하는 분자유전학을 포함한 많은 생물학 관련 연구에서 활용되었으며 현재에도 널리 이용되고 있는 실험 기법이다. 최근까지 개발된 PCR 기법으로는, 증폭에 소요되는 시간을 줄인 래피드 PCR(rapid PCR), 시료(sample)의 정제 과정을 생략하고자 하는 직접 PCR(direct PCR), 역전사 반응(reverse transcription)과 PCR을 결합시켜 RNA를 주형(template)으로 사용하게 한 역전사 효소-PCR(reverse transcriptase PCR; RT-PCR), PCR 반응의 실시간 모니터링(monitoring)이 가능한 실시간 PCR(real-time PCR), 1차 PCR과 2차 PCR로 구성된 두 단계의 PCR을 통하여 민감도(sensitivity)를 개선시킨 네스티드-PCR(nested-PCR), 다수의 표적 유전자를 동시에 증폭하는 다중(multiplex) PCR 등이 있다. 이외에도 매우 많은 PCR 기법들과 PCR 관련 기술들이 개발 되었다. 이에 대한 상세한 설명은 생략한다. 현재 PCR은 다양한 연구 및 응용 분야에서 활용되고 있으며, 대부분의 생물학 관련 연구 분야에 있어 강력한 실험 기법이 되었다(Science 252: 1643-1651, 1991). PCR-based detection methods have been proposed as an easy alternative diagnosis method. PCR is a molecular biological method that can exponentially amplify the number of copies of a desired portion of DNA. Any portion of the DNA can be amplified by PCR only by knowing its sequence. PCR was first invented by K. Mullis in the mid-1980s and has been used in many biology-related studies, including molecular genetics, to study and analyze genes, and is still widely used today. Recently developed PCR techniques include rapid PCR, which reduces the time required for amplification, direct PCR, reverse transcription, and PCR, which eliminates the purification of samples. Reverse transcriptase PCR (RTR-PCR), which combines RNA to be used as a template, real-time PCR, primary PCR and 2 for real-time monitoring of PCR reactions Two-step PCR consists of nested-PCR, which improves sensitivity, and multiplex PCR, which simultaneously amplifies multiple target genes. In addition, a number of PCR techniques and PCR-related techniques have been developed. Detailed description thereof will be omitted. PCR is currently used in a variety of research and application areas, and has become a powerful experimental technique for most biological research fields (Science 252: 1643-1651, 1991).
시료 중에 어떤 유전체(genome)의 존재 여부의 확인(detection)을 통하여 그 유전체를 가진 박테리아(bacteria)나 바이러스(virus)가 시료 속에 존재하고 있음을 판정하는 PCR에 기반한 박테리아나 바이러스의 검출 기술은 이제는 일반적인 기술이 되었다고 할 수 있으며, 현재 매우 널리 활용되고 있다. 이런 PCR에 기반한 박테리아나 바이러스의 검출 기술은 박테리아나 바이러스에 관련된 감염성 질환(infectious disease)의 진단 목적으로 질병 진단 분야에서 활발하게 활용되고 있다(Virol. Methods 66: 39-50, 1997; Clin. Microbiol. 35: 2076-2082, 1997). 이러한 감염 원인체의 유전체에 기반을 둔 진단법인 PCR 진단은 PCR 주형인 유전체로부터 다수의 증폭 산물을 만들 수 있는 PCR의 고유한 특징으로 인하여 타 진단 방법에 비하여 매우 높은 진단 민감도를 제공해 줄 수 있다. 높은 민감도를 제공해 줄 수 있다는 점과 진단에 필요한 소요 시간이 타 방법에 비교하여 매우 짧다는 이유로 인하여 PCR을 이용한 진단 방법이 점차적으로 다른 진단 방법을 대체해 가고 있다. PCR-based detection techniques for bacteria or viruses that determine whether bacteria or viruses with their genomes are present in the sample through detection of the presence of a genome in the sample It has become a common technology and is very widely used now. Such PCR-based detection of bacteria or viruses is actively used in the field of disease diagnosis for the purpose of diagnosing infectious diseases related to bacteria or viruses (Virol. Methods 66: 39-50, 1997; Clin.Microbiol 35: 2076-2082, 1997). PCR diagnosis, which is a diagnostic method based on the genome of an infectious agent, can provide a very high diagnostic sensitivity compared to other diagnostic methods due to the inherent characteristic of PCR that can generate a large number of amplification products from the PCR template genome. Due to the fact that it can provide high sensitivity and the time required for diagnosis is very short compared to other methods, PCR-based diagnostic methods are gradually replacing other diagnostic methods.
쯔쯔가무시증에 유관한 PCR 기반의 선행기술로는 다음과 같은 발명들을 제시할 수 있다. 대한민국특허등록 제10-0657866호에는 네스티드-PCR을 이용한 홍반열 리케치아(Rickettsia) 균의 검출방법이 개시되어있다. 상기 발명에서는 리케치아의 외막 단백질 B(romp B)의 유전자를 검출의 대상(target)으로 하고 있다. 또한 상기 발명 기술에 의한 검출 가능 세균으로는 리케치아 시비리카(Rickettsia sibirica), 리케치아 아카리(Rickettsia akari), 리케치아 코노리(Rickettsia conorii), 리케치아 펠리스(Rickettsia felis) 및 리케치아 자포니카(Rickettsia japonica)가 있다. 그러나 상기 발명은 오리엔티아 쯔쯔가무시 균의 검출에는 적합하지 않다. 대한민국특허공개 제10-2008-0111353호에는 PCR과 단일 가닥 구조 다형성(single strand conformation polymorphism; SSCP)을 이용한 미생물 검출 방법이 개시되어 있다 (이를 당분야에서는 PCR-SSCP법이라 한다). 상기 발명에서는 PCR의 대상 유전자로서 16S rRNA(ribosomal RNA), EF-2(translation elongation factor 2), IF-3(translation initiation factor 3) 및 IF-2(translation initiation factor 2)를 이용한다. 대한민국특허등록 제10-0550463호에는 리케치아와 쯔쯔가무시 균의 동시 검출용 프라이머가 개시되어 있다. 상기 발명에서는 GroEL 단백질을 코딩하는 groEL 유전자를 PCR의 대상 유전자로 하고 있다. 참고로, GroEL 단백질을 코딩하는 groEL 유전자를 대상으로 하고 있다는 점에서 대한민국특허등록 제10-0550463호와 유사한 발명으로는 대한민국특허등록 제10-0681837호, 대한민국특허등록 제10-0553520호, 대한민국특허등록 제10-0544069호, 대한민국특허등록 제10-0550463호 및 대한민국특허등록 제10-0681820호가 있다. As a PCR-based prior art related to Tsutsuga's disease, the following inventions can be suggested. Korean Patent Registration No. 10-0657866 discloses a method for detecting erythema rickettsia bacteria using Nested-PCR. In the above invention, the gene of Rickettsia's outer membrane protein B (romp B) is targeted for detection. In addition to the detectable bacteria according to the invention described has rikechiah fertilization Rica (Rickettsia sibirica), rikechiah Akari (Rickettsia akari), rikechiah nose nori (Rickettsia conorii), rikechiah Felice (Rickettsia felis) and rikechiah japonica (Rickettsia japonica). However, the present invention is not suitable for the detection of Orientia Tsutsugamu bacteria. Korean Patent Publication No. 10-2008-0111353 discloses a microbial detection method using PCR and single strand conformation polymorphism (SSCP) (hereinafter referred to as PCR-SSCP method). In the present invention, 16S ribosomal RNA (rRNA), translation elongation factor 2 (EF-2), translation initiation factor 3 (IF-3), and translation initiation factor 2 (IF-2) are used as a target gene of PCR. Korean Patent Registration No. 10-0550463 discloses a primer for the simultaneous detection of rickettsia and Tsutsugamu bacteria. In the above invention, the groEL gene encoding the GroEL protein is used as a target gene for PCR. For reference, the invention similar to Korean Patent Registration No. 10-0550463 in that it targets the groEL gene encoding GroEL protein is Korean Patent Registration No. 10-0681837, Korean Patent Registration No. 10-0553520, and Korean Patent Patent Registration No. 10-0544069, Republic of Korea Patent Registration No. 10-0550463 and Republic of Korea Patent Registration No. 10-0681820.
