KR101108524B1 - Diamond electrode for glucose biosensor and method for preparing the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 고감도 글루코오스 바이오센서용 다이아몬드 전극 및 상기 다이아몬드 전극의 제조 방법, 상기 다이아몬드 전극을 포함하는 글루코오스 바이오센서에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 표면에 전도성 고분자의 나노와이어(nanowire)가 코팅되어 있으며, 상기 나노와이어에 효소가 고정되어 있는 다이아몬드 전극을 이용하여, 감응 속도가 빠르고, 저농도의 글루코오스까지 검출이 가능한 고감도 글루코오스 바이오센서를 제공할 수 있다. The present invention relates to a diamond electrode for a high sensitivity glucose biosensor, a method for manufacturing the diamond electrode, a glucose biosensor including the diamond electrode, and more specifically, a nanowire of a conductive polymer is coated on a surface thereof. By using a diamond electrode in which an enzyme is immobilized on the nanowire, a high sensitivity glucose biosensor capable of detecting a fast glucose and detecting a low concentration of glucose can be provided.
Description
본 발명은 글루코오스 바이오센서용 다이아몬드 전극 및 그 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 작업 전극의 감도를 개선하여 매우 낮은 농도의 글루코오스까지 검출이 가능한 고감도 글루코오스 바이오센서용 다이아몬드 전극 및 그 제조 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a diamond electrode for glucose biosensors and a method for manufacturing the same, and more particularly, to a diamond electrode for glucose biosensors capable of detecting even a very low concentration of glucose by improving the sensitivity of the working electrode and a method for manufacturing the same. will be.
국내 바이오센서 중 90% 이상이 의료용 바이오센서로 혈당측정용이 대부분을 차지하고 있으며, 이러한 혈당 바이오센서의 국내 시장은 약 400억 원에 이르고, 당뇨환자 수가 매년 늘어남에 따라 시장 규모도 지속 확대될 것으로 예측되고 있다.More than 90% of the domestic biosensors are medical biosensors, and most of them are blood glucose measurement.The domestic market of these blood glucose biosensors reaches about 40 billion won, and the market size is expected to continue to expand as the number of diabetics increases every year. It is becoming.
바이오센서는 특정 물질을 그와 반응할 수 있는 물질을 전극 표면에 고정화하여 이를 전기적 신호로 바꿔 그의 성분이나 정량 분석하는 시스템이다. 이러한 바이오센서에 있어서, 전극 표면에 고정화되는 반응 관련 물질의 양은 바이오센서의 감도에 영향을 미치는 중요한 요인들 중 하나이다. 그러나 최근 들어 바이오센서가 점차 소형화되어짐에 따라 특정 물질과 반응할 수 있는 물질들을 고정화할 수 있는 면적도 작아지면서 고감도의 소형화 센서 개발의 심각한 한계가 나타나고 있다. A biosensor is a system that immobilizes a substance that can react with a specific substance on the surface of an electrode and converts it into an electrical signal to quantitatively analyze its components. In such biosensors, the amount of reaction-related substances immobilized on the electrode surface is one of the important factors affecting the sensitivity of the biosensor. However, in recent years, as the biosensor becomes smaller in size, the area for fixing the materials that can react with a specific substance is also reduced, and serious limitations of the development of a highly sensitive miniaturized sensor are appearing.
또한 기존의 바이오센서는 전극 표면 처리를 통한 감도 향상에 중점을 두고 개발되어 왔다. 그러나, 암과 같이 질환들 중에는 단분자 물질까지도 검출이 불가피한 경우도 있다. 따라서, 다양한 질병에 대한 정확한 진단을 위해서는 고감도 못지않게 미량의 농도 검출과 재현성도 센서 개발에 있어 중요한 요소들이다. 따라서 본 발명에서는 고감도의 저농도 물질까지 검출이 가능하면서 재현성도 우수한 센서를 개발하였다. In addition, existing biosensors have been developed with an emphasis on sensitivity enhancement through electrode surface treatment. However, in some diseases such as cancer, even a single molecule substance is unavoidable. Therefore, for the accurate diagnosis of various diseases, the detection of trace concentrations and reproducibility, as well as high sensitivity, are important factors in the development of the sensor. Therefore, in the present invention, a sensor capable of detecting even a low concentration of high sensitivity and having excellent reproducibility has been developed.
한편 전극 표면에 고정화되는 바이오물질의 양은 바이오센서의 감도에 영향을 미치는 중요한 요인들 중에 하나이기 때문에 이런 물질들을 고정화할 수 있는 유효면적 또한 고감도 센서 개발에 중요한 인자이다. On the other hand, since the amount of biomaterials immobilized on the electrode surface is one of the important factors affecting the sensitivity of the biosensor, the effective area to immobilize these materials is also an important factor in the development of high sensitivity sensors.
이런 한계를 극복하기 위해, 나노 기술을 접목한 센서들이 개발되고 있는데, 이런 센서들 중 하나가 나노와이어를 이용한 것이다. 그러나 기존의 나노와이어들은 대부분 반도체를 이용한 것으로 고온, 고압 하에서 고가의 장비를 이용하여 합성되어야 하며, 이와 같은 반도체 나노와이어들의 대부분은 다공성의 멤브레인을 사용하지 않고서는 기판 위에서 수직으로 직접 합성하는 것이 쉽지 않다는 단점이 있었다. 반면 기존의 전도성 고분자를 이용한 바이오센서는 박막 구조가 많았으며, 이는 흡착을 이용하여 바이오 물질을 고정화함으로써 이들의 배향성 문제가 있었다. 또한 이들을 이용한 나노와이어 바이오센서는 반도체 나노와이어에 비하여 합성은 쉽지만 감도가 좋지 않은 문제점을 갖고 있었다.To overcome this limitation, sensors are being developed that incorporate nanotechnology, one of which uses nanowires. However, the existing nanowires are mostly made of semiconductors and must be synthesized by using expensive equipment under high temperature and high pressure. Most of these semiconductor nanowires are easy to synthesize directly on a substrate without using a porous membrane. There was a downside. On the other hand, conventional biosensors using conductive polymers had many thin film structures, which had problems of orientation due to immobilization of biomaterials using adsorption. In addition, compared to semiconductor nanowires, nanowire biosensors using these compounds have a problem in that they are easy to synthesize but have poor sensitivity.