본 발명자들은 상기의 종래 방법들에 비교하여 그 실시가 간단하고 저렴하면서 또한 민감하고 특이적으로 오리엔티아 쯔쯔가무시의 감염 여부를 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 오리엔티아 쯔쯔가무시의 56 kDa의 형 특이적 항원(type-specific antigen; TSA) 유전자에 특이적이면서 이의 증폭에 있어 비특이 증폭을 획기적으로 줄여줄 수 있는 특징적 구조를 가진 프라이머들과 이를 이용 한 네스티드-PCR 기반의 오리엔티아 쯔쯔가무시 감염 여부 검출법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다. 상기 56 kDa의 형 특이적 항원은 주로 면역학적으로 활용되고 있다. 예로 미국특허 제6,482,415호, 미국특허 제6,699,674호 및 미국특허 제7,335,477호를 들 수 있으며, 네스티드-PCR에 기반한 오리엔티아 쯔쯔가무시의 검출에 대해서는 개시하고 있지 않다. 오리엔티아 쯔쯔가무시의 56 kDa의 형 특이적 항원을 코딩하고 있는 유전자에 대한 PCR 검출은 몇 몇 논문들에 발표되어 있다(J. Med. Entomol. 38: 308-311, 2001; Clin. Med. J. 115: 1881-1882, 2002; Am. J. Trop. Med. Hyg. 54: 647-651, 1996). 그러나 이러한 선행 기술들에서는 PCR 단계에서의 특이도 및 민감도가 낮다는 문제를 갖고 있다. 본 발명자들은 특이도를 개선시킬 수 있는 프라이머를 사용함으로써 이러한 점을 해결하였다.The inventors of the present invention have tried to develop a method capable of detecting an infection with Orientia Tsutsugamu, which is simple, inexpensive, and sensitive and specifically compared to the conventional methods described above. Primers with specific structures that are specific for the type-specific antigen (TSA) gene and can significantly reduce non-specific amplification in its amplification, and nested-PCR-based Orientia Tsutsugamu infection The present invention has been completed by developing a detection method. The 56 kDa type specific antigen is mainly used immunologically. Examples include US Pat. No. 6,482,415, US Pat. No. 6,699,674, and US Pat. No. 7,335,477, which do not disclose detection of Orientia Tsutsugamu based on nested-PCR. PCR detection of genes encoding a 56 kDa type specific antigen of Orientia Tsutsugamu has been published in several papers (J. Med. Entomol. 38: 308-311, 2001; Clin. Med. J. 115: 1881-1882, 2002; Am. J. Trop. Med. Hyg. 54: 647-651, 1996). However, these prior arts have a problem of low specificity and sensitivity in the PCR step. We solved this by using primers that could improve specificity.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용은 괄호 내에 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준과 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Throughout this specification, numerous papers and patent documents are referenced and their citations are indicated in parentheses. The disclosures of cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety, and the level of the technical field to which the present invention belongs and the contents of the present invention are more clearly described.
따라서 본 발명은 이러한 종래기술의 문제점과 과거로부터 요청되어온 기술적 과제를 해결하는 것을 목적으로 한다. Therefore, an object of the present invention is to solve the problems of the prior art and the technical problem that has been requested from the past.
본 발명의 목적은 기존 기술이 제공할 수 있던 특이도 및 민감도의 한계를 극복하면서 개선된 특이도와 민감도로 오리엔티아 쯔쯔가무시의 감염 여부 검사에 활용 가능한 프라이머들, 이를 포함하는 검사 키트 및 이 프라이머들을 이용한 오리엔티아 쯔쯔가무시의 감염 여부를 검출할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to overcome the limitations of specificity and sensitivity that the existing technology can provide, primers that can be used to test the infection of Orientia Tsutsugamu with improved specificity and sensitivity, a test kit comprising the same and using the primers It is to provide a method for detecting the presence of Orientia Tsutsugamu City.
상기와 같은 본 발명의 과제를 해결하기 위하여,In order to solve the problems of the present invention as described above,
본 발명은 오리엔티아 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi)의 56 kDa의 형 특이적 항원 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 일부 염기서열을 증폭할 수 있는 프라이머로서, 상기 프라이머의 5’-말단에 5’-말단으로부터 일정 부분까지의 염기서열의 역의 상보서열이 추가된 것을 특징적으로 하는 오리엔티아 쯔쯔가무시 감염 여부 검출용 프라이머를 제공한다.The present invention is a primer capable of amplifying a partial sequence of a gene encoding a 56 kDa type specific antigen polypeptide of Orientia tsutsugamushi , which is a part from the 5'-end of the 5'-end of the primer. Provided is a primer for detecting an Orientia Tsutsugamu infection, characterized in that the complementary sequence of the reverse of the base sequence up to.
상기 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 염기 서열로 구성되는 것이 바람직하다.The primer is preferably composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4.
또한, 본 발명은 상기 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 오리엔티아 쯔쯔가무시의 감염 여부 검출용 키트를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a kit for detecting the infection of Orientia Tsutsugamu comprising the primer.
또한, 본 발명은 상기 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 오리엔티아 쯔쯔가무시 관련 질환 진단용 키트를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a kit for diagnosing Orientia Tsutsugamushi-related disease, comprising the primer.
또한, 본 발명은 상기 프라이머를 이용한 오리엔티아 쯔쯔가무시의 감염 여부 검사 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method for testing the infection of Orientia Tsutsugamu using the primer.
상기 검사 방법은,The inspection method,
(1) 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;(1) extracting DNA from a sample;
(2) 서열번호 1 내지 서열번호 4로 구성되는 프라이머 조합 및 추출된 상기 DNA를 이용하여 네스티드-PCR을 실시하는 단계;(2) performing nested-PCR using a primer combination consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4 and the extracted DNA;
(3) 상기 단계 (2)로부터 얻어진 PCR 산물의 분석을 통하여 오리엔티아 쯔쯔가무시의 감염 여부를 조사하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.(3) It is preferable to include the step of investigating the infection of Orientia Tsutsugamu through the analysis of the PCR product obtained from step (2).