국내특허공개번호 제2000-8880호에는 고분자 음이온(AMPS)과 글루코스 옥시다아제(GOD)를 접합시킨 단백질 복합체를 전도성 고분자의 도펀트로 이용한 글루코오스 센서가 개시되어 있다. 종래의 글루코스 센서 제조에 사용된 단백질 고정화 방법의 문제점을 해결하기 위해, 상기 센서는 박막 전극 위에 고분자 박막 구조를 도핑한 형태의 센서 시스템을 구현하였다. Korean Patent Publication No. 2000-8880 discloses a glucose sensor using a protein complex conjugated with a polymer anion (AMPS) and glucose oxidase (GOD) as a dopant of a conductive polymer. In order to solve the problem of the protein immobilization method used in the conventional glucose sensor, the sensor implemented a sensor system of a type doped with a polymer thin film structure on the thin film electrode.
또한 국내공개특허 제2005-104171호에는 Ag/AgCl 전극을 이용하여 글루코오스를 정량적으로 측정하는 방법이 개시되어 있으며, 국내공개특허 2004-26323호에는 중기공성 백금을 포함하는 바이오센서 및 이를 이용한 글루코오스 농도 측정방법이 개시되어 있다. In addition, Korean Patent Publication No. 2005-104171 discloses a method for quantitatively measuring glucose by using an Ag / AgCl electrode, and Korean Patent Publication No. 2004-26323 discloses a biosensor comprising a medium-porous platinum and a glucose concentration using the same. A measuring method is disclosed.
그러나 상기 선행 발명들은 바이오센서에 효소를 고정화시킬 수 있는 전극 면적이 작아서 소형화가 어려울 뿐만 아니라 효소들의 배향성이 좋지 않기 때문에 전류의 흐름이 원활하지 않은 문제점이 있었다. However, the preceding inventions have a problem in that the current flow is not smooth because the electrode area for fixing the enzyme to the biosensor is small and it is difficult to miniaturize and the orientation of the enzymes is not good.
따라서 본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는 감응 속도가 빠르고, 저농도의 글루코오스까지 검출이 가능한 고감도의 글루코오스 바이오센서용 다이아몬드 전극을 제공하는 데 있다. Therefore, the first problem to be solved by the present invention is to provide a diamond electrode for glucose biosensor of high sensitivity capable of detecting a high sensitivity of glucose, even a low concentration of glucose.
본 발명이 해결하고자 하는 두 번째 과제는 상기 다이아몬드 전극의 제조 방법을 제공하는데 있다. The second object of the present invention is to provide a method for producing the diamond electrode.
본 발명이 해결하고자 하는 세 번째 과제는 상기 다이아몬드 전극을 포함하는 글루코오스 바이오센서를 제공하는 데 있다. The third object of the present invention is to provide a glucose biosensor comprising the diamond electrode.
상기 첫 번째 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 표면에 전도성 고분자로 이루어진 나노와이어(nanowire)가 형성되어 있으며, 상기 나노와이어에 효소가 고정되어 있는 글루코오스 바이오센서용 다이아몬드 전극을 제공한다.In order to solve the first problem, the present invention provides a diamond electrode for a glucose biosensor, wherein a nanowire (nanowire) made of a conductive polymer is formed on a surface thereof, and an enzyme is immobilized on the nanowire.
본 발명의 일실시예에 의하면, 상기 다이아몬드 전극은 보론이 도핑된 다이아몬드 전극인 것이 바람직하다. According to one embodiment of the invention, the diamond electrode is preferably a boron doped diamond electrode.
또한 본 발명의 다른 일실시예에 의하면, 상기 전도성 고분자는 상기 폴리아세틸렌(polyacetylene), 폴리아닐린(polyaniline), 폴리피롤(polypyrrole), 폴리티오펜(polythiophene), 폴리설퍼나이트라이드(poly sulfur nitride)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 이 중에서 폴리아닐린이 더욱 바람직하다. In addition, according to another embodiment of the present invention, the conductive polymer is composed of the polyacetylene (polyacetylene), polyaniline (polyaniline), polypyrrole (polypyrrole), polythiophene (polythiophene), poly sulfur nitride (poly sulfur nitride) It may be selected from the group, of which polyaniline is more preferred.
또한 본 발명의 다른 일실시예에 의하면, 상기 효소는 글루코오스 옥시다아 제인 것이 일반적이다. In addition, according to another embodiment of the present invention, the enzyme is generally glucose oxidase.
또한 본 발명의 또 다른 일실시예에 의하면, 상기 전도성 고분자의 나노와이어에는 백금(Pt) 나노입자가 분산되어 있는 것이 바람직하며, 백금(Pt) 나노입자의 크기는 30- 50 nm 범위인 것이 더욱 바람직하다. According to another embodiment of the present invention, it is preferable that platinum (Pt) nanoparticles are dispersed in the nanowires of the conductive polymer, and the size of the platinum (Pt) nanoparticles is in the range of 30-50 nm. desirable.
상기 두 번째 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 실리콘 기재 표면에 보론 도핑된 나노다이아몬드 박막을 형성하는 단계; 상기 나노다이아몬드 박막 상에 전도성 고분자의 나노와이어를 형성하는 단계; 상기 전도성 고분자의 나노와이어에 백금(Pt) 나노 입자를 분산시키는 단계: 및 상기 나노와이어와 효소를 결합시켜 고정하는 단계를 포함하는 글루코오스 바이오센서용 다이아몬드 전극의 제조 방법을 제공한다.In order to solve the second problem, the present invention comprises the steps of forming a boron doped nanodiamond thin film on the surface of the silicon substrate; Forming nanowires of a conductive polymer on the nanodiamond thin film; Dispersing platinum (Pt) nanoparticles on the nanowires of the conductive polymer: and provides a method for producing a diamond electrode for glucose biosensor comprising the step of fixing by bonding the nanowires and enzyme.