본 발명은 기존 방법에 비하여 개선된 특이도와 민감도로 오리엔티아 쯔쯔가무시의 감염 여부를 쉽고 빠르게 판별하게 해 준다. 따라서 본 발명은 상기 오리엔티아 쯔쯔가무시의 검출 방법으로 유용하게 사용될 수 있으며, 상기 오리엔티아 쯔쯔가무시 관련 질환 진단용 제품 개발에도 효과적으로 활용될 수 있다.The present invention allows for quick and easy determination of infection with Orientia Tsutsugamu with improved specificity and sensitivity compared to conventional methods. Therefore, the present invention can be usefully used as a detection method for Orientia Tsutsugamu, and can be effectively used for development of products for diagnosing Orientia Tsutsugamushi-related diseases.
상기한 바와 같이, 본 발명은 오리엔티아 쯔쯔가무시 균의 유전체와 결합할 수 있는 특이 프라이머들을 제공하고, 이를 포함하는 오리엔티아 쯔쯔가무시의 감염 여부 검출용 키트, 및 오리엔티아 쯔쯔가무시 관련 질환 진단용 키트를 제공하며, 나아가 이들 프라이머들을 이용한 네스티드-PCR에 기반한 오리엔티아 쯔쯔가무시 균의 감염 여부 검사 방법을 제공하는 것이다.As described above, the present invention provides specific primers capable of binding to the genome of Orientia Tsutsugamu strain, and provides a kit for detecting the presence of Orientia Tsutsugamu infection comprising the same, and a kit for diagnosing Orientia Tsutsugamushi related diseases, Furthermore, the present invention provides a method for testing the infection of Orientia Tsutsugamu based on Nested-PCR using these primers.
구체적으로, 본 발명은 오리엔티아 쯔쯔가무시의 56 kDa 크기의 형 특이적 항원을 코딩(coding)하고 있는 유전자로부터 1차 PCR 증폭하는 데에 활용될 수 있는 특이 프라이머들로서 바람직하게는 서열번호 1 내지 서열번호 2에 제시한 염기 서열로 이루어진 프라이머 서열들을 제공한다. 또한, 본 발명은 1차 PCR 산물의 내부에 위치한 염기서열 부분을 특이적으로 2차 PCR 증폭하는 데에 활용될 수 있는 특이 프라이머들로서 바람직하게는 서열번호 3 내지 서열번호 4에 제시한 염기 서열로 이루어진 프라이머 서열들을 제공한다. 이들 특이 프라이머들은 비특이 증폭을 줄일 수 있고 민감도를 개선시킬 수 있게 각 프라이머의 5’-말단(terminus)에 역의 상보서열(reverse complementary sequence)이 도입되어 있다. 이들 특이 프라이머들은 기존 프라이머 서열의 5’-말단의 5’-시작부위(start site)로부터의 일정 부분, 바람직하게는 5’-시작부위로부터의 3 내지 7번째 염기, 보다 바람직하게는 서열번호 1 내지 서열번호 4에 제시된 염기서열과 같은 5’-시작부위로부터의 5번째 염기와 상보적인 역의 상보서열을 포함한다. 이러한 역의 상보서열 도입은 PCR 반응액을 준비하는 단계를 포함한 PCR의 본격적인 반응에 진입하기 전까지의 기간 동안 프라이머가 불활성화 된 상태로 유지되게 해 준다. 프라이머의 불활성화는 상기 기간 동안 프라이머들이 서로 결합되어 프라이머로서의 역할(주형에 결합하여 증폭의 시발점이 되는 역할)이 억제됨에 의해서 구현된다. 즉, 본 발명의 프라이머들은 주형 변성 단계(template denaturation step) 이후의 정상적 PCR 반응에서의 어닐링 온도(annealing temperature)에서만 주형에 결합될 수 있어 이에 따라 PCR 증폭에서의 특이성이 높아지게 된다. 일반적으로, 상기 어닐링 온도에서 만 주형과 프라이머의 특이적 결합이 담보된다. 통상 보통의 프라이머(역의 상보서열이 없는 프라이머)를 사용할 경우에는 상기 어닐링 온도 이하에서는 주형과 프라이머 간의 결합이 비특이적이며, 이로 인하여 비특이 증폭이 초래된다. 또한 상기 역의 상보서열 도입은 PCR 반응 주기(cycle)에 있어 3번째 주기부터는 최초 주형(최초에 첨가해 준 주형을 지칭)에 의존한 증폭에 비해 3번째 주기 전에 생성된 PCR 산물에 의존한 증폭이 우세해진다. 결과적으로, 필요 없는 여러 서열 부분까지 포함한 최초 주형을 주형으로 할 때에 비하여 훨씬 단순한 서열로 구성된 PCR 산물을 주형으로 함에 따라 또한 특이도가 개선된다. 한편, 추가로 도입된 역의 상보서열의 수만큼 프라이머가 주형에 결합(priming)하는 자리의 수가 증가되게 되어 결과적으로 민감도가 개선된다. 구체적으로, 본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 4에 제시한 프라이머들은 PCR 주형과 결합할 프라이밍 서열로 구성된 최초 프라이머 서열과 이 최초 프라이머 서열의 5’-말단의 5’-시작부위로부터의 일정 부분과 상보적인 역의 상보서열이 상기 최초 프라이머의 5’-말단에 추가로 도입된 변형 프라이머들(modified primers)이다. Specifically, the present invention is a specific primers that can be used for primary PCR amplification from a gene encoding a 56 kDa size specific antigen of Orientia Tsutsugamu. Provided primer sequences consisting of the nucleotide sequence shown in 2. In addition, the present invention is a specific primers that can be used to specifically amplify the second nucleotide sequence located in the interior of the first PCR product of the base sequence preferably in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 4 Provided primer sequences were made. These specific primers have a reverse complementary sequence introduced at the 5′-terminus of each primer to reduce non-specific amplification and improve sensitivity. These specific primers are a portion from the 5'-end site of the existing primer sequence, preferably the 3-7th base from the 5'-start, more preferably SEQ ID NO: 1 To a complementary sequence complementary to the fifth base from the 5′-start, such as the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4. This reverse complementarity sequence allows primers to remain inactive for a period of time prior to entering the full-scale reaction of PCR, including preparing a PCR reaction solution. Inactivation of the primer is realized by the primers being bound to each other during this period, thereby inhibiting their role as primers (binding to the template to be the starting point of amplification). That is, the primers of the present invention can be bound to the template only at the annealing temperature in the normal PCR reaction after the template denaturation step, thereby increasing specificity in PCR amplification. In general, specific binding of the template and the primer is ensured at the annealing temperature. When using ordinary primers (primary primers without reverse complementary sequences), the binding between the template and the primers is nonspecific below the annealing temperature, which results in nonspecific amplification. In addition, the introduction of the complementary sequence of the inverse is amplification dependent on the PCR product generated before the third cycle from the third cycle in the PCR reaction cycle, compared to the amplification depending on the first template (the initial template). This prevails. As a result, the specificity is also improved by using a PCR product composed of a much simpler sequence as a template, as compared to when the template is composed of the original template including several parts of the sequence which are not necessary. On the other hand, the number of sites for primer priming to the template is increased by the number of complementary sequences of the reverse introduced, resulting in improved sensitivity. Specifically, the primers set forth in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4 of the present invention are the first primer sequence consisting of a priming sequence to bind the PCR template and a portion from the 5'-end of the 5'-end of the original primer sequence. Complementary sequences complementary to are the modified primers additionally introduced at the 5'-end of the original primer.