또한 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 보론 도핑된 다이아몬드 박막을 형성하는 단계는 a) 나노다이아몬드 입자 표면의 정전하와 반대되는 극성을 갖는 음이온성 고분자로 코팅하는 단계; b) 실리콘 기판을 상기 입자에 코팅된 고분자와 반대되는 극성을 갖는 양이온성 고분자로 표면처리하는 단계; c) 상기 음이온성 고분자로 코팅된 나노입자가 분산된 용액에 상기 양이온성 고분자로 표면처리된 기판을 침지시키는 단계; 및 d) 상기 기판에 화학기상증착법을 이용하여 보론 도핑된 다이아몬드 박막을 성장시키는 단계를 포함할 수 있다. 이때, 상기 a) 단계의 음이온성 고분자는 폴리소듐 4-스타이렌설포네이트인 것이 바람직하고, 상기 b) 단계의 양이온성 고분자는 폴리디알릴디메틸 암모늄 클로라이드인 것이 바람직하다. According to an embodiment of the present invention, the step of forming the boron-doped diamond thin film comprises the steps of: a) coating with an anionic polymer having a polarity opposite to the electrostatic charge on the surface of the nanodiamond particles; b) surface treating the silicon substrate with a cationic polymer having a polarity opposite to the polymer coated on the particles; c) immersing the substrate surface-treated with the cationic polymer in a solution in which the nanoparticles coated with the anionic polymer are dispersed; And d) growing a boron doped diamond thin film on the substrate using chemical vapor deposition. At this time, the anionic polymer of step a) is preferably polysodium 4-styrenesulfonate, and the cationic polymer of step b) is preferably polydiallyldimethyl ammonium chloride.
상기 세 번째 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 기준 전극, 상대 전극 및 작업 전극을 포함하는 글루코오스 바이오센서에 있어서, 상기 작업 전극은 표면에 전도성 고분자로 이루어진 나노와이어가 형성되어 있으며, 상기 나노와이어에 효소가 고정되어 있는 보론-도핑된 다이아몬드 전극인 것을 특징으로 하는 글루코오스 바이오센서를 제공한다. In order to solve the third problem, the present invention is a glucose biosensor comprising a reference electrode, a counter electrode and a working electrode, the working electrode is formed on the surface of the nanowire made of a conductive polymer, the nanowire It provides a glucose biosensor characterized in that the enzyme is a boron-doped diamond electrode is immobilized.
본 발명의 일실시예에 의하면, 상기 기준 전극은 Ag/AgCl 전극인 것이 바람직하고, 상기 상대 전극은 백금 전극인 것이 바람직하다. According to an embodiment of the present invention, the reference electrode is preferably an Ag / AgCl electrode, and the counter electrode is preferably a platinum electrode.
본 발명에 따른 글루코오스 바이오센서용 다이아몬드 전극은 실리콘 기재의 작업 전극상에 보론이 도핑된 다이아몬드 박막을 증착시키고, 백금이 분산된 전도성 고분자의 나노와이어를 다이아몬드 박막상에 도입함으로써, 글루코오스의 농도가 0.102 μM 정도의 매우 낮은 농도인 경우에도 검출이 가능한 고감도의 전기화학적 바이오센서를 제공할 수 있다. The diamond electrode for glucose biosensor according to the present invention deposits a boron-doped diamond thin film on a silicon-based working electrode, and introduces a nanowire of a conductive polymer in which platinum is dispersed on the diamond thin film, so that the concentration of glucose is 0.102. It is possible to provide a highly sensitive electrochemical biosensor that can be detected even at very low concentrations, such as μM.
본 발명은 빠른 감응시간을 갖는 초고감도 바이오센서에 관한 것으로서, 나노테크놀로지와 바이오테크놀로지를 접목시킨 기술이다. The present invention relates to an ultra-high sensitivity biosensor having a fast response time, and is a technology in which nanotechnology and biotechnology are combined.
본 발명의 실시예에 따른 글루코오스 바이오센서용 다이아몬드 전극은 표면에 전도성 고분자로 이루어진 나노와이어가 형성되어 있으며, 상기 나노와이어에 효소가 고정되어 있는 것이 특징이다. 이때, 상기 다이아몬드 전극은 보론이 도핑된 다이아몬드 전극인 것이 바람직하다. Diamond electrode for glucose biosensor according to an embodiment of the present invention is a nanowire made of a conductive polymer on the surface, characterized in that the enzyme is fixed to the nanowire. In this case, the diamond electrode is preferably a diamond electrode doped with boron.
또한 본 발명의 다른 일실시예에 의하면, 상기 전도성 고분자는 상기 폴리아세틸렌, 폴리아닐린, 폴리피롤, 폴리티오펜, 폴리설퍼나이트라이드로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 이때 폴리아닐린을 사용하는 것이 바람직하다. In addition, according to another embodiment of the present invention, the conductive polymer may be selected from the group consisting of the polyacetylene, polyaniline, polypyrrole, polythiophene, polysulfuritride, it is preferable to use polyaniline.
또한 본 발명의 다른 일실시예에 의하면, 상기 효소는 글루코오스 옥시다아제인 것이 바람직하다. In addition, according to another embodiment of the present invention, the enzyme is preferably glucose oxidase.
또한 본 발명의 또 다른 일실시예에 의하면, 상기 전도성 고분자의 나노와이어에는 백금(Pt) 나노입자가 분산되어 있는 것이 바람직하며, 백금(Pt) 나노입자의 크기는 30 - 50 nm 범위인 것이 더욱 바람직하다. According to another embodiment of the present invention, it is preferable that platinum (Pt) nanoparticles are dispersed in the nanowires of the conductive polymer, and the size of the platinum (Pt) nanoparticles is in the range of 30-50 nm. desirable.