이하, 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.Hereinafter, the content of the present invention will be described in more detail, but it will be understood by those skilled in the art that the present invention may be variously modified and changed without departing from the spirit and scope of the present invention.
본 발명에서의 특이 프라이머들은 오리엔티아 쯔쯔가무시의 56 kDa의 형 특이적 항원(TSA) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 부위를 증폭 대상으로 한다. 각각의 PCR에서 증폭되는 부위를 표시한 그림이 도 1에 제시되어 있다.Specific primers in the present invention target amplification of a gene region encoding a 56 kDa type specific antigen (TSA) polypeptide of Orientia Tsutsugamu. A diagram showing the sites to be amplified in each PCR is shown in FIG. 1.
보다 구체적으로는 본 발명의 특이 프라이머들은 1차 PCR 증폭용 프라이머와 2차 PCR 증폭용 프라이머로 구분되며, 1차 PCR 증폭용 프라이머는 DNA로부터 PCR을 통하여 1차 PCR 산물을 생성하고, 2차 PCR 증폭용 프라이머는 상기 1차 PCR 산물을 주형으로 한 2차 PCR을 통하여 특정 유전자 부위를 증폭하는 데에 사용된다.More specifically, the specific primers of the present invention are classified into primary PCR amplification primers and secondary PCR amplification primers, and primary PCR amplification primers generate primary PCR products through PCR from DNA, and secondary PCR. Amplification primers are used to amplify specific gene sites through secondary PCR based on the primary PCR product.
상기 오리엔티아 쯔쯔가무시를 검출할 수 있는 특이 프라이머들은 서열번호 1 내지 서열번호 4의 프라이머 조합을 통해 구현될 수 있다. 상기 특이 프라이머 조합은 1차 PCR 정방향(forward) 프라이머 1개와 1차 PCR 역방향(reverse) 프라이머 1개 및 2차 PCR 정방향 프라이머 1개와 2차 PCR 역방향 프라이머 1개로 이뤄져 있으며, 1차 PCR 증폭 산물의 크기는 1,156 bp 내지 1,168 bp이며 2차 PCR 증폭 산물의 크기는 448 bp 내지 471 bp이다. Specific primers capable of detecting the Orientia Tsutsugamu can be implemented through a primer combination of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4. The specific primer combination consists of one primary PCR forward primer, one primary PCR reverse primer, and one secondary PCR forward primer and one secondary PCR reverse primer, and the size of the primary PCR amplification product. Is 1,156 bp to 1,168 bp and the size of the second PCR amplification product is 448 bp to 471 bp.
본 발명의 1차 PCR 및 2차 PCR에 사용되는 특이 프라이머 조합에서의 각 프라이머들의 염기서열은 다음과 같다. 1차 PCR 증폭용 정방향 프라이머는 5’-GCA ATA TTG CTA GTG CAA TGT CTG C-3’ (25-mer, 서열번호 1)이고, 1차 PCR 증폭용 역방향 프라이머는 5’-ATG CAT GCA TGR CGC TKC AAT TTA-3’ (24-mer, 서열번호 2)이다. 또 2차 PCR 증폭용 정방향 프라이머는 5’-ATA GGC CTA TAA GTA TWG CKG ATC G-3’ (25-mer, 서열번호 3)이고 2차 PCR 증폭용 역방향 프라이머는 5’-CAT CTA GAY GCA CTA TTA GGC AAA-3’ (24-mer, 서열번호 4)이다. 이들 프라이머들은 최초 프라이머 서열의 5’-말단의 5’-시작부위로부터의 일정 부분과 상보적인 서열이 상기 최초 프라이머의 5’-말단에 추가로 도입된 변형 프라이머들이다. 추가로 도입된 역의 상보서열은 밑줄로 표시되어 있다. 본 명세서에는 프라이머의 서 열을 나타냄에 있어 IUB 중의성(ambiguity) 코드(codes)를 사용했다. 따라서 프라이머 서열에서 A는 아데닌(adenine)을, G는 구아닌(guanine)을, C는 시토신(cytosine)을, T는 티민(thymine)을 나타내고, W는 아데닌과 티민 둘 다가 가능한 자리를 나타내고, K는 구아닌과 티민 둘 다가 가능한 자리를 나타내고, R은 아데닌과 구아닌 둘다 가능한 자리를 나타내고, Y는 시토신과 티민 둘 다가 가능한 자리를 나타낸다. 이는 본 명세서의 모든 서열을 제시하는 데에 있어 동일하게 적용하였다.The base sequences of the respective primers in the specific primer combinations used in the primary PCR and the secondary PCR of the present invention are as follows. The forward primer for primary PCR amplification is 5'- GCA AT A TTG CTA GTG CAA TGT CTG C-3 '(25-mer, SEQ ID NO: 1), and the reverse primer for primary PCR amplification is 5'- ATG CA T GCA TGR CGC TKC AAT TTA-3 '(24-mer, SEQ ID NO: 2). The forward primer for secondary PCR amplification was 5'- ATA GG C CTA TAA GTA TWG CKG ATC G-3 '(25-mer, SEQ ID NO: 3) and the reverse primer for secondary PCR amplification was 5'- CAT CT A GAY. GCA CTA TTA GGC AAA-3 ′ (24-mer, SEQ ID NO: 4). These primers are modified primers in which a sequence complementary to a portion from the 5'-end of the 5'-end of the original primer sequence is further introduced at the 5'-end of the original primer. Additional complementary sequences of the introduced stations are underlined. In this specification, IUB ambiguity codes are used to indicate the sequence of primers. Therefore, in the primer sequence, A represents adenine, G represents guanine, C represents cytosine, T represents thymine, W represents a possible site of both adenine and thymine, and K Represents a possible site for both guanine and thymine, R represents a possible site for both adenine and guanine, and Y represents a possible site for both cytosine and thymine. The same applies to the presentation of all sequences herein.
본 발명의 상기 각 특이 프라이머들은 구성염기의 일부가 변경될 수 있으나 역의 상보서열을 가진다는 특징은 유지되어야 한다. 이와 같은 변경은 구성염기 서열의 일부결실, 부가, 치환, 또는 이들의 복합적인 것으로 구현될 수 있으나, 이러한 염기서열의 변경은 프라이머의 주형과의 특이적 결합을 훼손할 수 있기 때문에 적용에 있어 상당한 주의를 요한다. 따라서 특이성을 훼손하지 않는 범위 내에서 실험적 또는 경험적으로 결정되어야 한다. 이는 당업자에게는 일반적인 사항이므로 이에 대한 상세한 설명은 생략한다. 본 발명에서 제시된 프라이머들의 서열을 유지하는 것이 가장 바람직하다.Each of the specific primers of the present invention may be altered a part of the constituent base, but the characteristics of having a reverse complementary sequence should be maintained. Such alterations can be implemented as partial deletions, additions, substitutions, or combinations of constituent base sequences, but such alterations in nucleotide sequences can result in significant disruption in specific binding to the template of the primer. Requires attention. Therefore, it should be determined empirically or empirically within the scope of not impairing specificity. Since this is a general matter to those skilled in the art, a detailed description thereof will be omitted. Most preferred is to maintain the sequence of primers set forth in the present invention.