한편 본 발명의 일실시예에 따라 글루코오스 바이오센서용 다이아몬드 전극을 제조하는 방법은 실리콘 기재 표면에 보론 도핑된 나노다이아몬드 박막을 형성하는 단계; 상기 나노다이아몬드 박막 상에 전도성 고분자의 나노와이어를 형성하는 단계; 상기 전도성 고분자의 나노와이어에 백금(Pt) 나노 입자를 분산시키는 단계: 및 상기 나노와이어와 효소를 결합시켜 고정하는 단계를 포함할 수 있다.Meanwhile, a method of manufacturing a diamond electrode for a glucose biosensor according to an embodiment of the present invention includes forming a boron-doped nanodiamond thin film on a silicon substrate surface; Forming nanowires of a conductive polymer on the nanodiamond thin film; Dispersing platinum (Pt) nanoparticles on the nanowires of the conductive polymer: and binding and fixing the nanowires with an enzyme.
이때, 상기 보론 도핑된 다이아몬드 박막을 형성하는 단계는 a) 나노다이아몬드 입자 표면의 정전하와 반대되는 극성을 갖는 음이온성 고분자로 코팅하는 단계; b) 실리콘 기판을 상기 입자에 코팅된 고분자와 반대되는 극성을 갖는 양이온성 고분자로 표면처리하는 단계; c) 상기 음이온성 고분자로 코팅된 나노입자가 분산된 용액에 상기 양이온성 고분자로 표면처리된 기판을 침지시키는 단계; 및 d) 상기 기판에 화학기상증착법을 이용하여 보론 도핑된 다이아몬드 박막을 성장시키는 단계를 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 a) 단계의 음이온성 고분자는 폴 리소듐 4-스타이렌설포네이트인 것이 바람직하고, 상기 b) 단계의 양이온성 고분자는 폴리디알릴디메틸 암모늄 클로라이드인 것이 바람직하다. In this case, the forming of the boron-doped diamond thin film comprises the steps of: a) coating with an anionic polymer having a polarity opposite to the electrostatic charge on the surface of the nanodiamond particles; b) surface treating the silicon substrate with a cationic polymer having a polarity opposite to the polymer coated on the particles; c) immersing the substrate surface-treated with the cationic polymer in a solution in which the nanoparticles coated with the anionic polymer are dispersed; And d) growing a boron doped diamond thin film on the substrate using chemical vapor deposition. In addition, the anionic polymer of step a) is preferably polysodium 4-styrenesulfonate, and the cationic polymer of step b) is preferably polydiallyldimethyl ammonium chloride.
본 발명은 또한 기준 전극, 상대 전극 및 작업 전극을 포함하는 글루코오스 바이오센서에 있어서, 상기 작업 전극은 표면에 전도성 고분자로 이루어진 나노와이어가 형성되어 있으며, 상기 나노와이어에 효소가 고정되어 있는 보론-도핑된 다이아몬드 전극인 것을 특징으로 하는 글루코오스 바이오센서를 제공한다. 본 발명의 일실시예에 의하면, 상기 기준 전극은 Ag/AgCl 전극인 것이 바람직하고, 상기 상대 전극은 백금 전극인 것이 바람직하다. The present invention also provides a glucose biosensor comprising a reference electrode, a counter electrode, and a working electrode, wherein the working electrode has nanowires made of a conductive polymer on its surface, and boron-doped with an enzyme immobilized on the nanowires. It provides a glucose biosensor characterized in that the diamond electrode. According to an embodiment of the present invention, the reference electrode is preferably an Ag / AgCl electrode, and the counter electrode is preferably a platinum electrode.
다이아몬드는 생체 적합성 뿐 아니라, 화학 안정성, 열 전도성, 견고성, 광학적 특성이 우수하다. 그러나 다이아몬드 자체는 전기적 전류 전도가 안 되는 절연체이기 때문에, 보론을 가지고 도핑함으로써 반도체의 특성을 보이도록 하였다. 이와 같은 다이아몬드 전극의 기판은 높은 시그널-노이즈 비와 오랜 안정성, 높은 감도, 좋은 재현성 때문에, 기존 금이나 백금 등의 전극을 사용하였을 때보다 더 낮은 농도까지 검출이 가능하다. In addition to biocompatibility, diamond has excellent chemical stability, thermal conductivity, robustness and optical properties. However, since diamond itself is an insulator that does not conduct electric current, it is doped with boron to show the characteristics of the semiconductor. The substrate of such a diamond electrode can detect a lower concentration than using an electrode such as gold or platinum because of its high signal-to-noise ratio, long-term stability, high sensitivity, and good reproducibility.
그러나 보론이 도핑된 다이아몬드 박막은 소수성을 띄므로, 친수성의 생체물질과 결합이 쉽지 않아 그에 따른 표면처리 기술이 요구된다. 또한 본 발명에서는 다이아몬드 박막 표면 처리와 전극면적을 개선하기 위하여 나노 구조의 전도성 고분자를 도입하였다. 또 전도성 고분자 위에 백금 나노입자들을 분산시킴으로써 화학반응에 의해 생성된 전자 전달의 매개체 역할을 하였다. 이렇게 준비되어진 전극 위에 흡착 방법을 이용하여 바이오물질인 효소를 고정화함으로써 빠른 감응 속도와 저농도까지 감지할 수 있는 고감도의 바이오센서를 개발하였다. However, since the boron-doped diamond thin film is hydrophobic, it cannot be easily combined with hydrophilic biomaterials, and thus requires surface treatment technology. In addition, in the present invention, a nanostructured conductive polymer was introduced to improve the diamond film surface treatment and the electrode area. In addition, by dispersing platinum nanoparticles on conductive polymers, it acts as a medium for electron transfer generated by chemical reactions. By using the adsorption method on the electrode thus prepared, the enzyme, which is a biomaterial, was immobilized to develop a high sensitivity biosensor capable of detecting a fast response speed and low concentration.