상기 서열번호 1 내지 서열번호 4의 특이 프라이머들을 이용한 상기 오리엔티아 쯔쯔가무시의 검출 방법이 모식적으로 도 2에 제시되어 있으며, 바람직한 방법은 다음과 같다.The orientia Tsutsugamu detection method using the specific primers of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4 is schematically shown in Figure 2, the preferred method is as follows.
(1) DNA를 추출하는 단계;(1) extracting DNA;
(2) 상기 오리엔티아 쯔쯔가무시를 검출할 수 있는 서열번호 1 내지 서열번 호 4의 특이 프라이머들로부터 구성되어지는 프라이머 조합 및 상기 추출된 DNA를 이용하여 네스티드-PCR을 실시하는 단계;(2) performing nested-PCR using a primer combination consisting of specific primers of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4 capable of detecting the Orientia Tsutsugamushi and the extracted DNA;
(3) 상기 PCR 산물의 분석을 통하여 오리엔티아 쯔쯔가무시의 감염 여부를 조사하는 단계.(3) Investigating the infection of Orientia Tsutsugamu through analysis of the PCR product.
보다 상세히 설명하면, 먼저 혈액 등의 검체에서 공지의 방법에 따라 DNA를 추출한 후, 추출된 DNA를 함유한 추출액을 오리엔티아 쯔쯔가무시를 검출할 수 있는 본 발명의 특이 프라이머 조합 중 서열번호 1과 서열번호 2의 프라이머 쌍을 포함하고 있는 1차 PCR 반응액에 첨가한다. 이때, 1차 PCR 반응액은 PCR 증폭을 위한 DNA 중합효소(DNA polymerase) 등 PCR에 필요한 모든 성분을 포함하고 있어야 한다. 1차 PCR이 완료되면, 1차 PCR 산물의 일부를 본 발명의 특이 프라이머 조합 중 서열번호 3과 서열번호 4의 프라이머 쌍을 포함하고 있는 2차 PCR 반응액에 첨가한다. 이때 2차 PCR 반응액도 PCR 증폭을 위한 DNA 중합효소를 포함한 PCR에 필요한 모든 성분을 포함하고 있어야 한다. 다음으로, 상기 네스티드-PCR 과정을 거친 반응액을 통상적 방법으로 전기 영동하여 오리엔티아 쯔쯔가무시의 특이적 밴드의 생성 여부에 근거하여 오리엔티아 쯔쯔가무시의 감염 여부를 판정한다. 즉, 448 bp 내지 471 bp 크기의 PCR 산물이 확인되면 최초 추출하여 준비한 DNA 시료에 오리엔티아 쯔쯔가무시의 DNA가 포함되어 있었다는 것을 나타내며, 이는 DNA 추출에 사용한 최초의 검체인 혈액 등이 오리엔티아 쯔쯔가무시에 감염되어 있었음을 나타낸다.In more detail, first, DNA is extracted from a sample such as blood according to a known method, and then the extract containing the extracted DNA is SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO. It is added to the primary PCR reaction solution containing 2 primer pairs. At this time, the primary PCR reaction solution should contain all the components necessary for PCR such as DNA polymerase (DNA polymerase) for PCR amplification. When the primary PCR is completed, a portion of the primary PCR product is added to the secondary PCR reaction solution containing the primer pairs of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 of the specific primer combination of the present invention. At this time, the secondary PCR reaction solution should also contain all the components necessary for PCR including DNA polymerase for PCR amplification. Next, the reaction solution having undergone the nested-PCR process is electrophoresed in a conventional manner to determine whether or not Orientia Tsutsugamu is infected based on whether or not a specific band of Orientia Tsutsugamu is produced. In other words, when PCR products of 448 bp to 471 bp were identified, it indicated that the DNA sample prepared for the first extraction contained DNA of Orientia Tsutsugamu, which was the first sample used for DNA extraction, and infected with Orientia Tsutsugamu. Indicates that it was
따라서 본 발명에 의하면, 상기 본 발명의 특이 프라이머 조합을 이용한 네 스티드-PCR을 통하여 상기 오리엔티아 쯔쯔가무시의 감염 여부를 높은 민감도와 특이도로 검출할 수 있다. Therefore, according to the present invention, it is possible to detect with high sensitivity and specificity whether the orientia Tsutsugamu infection is infected through nested-PCR using the specific primer combination of the present invention.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but these Examples are merely illustrative of the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these Examples.
실시예 1: 특이 프라이머들의 제작Example 1: Preparation of Specific Primers
본 발명에서의 오리엔티아 쯔쯔가무시의 유전자 증폭에서는 56 kDa 형 특이적 항원(TSA) 폴리펩티드를 코딩하고 있는 유전자 부위 중 오리엔티아 쯔쯔가무시의 종류별 차이가 적은 부위를 증폭범위로 사용하였다.In the gene amplification of Orientia Tsutsugamu in the present invention, a region having a small difference by type of Orientia Tsutsugamu was used as an amplification range among gene regions encoding a 56 kDa type specific antigen (TSA) polypeptide.
표 1에는 본 발명에 따라 설계된 특이 프라이머들의 염기 서열이 제시되어 있으며, 서열번호 1 내지 서열번호 4의 오리엔티아 쯔쯔가무시의 56 kDa 형 특이적 항원(TSA) 폴리펩티드를 코딩하고 있는 유전자 증폭용 특이 프라이머들은 오리엔티아 쯔쯔가무시 보령(Boryong)형(NCBI accession number: AM494475)을 기준으로 해당 위치를 나타내었다. 이들 프라이머들은 앞에 상술한 역의 상보서열을 특징적으로 가지고 있으며 표 1에서 상기 역의 상보서열 부분은 밑줄로 표시되어 있다. Table 1 shows the nucleotide sequences of specific primers designed according to the present invention, and specific primers for gene amplification encoding 56 kDa type specific antigen (TSA) polypeptides of Orientia Tsutsugamu SEQ ID. The location is based on the Orientia Tsutsugamu Boryong type (NCBI accession number: AM494475). These primers have the complementary sequences inverted above, and the complementary sequences of the reversed in Table 1 are underlined.
1st PCR
2nd PCR
실시예 2: 검체 균주 및 DNA 준비Example 2: Sample Strain and DNA Preparation
오리엔티아 쯔쯔가무시 균주로는 오리엔티아 쯔쯔가무시 카프형(질병관리본부로부터 입수), 오리엔티아 쯔쯔가무시 카토형(질병관리본부로부터 입수), 오리엔티아 쯔쯔가무시 길리암형(질병관리본부로부터 입수) 및 오리엔티아 쯔쯔가무시 보령형(질병관리본부로부터 입수)을 사용하였다. 대조균주로는 홍반열을 매개하는 리케치아 자포니카 (Rickettia japonica)(질병관리본부로부터 입수), 리케치아 시빈카 (Rickettia sibinka)(질병관리본부로부터 입수), 리케치아 아카리 (Rickettia akari) (질병관리본부로부터 입수)와 발진열 매개균주인 리케치아 타이피(Rickettia typhi)(질병관리본부로부터 입수)를 사용하였다. DNA 추출은 (주)인트론바이오테크놀로지사의 Viral Gene-spinTM DNA/RNA Extraction Kit를 사용하여 제품 사용 설명에 따라 실시하였다.Orientia Tsutsugamu strains include Orientia Tsutsugamu Kape (obtained from the Disease Control Center), Orientia Tsutsugamu Kato type (obtained from the Disease Control Center), Orientia Tsutsugamu Gili Cancer (obtained from the Disease Control Center), and Orientia Tsutsugamu Boryeong A mold (obtained from the Centers for Disease Control) was used. Control strains include Rickettia japonica (obtained from the Centers for Disease Control), mediate erythema fever , Rickettia sibinka (obtained from the Centers for Disease Control), and Rickettia akari (obtained from the Disease Control Center). ) And a rash-mediated strain, Rickettia typhi (obtained from the Centers for Disease Control) were used. DNA extraction was carried out using the Viral Gene-spin ™ DNA / RNA Extraction Kit manufactured by Intron Biotechnology, Inc. according to the product usage instructions.