구체적으로 본 발명에서는 고감도의 저농도까지 검출이 가능한 센서를 개발하기 위하여 보론이 도핑된 다이아몬드 박막을 도입하였다. 또한, 보론이 도핑된 다이아몬드 박막은 소수성을 띄므로, 친수성의 생체물질과 결합이 쉽지 않아 대부분 표면 기능화를 주로 연구하고 적용하고 있다. 이 방법은 화학물질을 이용하는 방법으로 복잡하고 제한적이며 처리 시간이 길다. 따라서 본 발명은 극성/비극성 고분자 코팅 방법을 이용한 표면처리 기술을 적용하여 간단한 방법으로 이 문제를 해결하였다. Specifically, the present invention introduced a boron-doped diamond thin film in order to develop a sensor capable of detecting high sensitivity and low concentration. In addition, since the boron-doped diamond thin film is hydrophobic, it is difficult to bind with hydrophilic biomaterials, and most of the surface functionalization is mainly studied and applied. This method uses chemicals, which is complex, limited and has a long processing time. Therefore, the present invention solves this problem by a simple method by applying a surface treatment technology using a polar / non-polar polymer coating method.
또한 본 발명은 빠른 감응시간을 가지며, 저농도의 글루코오즈까지 검출할 수 있는 고감도의 전기화학적 바이오센서를 제공하기 위하여, 실리콘 기판 상에 전기화학적 방법을 이용하여 전도성 고분자로 나노와이어를 합성하여 그 면적을 극대화시킴으로써, 전극의 유효 표면적을 증가시킬 수 있었다. 본 발명에서는 전도성 고분자 나노와이어를 상온, 상압에서의 전기화학적 방법을 이용하여 다이아몬드 박막 위에 직접 합성하였으며, 감도 향상을 위해 이에 금속 나노입자, 바람직하게는 백금 입자를 분산시켜 화학반응에 의해 생성된 전자 전달의 매개체 역할을 하도록 했다. 일반적으로 금속막 자체는 쉽게 바이오물질들을 변이시켜 그의 활성을 저하시킨다고 알려져 있지만, 금속 나노입자에서는 쉽게 흡착된 바이오물질의 변성이 일어나지 않는다. In addition, the present invention has a fast response time, in order to provide a high-sensitivity electrochemical biosensor that can detect even low concentration of glucose, by using an electrochemical method on a silicon substrate by synthesizing the nanowires with a conductive polymer, the area By maximizing, the effective surface area of the electrode could be increased. In the present invention, the conductive polymer nanowires were synthesized directly on the diamond thin film using an electrochemical method at room temperature and atmospheric pressure, and electrons generated by chemical reaction by dispersing metal nanoparticles, preferably platinum particles, in order to improve sensitivity. It acts as a mediator of delivery. In general, the metal film itself is known to easily change the biomaterials to reduce their activity, but the metal nanoparticles do not denature the easily adsorbed biomaterial.
또한 본 발명은 이렇게 준비된 백금 입자 표면에 많은 양의 바이오물질인 효소를 고정화함으로써 바이오물질인 효소를 고정함으로써 빠른 감응 시간과 저농도까지 감지할 수 있는 고감도의 바이오센서를 구현할 수 있었다. In addition, the present invention was able to implement a high-sensitivity biosensor capable of detecting a fast response time and low concentration by fixing the enzyme as a biomaterial by immobilizing a large amount of biomaterial enzyme on the surface of the platinum particles thus prepared.
도 1은 본 발명에 따른 바이오센서의 구조도이다. 도면에 표시된 바와 같이, 좌측 전극이 작업 전극이며, 실리콘 기재에 다이아몬드 박막을 증착한 후 전도성 고분자 나노와이어을 형성하고, 그 위에 백금 나노입자를 분산시켰다. 한편 가운데 전극은 Ag/AgCl의 기준 전극이고 우측 전극은 백금(Pt) 상대전극을 나타낸다. 1 is a structural diagram of a biosensor according to the present invention. As shown in the figure, the left electrode is the working electrode, after depositing a diamond thin film on a silicon substrate to form conductive polymer nanowires, and the platinum nanoparticles were dispersed thereon. Meanwhile, the center electrode is a reference electrode of Ag / AgCl, and the right electrode represents a platinum (Pt) counter electrode.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이에 의해 제한되는 것은 아니다. 하기 실험에서, 모든 전류의 측정은 3개의 전극 셀이 연결된 auto-lab microAUTOBIII(Eco Chemie, 네덜란드)로 측정되었다. 본 발명의 일실시예에 따른 바이오센서의 전극은 백금(Pt) 상대전극, Ag/AgCl 기준전극 및 보론 도핑된 나노다이아몬드 작업 전극으로 구성된다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to preferred examples, but the present invention is not limited thereto. In the following experiments, all currents were measured with an auto-lab microAUTOBIII (Eco Chemie, The Netherlands) connected with three electrode cells. The electrode of the biosensor according to the embodiment of the present invention is composed of a platinum (Pt) counter electrode, an Ag / AgCl reference electrode, and a boron-doped nanodiamond working electrode.
실시예 1: 다이아몬드 전극의 제조Example 1 Preparation of Diamond Electrode
1 μm 두께의 열산화된 실리콘을 기재로 사용하여 나노다이아몬드를 합성했다. 먼저 나노다이아몬드 입자와 폴리소듐 4-스타이렌설포네이트(PSS; MW 70,000) 10% 수용액을 Attrition mill을 이용하여 5시간 동안 1000 rpm으로 혼합했다. 밀링 공정 후에, 양이온성 나노다이아몬드 입자는 음이온성 폴리소듐 4-스타이렌설포네이트로 코팅되었다. Nanodiamonds were synthesized using 1 μm thick thermally oxidized silicon as a substrate. First, nanodiamond particles and a 10% aqueous solution of polysodium 4-styrenesulfonate (PSS; MW 70,000) were mixed at 1000 rpm for 5 hours using an Attrition mill. After the milling process, the cationic nanodiamond particles were coated with anionic polysodium 4-styrenesulfonate.
한편 10 부피% 폴리디아릴디메틸 암모늄 클로라이드 수용액에 실리콘 기재를 30분 동안 담갔다가, 탈이온수로 기재를 세척함으로써 열산화된 실리콘 웨이퍼(산화물 두께: 1 μm)를 양이온 고분자로 코팅하였다. 이 과정을 통하여 대부분의 양잉온성 고분자가 용해되고, 기재와 직접적인 정전기적으로 접촉된 가장 안쪽 층만이 남는다. 같은 방법으로, 음이온성 폴리소듐 4-스타이렌설포네이트로 코팅된 다이아몬드 나노크리스탈 시드를 양이온성 기재표면에 밀도있게 부착시켰다. Meanwhile, the silicon substrate was immersed in an aqueous 10 volume% polydiaryldimethyl ammonium chloride solution for 30 minutes, and then the thermally oxidized silicon wafer (oxide thickness: 1 μm) was coated with a cationic polymer by washing the substrate with deionized water. This process dissolves most of the cationic polymer and leaves only the innermost layer in direct electrostatic contact with the substrate. In the same manner, diamond nanocrystal seeds coated with anionic polysodium 4-styrenesulfonate were densely attached to the surface of the cationic substrate.
결과적으로, 열적으로 산화된 실리콘 웨이퍼 표면상에 폴리디아릴디메틸 암모늄 클로라이드/폴리소듐 4-스타이렌설포네이트-나노다이아몬드(SiO2/PDDA/PSS-ND) 구조의 시드층이 형성되었다. 상기 나노크리스탈 시드층으로부터, 핫필라멘트 화학적 기상 증착법(HFCVD)을 사용하여 보론-도핑된 폴리크리스탈린 다이아몬드 필름을 성장시켰다. B2H6/CH4/H2 가스를 사용하였으며, B2H6, CH4 및 H2 의 유속은 각각 0.05 sccm, 1 sccm 및 100 sccm이었다. 또한 증착 과정은 800℃에서 5시간동안 총압력 90 torr 로 수행되었다. 폴리크리스탈린 다이아몬드의 막의 두께는 약 1 μm 였다. As a result, a seed layer of polydiaryldimethyl ammonium chloride / polysodium 4-styrenesulfonate-nanodiamond (SiO 2 / PDDA / PSS-ND) structure was formed on the thermally oxidized silicon wafer surface. From the nanocrystal seed layer, boron-doped polycrystalline diamond films were grown using hot filament chemical vapor deposition (HFCVD). B 2 H 6 / CH 4 / H 2 gas was used, and the flow rates of B 2 H 6 , CH 4 and H 2 were 0.05 sccm, 1 sccm and 100 sccm, respectively. In addition, the deposition process was carried out at a total pressure of 90 torr for 5 hours at 800 ℃. The thickness of the polycrystalline diamond was about 1 μm.
도 2에는 보론-도핑된 나노다이아몬드 전극의 SEM 이미지가 잘 나타나있다. 이때 측정된 보론-도핑된 나노다이아몬드 전극의 두께는 1 μm 였다.2 shows an SEM image of the boron-doped nanodiamond electrode well. The boron-doped nanodiamond electrode measured at this time had a thickness of 1 μm.
실시예 2: 고분자 나노와이어 합성 및 백금 나노입자의 분산Example 2: Polymer Nanowire Synthesis and Dispersion of Platinum Nanoparticles
다음으로, 일정 전압하에서 전기화학적 증착법을 사용하여 아닐린 중합이 수행되었다. 0.2 M H2SO4와 0.1 M 아닐린을 포함하는 전해질 용액에서 1.5 V 조건으로 30분 동안 보론-도핑된 나노다이아몬드 전극 상에 폴리아닐린 나노와이어을 전기화학적으로 증착했다. 그 후 증류수로 세척한 다음 40℃ 오븐에서 하루 동안 건조시켰다. Next, aniline polymerization was carried out using electrochemical deposition under constant voltage. Polyaniline nanowires were electrochemically deposited on boron-doped nanodiamond electrodes for 30 minutes at 1.5 V in an electrolyte solution containing 0.2 MH 2 SO 4 and 0.1 M aniline. Then washed with distilled water and then dried in a 40 ℃ oven for one day.
그 다음 상기 전극을 0.5 M H2SO4 와 2.0 mM K2PtCl6 중에서 다중순환 전압전류방법(multi-cyclic voltammetry: CV)을 이용하여 50 mV s-1 속도로 0.40 내지 -0.25 V 전압 조건에서 처리하여 폴리아닐린 나노와이어 중에 백금(Pt) 나노클러스터를 삽입시켰다. 이때 사용된 백금(Pt) 나노입자의 크기는 제한되지 않으나, 30- 50 nm 범위인 것이 바람직하다. 그 이유는 분산성이 우수하여, 바이오센서의 감도를 향상시키기 때문이다. The electrode was then treated at 0.40 to -0.25 V voltage conditions at 50 mV s −1 rate using multi-cyclic voltammetry (CV) in 0.5 MH 2 SO 4 and 2.0 mM K 2 PtCl 6 . To insert a platinum (Pt) nanocluster into the polyaniline nanowire. The size of the platinum (Pt) nanoparticles used is not limited, but is preferably in the range of 30-50 nm. This is because the dispersibility is excellent and the sensitivity of the biosensor is improved.
이에 따라 보론-도핑된 다이아몬드/폴리아닐린 나노와이어/백금 나노입자를 포함하는 전극이 형성되었다. 최적화된 사이클수는 약 60이었다.This resulted in an electrode comprising boron-doped diamond / polyaniline nanowires / platinum nanoparticles. The optimized cycle count was about 60.