실시예 3: 오리엔티아 쯔쯔가무시의 검출Example 3: Detection of Orientia Tsutsugamu
본 발명의 특이 프라이머들 및 이를 이용한 오리엔티아 쯔쯔가무시의 검출 방법의 유효성을 확인하고자 다음과 같은 실험을 수행하였다. 먼저 1차 PCR의 실시를 위해 총 부피 20 μl로 PCR 반응액을 준비하였고, 그 구성 성분은, 실시예 2에서 준비된 DNA 추출액 2 μl (약 50 ng의 DNA), 10 pmol/μl의 서열번호 1 내지 서열번호 2의 각 특이 프라이머들, 모든 PCR 필요 성분이 포함된 PCR 반응액, 및 증류수이다. 상기 구성 성분 중 하나인 PCR 반응액으로는 (주)인트론바이오테크놀로지사의 MaximeTM PCR PreMix (i-StarTaq)를 사용하였으며, 이는 제품의 사용 설명에 따라 사용하였다.In order to confirm the effectiveness of the specific primers of the present invention and the detection method of Orientia Tsutsugamu using the same, the following experiment was performed. First, a PCR reaction solution was prepared with a total volume of 20 μl for the execution of the first PCR, and its components were composed of 2 μl of DNA extract prepared in Example 2 (about 50 ng of DNA) and 10 pmol / μl of SEQ ID NO: 1 To each specific primer of SEQ ID NO: 2, a PCR reaction solution containing all PCR necessary components, and distilled water. As the PCR reaction solution, one of the components, Maxime TM PCR PreMix (i-StarTaq) manufactured by Intron Biotechnology, Inc., was used, which was used according to the instructions for use of the product.
1차 PCR의 첫 번째 단계는 먼저 준비한 PCR 반응액을 94℃에서 5분간 정치하여 PCR에서 주형이 될 DNA를 변성시켰다. 그 후 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 40초로 구성된 PCR 주기를 총 40회 반복시키는 방식으로 1차 PCR 반응을 실시하였다. 40회 반복 후 PCR 반응액은 72℃에서 5분간 더 정치시킴으로 1차 PCR을 종료하였다.In the first step of the first PCR, the prepared PCR reaction solution was left at 94 ° C for 5 minutes to denature the DNA to be a template in PCR. Thereafter, a first PCR reaction was performed in a manner of repeating a total of 40 PCR cycles consisting of 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 58 ° C, and 40 seconds at 72 ° C. After 40 repetitions, the PCR reaction solution was further left at 72 ° C. for 5 minutes to terminate the first PCR.
1차 PCR이 완료되면 1차 PCR 산물을 주형으로 하여 2차 PCR을 수행하였다. 2차 PCR의 실시를 위해 총 부피 20 μl로 반응액을 준비하였고, 그 구성 성분은, 상기 1차 PCR 결과로 생성된 1차 PCR 산물 1 μl, 10 pmol/μl의 서열번호 3 내지 서열번호 4의 각 특이 프라이머들, 모든 PCR 필요 성분이 포함된 PCR 반응액 및 증류수이다. 상기 구성 성분 중 하나인 PCR 반응액으로는 역시 (주)인트론바이오테크놀로지사의 MaximeTM PCR PreMix (i-StarTaq)를 사용하였으며, 이는 제품의 사용 설명에 따라 사용하였다.After the first PCR was completed, the second PCR was performed using the first PCR product as a template. The reaction solution was prepared with a total volume of 20 μl for the execution of the secondary PCR, and the components thereof were 1 μl and 10 pmol / μl of the first PCR product generated as a result of the first PCR. Each of the specific primers, PCR reaction solution containing all the necessary PCR components and distilled water. As the PCR reaction solution, one of the components, Maxime ™ PCR PreMix (i-StarTaq), also manufactured by Intron Biotechnology, Inc., was used according to the instructions for use of the product.
2차 PCR의 첫 번째 단계는 먼저 94℃에서 5분간 정치하여 PCR에서 주형이 될 DNA를 변성시켰다. 그 후 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초로 구성된 PCR 주기를 총 30회 반복시키는 방식으로 2차 PCR 반응을 실시하였다. 30회 반복 후 PCR 반응액은 72℃에서 5분간 더 정치시킴으로 2차 PCR을 종료하였다.In the first step of the second PCR, the DNA was first denatured by standing at 94 ° C for 5 minutes. Thereafter, a secondary PCR reaction was performed in a manner of repeating a total of 30 PCR cycles consisting of 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 58 ° C, and 30 seconds at 72 ° C. After 30 repetitions, the PCR reaction solution was further left at 72 ° C. for 5 minutes to terminate the secondary PCR.
2차 PCR이 완료되면 2차 PCR 반응액을 DNA 염색 시료인 (주)인트론바이오테크놀로지사의 RedSafe Nucleic Acid Staining Solution이 0.1 μg/ml의 농도로 포함된 1.5% 아가로즈 겔에 적하(loading)하여 전기영동을 실시하였다. 전기영동 후 PCR 산물을 분석하여 그 결과를 판독하였다.After the completion of the secondary PCR, the secondary PCR reaction solution was loaded onto a 1.5% agarose gel containing 0.1 μg / ml of RedSafe Nucleic Acid Staining Solution from Intron Biotechnology Co., Ltd. Youngdong was performed. After electrophoresis, PCR products were analyzed and the results were read.
본 발명의 특이 프라이머들(역의 상보서열이 포함된 프라이머)의 효과를 일반적인 프라이머(역의 상보서열을 포함하고 있지 않은 프라이머)와 비교한 결과가 도 3에 제시되어 있다. 도 3의 결과에서 알 수 있듯이 본 발명을 따를 때 면역학적 검사 결과와 일치하는 결과가 도출됨을 확인할 수 있다. 참고로, 면역학적 검사에 비해 훨씬 간편하고 시간이 적게 소요된다는 점을 고려할 때 본 발명의 방법이 면역학적 방법에 비해서도 우수하다고 할 수 있다. 한편, 기존의 일반적인 프라이머를 사용했을 경우에는 양성 시료 중 양성으로 판정하지 못하는 경우가 상당히 많았다. 이로부터 본 발명이 기존 PCR 기반의 검출 방법에 비해서도 우수하다는 점을 확인할 수 있다.The results of comparing the effects of the specific primers (primers with inverse complementary sequences) of the present invention with the general primers (primers without the reverse complementary sequences) are shown in FIG. 3. As can be seen from the results of Figure 3 it can be seen that the results are consistent with the immunological test results when following the present invention. For reference, it may be said that the method of the present invention is superior to the immunological method considering that it is much simpler and less time consuming than the immunological test. On the other hand, in the case of using the existing general primer, there were quite a few cases where it was not determined as positive among the positive samples. From this, it can be seen that the present invention is superior to the conventional PCR-based detection method.