도 3에는 본 발명에 따른 작업 전극의 제조 과정을 보여주는 순서도가 나타나있다. 또한 도 4에는 폴리아닐린 중합 및 효소 고정 과정에 대한 화학 반응식이 도시되어 있다. 3 is a flow chart showing the manufacturing process of the working electrode according to the present invention. Also shown in FIG. 4 is a chemical scheme for polyaniline polymerization and enzyme immobilization.
한편 도 5에는 백금 나노입자의 전기화학적 증착 전(a)과 후(b)를 보여주는 폴리아닐린 나노와이어의 네트워크를 보여주는 SEM 이미지가 나타나있다. 도 5a에서 확인할 수 있는 바와 같이, 폴리아닐린 나노와이어의 나노다공성 네트워크는 다수의 백금 나노입자들과 효소 고정을 위한 이상적인 표면을 제공할 뿐만 아니라, 활성 부위에 분석체를 더 많이 수송할 수 있고 더 쉽게 접근시킬 수 있다. 또한 도 5b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 백금 나노입자들은 폴리아닐린 나노와이어 표면에 잘 분산되어 부분적으로 삽입되어 있다. 이와 같이 잘 분산된 백금(Pt) 나노촉매는 효소 반응에 의해 생성된 과산화수소의 전기적산화를 위한 전기촉매적 활성을 증가시킬 수 있다. Meanwhile, FIG. 5 shows an SEM image showing a network of polyaniline nanowires showing (a) and (b) before and after electrochemical deposition of platinum nanoparticles. As can be seen in FIG. 5A, the nanoporous network of polyaniline nanowires not only provide an ideal surface for enzymatic immobilization with many platinum nanoparticles, but also can transport more analytes to the active site and more easily You can access it. As can also be seen in Figure 5b, the platinum nanoparticles are well dispersed and partially inserted on the surface of the polyaniline nanowires. This well dispersed platinum (Pt) nanocatalyst can increase the electrocatalytic activity for the electrooxidation of hydrogen peroxide produced by the enzymatic reaction.
실시예 3: 효소고정Example 3: Enzyme Fixation
글루코오스 옥시다이제 효소를 함유한 용액(1000 U/ml)에 담금으로써 백금 입자의 표면상에 효소를 직접 고정시켰다. 효소층이 형성된 후에, 전극을 인산완충용액 용액을 흘려주면서 헹구어 잔여 모노머 또는 약하게 연결된 효소 분자를 제거했다. The enzyme was directly immobilized on the surface of the platinum particles by immersion in a solution containing glucose oxidase enzyme (1000 U / ml). After the enzyme layer was formed, the electrode was rinsed with a phosphate buffer solution to remove residual monomers or weakly linked enzyme molecules.
시험예 1: 개질 전극의 감도 측정Test Example 1 Measurement of Sensitivity of Modified Electrode
글루코오스 바이오센서의 반응은 효소 촉매 반응에서 생성된 H2O2의 전기화학적 산화와 관련되어 있다. 반응 메카니즘은 아래와 같다. The reaction of glucose biosensors is associated with the electrochemical oxidation of H 2 O 2 produced in enzymatic catalysis. The reaction mechanism is as follows.
상기 반응에서 보여지는 바와 같이, 본 발명에서 관심이 되는 바이오분자는 글루코오스이며, 과산화수소는 환원 또는 산화반응의 부생성물이지만, 본 발명에 따른 센서는 과산화수소를 감지함으로써 글루코오스를 측정하게 된다. As shown in the above reaction, the biomolecule of interest in the present invention is glucose, and hydrogen peroxide is a by-product of a reduction or oxidation reaction, but the sensor according to the present invention measures glucose by sensing hydrogen peroxide.
다시 말해서, 글루코오스는 글루코오스의 효소 촉매적 산화로부터 생성된 과산화수소의 전기화학적 감지에 의해 검출되는 간접적인 방식으로 정량화할 수 있다. 이때, 매트릭스에 분산된 백금 나노입자는 H2O2의 산화에 촉매 작용을 하며, 센서의 감도를 높이게 된다. In other words, glucose can be quantified in an indirect manner that is detected by electrochemical sensing of hydrogen peroxide resulting from enzymatic catalytic oxidation of glucose. At this time, the platinum nanoparticles dispersed in the matrix catalyzes the oxidation of H 2 O 2 and increases the sensitivity of the sensor.
본 발명에 따른 폴리아닐린-나노와이어의 네트워크 구조는 수많은 백금-나노입자를 고정시킬 수 있는 이상적인 표면일 뿐만 아니라, 활성 부위에 분석물질을 더 많이 이동시키고, 더 쉽게 접근시킬 수 있다. 또한 본 발명에서 백금-나노입자는 잘 분산되어, 폴리아닐린-나노입자 표면에 부분적으로 삽입되어 있다.(도 3B) 따라서 잘 분산된 백금 나노촉매는 효소 반응에 의해 생성된 과산화수의 전기적 산화를 위한 전기촉매적 활성을 증가시킬 수 있다. The network structure of the polyaniline-nanowires according to the present invention is not only an ideal surface for immobilizing numerous platinum-nanoparticles, but also allows more analyte to move to the active site and more easily accessible. Also, in the present invention, the platinum-nanoparticles are well dispersed and partially inserted into the surface of the polyaniline-nanoparticles (FIG. 3B). Thus, the well-dispersed platinum nanocatalyst is used for the electrical oxidation of peroxide produced by the enzymatic reaction. Can increase electrocatalytic activity.