실시예 4: PCR의 민감도 측정Example 4: Measurement of sensitivity of PCR
본 발명에 따른 특이 프라이머들을 이용한 PCR 검출 방법에 있어 오리엔티아 쯔쯔가무시의 검출 민감도(sensitivity)를 조사해 본 결과를 도 4에 제시되어 있다. In the PCR detection method using specific primers according to the present invention, the results of investigating the detection sensitivity of Orientia Tsutsugamu are shown in FIG. 4.
상기 결과에 의하면, 본 발명에 따른 특이 프라이머들을 이용한 PCR 검출 방법은 오리엔티아 쯔쯔가무시의 감염 여부 검출에 활용되기에 충분한 정도의 민감도를 제공해 줄 수 있음을 확인할 수 있다.According to the results, it can be seen that the PCR detection method using the specific primers according to the present invention can provide a sufficient degree of sensitivity to be used to detect the infection of Orientia Tsutsugamu.
실시예 5: PCR의 유효성 측정Example 5: Validation of PCR
본 발명의 유효성을 다양한 오리엔티아 쯔쯔가무시에 대하여 조사해 보았다. 그 결과로서 오리엔티아 쯔쯔가무시 보령형, 오리엔티아 쯔쯔가무시 길리암형, 오리엔티아 쯔쯔가무시 카토형 및 오리엔티아 쯔쯔가무시 카프형에 대해서 본 발명에서 개시한 검출 방법이 모두 잘 작동하는 것을 보여 주는 결과가 도 5에 제시되어 있다.The effectiveness of the present invention was investigated for various Orientia Tsutsugamu. As a result, the results showing that the detection method disclosed in the present invention works well for the Orientia Tsutsugamushi Born type, Orientia Tsutsugamshi Gill type, Orientia Tsutsugamshi Kato type, and Orientia Tsutsugamshi Kato type, are shown in FIG. It is.
또한 본 발명에 따른 특이 프라이머들을 이용한 PCR 검출 방법의 특이도를 조사한 결과, 오리엔티아 쯔쯔가무시와 같은 리케치아속에 해당하는 발진열 및 홍반열을 야기하는 균주에 대해서는 특징적 증폭 산물의 밴드를 확인 할 수 없었으며 그 결과도 도 5에 제시되어 있다. 이로 통하여 본 발명이 오리엔티아 쯔쯔가무시의 감염 여부 확인에 특이적이며, 또한 효과적으로 활용될 수 있음을 확인할 수 있었다. In addition, as a result of examining the specificity of the PCR detection method using the specific primers according to the present invention, the bands of the characteristic amplification products could not be identified for the strains causing rash and erythema fever corresponding to the genus Rickettsia, such as Orientia Tsutsugashishi. The results are also shown in FIG. 5. Through this, it was confirmed that the present invention is specific to the identification of infection of Orientia Tsutsugamu, and can be effectively utilized.
실시예 6: 임상 시료에서의 유효성 확인Example 6: Validation in Clinical Samples
무작위로 선별된 임상시료에 대하여 본 발명에서 개시한 방법을 통해 PCR 증폭 확인한 결과가 도 6에 제시되어 있으며, 도 6에서 양성으로 판단된 시료는 DNA 추출에 사용한 최초의 검체에 대해 실시된 기존 면역학적 방법의 검사에서 모두 양성임이 확인된 시료들이다. 이로써 본 발명이 오리엔티아 쯔쯔가무시의 감염 여부에 대한 임상적 진단법으로 활용 가능함을 알 수 있었다. The results of PCR amplification of the randomly selected clinical sample using the method disclosed in the present invention are shown in FIG. 6, and the sample determined to be positive in FIG. 6 was subjected to conventional immunization against the first sample used for DNA extraction. All of the samples were found to be positive in the laboratory test. As a result, it could be seen that the present invention can be used as a clinical diagnosis method for the infection of Orientia Tsutsugamu.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술 하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Having described the specific part of the present invention in detail, it is apparent to those skilled in the art that such a specific technology is only a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereto. Therefore, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and equivalents thereof.
도 1은 오리엔티아 쯔쯔가무시의 56 kDa의 형 특이적 항원(TSA) 폴리펩티드를 코딩하고 있는 유전자에서 1차 PCR 및 2차 PCR로 증폭되는 부위를 표시한 그림이다. 1 is a diagram showing a site amplified by primary PCR and secondary PCR in a gene encoding a 56 kDa type specific antigen (TSA) polypeptide of Orientia Tsutsugamu.
도 2는 본 발명에 따른 PCR 검출 방법을 이용한 오리엔티아 쯔쯔가무시 검출 과정을 나타내는 순서도이다. Figure 2 is a flow chart showing the orientia Tsutsugamu detection process using the PCR detection method according to the present invention.
도 3은 본 발명에 따른 특이 프라이머들을 이용한 오리엔티아 쯔쯔가무시 검출 방법과 기존 일반적인 프라이머를 사용한 검출 방법을 비교한 결과이다. 참고로 해당 DNA 추출에 사용한 검체에 대한 면역학적 검사 결과도 함께 나타내었다. 면역학적 검사 결과에서 “+”는 양성을, “-”는 음성을 나타낸다. 각 PCR 검출 실험들에서 같은 번호로 표시된 시료는 같은 시료를 나타내며, 면역학적 검사에서 같은 번호로 표시된 시료는 PCR 검출에 사용한 DNA의 추출에 사용한 해당되는 검체에 대한 검사 결과이다. Figure 3 is a result of comparing the detection method using the orientia Tsutsugamu detection method using the specific primers according to the present invention and the existing conventional primers. For reference, the results of immunological tests on the samples used for DNA extraction are also shown. In the immunological test results, "+" is positive and "-" is negative. Samples with the same number in each PCR detection experiment represent the same sample, and the sample with the same number in the immunological test is the test result of the corresponding sample used for extraction of the DNA used for PCR detection.
도 4는 본 발명에 따른 특이 프라이머들을 이용한 오리엔티아 쯔쯔가무시에 대한 검출 민감도를 조사한 전기영동 사진이다. 레인 M은 DNA 크기 마커, 레인 N은 음성 기준이다. 레인 윗 부분에 표시된 1ng, 100pg, 10pg, 1pg, 100fg, 10fg, 및 1fg은 각각의 PCR 반응에 사용된 오리엔티아 쯔쯔가무시로부터 추출된 DNA 농도를 나타낸다. Figure 4 is an electrophoresis picture of the detection sensitivity for Orientia Tsutsugamu using specific primers according to the present invention. Lane M is a DNA size marker and lane N is a negative reference. 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg, and 1 fg shown in the upper portion of the lanes represent the DNA concentrations extracted from Orientia Tsutsugamu used in each PCR reaction.
도 5는 본 발명 대한 유효성 및 특이도를 조사해 본 결과로서, 인수공통 병원성 리케치아속 내 원인균과의 교차반응 여부를 확인한 결과이다. 레인 M은 DNA 크기 마커, 레인 “1”은 오리엔티아 쯔쯔가무시 보령주, 레인 “2”는 오리엔티아 쯔쯔가무시 길리암주, 레인 “3”은 오리엔티아 쯔쯔가무시 카토주, 레인 “4”는 오리엔티아 쯔쯔가무시 카프주 에 대한 결과이며, 레인 5~7 은 홍반열의 원인균으로서 레인“5”는 리케치아 자포니카, 레인 “6”은 리케치아 시빈카 , 레인 “7”은 리케치아 아카리이며, 레인 “8”은 발진열의 원인균인 리케치아 타이피, 레인 N은 음성 기준이며, 레인 P는 양성 기준으로서 기존 면역학적 방법에서 양성으로 확인된 검체로부터 추출된 DNA를 이용한 PCR 결과이다.5 is a result of examining the effectiveness and specificity of the present invention, it is a result confirming the cross-reaction with the causative bacteria in the common pathogenic rickettsia genus. Lane M is DNA size marker, lane "1" is Orientia Tsutsugamu Boryeong, lane "2" is Orientia Tsutsugamu Giliam, lane "3" is Orientia Tsutsugamu Kato, lane "4" is Orientia
도 6은 본 발명을 임의 선택된 임상시료에 대하여 실시한 결과이다. 레인 M은 DNA 크기 마커이며, 레인 N은 음성 기준을 나타내고, 레인의 각 숫자는 임상시료에 임의로 부여된 임상시료 번호이다.Figure 6 shows the results of the present invention for any selected clinical sample. Lane M is a DNA size marker, lane N represents a negative criterion, and each number in the lane is a clinical sample number randomly assigned to the clinical sample.
<110> iNtRON Biotechnology, Co., Ltd. <120> Detection method of Orientina thstsugamushi using high Orientina thstsugamushi-specific primers with specific structure of a reverse complementary sequence <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1st forward primer <400> 1 gcaatattgc tagtgcaatg tctgc 25 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1st reverse primer <400> 2 atgcatgcat grcgctkcaa ttta 24 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2nd forward primer <400> 3 ataggcctat aagtatwgck gatcg 25 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2nd reverse primer <400> 4 catctagayg cactattagg caaa 24 <110> iNtRON Biotechnology, Co., Ltd. <120> Detection method of Orientina thstsugamushi using high Orientina thstsugamushi-specific primers with specific structure of a reverse complementary sequence <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1st forward primer <400> 1 gcaatattgc tagtgcaatg tctgc 25 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1st reverse primer <400> 2 atgcatgcat grcgctkcaa ttta 24 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2nd forward primer <400> 3 ataggcctat aagtatwgck gatcg 25 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2nd reverse primer <400> 4 catctagayg cactattagg caaa 24
Claims (5)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020090086235A KR101111621B1 (en) | 2009-09-14 | 2009-09-14 | Detection method of Orientina tsutsugamushi using high Orientina tsutsugamushi specific primers with specific structure of a reverse complementary sequence |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020090086235A KR101111621B1 (en) | 2009-09-14 | 2009-09-14 | Detection method of Orientina tsutsugamushi using high Orientina tsutsugamushi specific primers with specific structure of a reverse complementary sequence |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20110028689A KR20110028689A (en) | 2011-03-22 |
KR101111621B1 true KR101111621B1 (en) | 2012-02-14 |
Family
ID=43934778
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020090086235A KR101111621B1 (en) | 2009-09-14 | 2009-09-14 | Detection method of Orientina tsutsugamushi using high Orientina tsutsugamushi specific primers with specific structure of a reverse complementary sequence |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR101111621B1 (en) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101809136B1 (en) * | 2015-12-30 | 2017-12-15 | 인하대학교 산학협력단 | Method for Determing Scrub Typhus Using measurement Interferon-Gamma Secretion of Peripheral Blood Mononuclear Cells |
KR102026553B1 (en) * | 2018-01-08 | 2019-09-27 | 조선대학교산학협력단 | Diagnosis method of Tsutsugamushi disease using multicopy genes |
-
2009
- 2009-09-14 KR KR1020090086235A patent/KR101111621B1/en active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Am. J. Trop. Med. Hyg., 72(5), pp. 640–641 (2005) |
Journal of Medical Entomology, 38(2), pp. 308-311 (2001) |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20110028689A (en) | 2011-03-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Elfaki1ABCDEF et al. | Evaluation of culture, tube agglutination, and PCR methods for the diagnosis of brucellosis in humans | |
JP3194942B2 (en) | Nucleic acid probe for detection of Lyme disease spirochetes | |
Adékambi et al. | Description of Mycobacterium conceptionense sp. nov., a Mycobacterium fortuitum group organism isolated from a posttraumatic osteitis inflammation | |
RU2625006C1 (en) | Method for target amplification of human reproductive organs infectors genomes for simultaneous identification of infectors with primer set | |
JP2022547023A (en) | Systems, methods, and compositions for rapid early detection of host RNA biomarkers of infection and early identification of COVID-19 coronavirus infection in humans. | |
US7989170B2 (en) | Method for the detection of bacterial species of the genera anaplasma/ehrlichia and bartonella | |
US20110287965A1 (en) | Methods and compositions to detect clostridium difficile | |
Debruyne et al. | Comparative performance of different PCR assays for the identification of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli | |
FI118690B (en) | Diagnostic procedure and products useful therein | |
JP5750369B2 (en) | Rapid detection of mycobacteria | |
KR101111621B1 (en) | Detection method of Orientina tsutsugamushi using high Orientina tsutsugamushi specific primers with specific structure of a reverse complementary sequence | |
Velasco et al. | Lack of correlation between phenotypic techniques and PCR-based genotypic methods for identification of Enterococcus spp. | |
JP2012531908A (en) | Methods and / or primers for detecting Mycobacterium tuberculosis | |
EP0739987A2 (en) | Oligonucleotides for detecting Salmonella species and detection process using the same | |
KR101765677B1 (en) | Primer set for detection of mycobacterium tuberculosis and non-Tuberculosis mycobacteria and use thereof | |
CN103080312A (en) | Primer pairs for detecting orientia tsutsugamushi and detection method using the same | |
KR101395938B1 (en) | Pcr diagnosis using specific primer for bacteria that cause diseases of allomyrina dichotoma | |
US20030165870A1 (en) | Novel sequences of E. coli CFT073 | |
KR101886520B1 (en) | Method for diagnosing latent infection phase of Johne's Disease | |
WO2008140832A2 (en) | Method for rapid detection of clostridium botulinum | |
JPH07163400A (en) | Dna variation arrangement for detecting subgroup of b. burgdorferi using reproduced chain reaction | |
JP4664516B2 (en) | Detection method of Mycoplasma genitalium | |
KR20190084476A (en) | Diagnosis method of Tsutsugamushi disease using multicopy genes | |
KR102612101B1 (en) | Primer set for detecting Rhodococcus fascians | |
US9944995B2 (en) | Diagnostic methods for detecting Clostridium difficile |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A201 | Request for examination | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant | ||
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20150102 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20160104 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20170106 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20180126 Year of fee payment: 7 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190128 Year of fee payment: 8 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20200128 Year of fee payment: 9 |