도 6은 a) 글루코오스 용액이 없을 경우와, b) 2mM의 글루코오스 용액의 존재하에서 50 mV/s의 스캔 속도로 측정한 보론-도핑된 다이아몬드/폴리아닐린 나노와이어/글루코오스 전극의 전형적인 다중순환 전압전류(CV) 측정 결과이다. 글루코오스의 존재하에, 본 발명에 따라 개질된 전극의 CV 전류값은 산화 피크 전류의 증가에 따라 급격하게 변화했다. 이는 글루코오스에 대한 바이오센서의 전류 반응이 글루코오스 옥시다아제(GOx)의 촉매적 효과에 기인한 것임을 나타내며, 고정된 글 루코오스 옥시다아제가 그 활성을 유지한다는 것을 보여준다. 다시 말해서, 글루코오스에 대한 전기화학적 촉매 특성을 보여준다. 6 shows a typical multicyclic voltammetry of boron-doped diamond / polyaniline nanowire / glucose electrodes measured at a scan rate of 50 mV / s in the absence of a) glucose solution and b) in the presence of a 2 mM glucose solution. CV) measurement result. In the presence of glucose, the CV current value of the electrode modified according to the present invention changed drastically with increasing oxidation peak current. This indicates that the current response of the biosensor to glucose is due to the catalytic effect of glucose oxidase (GOx) and shows that the fixed glucose oxidase maintains its activity. In other words, electrochemical catalytic properties for glucose are shown.
한편 +0.40 V vs. Ag/AgCl의 전압을 적용하여 50mM 인산완충용액 중에서 준비된 글루코오스 수용액 샘플을 사용하여, 본 발명에 따라 개질된 나노다이아몬드 전극 상에서 글루코오스의 전류를 측정했다. Meanwhile, +0.40 V vs. The current of glucose was measured on the nanodiamond electrode modified according to the present invention using a sample of an aqueous glucose solution prepared in 50 mM phosphate buffer solution by applying a voltage of Ag / AgCl.
앞선 연구에서, 본 발명자는 금(Gold) 기재상에 백금 분산된 폴리아닐린 나노로도로 개질된 글루코오스 센서를 제조했으며, 이때 그래프의 선형 범위는 0.3 과 2.5 mM 사이였다. 이에 비해, 본 발명은 5.94 μM부터 0.514mM의 비교적 넓은 농도 범위에서 선형성을 나타내었으며, 기울기는 5.54 μA/mM (상관계수 r=0.9947)였다. 또한 검출한계는 0.102 μM로서 상당히 낮은 농도에서도 검출이 가능하였다. 본 측정 결과는 도 7에 도시하였다. In the previous study, we prepared a glucose sensor modified with polyaniline nanorode dispersed in platinum on a gold substrate, where the linear range of the graph was between 0.3 and 2.5 mM. In contrast, the present invention showed linearity in a relatively wide concentration range of 5.94 μM to 0.514 mM and the slope was 5.54 μA / mM (correlation coefficient r = 0.9947). In addition, the detection limit was 0.102 μM, and detection was possible even at a considerably low concentration. This measurement result is shown in FIG.
이러한 결과로부터, 본 발명이 훨씬 더 낮은 농도의 글루코오스까지 검출할 수 있다는 것을 알 수 있으며, 나노다이아몬드 기재가 낮은 농도에서의 분석에 적합하다는 것을 확인할 수 있다. 또한 다이아몬드 박막 위에 전도성 고분자 나노와이어을 적용함으로써 표면 처리가 쉬워졌으며 다양한 방법으로 바이오물질 고정화가 가능해졌다. 또한 종래의 글루코오스 바이오센서에 비해 매우 높은 감도를 나타냈다. 이 결과로부터, 백금 나노입자가 분산된 전도성 고분자 나노선을 이용한 처리 방법이 센서의 감도를 크게 향상시키는 것을 확인할 수 있었다. From these results, it can be seen that the present invention can detect even lower concentrations of glucose, confirming that the nanodiamond substrate is suitable for analysis at low concentrations. In addition, by applying conductive polymer nanowires on the diamond thin film, surface treatment is easy and biomaterials can be immobilized in various ways. In addition, compared to the conventional glucose biosensor showed a very high sensitivity. From this result, it was confirmed that the treatment method using the conductive polymer nanowires in which the platinum nanoparticles were dispersed greatly improved the sensitivity of the sensor.
도 1은 본 발명에 따른 글루코오스 바이오센서의 구조도이다. 1 is a structural diagram of a glucose biosensor according to the present invention.
도 2는 보론 도핑된 나노다이아몬드의 SEM 이미지로서, 나노다이아몬드의 두께는 약 1㎛ 이다. 2 is an SEM image of boron-doped nanodiamonds, wherein the nanodiamonds have a thickness of about 1 μm.
도 3은 개질된 작업 전극의 제조 과정을 보여주는 순서도이다. 3 is a flow chart showing the manufacturing process of the modified working electrode.
도 4는 폴리아닐린 중합 및 효소 고정 과정에 대한 화학 반응식이 도시된 도면이다.4 is a diagram illustrating the chemical reaction for the polyaniline polymerization and enzyme immobilization process.
도 5는 백금 나노입자의 전기화학적 증착 전(a)과 후(b)를 보여주는 폴리아닐린 나노와이어의 네트워크를 보여주는 SEM 이미지이다. FIG. 5 is an SEM image showing a network of polyaniline nanowires showing before (a) and after (b) electrochemical deposition of platinum nanoparticles.
도 6은 글루코오스가 없는 경우(실선)와 글루코오스가 있는 경우(점선)의 백금 분산된 폴리아닐린 나노와이어로 개질된 나노다이아몬드 전극의 순환 전류(Cyclic votammograms) 측청값을 나타낸 그래프이다. FIG. 6 is a graph showing cyclic current (Cyclic votammograms) measurement values of nanodiamond electrodes modified with platinum dispersed polyaniline nanowires in the absence of glucose (solid line) and in the presence of glucose (dashed line).
도 7은 글루코오스 농도와 반응 전류의 변화를 보여주는 그래프로서, 내부 그래프는 글루코오스 농도가 5.94x10-6 부터 5.14×10-3 M 범위일 때의 센서의 교정 그래프이다. 7 is a graph showing changes in glucose concentration and reaction current, and an internal graph is a calibration graph of a sensor when the glucose concentration ranges from 5.94 × 10 −6 to 5.14 × 10 −3 M.
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